本发明涉及羟基苯并吡喃酮类化合物的用途。 本发明化合物适用于预防和治 疗慢性粒细胞性白血病。本发明还涉及包含这 些化合物的药物组合物， 并且涉及 使用所述化合物， 单独使用或与其他药剂联合使用， 治疗慢性粒细胞性白血病。 背景技术

雌激素是由体内内分泌系统产生的一种类固醇 激素，在生殖系统、心血管系 统、 中枢神经系统、免疫系统和骨骼系统中都发挥 着重要的作用。近年来的研究 表明， 雌激素通过细胞核途径和细胞膜途径两种信号 转导通路发挥生物效应； 雌 激素及其受体信号转导系统广泛参与体内多个 系统组织中细胞生长、分化和凋亡 过程。 已有大量研究证实雌激素受体 ER-ct存在于白血病患者的白血病细胞中， 且其受体表达水平与临床治疗预后存在相关性 ； ER-ct介导的信号转导途径很可 能参与了白血病的形成和发展过程。

目前研究证实雌激素受体分为 α和 β两种亚型； 其中 ER-ct包括三个同源异 构体 ER-a66、 ER-a46和 ER-a36。 异构体 ER-a36从位于 ER-a66基因的第一个 内含子中的启动子开始转录，利用 ER-(x66的部分外显子进行编码。因此， ER-CL36 缺失两个转录功能区， 保留了 DNA结合功能区和二聚化功能区； 更为重要的是 ER-a36 的激素配体结合区缺失了部分螺旋区， 从而完全改变了其与激素配体结 合的专一性和亲和力。 ER-CL36 主要分布于细胞膜和细胞浆中， 少量存在于细胞 核中。 ER-CL36可以通过雌激素的细胞膜信号转导途径� �节细胞生长和凋亡 (1. ZY, Wang; XT, Zhang; P, Shen; BW, Loggie; YC, Chang; TF, Deuel. A variant of estrogen receptor-α, hER-a36： Transduction of estrogen- and antiestrogen- dependent membrane-initiated mitogenic signaling. PNAS. 2006, 103(24):9063-9068. 2. LMJ, Lee; J, Cao; H, Deng; P, Chen; Z, Gatalica; ZY, Wang. ER-a36, a novel variant of ER-α, is expressed in ER-positive and -negative human breast carcinomas. Anticancer Res. 2008, 28(lB):479-483)。 发明内容

本发明的化合物用作调节雌激素受体生物信息 系统，可以用于预防和治疗慢 性粒细胞性白血病。

本发明涉及式 (I)的化合物， 其药学上可接受的盐或药物组合物在制备改善 、 预防和治疗白血

(I)

其中，

R R ² 和 R ³ 彼此独立地选自氢、 甲基、 乙基、 丙基、 异丙基。

在本发明的一个特别优选实施方案中， 式 (I)的化合物是： 3，5，7-三羟基 -2-(4- 甲氧基苯基) -8-(3-甲基 -2-丁烯 -)-4H-苯并吡喃 -4-酮 （又名： 淫羊藿素， Icaritin), 也即式 (I)的化合物

(Π)

在本发明的一个特别优选实施方案中， 式 (I)的化合物是式 （Π) 化合物的去 甲基产物， 即式 (ΠΙ)所示的去甲基淫羊藿素： 3，5，7-三羟基 -2-(4-羟基苯基) -8- 3- 甲基 -2-丁烯 -)-4H-苯并吡喃 -4-酮。

(ΠΙ)

所述白血病是指慢性粒细胞性白血病 (Chronic myeloid leukemia, CML)。 所述的式 (I)化合物，及其药学上可接受的盐或药物组合 物， 在制备受雌激素 受体 ER-ct或 ER-β

(I)

其中，

R R ² 和 R ³ 彼此独立地选自氢、 甲基、 乙基、 丙基、 异丙基。

在本发明的一个特别优选实施方案中， 式 (I)的化合物是： 3，5，7-三羟基 -2-(4- 甲氧基苯基) -8-(3-甲基 -2-丁烯 -)-4H-苯并吡喃 -4-酮 （又名： 淫羊藿素， Icaritin), 也即式 (I)的化合物具 (Π)的结构：

在本发明的一个特别优选实施方案中， 式 (I)的化合物是式 （Π) 化合物的去 甲基产物， 即式 (ΠΙ)所示的去甲基淫羊藿素： 3，5，7-三羟基 -2-(4-羟基苯基) -8-(3- 甲基 -2-丁烯 -)-4H-苯并吡喃 -

(ΠΙ)

所述的式 ω、 （π)、 cm) 化合物， 及其药学上可接受的盐或药物组合物， 在制备受雌激素受体 ER-ct或 ER-β亚型调控的相关疾病的药物中的应用， 所述 ER-α亚型包括 ER-a36， ER-a46和 ER-a66。

所述式 (1)、 （Π)、 (III) 化合物， 及其药学上可接受的盐或药物组合物是作 为雌激素受体 ER-a和 ER-β亚型的调节剂。

术语"式 （I) 化合物"包括如这里定义的式 （I) 以及这化合物的所有实施方 案， 优选实施方案， 更优选实施方案以及特别优选实施方案， 包括有具体名称的 或实施例中公开的化合物，这些化合物的每个 都是通式定义的化合物的特别优选 实施方案。 关于"本发明的化合物"是指上述定义的式 （I) 中的任何化合物。

本发明还涉及到本发明的化合物的盐， 多晶型物， 溶剂化物和水合物。 这里 使用的术语"药学上可接受的盐"， 除非另有所述， 包括可以在本发明的化合物中 存在的盐。

用于本发明的动词"治疗"， 除非另有所述， 是指逆转、 减轻、 抑制疾病或病 症的过程， 或预防这样的疾病或病症。 这里使用的名词"治疗"是指治疗的行为， 其中的治疗如上面所定义。

本发明还涉及一种药物组合物， 所述的药物组合物包括式（I)的化合物和一 种药学上可接受的载体。 例如， 药物组合物可以以片剂、 胶囊、 丸剂、 粉末、 缓 释剂、 溶液、 悬浮液的形式口服给药； 药物组合物也可以以无菌液、 悬浮液或乳 液的形式肠胃外注射给药； 药物组合物也可以以软膏或霜膏的形式局部给 药； 药 物组合物也可以以栓剂的形式直肠给药。药物 组合物可以做成单位剂型， 其适于 精确剂量的单一给药。药物组合物包括常规的 药物载体或赋形剂和作为活性成分 的本发明的化合物。 另外， 药物组合物可以包括其它医学或药学制剂、 载体、 助 剂等等。

合适的药物载体包括惰性稀释剂或填料、 水和各种有机溶剂。 如果需要， 本 药物组合物可以含有其它的成分， 例如调味剂、 粘合剂、 赋形剂等等。 因此对于 口服给药， 片剂可以包含各种赋形剂， 例如可以使用柠檬酸和各种崩解剂例如淀 粉、 褐藻酸和某些复杂的硅酸盐和粘合剂例如蔗糖 、 明胶和阿拉伯胶。 另外， 经 常在片剂中使用润滑剂例如硬脂酸镁、十二烷 基硫酸钠和滑石粉。 固体组合物的 一个相似类型也可以使用软的和硬的填充胶囊 。优选的材料包括乳糖或奶糖和高 分子量的聚乙二醇。当希望通过可口服给予本 发明活性化合物时， 水悬浮液或酏 剂可以与各种增甜剂或调味剂、 色素或染料以及， 如果需要， 乳化剂或悬浮剂， 以及稀释剂例如水、 乙醇、 丙二醇、 甘油或其组合结合给药。

示范性的肠胃外给药形式包括活性化合物在无 菌水溶液中的溶液或悬浮液， 例如， 丙二醇或右旋糖水溶液。 如果需要， 这样的剂型可以适当地缓冲。 视情况 而定，本发明的含水组合物可以包括其它药学 上可接受的溶质， 包括添加剂及其 它药物。 合适的添加剂是本领域熟知的那些， 包括但不限于， 抗氧化剂、 抗菌药 物、 表面活性剂、 螯合剂、 糖、 以及防腐剂。 本发明的含水组合物可以通过注射 给药， 其中注射可以是肌肉注射、 静脉注射或皮下注射。

在给药的预定途径和标准药物操作方面， 本发明的化合物可以单独给药， 但 常常与本领域公知的合适的药物赋形剂、稀释 剂或载体一起给药。如果合适的话， 可以加入辅助剂， 所述的辅助剂包括防腐剂、 抗氧化剂、 调味剂、 或着色剂。 本 发明的化合物可以配制成合适的药物组合物， 以提供直接的、 延迟的、 改性的、 持久的、脉冲的或控制的释放， 取决于具体给药途径以及释放分布的特异性， 与 治疗需要相对应。

本发明的化合物可以按以下路线给药， 例如， 但不限于， 本领域公知的口服 (包括口腔、 舌下等等） 形式。 在这种情况下， "口服"是指口服给药方式， 其中 动物的口服使用量是明文规定的， 例如在食物或饮料中， 直接放入口腔中， 或者 是自由选择使用量。在本发明中， 术语"动物"是指动物界拥有适应性机能的温血 动物， 例如犬和人类。 典型的口服的固体形式可以包括片剂、 粉剂、 多微粒制剂 （颗粒）、 胶囊、 咀嚼剂、 锭剂、 膜剂、 贴片等等。 典型的口服液体（包括半固体和胶质）形式可 以包括溶液、 酏剂、 凝胶剂、 喷雾剂、 液体填充的咀嚼剂等等。 也可以使用其它 口服给药形式， 其中活性剂悬浮在液体或半固体载体相中， 例如悬浮液。

本发明的化合物还可以通过肠胃外给药。术语 肠胃外给药是指给药路线不通 过口腔。 优选对于本发明的化合物， 肠胃外给药可以包括局部和经皮、 直肠、 阴 道、 鼻腔、 吸入和注射给药 （需要通过针和无针方法渗透皮肤屏障的给药 方式， 包括植入物和储层）。

本发明的组合物包括片剂。 在一种优选实施方案中， 片剂通过选自直接压片 或湿、 干或熔融造粒、 熔融凝结方法和挤出的方法制备。 在另一个实施方案中， 本发明的组合物的片剂核部分可以是单层或多 层的，用本领域公知的合适包衣材 料进行包衣。

本发明化合物的口服液形式优选是溶液或悬浮 液， 其中活性化合物是充分溶 解或部分溶解的。在一种实施方案中， 溶液包含活性化合物和药学上有先例的适 于口服的溶剂。在一种优选实施方案中， 溶剂是一种对本发明的化合物显现出良 好溶解度的溶剂。这些溶剂通常占配方的主要 部分， 即大于 50% (按重量计算）， 优选大于 80%， 例如 95%。 在一种优选实施方案中， 溶液进一步包含辅助剂或 添加剂。 在其一种优选的实施方案中， 添加剂或辅助剂是一种掩味剂、 可口剂、 调味剂、 抗氧化剂、 稳定剂、 质地改性剂、 粘度调节剂和增溶剂。

另一个实施方案是制备本发明化合物的优选口 服液形式的方法， 其中在适宜 温度范围内，各个优选组分以一种有利于溶解 速度的方式任选通过机械搅拌或超 声波搅拌混合。

本发明化合物的制备从中药材原料中提取分离 得到。 本发明的化合物的 制备参照另一发明专利 "淫羊藿素的制备方法"（孟坤， CN 101302548A) 中所 述的方法， 自中药材淫羊藿中分离提取出化学成份淫羊藿 素， 也即本分明实施例 化合物。

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生物实验及测试

1. 化合物对 CML细胞的抑制增值和诱导凋亡效应： 用 MTT实验观察不同浓度的化合物对 K562细胞和来自 CML患者骨髓的原 代细胞的增殖抑制率， CML患者的骨髓细胞分为急变期和慢性期两种， 另采集 正常人骨髓细胞作为对照； 用流式细胞仪检测不同浓度化合物作用于 CML患者 骨髓的原代细胞后凋亡细胞的百分率。

2. 化合物对移植 K562细胞株的 NOD-SCID小鼠的治疗作用：

用无菌生理盐水调整 K562细胞浓度为 l x l0 ⁷ /ml，每只 NOD-SCID小鼠经尾 静脉注射 K562细胞 2x l0 ⁶ /0.2mL。 荷瘤小鼠随机分为四组； 空白对照组给予等 量溶剂； 阳性对照组给予 Imatinib ( Glivec, 格列卫） 50μ _§ / _{§ ;} 实验组分别给予 两个浓度的化合物。 每日一次给予荷瘤小鼠腹腔注射不同药物， 连续 45 日。 每 周检测小鼠外周血白细胞数和 CD45 ⁺ 白血病细胞数，小鼠死亡后通过 HE染色观 察小鼠脾的病理学变化， 并通过免疫组化检测小鼠脾脏白血病细胞 ERct-36受体 的表达。

3. 化合物对 K562细胞中 ERa-36受体表达的影响：

用流式细胞仪和间接免疫荧光显微镜检测无干 预和 8μΜ化合物作用后 Κ562 细胞中表达 ERa-36受体的细胞的比例， 用 Western blot方法检测不同浓度化合 物干预后 K562细胞中 ERa-36受体蛋白表达量情况。

实验结果表明， 具有式 （I ) 结构的化合物特别是式 （Π)， 能以浓度依赖性 的方式抑制 CML细胞增殖， 并以浓度依赖性的方式诱导 CML患者骨髓细胞发 生凋亡； 能明显降低外周血白细胞计数和 CD45+白血病细胞比例； 同时还能明显 减轻白血病小鼠的脾脏重量；还能以浓度依赖 性的方式抑制 K562细胞中 ERa-36 受体蛋白表达量， 因此表明式 （I ) 结构的化合物能治疗慢性粒细胞性白血病。 附图说明

图 1 化合物（Π)对 K562细胞的增殖抑制效应 MTT试验。

图 2 化合物（I I)对 19例 CML患者骨髓原代白血病细胞和 11例非血液肿瘤患者 骨髓单个核细胞的增殖抑制效应 MTT试验。

图 3 化合物（I I)对 CML患者骨髓原代白血病细胞凋亡率的影响 (与对照组相比 * P<0.05， ** P<0.01

图 4 化合物（I I)对小鼠外周血白细胞计数随生存时间变化的� ��响。

图中 IC 8为化合物 (Π)8μ _§ / _§ 组， IC 4为化合物 (Π)4μ _§ / _§ 组， Con为空白对照组， Ima 50为 Imatinib50 g/g组。

图 5 化合物（II)对小鼠外周血人 CD45抗原表达随生存时间变化的影响。

图中 IC 8为化合物 (II)8 g/g组， IC 4为化合物 (II)4 g/g组， Con为空白对照组， Ima

50为 Imatinib5(^g/g组。

图 6 化合物（II)对荷瘤小鼠脾脏大小的影响。

图中 Control为空白对照组， IC162 8为化合物 (II)8 g/g组， IC162 4为化合物 (II)4 g/g组， Ima 50为 Imatinib5(^g/g组。

图 7 化合物（II)对荷瘤小鼠脾脏平均重量的影响。

图中 Con为空白对照组， IC 8为化合物 (II)8 g/g组， IC 4为化合物 (II)4 g/g组， Ima 50为 Imatinib5(^g/g组 （与空白对照组比较， * P<0.05; 与阳性对照组比较， # P 〉0.05; 与化合物 (II)4 g/g组比较， △ P〉0.05)。

图 8 化合物（II)对荷瘤小鼠脾脏 ERct-36受体表达的影响。

其中 A、 B、 C和 D分别为空白对照组、 Imatinib5(^g/g组、 化合物 (II)4 g/g组 和化合物 (Π)8μ _§ / _§ 组。

图 9 化合物（II)对 Κ562细胞膜 ERct-36受体表达的影响。

图 10 化合物（II)对 K562细胞 ERct-36受体蛋白表达的影响。

具体实施方式

下面的实施例说明制备本发明的化合物和方法 。 应该理解， 本发明并不受下 面提供的具体内容的限制。

下面的实施例说 (Π)化合物的制备。

3，5，7-三羟基 -2-(4-甲氧基苯基) -8-(3-甲基 -2-丁烯基 -)-4H-苯并吡喃 -4-酮 （又名： 淫羊藿素， Icaritin; 在生物测试实验中又名 IC162和 IC)

该实施例化合物的制备参照另一发明专利 "淫羊藿素的制备方法"（孟坤， CN 101302548A)中所述的方法， 自中药材淫羊藿中分离提取出化学单体淫羊藿 素， 也即本发明实施例化合物。

实施例化合物的生物实验

前面已描述了本发明涉及式（I )的化合物或其药学上可接受的盐或药物组合 物适用于治疗慢性粒细胞性白血病。 现以实施例的化合物 (Π)为例， 对其进行详 细说明。

( 1)实施例化合物（Π)对 CML细胞的抑制增值和诱导凋亡效应：

本实验具体实验方法如前生物实验及测试部分 中实验 1 (化合物对 CML细 胞的抑制增值和诱导凋亡效应）所述。 除对 K562细胞周期的影响采用单一浓度 夕卜，其余实验中实施例化合物（Π)所用浓度 均为 0μΜ、4μΜ、8μΜ、 16μΜ、32μΜ、 64μΜ。

实验结果显示实施例化合物 (Π)能以浓度依赖性的方式抑制 CML细胞增殖， 并以浓度依赖性的方式诱导 CML患者骨髓细胞发生凋亡。 具体结果见图 1-3。

(2) 实施例化合物（I I)对移植 Κ562细胞株的 NOD-SCID小鼠的治疗作用：

本实验具体实验方法如前生物实验及测试部分 中实验 2 (化合物对移植 Κ562 细胞株的 NOD-SCID小鼠的治疗作用） 所述。 实施例化合物（I I)采用 4 g/g和 8μ _§ / _§ 两个剂量。

实验结果显示实施例化合物 (Π)能明显降低外周血白细胞计数和 CD45+白血 病细胞比例； 实施例化合物 (Π)能明显减少白血病小鼠的脾脏体积同时减� �白血 病小鼠的脾脏重量。 实验结果还显示空白对照组小鼠脾脏中 ERct-36受体表达较 多， 实施例化合物 (Π)处理后的小鼠脾脏则未见 ERct-36受体表达。具体结果如图 4-8， 图中 IC 8和 IC162 8表示实施例化合物 (n)8 g/g组， IC 4和 IC162 4表示实 施例化合物 (Ii ^g/g 组， Con 和 Control 表示空白对照组， Ima 50 表示 Imatinib50 g/g组。

(3) 实施例化合物（I I)对 K562细胞中 ERa-36受体表达的影响：

本实验具体实验方法如前生物实验及测试部分 中实验 3所述 (化合物对 K562 细胞中 ERa-36受体表达的影响）。实施例化合物（I I)采用 8μΜ浓度作用于 Κ562 细胞， 免疫荧光和流式细胞仪检测表达 ERa-36受体的细胞的比例。 实施例化合 物（Π)采用 0μΜ、4μΜ、8μΜ、 16μΜ、 32μΜ和 64μΜ浓度处理细胞， Western blot 方法检测细胞中 ERa-36表达情况。 实验结果显示 K562细胞膜存在 ERct-36受体强表达情况，实施例化合物（II) 能够显著降低 K562细胞膜 ERct-36受体的表达。 实施例化合物（Π)还能以浓度 依赖性的方式抑制 K562细胞中 ERct-36受体蛋白表达量。 具体结果见图 9-10。