Verwendung von Hydrophobinen zur Oberflächenbehandlung von gehärteten mineralischen Baustoffen, Naturstein, Kunststein und Keramiken

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Hydrophobinen zur Behandlung der Oberfläche von gehärteten mineralischen Baustoffen, Naturstein, Kunststein oder Keramik, ein Verfahren zur Behandlung derartiger Oberflächen sowie Oberflächen von gehärteten mineralischen Baustoffen, Naturstein, Kunststein oder Keramik, welche eine Hydrophobine umfassende Beschichtung aufweisen.

Es ist bekannt, Oberflächen im Innen- und Außenbereich mit Beschichtungen zu versehen, welche die Haltbarkeit und/oder das Aussehen der Oberfläche verbessern sollen. Derartige Beschichtungen sollen beispielsweise konservierend wirken, Feuchtigkeit abweisen, Verschmutzungen verhindern oder eine leichtere Reinigung der Oberfläche ermöglichen.

Hierbei kann es sich um permanente Beschichtungen, beispielsweise um dem Lotuseffekt nachempfundene Beschichtungen handeln, wie von EP-A 933 388 offenbart.

Es kann sich aber auch um einen temporären Schutz handeln. Ein derartiger, temporärer, schmutzabweisender Effekt kann beispielsweise durch Substanzen in einer Reinigerformulierung erreicht werden, welche beim Reinigen der Oberfläche aufgetragen werden. Es kann sich hierbei beispielsweise um Reiniger für Fliesen handeln.

WO 03/002620 offenbart die Verwendung von (Meth)acrylsäuredialkylaminoalkylestern als Soil-Release-Polymere für harte Oberflächen, beispielsweise Feinsteinböden oder Edelstahloberflächen. Die offenbarten Formulierungen enthalten 0,1 bis 5 Gew. % des Polymeren.

DE-A 100 61 897 offenbart Reinigungsmittel, die hydrophile, silikathaltige Partikel enthalten, die zu einer verbesserten Schmutzablösung bei gleichzeitiger Verringerung der Wiederanschmutzung führen. Die Partikel lagern sich auf der Oberfläche der zu reinigenden Substanzen an und verändern so die Oberflächeneigenschaften.

Hydrophobine sind kleine Proteine von etwa 100 bis 150 Aminosäuren, die charakteristisch für filamentöse Pilze, beispielsweise Schizophyllum commune, sind. Sie weisen in aller Regel 8 Cystein-Einheiten auf.

Hydrophobine weisen eine ausgeprägte Affinität zu Grenzflächen auf und eignen sich daher zur Beschichtung von Oberflächen. So lässt sich beispielsweise Teflon mittels Hydrophobinen unter Erhalt einer hydrophilen Oberfläche beschichten.

Hydrophobine können aus natürlichen Quellen isoliert werden. Es können aber auch natürlich nicht vorkommende Hydrophobine mittels chemischer und/oder biotechnolo-

gischer Herstellverfahren synthetisiert werden. Unsere ältere Anmeldung DE 102005007480.4 offenbart ein Herstellverfahren für Hydrophobine, die nicht in der Natur vorkommen.

Im Stand der Technik ist die Verwendung von Hydrophobinen für verschiedene Anwendungen vorgeschlagen worden.

WO 96/41882 schlägt die Verwendung von Hydrophobinen als Emulgatoren, Verdicker, oberflächenaktive Substanzen, zum Hydrophilieren hydrophober Oberflächen, zur Verbesserung der Wasserbeständigkeit hydrophiler Substrate, zur Herstellung von Öl-inWasser-Emulsionen oder von Wasser-in-ÖI-Emulsionen vor. Weiterhin werden pharmazeutische Anwendungen wie die Herstellung von Salben oder Cremes sowie kosmetische Anwendungen wie Hautschutz oder die Herstellung von Haarshampoos oder Haarspülungen vorgeschlagen.

EP-A 1 252 516 offenbart die Beschichtung von Fenstern, Kontaktlinsen, Biosensoren, medizinischen Vorrichtungen, Behältern zur Durchführung von Versuchen oder zur Lagerung, Schiffrümpfen, festen Teilchen oder Rahmen oder Karosserie von Personenkraftwagen mit einer Hydrophobine enthaltenden Lösung bei einer Temperatur von 30 bis 80 ⁰ C.

WO 03/53383 offenbart die Verwendung von Hydrophobin zum Behandeln von Keratin- Materialien in kosmetischen Anwendungen.

WO 03/10331 offenbart einen mit Hydrophobin beschichteten Sensor, beispielsweise eine Messelektrode, an den nicht kovalent weitere Substanzen, z.B. elektroaktive Substanzen, Antikörper oder Enzyme gebunden sind.

Keine der zitierten Schriften offenbart die Oberflächenbehandlung von gehärteten mineralischen Baustoffen, Naturstein, Kunststein oder Keramiken.

Aufgabe der Erfindung war es, neuartige Techniken zur Behandlung derartiger Oberflächen bereitzustellen, mit denen mindestens ein schmutzabweisender und/oder hydrophobierender und/oder ein konservierender Effekt erzielt werden kann.

Dementsprechend wurde die Verwendung von Hydrophobinen zur Behandlung von Oberflächen gefunden, wobei es sich bei den Oberflächen um die Oberfläche eines Materials ausgewählt aus der Gruppe von gehärteten mineralischen Baustoffen, Naturstein, Kunststein oder Keramik handelt. In einer bevorzugten Ausführungsform wird hierzu eine Formulierung aus einem Hydrophobin sowie mindestens einem Lösemittel verwendet.

In einem zweiten Aspekt der Erfindung wurde ein Verfahren zum Behandeln von Oberflächen gefunden, bei dem man die Oberfläche mit mindestens einem Hydrophobin in Kontakt bringt, und es sich bei der Oberfläche um die Oberfläche eines Materials ausgewählt aus der Gruppe von gehärteten mineralischen Baustoffen, Naturstein, Kunststein oder Keramiken handelt.

In einem dritten Aspekt der Erfindung wurden mit mindestens einem Hydrophobin beschichtete Oberfläche von gehärteten mineralischen Baustoffen, Naturstein, Kunststein oder Keramik gefunden.

Überraschenderweise wurde gefunden, dass schon äußerst geringe Mengen von Hydrophobinen zu einer wirksamen, schmutzabweisenden und/oder hydrophobieren- den und/oder konservierenden Behandlung der Oberflächen von gehärteten mineralischen Baustoffen, Steinen oder Keramiken ausreichend sind.

Zu der Erfindung ist im Einzelnen das Folgende auszuführen:

Erfindungsgemäß wird zur Behandlung der Oberfläche von gehärteten mineralischen Baustoffen, Naturstein, Kunststein oder Keramiken mindestens ein Hydrophobin verwendet. Es kann selbstverständlich auch ein Gemisch mehrerer, verschiedener Hydrophobine eingesetzt werden.

Unter dem Begriff „Hydrophobine" im Sinne dieser Erfindung sollen im Folgenden Polypeptide der allgemeinen Strukturformel (I)

X _n -C -X-ι- ₅₀ -C -Xo- ₅ -C -Xi-ioo-C -X-MOO-C -XI-SO-C -XO-S-C -XI-SO-C -X _m (I)

verstanden werden, wobei X für jede der 20 natürlich vorkommenden Aminosäuren (Phe, Leu, Ser, Tyr, Cys, Trp, Pro, His, GIn, Arg, He Met, Thr, Asn, Lys, VaI, AIa, Asp, GIu, GIy) stehen kann. Dabei können X jeweils gleich oder verschieden sein. Hierbei stellen die bei X stehenden Indizes jeweils die Anzahl der Aminosäuren dar, C steht für Cystein, Alanin, Serin, Glycin, Methionin oder Threonin, wobei mindestens vier der mit C benannten Aminosäuren für Cystein stehen, und die Indizes n und m stehen unabhängig voneinander für natürliche Zahlen von 0 und 500, bevorzugt von 15 bis 300.

Die Polypetide gemäß Formel (I) sind weiterhin durch die Eigenschaft charakterisiert, dass sie bei Raumtemperatur nach Beschichten einer Glasoberfläche eine Vergrößerung des Kontaktwinkels eines Wassertropfens von mindestens 20°, bevorzugt mindestens 25°, besonders bevorzugt mindestens 30°, und ganz besonders bevorzugt mindestens 35° bewirken, jeweils verglichen mit dem Kontaktwinkel eines gleich großen Wassertropfens mit der unbeschichteten Glasoberfläche.

Die mit C ¹ bis C ⁸ benannten Aminosäuren sind bevorzugt Cysteine; sie können aber auch durch andere Aminosäuren ähnlicher Raumerfüllung, bevorzugt durch Alanin, Serin, Threonin, Methionin oder Glycin ersetzt werden. Allerdings sollen mindestens vier, bevorzugt mindestens 5, besonders bevorzugt mindestens 6 und insbesondere mindestens 7 der Positionen C ¹ bis C ⁸ aus Cysteinen bestehen. Cysteine können in den erfindungsgemäßen Proteinen entweder reduziert vorliegen oder miteinander Di- sulfidbrücken ausbilden. Besonders bevorzugt ist die intramolekulare Ausbildung von C-C Brücken, insbesondere die mit mindestens einer, bevorzugt 2, besonders bevorzugt 3 und ganz besonders bevorzugt 4 intramolekularen Disulfidbrücken. Bei dem oben beschriebenen Austausch von Cysteinen durch Aminosäuren ähnlicher Raumerfüllung werden vorteilhaft solche C-Positionen paarweise ausgetauscht, die intramolekulare Disulfidbrücken untereinander ausbilden können.

Falls in den mit X bezeichneten Positionen auch Cysteine, Serine, Alanine, Glycine, Methionine oder Threonine verwendet werden, kann sich die Nummerierung der einzelnen C-Positionen in den allgemeinen Formeln entsprechend verändern.

Bevorzugt werden Hydrophobine der allgemeinen Formel (II)

X _n -C -X3-25-C -Xo-2"C -X5_50"C -X2..35-C -X2-15-C -Xo-2"C -X3.35-C "Xm (II)

zur Ausführung der vorliegenden Erfindung eingesetzt, wobei X, C und die bei X stehenden Indizes die obige Bedeutung haben, die Indizes n und m für Zahlen zwischen 0 und 300 stehen, und sich die Proteine weiterhin durch die oben erwähnte Kontaktwinkeländerung auszeichnen.

Besonders bevorzugt werden Hydrophobine der allgemeinen Formel (III)

X _n -C -Xö-g-C -C -X-I1-39-C -X2-23-C -X5-9-C -C -X6-18-C -X _m (III)

eingesetzt, wobei X, C und die bei X stehenden Indizes die obige Bedeutung haben, die Indizes n und m für Zahlen zwischen 0 und 200 stehen, und sich die Proteine weiterhin durch die oben erwähnte Kontaktwinkeländerung auszeichnen, und es sich weiterhin bei mindestens 6 der mit C benannten Aminosäuren um Cystein handelt. Besonders bevorzugt handelt es sich bei allen Aminosäuren C um Cystein.

Bei den Resten X _n und X _m kann es sich um Peptidsequenzen handeln, die natürlicherweise auch mit einem Hydrophobin verknüpft sind. Es kann sich aber auch bei einem oder beiden Resten um Peptidsequenzen handeln, die natürlicherweise nicht mit einem Hydrophobin verknüpft sind. Darunter sind auch solche Reste X _n und/oder X _m zu verstehen, bei denen eine natürlicherweise in einem Hydrophobin vorkommende Peptid-

sequenz durch eine nicht natürlicherweise in einem Hydrophobin vorkommende Pep- tidsequenz verlängert ist.

Falls es sich bei X _n und/oder X _m um natürlicherweise nicht in Hydrophobinen vorkommende Peptidsequenzen handelt, sind derartige Sequenzen in der Regel mindestens 20, bevorzugt mindestens 35, besonders bevorzugt mindestens 50 und ganz besonders bevorzugt mindestens 100 Aminosäuren lang. Ein derartiger, natürlicherweise nicht mit einem Hydrophobin verknüpfter Rest soll im Folgenden auch als Fusionspartner bezeichnet werden. Damit soll ausgedrückt werden, dass die Proteine aus einem Hydrophobinteil und einem Fusionspartnerteil bestehen, die in der Natur nicht zusammen in dieser Form vorkommen. Derartige Proteinen sollen auch als Fusionsproteine bezeichnet werden.

Der Fusionspartnerteil kann aus einer Vielzahl von Proteinen ausgewählt werden. Es können auch mehrere Fusionspartner mit einem Hydrophobinteil verknüpft werden, beispielsweise am Aminoterminus (X _n ) und am Carboxyterminus (X _m ) des Hydropho- binteils. Es können aber auch beispielsweise zwei Fusionspartner mit einer Position (X _n oder X _m ) des erfindungsgemässen Proteins verknüpft werden.

Besonders geeignete Fusionspartner sind Polypeptide, die natürlicherweise in Mikroorganismen, insbesondere in E. coli oder Bacillus subtilis vorkommen. Beispiele für solche Fusionspartner sind die Sequenzen yaad (SEQ ID NO: 15 und 16 ) , yaae (SEQ ID NO: 17 und 18 ) und Thioredoxin. Gut geeignet sind auch Fragmente oder Derivate dieser genannten Sequenzen, die nur einen Teil, bevorzugt 70-99%, besonders bevorzugt 80-98% der genannten Sequenzen umfassen, oder bei denen einzelne Aminosäuren, bzw. Nukleotide gegenüber der genannten Sequenz verändert sind.

Die erfindungsgemäß verwendeten Proteine können auch noch in ihrer Polypeptidse- quenz modifiziert sein, beispielsweise durch Glycosilierung, Acetylierung oder auch durch chemische Quervernetzung beispielsweise mit Glutardialdehyd.

Eine Eigenschaft der erfindungsgemäß verwendeten Proteine ist die Änderung von Oberflächeneigenschaften, wenn die Oberflächen mit den Proteinen beschichtet werden. Die Änderung der Oberflächeneigenschaften lässt sich experimentell dadurch bestimmen, dass der Kontaktwinkel eines Wassertropfens vor und nach der Beschich- tung einer Oberfläche mit dem Protein gemessen wird und die Differenz der beiden Messungen ermittelt wird.

Die Durchführung von Kontaktwinkelmessungen ist dem Fachmann prinzipiell bekannt. Die genauen experimentellen Bedingungen zur Messung des Kontaktwinkels sind im experimentellen Teil dargestellt. Unter den dort genannten Bedingungen besitzen die erfindungsgemäß verwendeten Proteine die Eigenschaft, den Kontaktwinkel eines

Wassertropfens auf einer Glasoberfläche um mindestens 20°, bevorzugt mindestens 25°, besonders bevorzugt mindestens 30° zu vergrößern.

Im Hydrophobinteil der bisher bekannten Hydrophobine sind die Positionen der polaren und unpolaren Aminosäuren konserviert, was sich in einem charakteristischen Hydrophobizitätsplot äußert. Unterschiede in den biophysikalischen Eigenschaften und in der Hydrophobizität führten zur Einteilung der bisher bekannten Hydrophobine in zwei Klassen, I und Il (Wessels et al. 1994, Ann. Rev. Phytopathol., 32, 413-437).

Die assemblierten Membranen aus Klasse I Hydrophobinen sind hochgradig unlöslich (selbst gegenüber 1% SDS bei erhöhter Temperatur) und können nur durch konzentrierte Trifluoressigsäure (TFA), bzw. Ameisensäure wieder dissoziiert werden. Im Gegensatz dazu sind die assemblierten Formen von Klasse Il Hydrophobinen weniger stabil. Sie können bereits durch 60%iges Ethanol, bzw. 1% SDS (bei Raumtemperatur) wieder aufgelöst werden.

Ein Vergleich der Aminosäuresequenzen zeigt, dass die Länge des Bereichs zwischen Cystein C ³ und C ⁴ bei Klasse Il Hydrophobinen deutlich kürzer ist, als bei Hydrophobinen der Klasse I. Klasse Il Hydrophobine weisen weiterhin mehr geladene Aminosäuren als Klasse I auf.

Besonders bevorzugte Hydrophobine zur Ausführung der vorliegenden Erfindung sind die Hydrophobine des Typs dewA, rodA, hypA, hypB, sc3, basfi , basf2, die im nachfolgenden Sequenzprotokoll strukturell charakterisiert sind. Es kann sich auch nur um Teile oder Derivate davon handeln. Es können auch mehrere Hydrophobine, bevorzugt 2 oder 3, gleicher oder unterschiedlicher Struktur miteinander verknüpft und mit einer entsprechenden geeigneten Polypeptidsequenz, die natürlicherweise nicht mit einem Hydrophobin verbunden ist, verknüpft werden.

Besonders geeignet zur Durchführung der vorliegenden Erfindung sind weiterhin die Fusionsproteine mit den in SEQ ID NO: 20, 22, 24 dargestellten Polypeptidsequenzen sowie den dafür codierenden Nukleinsäuresequenzen, insbesondere den Sequenzen gemäss SEQ ID NO: 19, 21, 23. Auch Proteine, die sich ausgehend von den in SEQ ID NO. 20, 22 oder 24 dargestellten Polypeptidsequenzen durch Austausch, Insertion oder Deletion von mindestens einer, bis hin zu 10. bevorzugt 5 , besonders bevorzugt 5% aller Aminosäuren ergeben, und die die biologische Eigenschaft der Ausgangsproteine noch zu mindestens 50% besitzen, sind besonders bevorzugte Ausführungsformen. Unter biologischer Eigenschaft der Proteine wird hierbei die bereits beschriebene Änderung des Kontaktwinkels um mindestens 20° verstanden.

Die erfindungsgemäß verwendeten Polypeptide lassen sich chemisch durch bekannte Verfahren der Peptidsynthese, beispielsweise durch Festphasensynthese nach Merri- field herstellen.

Natürlich vorkommende Hydrophobine lassen sich aus natürlichen Quellen mittels geeigneter Methoden isolieren. Beispielhaft sei auf Wösten et. al., Eur. J Cell Bio. 63, 122-129 (1994) oder WO 96/41882 verwiesen.

Die Herstellung von nicht natürlich vorkommenden Fusionsproteinen kann bevorzugt durch gentechnische Verfahren erfolgen, bei denen eine für den Fusionspartner und eine für den Hydrophobinteil codierende Nukleinsäuresequenz, insbesondere DNA- Sequenz, so kombiniert werden, dass in einem Wirtsorganismus durch Genexpression der kombinierten Nukleinsäuresequenz das gewünschte Protein erzeugt wird. Ein derartiges Herstellverfahren ist in unserer älteren Anmeldung DE 102005007480.4 offenbart.

Geeignete Wirtsorganismen (Produktionsorganismen) für das genannte Herstellverfahren können dabei Prokaryonten (einschließlich der Archaea) oder Eukaryonten sein, besonders Bakterien einschliesslich Halobacterien und Methanococcen, Pilze, Insektenzellen, Pflanzenzellen und Säugerzellen, besonders bevorzugt Escherichia coli, Bacillus subtilis, Bacillus megaterium, Aspergillus oryzea, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Pichia pastoris, Pseudomonas spec, Lactobacillen, Hansenula poly- morpha, Trichoderma reesei, SF9 (bzw. verwandte Zellen) u.a..

Im Rahmen der vorliegenden Erfindungen können Expressionskonstrukte, erhalten unter der genetischen Kontrolle regulativer Nukleinsäuresequenzen, eine für ein erfindungsgemäß verwendetes Polypeptid kodierende Nukleinsäuresequenz, sowie Vektoren, umfassend wenigstens eines dieser Expressionskonstrukte zur Herstellung von Hydrophobinen eingesetzt werden.

Vorzugsweise umfassen eingesetzte Konstrukte 5'-stromaufwärts von der jeweiligen kodierenden Sequenz einen Promotor und 3'-stromabwärts eine Terminatorsequenz sowie gegebenenfalls weitere übliche regulative Elemente, und zwar jeweils operativ verknüpft mit der kodierenden Sequenz.

Unter einer "operativen Verknüpfung" versteht man die sequentielle Anordnung von Promotor, kodierender Sequenz, Terminator und gegebenenfalls weiterer regulativer Elemente derart, dass jedes der regulativen Elemente seine Funktion bei der Expression der kodierenden Sequenz bestimmungsgemäß erfüllen kann.

Beispiele für operativ verknüpfbare Sequenzen sind Targeting-Sequenzen sowie En- hancer, Polyadenylierungssignale und dergleichen. Weitere regulative Elemente um-

fassen selektierbare Marker, Amplifikationssignale, Replikationsursprünge und dergleichen. Geeignete regulatorische Sequenzen sind z. B. beschrieben in Goeddel, Gene Expression Techno- logy : Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990).

Zusätzlich zu diesen Regulationssequenzen kann die natürliche Regulation dieser Sequenzen vor den eigentlichen Strukturgenen noch vorhanden sein und gegebenenfalls genetisch verändert worden sein, so dass die natürliche Regulation ausgeschaltet und die Expression der Gene erhöht wurde.

Ein bevorzugtes Nukleinsäurekonstrukt enthält vorteilhaft auch eine oder mehrere der schon erwähnten "Enhancer"-Sequenzen, funktionell verknüpft mit dem Promotor, die eine erhöhte Expression der Nukleinsäuresequenz ermöglichen. Auch am 3'-Ende der DNA-Sequenzen können zusätzliche vorteilhafte Sequenzen inseriert werden, wie weitere regulatorische Elemente oder Terminatoren.

Die Nukleinsäuren können in einer oder mehreren Kopien im Konstrukt enthalten sein. Im Konstrukt können noch weitere Marker, wie Antibiotikaresistenzen oder Au- xotrophien komplementierende Gene, gegebenenfalls zur Selektion auf das Konstrukt enthalten sein.

Vorteilhafte Regulationssequenzen für das Verfahren sind beispielsweise in Promotoren wie cos-, tac-, trp-, tet-, trp-tet-, Ipp-, lac-,lpp-lac-,laclq-T7- , T5-, T3-, gal-, trc-, ara-, rhaP(rhaPBAD) SP6-, lambda-PR-oder imlambda-P-Promotor enthalten, die vorteilhaft in gram-negativen Bakterien Anwendung finden. Weitere vorteilhafte Regulationssequenzen sind beispielsweise in den gram-positiven Promotoren amy und SP02, in den Hefe-oder Pilzpromotoren ADC1 ,MFalpha, AC, P-60, CYC1 , GAPDH, TEF, rp28, ADH enthalten. Es können auch künstliche Promotoren für die Regulation verwendet werden.

Das Nukleinsäurekonstrukt wird zur Expression in einem Wirtsorganismus vorteilhafterweise in einen Vektor, wie beispielsweise einem Plasmid oder einem Phagen inseriert, der eine optimale Expression der Gene im Wirt ermöglicht. Unter Vektoren sind außer Plasmiden und Phagen auch alle anderen dem Fachmann bekannten Vektoren, also z. B. Viren, wie SV40, CMV, Baculovirus und Adenovirus, Transposons.IS- Elemente, Phasmide, Cosmide, und lineare oder zirkuläre DNA, sowie das Agrobacterium- System zu verstehen.

Diese Vektoren können autonom im Wirtsorganismus repliziert oder chromosomal repliziert werden. Diese Vektoren stellen eine weitere Ausgestaltung der Erfindung dar. Geeignete Plasmide sind beispielsweise in E. coli pLG338, pACYC184, pBR322, pUC18,pUC19, pKC30, pRep4, pHS1 , pKK223-3, pDHE19.2, pHS2, pPLc236,

pMBL24, pLG200, pUR290,plN-lll"3-B1 _I tgt11 oder pBdCI, in StreptomycesplJ101 , plJ364,plJ702 oderplJ361 , in Bacillus pUB110, pC194 oder pBD214, in Corynebacteri- um pSA77 oder pAJ667, in Pilzen pALS1 , plL2 oder pBB116, in Hefen 2alpha, pAG-1 , YEp6, YEp13 oder pEMBLYe23 oder in Pflanzen pLGV23,pGHIac+, pBIN19, pAK2004 oder pDH51. Die genannten Plasmide stellen eine kleine Auswahl der möglichen Plasmide dar. Weitere Plasmide sind dem Fachmann bekannt und können beispielsweise aus dem Buch Cloning Vectors (Eds. Pouwels P. H. et al. Elsevier, Ams- terdam- New York-Oxford, 1985, ISBN 0 444 904018) entnommen werden.

Vorteilhaft enthält das Nukleinsäurekonstrukt zur Expression der weiteren enthaltenen Gene zusätzlich noch 3'-und/oder 5'-terminale regulatorische Sequenzen zur Steigerung der Expression, die je nach ausgewähltem Wirtorganismus und Gen oder Gene für eine optimale Expression ausgewählt werden.

Diese regulatorischen Sequenzen sollen die gezielte Expression der Gene und der Proteinexpression ermöglichen. Dies kann beispielsweise je nach Wirtsorganismus bedeuten, dass das Gen erst nach Induktion exprimiert oder überexprimiert wird, oder dass es sofort exprimiert und/oder überexprimiert wird.

Die regulatorischen Sequenzen bzw. Faktoren können dabei vorzugsweise die Genexpression der eingeführten Gene positiv beeinflussen und dadurch erhöhen. So kann eine Verstärkung der regulatorischen Elemente vorteilhafterweise auf der Transkriptionsebene erfolgen, indem starke Transkriptionssignale wie Promotoren und/oder "Enhancer" verwendet werden. Daneben ist aber auch eine Verstärkung der Translation möglich, indem beispielsweise die Stabilität der mRNA verbessert wird.

In einer weiteren Ausgestaltungsform des Vektors kann der das Nukleinsäurekonstrukt oder die Nukleinsäure enthaltende Vektor auch vorteilhaft in Form einer linearen DNA in die Mikroorganismen eingeführt werden und über heterologe oder homologe Rekombination in das Genom des Wirtsorganismus integriert werden. Diese lineare DNA kann aus einem linearisierten Vektor wie einem Plasmid oder nur aus dem Nukleinsäurekonstrukt oder der Nukleinsäure bestehen.

Für eine optimale Expression heterologer Gene in Organismen ist es vorteilhaft die Nukleinsäuresequenzen entsprechend des im Organismus verwendeten spezifischen "codon usage"zu verändern. Der "codon usage" lässt sich anhand von Computerauswertungen anderer, bekannter Gene des betreffenden Organismus leicht ermitteln.

Die Herstellung einer Expressionskassette erfolgt durch Fusion eines geeigneten Promotors mit einer geeigneten kodierenden Nukleotidsequenz sowie einem Terminatoroder Polyadenylierungssignal. Dazu verwendet man gängige Rekombinations- und Klonierungstechniken, wie sie beispielsweise in T. Maniatis, E. F.Fritsch und J.

Sambrook, Molecular Cloning : A Laboratory Manual, CoId Spring Harbor Laboratory, CoId Spring Harbor, NY (1989) sowie in T. J. Silhavy, M. L. Berman und L. W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, CoId Spring Harbor Laboratory, CoId Spring Harbor, NY (1984) und in Ausubel, F. M. etal., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. andWiley Interscience (1987) beschrieben sind.

Das rekombinante Nukleinsäurekonstrukt bzw. Genkonstrukt wird zur Expression in einem geeigneten Wirtsorganismus, vorteilhaft in einen wirtsspezifischen Vektor inser- tiert, der eine optimale Expression der Gene im Wirt ermöglicht. Vektoren sind dem Fachmann wohl bekannt und können beispielsweise aus "Cloning Vectors" (Pouwels P. H. et al., Hrsg, Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985) entnommen wer- den.

Mit Hilfe der Vektoren sind rekombinante Mikroorganismen herstellbar, welche beispielsweise mit wenigstens einem Vektor transformiert sind und zur Produktion der erfindungsgemäß verwendeten Polypeptide eingesetzt werden können. Vorteilhafterweise werden die oben beschriebenen rekombinanten Konstrukte in ein geeignetes Wirtssystem eingebracht und exprimiert. Dabei werden vorzugsweise dem Fachmann bekannte geläufige Klonierungs- und Transfektionsmethoden, wie beispielsweise Co- Präzipitation, Protoplastenfusion, Elektroporation, retrovirale Transfektion und dergleichen, verwendet, um die genannten Nukleinsäuren im jeweiligen Expressionssystem zur Expression zu bringen. Geeignete Systeme werden beispielsweise in Current Protocols in Molecular Biology, F.Ausubel etal., Hrsg., Wiley Interscience, New York 1997, oder Sambrook et al. Molecular Cloning : A Laboratory Manual. 2. Aufl., CoId Spring Harbor Laboratory, CoId Spring Harbor Laboratory Press, CoId Spring Harbor, NY, 1989 beschrieben.

Es sind auch homolog rekombinierte Mikroorganismen herstellbar. Dazu wird ein Vektor hergestellt, der zumindest einen Abschnitt eines erfindungsgemäß zu verwendenden Gens oder einer kodierenden Sequenz enthält, worin gegebenenfalls wenigstens eine Aminosäure-Deletion, -Addition oder -Substitution eingebracht worden ist, um die Sequenz zu verändern, z. B. funktionell zu disruptieren ("Knockout"- Vektor). Die eingebrachte Sequenz kann z. B. auch ein Homologes aus einem verwandten Mikroorganismus sein oder aus einer Säugetier-, Hefe- oder Insektenquelle abgeleitet sein. Der zur homologen Rekombination verwendete Vektor kann alternativ derart ausgestaltet sein, dass das endogene Gen bei homologer Rekombination mutiert oder anderweitig verändert ist, jedoch noch das funktionelle Protein kodiert (z. B. kann der stromaufwärts gelegene regulatorische Bereich derart verändert sein, dass dadurch die Expression des endogenen Proteins verändert wird). Der veränderte Abschnitt des erfindungsgemäß verwendeten Gens ist im homologen Rekombinationsvektor. Die Konstruktion geeigneter Vektoren zur homologen Rekombination ist z. B. beschrieben in Thomas, K. R. und Capecchi, M. R. (1987) Cell 51 : 503.

Als rekombinante Wirtsorganismen für die erfindungsgemäß verwendete Nukleinsäure oder dem Nukleinsäurekonstrukt kommen prinzipiell alle prokaryontischen oder euka- ryontischen Organismen in Frage. Vorteilhafterweise werden als Wirtsorganismen Mikroorganismen wie Bakterien, Pilze oder Hefen verwendet. Vorteilhaft werden grampositive oder gram-negative Bakterien, bevorzugt Bakterien der Familien Enterobacte- riaceae, Pseudomonadaceae, Rhizobiaceae, Streptomycetaceae oder Nocardiaceae, besonders bevorzugt Bakterien der Gattungen Escherichia, Pseudomonas, Streptomy- ces, Nocardia, Burkholderia, Salmonella, Agrobacterium oder Rhodococcus verwendet.

Die im Herstellverfahren für Fusionsproteine verwendeten Organismen werden je nach Wirtsorganismus in dem Fachmann bekannter Weise angezogen bzw. gezüchtet. Mikroorganismen werden in der Regel in einem flüssigen Medium, das eine Kohlenstoffquelle meist in Form von Zuckern, eine Stickstoffquelle meist in Form von organischen Stickstoffquellen wie Hefeextrakt oder Salzen wie Ammoniumsulfat, Spurenelemente wie Eisen-, Mangan- und Magnesiumsalze sowie gegebenenfalls Vitamine enthält, bei Temperaturen zwischen 0 und100 ⁰ C, bevorzugt zwischen 10 bis 60 ⁰ C unter Sauerstoffbegasung angezogen. Dabei kann der pH-Wert der Nährflüssigkeit auf einem festen Wert gehalten werden, das heißt während der Anzucht reguliert werden oder nicht. Die Anzucht kann "batch"-weise, "semi-batch"-weise oder kontinuierlich erfolgen. Nährstoffe können zu Beginn der Fermentation vorgelegt oder semikontinuierlich oder kontinuierlich nachgefüttert werden. Die Enzyme können nach dem in den Beispielen beschriebenen Verfahren aus den Organismen isoliert werden oder als Rohextrakt für die Reaktion verwendet werden.

Die erfindungsgemäß verwendeten Polypeptide oder funktionelle, biologisch aktive Fragmente davon können mittels eines rekombinanten Verfahrens hergestellt werden, bei dem man einen Polypeptide-produzierenden Mikroorganismus kultiviert, gegebenenfalls die Expression der Polypeptide induziert und diese aus der Kultur isoliert. Die Polypeptide können so auch in großtechnischem Maßstab produziert werden, falls dies erwünscht ist. Der rekombinante Mikroorganismus kann nach bekannten Verfahren kultiviert und fermentiert werden. Bakterien können beispielsweise in TB-oder LB- Medium und bei einer Temperatur von 20 bis 40 ⁰ C und einem pH-Wert von 6 bis 9 vermehrt werden. Geeignete Kultivierungsbedingungen werden beispielsweise in T. Maniatis, E. F. Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning : A Laboratory Manual, CoId Spring Harbor Laboratory, CoId Spring Harbor, NY (1989) beschrieben.

Die Zellen werden dann, falls die Polypeptide nicht in das Kulturmedium sezerniert werden, aufgeschlossen und das Produkt nach bekannten Proteinisolierungsverfahren aus dem Lysat gewonnen. Die Zellen können wahlweise durch hochfrequenten Ultraschall, durch hohen Druck, wie z. B. in einer French-Druckzelle, durch Osmolyse, durch Einwirkung von Detergenzien, lytischen Enzymen oder organischen Lösungsmit-

teln, durch Homogenisatoren oder durch Kombination mehrerer der aufgeführten Verfahren aufgeschlossen werden.

Eine Aufreinigung der Polypeptide kann mit bekannten, chromatographischen Verfahren erzielt werden, wie Molekularsieb-Chromatographie (Gelfiltration), wie Q- Sepharo- se-Chromatographie, lonenaustausch-Chromatographie und hydrophobe Chromatographie, sowie mit anderen üblichen Verfahren wie Ultrafiltration, Kristallisati- on, Aussalzen, Dialyse und nativerGelelektrophorese. Geeignete Verfahren werden beispielsweise in Cooper, F. G., Biochemische Arbeitsmethoden, Verlag Water de Gruy- ter, Berlin, New York oder in Scopes, R., Protein Purification, Springer Verlag, New York, Heidelberg, Berlin beschrieben.

Vorteilhaft kann es sein, zur Isolierung des rekombinanten Proteins Vektorsysteme oder Oligonukleotide zu verwenden, die die cDNA um bestimmte Nukleotidsequenzen verlängern und damit für veränderte Polypeptide oder Fusionsproteine kodieren, die beispielsweise einer einfacheren Reinigung dienen. Derartige geeignete Modifikationen umfassen als Anker fungierende sogenannte "Tags", wie beispielsweise die als Hexa- Histidin-Anker bekannte Modifikation oder Epitope, die als Antigene von Antikörpern erkannt werden können (beschrieben zum Beispiel in Harlow, E. and Lane, D., 1988, Antibodies : A Laboratory Manual. CoId Spring Harbor (N. Y. ) Press). Weitere geeignete Tags sind z.B. HA, Calmodulin-BD, GST, MBD; Chitin-BD, Steptavidin-BD-Avi- Tag, Flag-Tag, T7 etc. Diese Anker können zur Anheftung der Proteine an einen festen Träger, wie z. B. einer Polymermatrix, dienen, die beispielsweise in einer Chromatographiesäule eingefüllt sein kann, oder an einer Mikrotiterplatte oder an einem sonstigen Träger verwendet werden kann. Die entsprechenden Reinigungsprotokolle sind von den kommerziellen Affinitäts-Tag-Anbietern erhältlich.

Die wie beschrieben hergestellten Proteine können sowohl direkt als Fusionsproteine als auch nach Abspaltung und Abtrennung des Fusionspartners als „reine" Hydrophobine verwendet werden.

Wenn eine Abtrennung des Fusionspartners vorgesehen ist, empfiehlt es sich eine potentielle Spaltstelle (spezifische Erkennungsstelle für Proteasen) in das Fusionsprotein zwischen Hydrophobinteil und Fusionspartnerteil einzubauen. Als Spaltstelle geeignet sind insbesondere solche Peptidsequenzen geeignet, die ansonsten weder im Hydrophobinteil noch im Fusionspartnerteil vorkommen, was sich mit bioinformatischen Tools leicht ermitteln lässt. Besonders geeignet sind beispielsweise BrCN-Spaltung an Methionin oder durch Protease vermittelte Spaltung mit Faktor Xa-, Enterokinase-, Thrombin, TEV-Spaltung (Tobacca etch virus Protease).

Bei den erfindungsgemäß mit Hydrophobinen zu behandelnden Oberflächen handelt es sich um die Oberfläche eines Materials ausgewählt aus der Gruppe von gehärteten

mineralischen Baustoffen, Naturstein, Kunststein oder Keramik. Derartige Oberflächen sind insbesondere im Baubereich, sowohl im Innen- wie im Außenbereich zu finden.

Unter „gehärteten mineralischen Baustoffen" im Sinne dieser Erfindung sind steinartige Massen zu verstehen, welche durch Mischen von im Wesentlichen anorganischen Baustoffen mit Wasser gefolgt von Härtung aufgrund chemischer und/oder physikalischer Reaktionen erhältlich sind. Bei den Ausgangsmaterialien kann es sich um hydraulisch härtende Baustoffe, die sowohl an Luft wie auch im Wasser erhärten, oder um lufthärtende Baustoffe handeln, die nur an Luft erhärten. Weiterhin kann es sich beispielsweise um dampfgehärtete Baustoffe handeln.

Beispiele derartiger gehärteter Baustoffe umfassen insbesondere Beton oder Mörtel welche aus Zementen, wie Portlandzement, Tonerdzement oder Puzzolanzement und deren Mischungen mit groben Zuschlägen wie Sand, Kies, Schotter oder geblähten Stoffen sowie Wasser erhältlich sind. Sie können in bekannter Art und Weise noch weitere anorganische und/oder organische Hilfsstoffe, wie beispielsweise Betonverflüssi- ger umfassen. Weitere Beispiele gehärteter Baustoffe umfassen Gips, Kalk oder Putze für den Innen- und Außenbereich.

Bei Natursteinen handelt es sich um natürlich vorkommende Gesteine wie Sandstein, Granit, Gneis, Schiefer, Kalk oder Marmor. Diese können sowohl als Bruchsteine in unregelmäßiger Form oder aber auch in Form ausgeformter Bauteile eingesetzt werden, beispielsweise als Mauersteine, Fensterbänke, Treppenstufen, Brüstungen, Türpfosten, Platten zur Verkleidung, Bodenplatten, Dachplatten, dekorative Elemente oder Skulpturen.

Bei Kunststeinen handelt es sich um Bauteile, die analog Natursteinen eingesetzt werden können, die aber nicht aus natürlich Quellen stammen, sondern im Regelfalle industriell gefertigt werden. Beispiele umfassen Ziegel, Klinker, Kalksandsteine, Betonsteine, Gasbetonsteine oder Blähtonblöcke.

Der Begriff „Keramik" ist dem Fachmann prinzipiell bekannt. Es handelt sich hierbei um eine Sammelbezeichnung für Erzeugnisse, die aus nichtmetallischen anorganischen Verbindungen aufgebaut sind und normalerweise durch Hochtemperaturprozesse gebrauchsfertig gemacht werden.

Es kann sich bei Keramiken um tonkeramische Werkstoffe handeln, welche mindestens 20 Gew. % Tonmineral in der Rohmischung aufweisen sowie um sonderkeramische Werkstoffe, welche entweder tonmineralfrei sind oder nur einen geringen Tonmineralgehalt aufweisen. Es kann sich um feinkeramische oder grobkeramische Werkstoffe handeln, sowie um poröse oder dichte Werkstoffe. Keramische Werkstoffe kön-

nen in prinzipiell bekannter Art und Weise Glasuren aufweisen. Die Glasuren können auch farbig sein.

Beispiele tonkeramischer Werkstoffe umfassen baukeramische Erzeugnisse wie Backsteine oder Klinker, Tonrohre, Schamottsteine, Dachziegel, Töpferwaren, Tonsteingut, Kalksteingut, Feldspatsteingut, Steinzeug, Hartporzellan, Weichporzellan oder Fliesen, die selbstverständlich auch lasiert sein können.

Beispiele sonderkeramischer Erzeugnisse umfassen Silikasteine, tongebundenes SiIi- ciumcarbid, schmelzgegossene Steine, oxidkeramsiche Isolierstoffe, keramische Filter, carbidkeramische Werkstoffe, Elektrokeramik, Magnetokeramik oder Dentalkeramik.

Weitere Einzelheiten zu Keramiken können beispielsweise Büchner et al., „Industrielle Anorganische Chemie", VCH Verlag, Weinheim, New York 1986, S. 431 bis 476 entnommen werden.

Selbstverständlich können die Oberflächen aus mehreren, verschiedenen Materialien zusammengesetzt sein. Als Beispiel sei auf eine geflieste Wand verwiesen, welche eine Oberfläche aus Keramikfliesen sowie Fugenmörtel umfasst. Die Oberflächen können auch andersartige Materialien, wie beispielsweise eingelassene Metallteile umfassen.

Zur erfindungsgemäßen Verwendung von Hydrophobinen zur Behandlung der besagten Oberflächen können die Hydrophobine in Substanz verwendet werden. Bevorzugt werden die Hydrophobine aber als Formulierungen bzw. Zusammensetzungen in mindestens einem geeigneten Lösemittel eingesetzt.

Die Auswahl der Hydrophobine zur Ausführung der Erfindung ist nicht beschränkt. Es können ein Hydrophobin oder auch mehrere verschiedene eingesetzt werden. Der Fachmann trifft eine geeignete Auswahl. Beispielsweise können Fusionsproteine, wie beispielsweise yaad-Xa-dewA-his (SEQ ID NO: 19) oder yaad-Xa-rodA-his (SEQ ID NO: 21) eingesetzt werden, wobei der yaad - Fusionspartner auch verkürzt sein kann.

Bei den Lösemitteln für Formulierungen kann es sich um Wasser und/oder organische Lösemittel handeln. Selbstverständlich können auch Lösemittelgemische eingesetzt werden. Die Art des Lösemittels richtet sich beispielsweise nach dem Hydrophobin, der Art der zu behandelnden Oberfläche sowie der Anwendung und wird vom Fachmann entsprechend gewählt.

Bevorzugt handelt es sich bei dem Lösemittel um Wasser oder Gemische aus Wasser und mit Wasser mischbaren, organischen Lösemitteln. Beispiele derartiger organischer Lösemittel umfassen mit Wasser mischbare einwertige oder mehrwertige Alkohole, wie

beispielsweise Methanol, Ethanol, n-Propanol, i-Propanol, Ethylenglykol, Propylengly- kol oder Glycerin. Weiterhin kann es sich auch um Etheralkohole handeln. Beispiele umfassen Monoalkylether von (Poly)ethylen- oder (Poly)propylenglykolen wie Ethylen- glykolmonobutylether. Art und Menge der wasserlöslichen, organischen Lösemittel werden vom Fachmann gewählt.

Zur Herstellung der erfindungsgemäß verwendeten Zusammensetzung können bevorzugt die bei der Synthese, Isolierung und/oder Reinigung der Hydrophobine erhaltenen wässrigen Lösungen der Hydrophobine eingesetzt werden. Diese können je nach Reinheit noch Reste von Hilfsstoffen aus der Synthese enthalten. Selbstverständlich können die Hydrophobine aber auch zunächst als Substanz isoliert werden, beispielsweise durch Gefriertrocknen, und erst in einem zweiten Schritt formuliert werden.

Die Menge der Hydrophobine in der Formulierung kann vom Fachmann je nach der Art der Oberfläche und/oder der Anwendung bestimmt werden. Es sind aber schon relativ kleine Mengen ausreichend, um eine Wirkung, d.h. eine Veränderung der Eigenschaften der Oberfläche zu erzielen. Bewährt hat sich eine Menge von 0,0001 bis 1 Gew. % bezüglich der Summe aller Bestandteile der Formulierung, ohne dass die Erfindung damit auf diesen Bereich beschränkt sein soll. Bevorzugt beträgt die Menge von 0,0005 bis 0,5 Gew. % und besonders bevorzugt 0,001 bis 0,1 Gew. %.

Die Formulierung kann optional darüber hinaus noch weitere Komponenten, beispielsweise Zusatzstoffe und/oder Hilfsmittel umfassen. Beispiele derartiger Komponenten umfassen insbesondere Tenside, wie beispielsweise anionische, nichtionische, ampho- tere und/oder kationische Tenside. Beispiele weiterer Zusatzstoffe umfassen Säuren oder Basen, beispielsweise Carbonäuren oder Ammoniak, Puffersysteme, Polymere, anorganische Partikel wie SiO ₂ oder Silikate, Farbstoffe oder Biozide.

Erfindungsgemäß wird die Behandlung der Oberflächen vorgenommen, indem man die Oberfläche mit Hydrophobin oder einer Zusammensetzung umfassend mindestens ein Hydrophobin sowie mindestens ein Lösemittel in Kontakt bringt.

Das „In-Kontakt-Bringen" kann beispielsweise durch Besprühen, Aufstreichen oder Aufwalzen erfolgen oder auch durch Eintauchen des gesamten Gegenstandes in die Formulierung. Letzteres ist naturgemäß nur bei nicht eingebauten Gegenständen möglich. Die Behandlungsdauer wird vom Fachmann festgelegt. Sie kann wenige Sekunden bis zu mehreren Stunden dauern. Die Oberfläche kann nach der Behandlung zur Entfernung überschüssiger Behandlungslösung nachgespült werden, beispielsweise mit Wasser.

Die Behandlung kann auch in Kombination mit einer Reinigung der Oberfläche erfolgen. Hierzu wird ein Reinigungsmittel eingesetzt, welches mindestens ein Hydropho- bin, mindestens ein Tensid sowie mindestens ein Lösemittel umfasst.

Die Behandlung kann bei Temperaturen unterhalb von Raumtemperatur, bei Raumtemperatur oder bei erhöhten Temperaturen vorgenommen werden, beispielsweise bei 20 bis 100 ⁰ C, bevorzugt 20 bis 60 ⁰ C.

Nach dem Behandeln mit der Zusammensetzung wird die behandelte Oberfläche getrocknet. Das Trocknen der behandelten Oberfläche kann, quasi von selbst, bei Raumtemperatur erfolgen, oder es kann auch bei erhöhten Temperaturen getrocknet werden.

An die Behandlung sowie ggf. das Trocknen der Oberfläche kann sich eine thermische Nachbehandlung der Oberfläche bei erhöhten Temperaturen, beispielsweise bei Temperaturen von bis zu 120 ⁰ C anschließen. Die thermische Nachbehandlung kann natürlich auch kombiniert mit der Trocknung vorgenommen werden. Bevorzugt betragen die Temperaturen bei einer thermischen Nachbehandlung 30 bis 100°C, besonders bevorzugt 40 bis 8O ⁰ C und beispielsweise 50 bis 70°C. Die Behandlungsdauer wird vom Fachmann festgelegt, sie kann beispielsweise von 1 min bis 10 h betragen. Die thermische Nachbehandlung kann je nach der Art der Behandlung beispielsweise durch Bestrahlen der Oberfläche mit einem IR-Strahler oder Anblasen mit warmen Luftströmen erfolgen.

Durch das erfindungsgemäße Verfahren ist eine Oberfläche ausgewählt aus der Gruppe von gehärteten mineralischen Baustoffen, Naturstein, Kunststein oder Keramiken erhältlich, die eine mindestens ein Hydrophobin umfassende Beschichtung aufweist. Bei der Beschichtung handelt es sich in der Regel mindestens um eine monomolekulare Schicht des Hydrophobins auf der Oberfläche.

Durch die erfindungsgemäße Behandlung wird zumindestens eine schmutzabweisende und/oder hydrophobierende und/oder konservierende Wirkung erzielt. Im Regelfalle werden mindestens zwei der Vorteile, insbesondere eine kombinierte Hydrophobierung und Schmutzabweisung erzielt. Die Hydrophobine weisen bereits in geringen Mengen eine deutliche Wirkung auf. Im Regelfalle führt bereits die Behandlung mit einer nur 0,01 Gew. % Hydrophobine enthaltenden Zusammensetzung zu einer wirksamen Veränderung der Oberfläche.

Die schmutzabweisende Wirkung kann mittels prinzipiell bekannter Methoden bestimmt werden, beispielsweise, indem man die Ablösbarkeit von Schmutz durch Abspülen mit Wasser von einer unbehandelten und einer mit Hydrophobinen behandelten Oberflä-

che vergleicht. Die Hydrophobierung kann in bekannter Art und Weise durch Messung des Kontaktwinkels bestimmt werden.

Die erfindungsgemäße Behandlung eignet sich besonders vorteilhaft für keramische Oberflächen, wie beispielsweise für Fliesen, auf denen sowohl eine schmutzabweisende und eine hydrophobierende Wirkung erzielt werden. Dies ist insbesondere in Feuchträumen, wie beispielsweise Badezimmern ein wesentlicher Vorteil.

Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern:

Teil A:

Herstellung und Test der erfindunqsqemäß verwendeten Hvdrophobine

Beispiel 1

Vorarbeiten für die Klonierung von vaad-His _R / vaaE-Hisg

Mit Hilfe der Oligonukleotide Hal570 und Hal571 (HaI 572/ HaI 573) wurde eine Polymerase Kettenreaktion durchgeführt. Als Template DNA wurde genomische DNA des Bakteriums Bacillus subtilis verwendet. Das erhaltene PCR Fragment enthielt die codierende Sequenz des Gens yaaD / yaaE aus Bacillus subtilis, und an den Enden je eine Ncol bzw. BgIII Restriktionsschnittstelle. Das PCR Fragment wurde gereinigt und mit den Restriktionsendonukleasen Ncol und BgIII geschnitten. Dieses DNA Fragment wurde als Insert verwendet, und in den zuvor mit den Restriktionsendonukleasen Ncol und BgIII linearisierten Vektor pQE60 der Firma Qiagen kloniert. Die so enstandenen Vektoren pQE60YAAD#2 / pQE60YaaE#5 können zur Expression von Proteinen bestehend aus, YAAD::HIS ₆ bzw. YAAE::HIS ₆ verwendet werden.

Hal570: gcgcgcccatggctcaaacaggtactga Hal571 : gcagatctccagccgcgttcttgcatac Hal572: ggccatgggattaacaataggtgtactagg Hal573: gcagatcttacaagtgccttttgcttatattcc

Beispiel 2

Klonierung von vaad-Hvdrophobin DewA-Hisg

Mit Hilfe der Oligonukleotide KaM 416 und KaM 417 wurde eine Polymerase Kettenreaktion durchgeführt. Als Template DNA wurde genomische DNA des Schimmelpilzes Aspergillus nidulans verwendet. Das erhaltene PCR Fragment enthielt die codierende Sequenz des Hydrophobin Gens dewA und einer N-Terminalen FaktorXa Proteinase Schnittstelle. Das PCR Fragment wurde gereinigt und mit der Restriktionsendonuklea- se BamHI geschnitten. Dieses DNA Fragment wurde als Insert verwendet, und in den

zuvor mit der Restriktionsendonuklease BgIII linearisierten Vektor pQE60YAAD#2 klo- niert.

Der so enstandene Vektor #508 kann zur Expressions eines Fusionsproteins bestehend aus, YAAD::Xa::dewA::HIS ₆ verwendet werden.

KaM416: GCAGCCCATCAGGGATCCCTCAGCCTTGGTACCAGCGC KaM417: CCCGTAGCTAGTGGATCCATTGAAGGCCGCAT- GAAGTTCTCCGTCTCCGC

Beispiel 3

Klonierunq von vaad-Hvdrophobin RodA-Hisg

Die Klonierung des Plasmids #513 erfolgte analog zu Plasmid #508 unter Verwendung der Oligonukleotide KaM 434 und KaM 435.

KaM434: GCTAAGCGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCATTGCTGC KaM435: CCAATGGGGATCCGAGGATGGAGCCAAGGG

Beispiel 4

Klonierunq von väad-Hvdrophobin BASFI -HJSR

Die Klonierung des Plasmids #507 erfolgte analog zu Plasmid #508 unter Verwendung der Oligonukleotide KaM 417 und KaM 418.

Als Template DNA wurde ein künstlich synthetisierte DNA Sequenz - Hydrophobin BASF1 -eingesetzt (siehe Anhang).

KaM417:CCCGTAGCTAGTGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCGTCTCCG

C

KaM418: CTGCCATTCAGGGGATCCCATATGGAGGAGGGAGACAG

Beispiel 5

Klonierunq von vaad-Hvdrophobin BASF2-HJSR

Die Klonierung des Plasmids #506 erfolgte analog zu Plasmid #508 unter Verwendung der Oligonukleotide KaM 417 und KaM 418.

Als Template DNA wurde ein künstlich synthetisierte DNA Sequenz - Hydrophobin BASF2 -eingesetzt (siehe Anhang).

KaM417:CCCGTAGCTAGTGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCGTCTCCG

C

KaM418: CTGCCATTCAGGGGATCCCATATGGAGGAGGGAGACAG

Beispiel 6

Kloπierung von yaad-Hvdrophobin SC3-HiSg

Die Klonierung des Plasmids #526 erfolgte analog zu Plasmid #508 unter Verwendung der Oligonukleotide KaM464 und KaM465.

Als Template DNA wurde cDNA von Schyzophyllum commune eingesetzt (siehe Anhang).

KaM464: CGTTAAGGATCCGAGGATGTTGATGGGGGTGC KaM465: GCTAACAGATCTATGTTCGCCCGTCTCCCCGTCGT

Beispiel 7

Fermentation des rekombinanten E. coli Stammes vaad-Hvdrophobin DewA-HiSg

Inokulation von 3ml LB Flüssigmedium mit einem yaad-Hydrophobin DewA-His ₆ expri- mierenden E.coli Stamm in 15ml Greiner Röhrchen. Inkubation für 8h bei 37°C auf einem Schüttler mit 200 UpM. Je 2 11 Erlenmeyer Kolben mit Schikanen und 250ml LB Medium (+ 100μg/ml Ampicillin) werden mit jeweils 1ml der Vorkultur angeimpft und 9h bei 37 ^C C auf einem Schüttler mit 180 UpM inkubiert.

13.51 LB-Medium (+100μg/ml Ampicillin) in einem 2Ol Fermenter mit 0,51 Vorkultur (OD ₆ oo _nm 1 :10 gegen H ₂ O gemessen) animpfen. Bei einer OD ₆ o _nm von -3.5 Zugabe von 140ml 10OmM IPTG. Nach 3h Fermenter auf 10 ^c C abkühlen und Fermentationsbrühe abzentrifugieren. Zellpellet zur weiteren Aufreinigung verwenden.

Beispiel 8

Reinigung des rekombinanten Hydrohobin-Fusionsproteins

(Reinigung von Hydrophobin-Fusionsproteinen, die ein C-terminales His6-tag besitzen)

100 g Zellpellet (100 - 500 mg Hydrophobin) werden mit 50 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,5 auf 200 ml Gesamtvolumen aufgefüllt und resuspendiert. Die Suspension wird mit einem Ultraturrax Typ T25 (Janke und Kunkel; IKA-Labortechnik) für 10 Minuten behandelt und anschliessend für 1 Stunde bei Raumtemperatur mit 500 Einheiten Benzonase (Merck, Darmstadt; Best.-Nr. 1.01697.0001 ) zum Abbau der Nukleinsäuren inkubiert. Vor dem Zellaufschluss wird mit einer Glaskartusche (P1) filtriert. Zum Zellaufschluß und für das Scheren der restlichen genomischen DNA werden zwei Homogenisatorläufe bei 1.500 bar durchgeführt (Microfluidizer M-110EH; Microfluidics Corp.). Das Homogenisat wird zentrifugiert (Sorvall RC-5B, GSA-Rotor, 250 ml Zentrifugenbecher, 60 Minuten, 4°C, 12.000 Upm, 23.000 g), der Überstand auf Eis gestellt und das Pellet in 100 ml Natriumphosphatpuffer, pH 7,5 resuspendiert. Zentrifugation und Resuspendieren werden dreimal wiederholt, wobei der Natriumphosphatpuffer bei der dritten Wiederholung 1 % SDS enthält. Nach der Resuspension wird für eine Stun-

de gerührt und eine abschliessende Zentrifugation durchgeführt (Sorvall RC-5B, GSA- Rotor, 250 ml Zentrifugenbecher, 60 Minuten, 4°C, 12.000 Upm, 23.000 g). Gemäß SDS-PAGE Analyse ist das Hydrophobin nach der abschliessenden Zentrifugation im Überstand enthalten (Abbildung 1 ). Die Versuche zeigen, dass das Hydrophobin wahrscheinlich in Form von Einschlusskörpern in den entsprechenden E. coli Zellen enthalten ist. 50 ml des Hydrophobin-enthaltenden Überstandes werden auf eine 50 ml Ni- ckel-Sepharose High Performance 17-5268-02 Säule aufgetragen (Amersham), die mit 50 mM Tris-Cl pH 8,0 Puffer äquilibriert wurde. Die Säule wird mit 50 mM Tris-Cl pH 8,0 Puffer gewaschen und das Hydrophobin anschliessend mit 50 mM Tris-Cl pH 8,0 Puffer, der 200 mM Imidazol enthält, eluiert. Zur Entfernung des Imidazols wird die Lösung gegen 50 mM Tris-Cl pH 8,0 Puffer dialysiert.

Abbildung 1 zeigt die Reinigung des hergestellten Hydrophobins:

Spur 1 : Auftrag Nickel-Sepharose Säule (1 :10 Verdünnung)

Spur 2: Durchlauf = Eluat Waschschritt

Spuren 3 - 5: OD 280 Maxima der Elutionsfraktionen

Das Hydrophobin der Abbildung 1 besitzt ein Molekulargewicht von ca. 53 kD. Die kleineren Banden repräsentieren zum Teil Abbauprodukte des Hydrophobins.

Beispiel 9

Technische Prüfung; Charakterisierung des Hvdrophobins durch Kontaktwinkelände- rung eines Wassertropfens auf Glas

Substrat:

Glas (Fensterglas, Süddeutsche Glas, Mannheim): Konzentration Hydrophobin: 100 μg/mL

Inkubation von Glasplättchen über Nacht (Temperatur 80 ⁰ C) in 5OmM Na-Acetat pH 4 + 0,1 % Tween 20 danach Glasplättchen mit Hydrophobin - Beschichtung waschen in destilliertem Wasser danach Inkubation 10min / 80 ⁰ C / 1% SDS-Lösung in dest. Wasser Waschen in dest. Wasser

Die Proben werden an der Luft getrocknet und der Kontaktwinkel (in Grad) eines Tropfens von 5 μl Wasser bestimmt.

Die Kontaktwinkelmessung wurde auf einem Gerät Dataphysics Contact Angle System OCA 15+, Software SCA 20.2.0. (November 2002) bestimmt. Die Messung erfolgte gemäss den Herstellerangaben.

Unbehandeltes Glas ergab einen Kontaktwinkel von 30 ± 5°; eine Beschichtung mit dem funktionellen Hydrophobin gemäss Beispiel 8 (yaad-dewA-his ₆ ) ergab Kontaktwinkel von 75 ± 5°.

Teil B:

Verwendung der Hvdrophobine zur schmutzabweisenden Beschichtung von keramischen Oberflächen

Verwendete Lösung:

Für die anwendungstechnischen Versuche wurde eine Lösung des gemäß Beispiel 8 hergestellten Fusionsproteines yaad-Xa-dewA-his (SEQ ID NO: 19) in Wasser eingesetzt. Konzentration des Hydrophobins in Lösung: 100 μg/ml (0,01 Gew. %).

Verwendete keramische Oberfläche:

Keramikfliese, weiss glänzend, 10 cm x 15 cm (Fa. Novocker), mit Ethanol und Wasser abgewischt.

Verwendeter Schmutz:

Für die Tests wurde IKW-Ballastschmutz verwendet (gemäß Seifen, Fette, Öle, Wachse (SÖFW) -Journal, 124. Jg., 14/98, S. 1029)

Durchführung der Behandlung

Auf eine Fliese wurden 2 g der oben erwähnten, wässrigen Hydrophobinlösung mit einer Konzentration von 100 μg/ml aufgetropft (1,3 μm Hydrophobin/cm ² ) und mit einem Tuch leicht verrieben, so dass die gesamte Oberfläche bedeckt war. Die Fliese wurde daraufhin liegend für 24 h an Luft getrocknet.

Anschließend wurde die Fliese mit Wasser abgespült und für 3x10 min in ein Becherglas mit Wasser gestellt. Für jedes Spülen wurde frisches Wasser verwendet. Die Fliese wurde dann stehend an Luft getrocknet.

Kontaktwinkelmessung und schmutzabweisende Wirkung

Auf der behandelten Fliese wurde mit einem Wassertropfen ein Kontaktwinkel von 56° gemessen (Mittelwert aus 10 Messungen). Eine unbehandelte Fliese im Vergleich zeigt einen Kontaktwinkel von 20°. Die Fliese wurde also deutlich hydrophobiert.

Auf die behandelte Fliese und zum Vergleich auch auf eine unbehandelte wurden mit einer Transferpipette jeweils 50, 100 und 200 μg IKW-Ballastschmutz punktförmig aufgetragen und für eine h bei Raumtemperatur getrocknet.

Die Fliesen wurden dann 3 x mit jeweils 500 ml Wasser gespült. Während sich von der unbehandelten Oberfläche der Schmutz dabei nicht ablöste, konnte von der mit Hydrophobin vorbehandelten Kachel eine teilweise Schmutzablösung beobachtet werden.

Die Vorbehandlung der Fliese mit Hydrophobin führte somit zu einer geringeren Schmutzhaftung und zu einer Hydrophobierung der keramischen Oberfläche.

Zuordnung der Sequenznamen zu DNA- und Polypeptidsequenzen im Sequenzprotokoll