La présente invention concerne le domaine du traitement et du diagnostic des maladies du système nerveux central, et s'intéresse plus particulièrement au passage et à la délivrance d'agents actifs thérapeutiques ou de diagnostic au niveau du système nerveux central.

Alors que le cancer et les problèmes cardio- vasculaires sont les principales causes de mortalité dans les pays développés, les maladies liées au système nerveux sont parmi les premiers facteurs qui exposent les populations à des problèmes de santé (morbidité).

Les progrès en biologie et en neurologie ont toutefois des difficultés à se concrétiser sous forme de nouveaux outils de diagnostic et de thérapeutique du système nerveux central (SNC), notamment parce qu'il sont particulièrement difficiles à administrer de manière efficace.

Il n'y a en effet pas de diffusion des substances et des nutriments depuis les capillaires sanguins au niveau de la moelle épinière et du cerveau comme au niveau des autres organes. Les échanges sont limités au niveau de la barrière hémato-encéphalique (BHE) et du plexus choroïde, où se forme le liquide céphalo rachidien (LCR). Celui-ci apporte les nutriments, les hormones et les leucocytes aux cellules du SNC. La BHE contrôle strictement la composition du milieu extracellulaire des neurones en limitant l'entrée de la plupart des substances présentes dans le sang et en en rejetant d'autres.

La délivrance de substances exogènes au SNC ne peut se faire par les voies systémiques conventionnelles de la thérapeutique, à l'exception des composés extrêmement lipophiles de faible poids

moléculaire ou de composés susceptibles d'un transport sélectif lié à la présence d'un transporteur ou à des phénomènes d'endocytose (Ikumi Tamai et al. Drug Delivery through the BBB, (1996) Advanced Drug Delivery Reviews 19 : 401-424). La plupart des médicaments utilisés en neuropsychiatrie à 1'heure actuelle comme par exemple la codéine, les benzodiazépines, la phénytoine, etc... sont des produits pharmaceutiques liposolubles qui traversent la BHE après administration orale (Oldendorf, W. H. Lipid solubility and drug penetration of the Blood- Brain-barrier (1974) Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 147 : 813- 816). L'entrée du glucose et de l'acide lactique, qui sont des substances polaires, ou de la L-Dopa (Nutt, J. G. et al. The"on-off"phenomenon in parkinson's disease.

Relation to levodopa absorption and transport. (1984) N.

Engl. J. Med. 310 : 483-488), aminoacide neutre servant au traitement de la maladie de Parkinson, sont liées à des transporteurs spécifiques. Certains transporteurs, comme la glycoprotéine-P, sont bidirectionnels (Knudsen, G. M. et al. Kinetic analysis of the human BBB transport of lactate and its influence by hypercapnia. (1991) Cerebral Blood Flow Metab. 11 : 581-586) et limitent l'entrée de drogues vers le cerveau.

La BHE exclut en particulier l'entrée des protéines et d'un grand nombre de peptides du plasma, à tel point que le fluide interstitiel du cerveau contient moins de 0,5% des protéines plasmatiques. Ainsi, les travaux réalisés en neurobiotechnologie sur de nombreux composés hydrophiles et/ou à haut poids moléculaire ayant un très fort potentiel en thérapeutique comme les peptides, les canaux ioniques, les récepteurs neuronaux, les facteurs neurotrophiques et les déterminants génétiques sont à ce jour limités dans leurs applications médicales du fait de leur difficulté d'administration au SNC comme xénobiotiques.

Pour pallier ces inconvénients, il a été proposé de rendre liposoluble une molécule donnée par transformation chimique (lipidisation). La lipidisation

est utilisée pour la fabrication de pro-drogues, analogues liposolubles de composés pharmacologiques hydrophiles capables de traverser les membranes biologiques. Toutefois, la BHE refoule vers le sang ce type de composé et leur demi-vie est extrêmement courte.

Pour cela, on développe en parallèle des systèmes de séquestration tissulaires, voire d'inhibition de la glycoprotéine-P (Ikumi Tamai et al. Drug Delivery through the BBB, (1996) Advanced Drug Delivery Reviews 19 : 401-424). Les modifications chimiques apportées à la molécule sont délicates et peuvent compromettre l'affinité au récepteur responsable de l'activité biologique. La lipidisation n'est utilisable que pour les molécules de poids moléculaire relativement faible (inférieur à 1.000, voire 600-800) soit au mieux les tetra-peptides et penta-peptides (Pardridge, W. M.

Peptide lipidization and liposomes. In Peptide Drug Delivery to the Brain pp 129-140 (1991) Raven Press, New York).

Les liposomes de petite taille (25-50 nm) pourraient présenter un intérêt pour la délivrance de produits biologiquement actifs au niveau central. Mais les liposomes de taille plus élevée (0,3-2 um) sont piégés dans l'espace vasculaire cérébral et présentent donc des risques d'embolie. Toutefois, les liposomes sont instables dans le cerveau, notamment à cause de la présence de l'enzyme lecithine-transférase au niveau des membranes neuronales et des cellules gliales (Pardridge, W. M. Peptide lipidization and liposomes. In Peptide Drug Delivery to the Brain pp 140-148 (1991) Raven Press, New York.

Par ailleurs, des implants intracérébro- ventriculaires de plusieurs types sont en cours d'expérimentation comme : un implant de cellules génétiquement modifiées pour l'expression de facteurs protéiques, encapsulées dans une fibre creuse (BioWorld

Today, American Health Consultants Vol 8 35 : 1,4, 1997), -une micro-pompe chargée de drogue pour quelques mois (Winn, S. R. et al. Polymer-encapsulated cells genetically modified to secrete human nerve growth factor promote the survival of axotomized septal cholinergic functions. PNAS (1994) Vol 19 : 2324-2328), ou -des formulations à relargage contrôlé utilisant des lipides, où les drogues sont encapsulées dans des microvésicules structurées en éponge (Chatelut E. et al Sustained-release methotrexate for intracavitary chemotherapy. J. Pharm. Sc (1994) Vol 83, 3 : 429-432).

Mais ce type d'administration est extrêmement lourd d'application car il implique une intervention chirurgicale.

Des formulations de substances actives qui pénétreraient le SNC sans avoir à être implantées sont recherchées, notamment en exploitant les transporteurs endogènes de la BHE. Ces transporteurs comportent des récepteurs membranaires qui, en présence de leur ligand, sont internalisés par la cellule endothéliale. Les vésicules contenant le ligand migrent vers la paroi abluminale et sont relarguées vers le tissu nerveux.

Ceci peut être obtenu, par exemple, par fusion de la protéine active avec une protéine ayant un récepteur cellulaire au niveau central, comme décrit dans la demande de brevet internationale PCT publiée sous le numéro W095/02421.

D'autres études récentes ont montré le passage d'un hexapeptide, la dalargine, à travers la BHE de souris, après administration intraveineuse d'une formulation dans des nanoparticules (230 nm) de butyl- cyanoacrylate, pourvu que ces particules soient recouvertes de surfactant, le polysorbate 80. Ces particules chargées de peptide pénétreraient par phagocytose ou endocytose. Dans cette expérience, le peptide doit être associé aux nanoparticules,

l'injection d'un simple mélange contenant la drogue, les microparticules et le surfactant ne provoque aucun effet biologique (Kreuter, J. et al Passage of peptides through the BBB with colloidal polymer particles Brain Research (1995) 674 : 171-174).

La première administration d'un peptide recombinant au niveau du SNC a été réalisée par infusion intra-cérébroventriculaire, directement dans le LCR.

Cette méthode permet une délivrance à des concentrations thérapeutiques et à proximité des parois ventriculaires, le LCR ne pénétrant pas dans le parenchyme cérébral (Pardridge, W. M. Transnasal and ventricular delivery of drugs. In Peptide Drug Delivery to the Brain pp 109-122 (1991) Raven Press, New York). Ce type d'administration, invasif et extrêmement délicat d'utilisation, a été utilisé pour administrer par exemple du methotrexate pour traiter la leucémie méningeoïde, de la pénicilline pour la méningite bactérienne, des immunoglobulines pour la méningite virale et la morphine contre la douleur chronique.

Les fosses nasales représentent une voie naturelle d'administration de substances actives qui offre de nombreux avantages potentiels dont la surface relative de la muqueuse nasale, l'épithélium richement vascularisé, la perméabilité aux substances lipophiles et la relative perméabilité aux hydrophiles. De plus, l'irrigation sanguine de cette muqueuse, liée à la circulation pulmonaire, évite le foie (Harris, A. S.

Review : Clinical opportunities provided by the nasal administration of peptides. Journal of Drug targetting Vol. 1, pp 101-116 (1993)). Aussi, l'administration nasale a été largement testée pour ses capacités à délivrer des substances au sang, et notamment des polypeptides comme l'insuline, le GnRH (gonadotrophin releasing hormone) et le GHRH (growth hormone releasing hormone), la vasopressine et ses analogues, etc. Il existe sur le marché des formulations, sous forme de spray nasal, de calcitonine, d'ocytocine, de

desmopressine ainsi que d'analogues de GnRH (gonadotropin-releasing hormone). Le plus souvent, des agents perméabilisants doivent être utilisés dans les formulations. Ces substances, comme les sels biliaires, dont le déoxycholate de sodium, la saponine, des agents tensio actifs non ioniques, augmentent l'absorption et la biodisponibilité du produit actif en altérant le film muqueux voire la structure de l'épithélium de la muqueuse. Dès lors, leur utilisation dans des formulations pharmaceutiques pose des problèmes de tolérance et de sécurité, notamment pour des applications chroniques (Björk E., Edman P., Microspheres as a nasal drug delivery system.

Pharmaceutical particulate carriers. Therapeutic applications, Edited by A. Rolland, Marcel Dekker Inc.

(1993) pp 21-31). Des microsphères de diverses tailles (45-200 um) et de divers polymères (dérivés de l'amidon, du dextran, de la cellulose...) administrées sous forme de poudre ont la capacité d'augmenter la durée du contact avec la muqueuse et probablement aussi de déshydrater le mucus. Elles ont démontré leur capacité d'augmenter l'absorption de drogues et leur passage dans le sang, notamment l'insuline, avec peu d'effets secondaires au niveau nasal, comme indiqué dans la demande de brevet PCT publiée sous le No. W091/07947.

Il a ainsi été proposé dans l'art antérieur le couplage d'agents actifs à des particules de taille, de structure et de composition très variées pour une administration notamment par voie nasale. Outre les travaux rapportés ci-dessus, on peut encore citer les associations suivantes : -Dans la demande de brevet PCT publiée sous le No. W093/15737, il est proposé de fixer des composés anti-migraineux sur des particules d'amidon d'une taille comprise entre 10 et 200 microns, de façon à former des complexes utiles pour la préparation d'une composition pour l'administration nasale. L'efficacité de ce système

réside dans l'excès de particules d'amidon par rapport à l'agent actif dans la composition.

-Dans la demande de brevet PCT publiée sous le No. W094/27576, il est proposé d'associer, dans une composition pour l'administration nasale, un analgésique opiacé avec un polymère comme du chitosan ou des microsphères d'amidon pour promouvoir l'adsorption.

-Dans la demande de brevet PCT publiée sous le No. W094/27576, il est proposé des compositions pour l'administration nasale comprenant des complexes formés entre de la nicotine et un vecteur constitué d'un composé échangeur d'ions. Ce vecteur présente une taille comprise entre 0,5 et 250 microns et permet, lorsqu'il est ionisé de libérer une charge positive, laissant ainsi une charge négative disponible pour fixer la nicotine ionisée.

-Dans la demande de brevet PCT publiée sous le No. W095/22963, il est proposé d'utiliser des nanoparticules recouvertes d'un surfactant (polysorbate 80) sur lesquelles un peptide est fixé par adsorption, absorption ou même incorporation (Ueda, M. et al., Sept.

1997, J. of Microencapsulation 14,593-605 ; Kreuter, J.

1996, J. Anatom. Y. 189,503-505) Les cellules constituant l'épithélium de la muqueuse nasale sont jointes par des jonctions serrées (tight junctions), qui limitent le passage de molécules entre la lumière de la cavité et les vaisseaux sanguins.

Par contre, le pôle basal des cellules neurosensorielles olfactives de l'épithélium nasal s'allonge en un axone qui se termine dans le bulbe olfactif du cerveau. Cet axone traverse la membrane basale de la muqueuse et l'espace submucosal. La voie neuronale olfactive pourrait ainsi constituer une porte d'entrée vers le cerveau.

De plus, l'espace sous-arachnoidien se prolonge au niveau des axones des cellules neuro- sensorielles en des digitations qui viennent au contact

de la sous-muqueuse nasale. Il y a donc un flux de LCR provenant du lobe olfactif vers l'espace sous mucosal.

L'anatomie particulière de la muqueuse nasale confère donc un voisinage inhabituel avec le LCR.

Par ailleurs, dès la fin du 196me siècle, des chercheurs avaient postulé que le nerf olfactif pouvait permettre le transport de substances traçantes et d'organismes divers de la muqueuse nasale au bulbe olfactif et au CNS.

En 1970 De Lorenzo (De Lorenzo Taste and Smell in vertebrates J & A Churchill ltd (1970), 151- 176) a administré par voie intranasale des particules d'or chez le singe et estimé la vitesse de progression entre le nez et le bulbe olfactif à 2,5mm/h.

En 1971, Kristensson & Al (Kristensson & Al Acta Neuropathol. (1971), 19,145-154) ont démontré que si des méthodes sensibles sont utilisées pour tracer des substances macromoléculaires comme la péroxydase de raifort et l'albumine, on observait un mouvement de la muqueuse nasale vers 1'espace subarachnoide.

Plus tard Pardridge (Partridge Peptide drug delivery to the brain Raven Press (1991), 101), dans son livre sur la délivrance des peptides au cerveau énonce que l'administration nasale de substances hautement liposolubles, telle la progestérone permet d'atteindre directement le fluide cérébrospinal sans entrer dans le compartiment sanguin périphérique. La biodisponibilité de la progesterone étant plus grande après insufflation nasale qu'après infusion intraveineuse. Les peptides, substances hautement hydrophiles pénètrent les barrières de diffusion membranaires entre le nez et l'espace subarachnoide olfactif à des vitesses considérablement plus faibles que la progestérone.

La demande de brevet PCT publiée sous le numéro W091/07947 décrit des compositions pharmaceutiques pour l'administration nasale de substances actives qui empruntent cette voie neuronale.

Les compositions associent le produit biologiquement actif à un transporteur capable d'induire l'absorption, la drogue subirait alors un transport neuronal rétrograde et/ou antérograde.

Sakane (Sakane & Al S. T. P. Pharma Sciences (1997), 7, (1), 98-106) a publié très récemment une étude systématique sur le transport direct de la cavité nasale au fluide cérébrospinal : l'étude de la céphalexine, antibiotique hydrophile, montre clairement un transport direct de la cavité nasale au fluide cérébro-spinal. l'étude de différents sulfonamides à lipophilie variable montre que le transport est dépendant de la lipophilie et de la fraction non ionisée du principe actif. l'étude de dextranes de différents poids moléculaires a montré que les principes actifs pouvaient être transportés jusqu'à 20KDa de poids moléculaire.

-enfin une étude du transport des peptides a été réalisée. La molécule choisie est un oligopeptide analogue de l'enkephaline : la (D-Ala 2)-Méthionine enképhalinamide, elle est détectée dans le liquide cérébrospinal après administration nasale et sa concentration est augmentée par l'utilisation d'un promoteur d'absorption : le glycocholate de sodium et par des inhibiteurs de protéases : la puromycine (inhibiteur de l'aminopeptidase) et le thiorphan (inhibiteur de l'enkephalinase).

Cependant, malgré des méthodes d'instillation nasale chez le rat, visant à limiter au maximum la fuite du produit dans le pharynx, les quantités de peptide obtenues dans le fluide cérébrospinal sont très faibles, même en présence d'un promoteur d'absorption ou d'inhibiteurs de protéases (de l'ordre de la centaine de ng/ml), ne permettant pas un effet thérapeutique.

La Demanderesse a développé son expertise dans la préparation de vecteurs particulaires synthétiques, désignés sous le terme général de Biovecteurs Supramoléculaires, ci-après désignés"BVSM" ou"Biovecteurs", capables d'associer, et avantageusement de vectoriser, différentes substances ou principes actifs, et donc utiles pour la fabrication de compositions pharmaceutiques.

Un premier type de Biovecteurs Supramoléculaires, et son procédé de préparation, a été décrit dans le brevet européen No. 344 040.

Il s'agit de particules comprenant de l'intérieur vers l'extérieur : -un noyau central hydrophile non liquide constitué d'une matrice de polysaccharides ou d'oligosaccharides naturellement ou chimiquement réticulés, pouvant être modifiés par des groupements ioniques divers ; -une couche d'acides gras greffés par des liaisons covalentes au noyau ; -une ou plusieurs couches lipidiques constituées notamment de phospholipides.

Les développements de cette première génération de Biovecteurs Supramoléculaires ont conduit la Demanderesse à concevoir et préparer de nouveaux Biovecteurs Supramoléculaires, aux propriétés améliorées notamment en fonction des principes actifs transportés.

Les demandes de brevet internationales PCT publiées sous les Numéros WO 94/23701, WO 94/20078 et WO 96/06638 décrivent ces Biovecteurs, leur fabrication, leur association à divers principes actifs et leur utilisation pour la préparation de compositions pharmaceutiques.

L'enseignement des demandes de brevets ci- dessus est incorporé dans la présente description par référence.

Le savoir faire dont dispose aujourd'hui la Demanderesse sur la préparation des BVSM lui permet de

disposer d'une gamme étendue de type de BVSM. Ces BVSM sont formés d'un polymère hydrophile réticulé, préférentiellement des polysaccharides, sous forme de gel nanoparticulaire, ces BVSM sont dits de type PSC (ou NPS en français).

Ce polymère peut éventuellement porter des ligands ioniques positifs, BVSM dit cationique, ou négatifs, BVSM dit anionique. Ce polymère chargé ou non est optionnellement recouvert d'une couche de composés amphiphiles, préférentiellement des phospholipides, BVSM dit de type Light décrit dans la demande de brevet PCT W094/20078.

La taille des BVSM est comprise entre 20 et 200 nm, préférentiellement entre 50 et 100 nm et plus préférentiellement entre 60 et 80 nm.

Les BVSM sont stérilisables par filtration et leur association aux principes actifs se fait sur les BVSM complètement fabriqués (Major & Al Biochem. & Biophys. Acta (1997), 1327,32-40). Ceci permet de travailler les molécules biologiques, particulièrement fragiles, dans des conditions optimales.

Les BVSM protègent les molécules biologiques de la dégradation (Prieur R. et al. Vaccins (1996) Vol 14, N°6 pp. 511-520 Combination of hCMV recombinant IE1 protein with 80 nm cationic biovectors : protection from proteolysis and potentiation of presentation to CD4) et ont montré qu'ils augmentaient l'activité biologique de peptides et de protéines comme des enzymes, des antigènes, etc...

Les BVSM sont connus pour être utilisés comme transporteurs de substances actives, par exemple peptides, antigènes ou oligonucléotides. Dans cette utilisation, il y a formation d'un réel complexe entre le biovecteur et la substance active, comme des interactions ioniques entre le noyau cationique du BVSM et l'oligonucléotide anionique. Il y a donc formation d'un conjugué ionique stable dans un milieu biologique.

Dans ce type de préparation, le rapport oligonucléotide

/BVSM est de 5 à 10 % et le rendement d'association mesuré est supérieur à 90 %. De même, la demande de brevet français publiée sous le numéro 2 723 849 décrit que l'augmentation d'immunogénicité n'est pas obtenue avec un simple mélange antigène/BVSM, sans interaction préalable de l'antigène et du vecteur particulaire.

L'antigène est là aussi associé au vecteur particulaire par des liaisons ioniques et/ou hydrophobes. Pour obtenir ce résultat, on incube par exemple 1 mg de proteine GST-e4 pour 10 mg de BVSM, ce qui permet d'obtenir des taux d'association moyens de 90 % quel que soit le type de BVSM utilisé (Prieur R. et al. Vaccins (1996) Vol 14, N°6 pp 511-520).

La Demanderesse a maintenant découvert que les BVSM sont particulièrement adaptés pour l'administration nasale et ont un temps de rétention prolongé au niveau de la muqueuse nasale lorsqu'ils sont administrés sous forme de spray chez l'animal et chez 1'homme. Un tel résultat est tout à fait exceptionnel pour une formulation liquide, d'autant que la présence des BVSM est encore significative après 12 heures et détectable jusqu'à 24 heures.

Cette adhésivité aux muqueuses a été mise à profit pour l'administration par voie mucosale de substances actives, notamment des antigènes, associés dans des formulations à des BVSM. Dans ces formulations, les quantités de BVSM utilisées sont adaptées à la quantité de substance active que l'on veut délivrer, la formulation consistant en l'association de la (des) substance (s) active (s) aux BVSM, celui-ci jouant le rôle d'un transporteur.

Par ailleurs, les BVSM ne présentent pas de toxicité par administration nasale, l'épithelium de la muqueuse, en particulier le mouvement ciliaire et les tight junctions, est intact après des applications chroniques pendant un mois.

In vivo, lorsque des BVSM anioniques marqués sont administrés par voie intraveineuse chez le rat,

seule une faible quantité passe de manière fugace dans la microcirculation cérébrale : environ 0,15% de la dose administrée est présente à 5 mn contre environ 0% à 1 heure. Cette quantité n'est pas suffisante pour pouvoir considérer que les BVSM anioniques franchissent la BHE in vivo, les BVSM cationiques étant indétectables dans les mêmes conditions.

Les travaux de recherche réalisés par la Demanderesse dans le cadre de la présente invention ont montré que, in vitro, les BVSM Light cationiques traversaient un modèle de barrière hémato-encéphalique par transcytose (Cechelli, R. et al., Journal of Controll. Release 1992,21, p. 81-92 ; Cechelli, R. et al., Journal of Neurochemistry 1990,54,5, p. 1798- 1801). Mais ces mêmes particules sans membrane phospholipidique, de même que les BVSM Light anioniques, ne traversent peu ou pas cette même barrière. Par contre, lorsqu'ils sont administrés par voie nasale, les BVSM ne sont pas retrouvés au niveau cérébral. Les résultats in vitro ne peuvent donc pas être corrélés aux résultats obtenus in vivo.

Afin d'évaluer les propriétés des BVSM sur le passage du nez au cerveau de substances actives, plusieurs drogues d'intérêt central antinociceptif ont été étudiées : la bêta endorphine, le DAGO et la morphine, etc.... Les composés de type opiacé qui ont été testés sont des molécules de faible poids moléculaire, entre 50 et 10 000, relativement hydrosolubles.

Leur passage au niveau du SNC est mesuré par leur activité antinociceptive. Les opiacés produisent leurs effets par l'interaction avec trois types de récepteurs : mu, delta et kappa. Les composés choisis, dont notamment les dérivés de l'enkephaline endogène, ont une action spécifique sur les récepteurs mu des opiacés (Pasternak G. W. et al Morphine-6-glucuronide, a potent mu agonist, Life Sci. 41 : 2845-2849, (1987) ; Kosterlitz H. W., et al. Br. J. Pharmacol 73,299 (1981)). Ces récepteurs baignent dans le LCR, par

conséquent l'observation d'une activité biologique indique le passage de la substance jusqu'à ce niveau.

Ces composés sont facilement dégradés et ont peu de chances d'atteindre le cerveau par voie systémique lorsqu'ils sont administrés à faible dose.

-La bêta endorphine est une enképhaline endogène de 31 aa. Elle est reconnue comme ne traversant pas la BHE (Hougten R. A., et al bêta endorphin : stability, clearance behavior and entry into the CNS after intravenous injection of the tritiated peptide in rat and rabbits. PNAS ASA 77 : 4588-4591 (1980)).

Molécule labile, son utilisation est délicate in vivo et son pouvoir analgésique dépendant de l'état physiologique des animaux.

-Le DAGO un pentapeptide [Tyr, D-Ala, Gly, N-Me-Phe, Gly-ol], analogue de l'extrémité amino terminale de la bêta endorphine, connu pour être plus résistant aux protéases que 1'enkephaline endogène.

Poids moléculaire de 513.

-La morphine est le prototype de l'analgésique et narcotique de type opiacé, principal alcaloide de l'opium. Son poids moléculaire est de 285.

Dans les applications médicales, elle peut être administrée par voie parentérale pour les douleurs postopératoires et par voie orale pour les douleurs liées au cancer.

-Le Butorphanol est une molécule de la famille des morphinanes de PM = 327. Il s'agit d'une molécule plus lipophile que la morphine. Le butorphanol est déjà utilisé aux USA et en Angleterre en spray- nasal chez l'homme sous le nom de Stadol0 (Nastech).

-La Buprénorphine est une oripavine, plus lipophile que la morphine, dérivée de la thébaine.

Analgésique puissant, 25 à 50 fois plus que la morphine, elle est douée d'une activité agoniste-antagoniste partielle des récepteurs opiacés. En clinique, elle est très largement utilisée (ex : Temgésic-comprimés) dans

le traitement des douleurs aiguës ou chroniques par administration parentérale ou sublinguale.

-Le peptide FK33-824 (OU DAMME) est de nature hydrophile tout comme le DAGO. Le FK33-824 de masse molaire 603 répond à la formule suivante : Tyr-D-Ala-Gly- [N-Methyl-Phe]-Met [0]-ol Dans un premier temps, il a été tenté d'associer la bêta endorphine, le DAGO, la morphine avec différents types de BVSM (anioniques, cationiques, noyaux phospholipidés ou non). De cette première série de formulations, il a été vérifié que seule la bêta endorphine était capable de s'associer à un BVSM anionique de manière satisfaisante, alors qu'aucune autre combinaison avec les drogues précitées ne donnait d'association satisfaisante.

Pour la bêta endorphine la formulation BVSM Light anionique/bêta endorphine a été testée à la dose de 20 ug de BVSM pour 20 ug d'endorphine ainsi qu'à la dose 2 ug de BVSM pour 20 ug d'endorphine. A titre de témoin négatif, les BVSM cationiques ont été utilisés à des doses où ils n'associent pas la drogue (2 ug de BVSM exprimés en poids de noyau polysaccharidique (NPS), pour 20 ug d'endorphine) : -La bêta endorphine seule par voie nasale n'a montré aucun effet antinociceptif -Un effet dosable à 30 minutes a été observé avec les formulations BVSM anioniques -De manière étonnante, un effet avec le BVSM cationique a également été observé -On a également noté avec les BVSM anioniques, un effet plus important avec la dose de 2 ug de BVSM qu'avec 20 ug.

Les BVSM conçus comme véhicules pour le transport et la présentation de substances actives, tels que décrits dans les demandes de brevets mentionnées

précédemment, ne permettent plus d'expliquer les résultats obtenus.

Afin de consolider ce nouveau concept, des formulations à base de DAGO et de morphine, pour lesquelles aucun des BVSM testés n'avait pu montrer d'association satisfaisante avec l'endorphine, ont été à nouveau étudiées.

Les travaux réalisés avec ces composés ont permis de mettre en évidence de nouvelles propriétés des BVSM non plus comme transporteur mais comme activateur du passage d'agents actifs du nez au système nerveux central. Plus particulièrement, les BVSM présentent les propriétés suivantes : -Ils permettent le passage du nez au cerveau de substances actives à des doses où la substance seule n'est pas active par administration nasale.

-Ils permettent d'augmenter 1'effet d'une dose de substance active par administration nasale comparativement à la drogue seule administrée par la même voie ou à la drogue administrée avec un agent perméabilisant.

-Ils permettent par administration nasale l'obtention d'effets quantitativement comparables à ceux obtenus par la même dose en administration systémique -Ils prolongent la durée d'action de la substance active administrée par voie nasale lorsque cette substance seule est déjà active par cette voie (augmentation de la durée d'action).

Les résultats obtenus ont permis d'observer que les BVSM type Light et type PSC sont efficaces.

Toutefois, les BVSM de type Light et de type PSC n'ont pas la même efficacité aux mêmes doses (en équivalent poids sec de la partie polysaccharidique).

Par ailleurs, à la différence de l'utilisation des BVSM comme transporteur, il n'y a pas dans la nouvelle utilisation selon la présente invention

d'effet de la charge, car les BVSM anioniques et cationiques sont efficaces.

Enfin, la nouvelle utilisation des BVSM selon l'invention se distingue donc des utilisations antérieures comme transporteur, par le fait que les substances testées ne sont non plus fixées au BVSM mais simplement mélangées avec les BVSM dans des ratios pondéraux tels que l'excès de drogue libre ne permet pas d'envisager une quelconque association. En outre, de façon remarquable, la Demanderesse a observé que les doses de BVSM utiles selon la présente invention ont une forte incidence sur les propriétés rapportées ci-dessus.

Il a ainsi été constaté qu'il existe une fenêtre optimale pour la dose de BVSM. Trop ou trop peu de BVSM, ne modifie pas de manière sensible le comportement intrinsèque de la drogue.

Cette observation tend à faire penser que les BVSM n'agissent pas par simple effet passif mais qu'ils induisent un phénomène actif responsable de la pénétration de la substance. Le mécanisme d'action des BVSM sur le passage de substances actives de la muqueuse nasale vers le cerveau n'est pas élucidé, mais il est d'ores et déjà certain que, 1'effet dit"transporteur" du BVSM décrit dans l'art antérieur ne permet pas d'expliquer les propriétés précédentes.

Les travaux réalisés par la Demanderesse suggèrent que les BVSM interagissent avec la muqueuse nasale en favorisant le passage direct du nez au LCR sans passage par le sang. L'activation de 1'endocytose des cellules épithéliales nasales pourrait être le mécanisme impliqué.

En conséquence, l'invention concerne l'utilisation de particules (i) composées d'un noyau formé d'un polymère hydrophile portant ou non des ligands ioniques et éventuellement recouvert d'une couche de composés amphiphiles, (ii) présentant une taille comprise entre environ 20 et 200 nm et

avantageusement entre environ 50 et 100 nm, dans une composition pharmaceutique aqueuse administrée par voie nasale chez un sujet humain ou animal, pour obtenir et/ou augmenter le passage d'un agent actif présent dans ladite composition au niveau du SNC.

La nouvelle utilisation selon l'invention, est remarquable en ce que les BVSM permettent d'obtenir et/ou de favoriser le passage du nez au SNC de substances actives pour le diagnostic ou le traitement d'une affection du SNC, et plus particulièrement de petites molécules et/ou de molécules fragiles comme les peptides ou protéines.

L'obtention et/ou l'augmentation du passage d'un agent actif administré par voie nasale jusqu'au SNC se traduit dans le cas ou l'agent actif est une substance pharmacologiquement active au niveau du SNC par l'obtention et/ou l'augmentation de l'efficacité de ladite substance.

Les déterminants majeurs de l'absorption nasale des peptides et des protéines dans le sang sont la taille de la molécule administrée et l'amplitude de son hydrolyse et de sa dégradation enzymatique.

Pour augmenter l'absorption et la biodisponibilité dans le sang, différentes approches ont été explorées dans l'art antérieur : -inhibition des enzymes qui constituent une barrière au niveau de la muqueuse, -utilisation d'agents perméabilisants de la muqueuse et de transporteurs comme les microsphères ou les microcapsules qui utilisent des polymères bioadhésifs ou des solutions visqueuses pour augmenter le temps de rétention de la substance active dans la cavité nasale.

Schématiquement, il existe plusieurs classes d'agents perméabilisants, dont les sels biliaires et les DHF (dihydrofusidates).

Les sels biliaires (déoxycholate, chénodéoxycholate, cholate, glycocholate) sont des stéroïdes amphiphiles tensioactifs, dérivés biochimiques du cholestérol. Leur efficacité à promouvoir la délivrance de substances actives à travers les muqueuses dépend de leur lipophilicité, ainsi que leur capacité à augmenter la stabilité des substances actives testées (comme l'insuline ou les enkephalines) par inhibition de l'activité protéolytique (Sayani & Al Crit. Rev. in Therap. Drug carrier Systems (1996), 13, (1 & 2), 85- 184). Il a également été démontré que cet effet est lié à leur capacité à altérer la muqueuse, ce qui exclut une utilisation à des fins autres qu'expérimentales.

Les dihydrofusidates, dérivés de l'acide fusidique, sont moins toxiques (bien qu'irritants) que les sels biliaires et sont, pour certains, plus efficaces comme promoteurs de l'absorption mucosale.

Leur efficacité est dose-dépendante. Des dérivés acides, basiques et neutres ont été testés, les acides étant les plus efficaces. Ils agiraient en inhibant l'activité protéolytique et induisant la formation de micelles qui solubilise le peptide/la protéine.

A l'inverse de ces produits, les BVSM ne sont pas irritants. De plus, à l'inverse des BVSM, l'agent perméabilisant testé (le deoxycholate de sodium) n'a pas les mêmes effets que les BVSM sur l'activité biologique des substances actives testées.

Illum et ses collaborateurs ont les premiers introduit le principe de l'utilisation de microsphères pour la délivrance nasale de substances faiblement absorbées.

Ainsi ont été testées : des microsphères biodégradables d'amidon (DSM), des microsphères de dextrane, et plus récemment du chitosan.

Ce sont les DSM qui ont été testées les premières (Illum & Al Int. J. Pharm. (1987), 39,189- 199) : Chez le mouton, la biodisponibilité de l'insuline a ainsi été augmentée de 10 fois par rapport à

l'administration nasale d'insuline seule. Un ratio optimal insuline/DSM égal à 1/3-4 mg/kg DSM a été établi, ratio pour lequel on obtient une réduction maximum du glucose sanguin.

Des sphères de dextrane réticulé avec de l'épichlorhydrine (sephadex) ont été utilisées plus tard de manière analogue aux DSM (Ryden et al., Int. J.

Pharm. (1992), 83,1). Il a été constaté que l'efficacité de l'insuline dans des particules de sephadex est inférieure à celle de l'insuline dans des DSM à dose équivalente dans l'abaissement du taux de glucose sanguin.

Plus tard, Illum a également testé le chitosan dans la délivrance nasale d'insuline (Illum et al., Pharm. Res. (1994), 11, (8), 1186-9). Le chitosan est un polysaccharide cationique de haut poids moléculaire, dérivé de la chitine des carapaces de crustacés. C'est un polymère bioadhésif. Utilisé sous forme de gel (0,5% poids par volume) avec de l'insuline, il a démontré sa capacité à délivrer l'insuline pendant 3 à 4 heures.

Alors que les agents perméabilisants ont des effets irritants reconnus sur la muqueuse nasale il semble que les microsphères soient mieux acceptées.

Cependant des essais sur le lapin du DSM pendant 8 semaines ont montré pour certains animaux, une hyperplasie légère de l'épithélium et une augmentation des cellules calciformes (Bjork & Al Int. J. Pharm.

(1991), 75,73).

De plus l'optimisation de la valeur thérapeutique des formulations insuline/microsphères conduit à la coadministration d'agents perméabilisants.

Ainsi chez le mouton lorsque les DSM sont combinées avec la lysophosphatidylcholine (LPC), la biodisponibilité de l'insuline est multipliée par trois (Farraj & Al J.

Contr. Rel. (1990), 13,253).

De même des formulations desmopressine microsphères d'amidon avec la LPC montrent une amélioration significative de la biodisponibilité de la

desmopressine en comparaison avec le système de délivrance microsphères seul ou la formulation LPC administrée seule. Ces résultats prouvent qu'il y a un effet de synergie entre 1'effet microsphères et 1'effet LPC (Critchley & Al J. Pharm. Pharmacol.

(1994), 46, (8), 651-6). Cependant, il convient de noter que la LPC bien que considérée comme un agent perméabilisant doux, a des effets hémolytiques sur les érythrocytes variables selon les espèces (fonction de la composition lipidique de l'érythrocyte). La non toxicité des BVSM dans les conditions d'emploi envisagées présente un avantage par rapport à ce type de produit.

Le mécanisme d'action des microsphères n'est pas parfaitement élucidé. Les hypothèses se resserrent cependant autour de 2 mécanismes d'action : -les propriétés bioadhésives des microsphères permettent un temps de contact plus important entre la substance thérapeutique et les sites d'absorption de la membrane nasale.

-les microsphères permettent un élargissement transitoire des tight jonctions entre les cellules, permetttant ainsi le passage de plus grosses molécules hydrophiles (expérience d'Edman sur des monocouches de cellules Caco-2) (Edman & Al J. Control.

Rel. (1992), 21,165-172).

De façon tout à fait surprenante, la Demanderesse a constaté que l'administration nasale de substances actives au niveau du SNC en présence de BVSM à des doses infraliminales permet d'obtenir une augmentation de la durée d'action de la substance active et de son intensité. Il n'a pas été observé d'augmentation de la délivrance sanguine de la substance active, par contre il a été remarqué une augmentation de la résidence de la substance active dans le nez en présence de BVSM ou de NPS. Comme indiqué précédemment, ces observations démontrent qu'il ne s'agit pas d'un effet"transporteur", car il n'y a pas association du

BVSM et de l'agent actif. En effet, les doses de BVSM sont très faibles par rapport à celles de l'agent actif, et si l'on augmente la dose de BVSM, on observe une inhibition de l'augmentation d'activité de la substance active. D'autre part, l'administration décalée des BVSM et de l'agent actif dans le même rapport de dose permet d'obtenir le même effet.

Ainsi, dans l'utilisation selon l'invention, le ou les agents actifs ne sont pas liés au particules.

En outre, la Demanderesse a défini que la quantité, en poids, de particule hydrophile dans la composition pharmaceutique pour l'administration par voie nasale selon l'invention est inférieure et avantageusement très inférieure, en poids, à la quantité d'agent actif. Plus particulièrement, les travaux réalisés dans le cadre de la présente invention ont permis de mettre en évidence que les doses de particules hydrophiles et d'agent (s) actif (s) dans la composition pharmaceutique pour l'administration par voie nasale selon l'invention, sont indépendantes, et ont montré, de façon tout à fait inattendu, que la dose de particules dans ladite composition permettant le transport de l'agent actif est fixe quelque soit l'agent actif.

Ainsi, les expériences réalisées chez la souris, et rapporté plus loin dans les exemple, ont montré que la dose optimale est toujours la même, de l'ordre de 0,1 ug à 2 ug quelque soit 1'agent actif utilisé, de sorte que l'on adapte la dose d'agent actif dans la composition uniquement en fonction dudit agent actif. Les doses rapportées ci-dessus ont été définies à partir des différents types de BVSM mis en oeuvre, ainsi, la dose optimale de 0,1 ug correspond au NPS, et celle de 2 ug correspond au BVSM de type Light. En conséquence, sur la base de ces résultats chez la souris, l'homme du Métier est à même de définir les doses efficaces de particules dans des compositions pour l'administration nasale chez 1'homme, dans lesquelles la dose de particule est comprise entre quelques

nanogrammes et quelques milligrammes, plus particulièrement comprise entre 10 ng et 1 mg.

Ainsi dans l'utilisation selon l'invention, la quantité de particule de polymère hydrophile, exprimée en poids de polymère hydrophile sec, est de l'ordre de 10 ng à 1 mg quelque soit la quantité d'agent actif administrée par voie nasale.

Cette caractéristique de l'utilisation des BVSM confère l'avantage de permettre une diminution de la quantité d'agent actif dans les compositions pour l'administration par voie nasale selon l'invention. Cet avantage est tout particulièrement important lorsque l'agent actif est très cher.

A titre d'exemple, le rapport en poids de la quantité de particule de polymère hydrophile par rapport la quantité d'agent actif est la suivante : -dans le cas du DAGO, le rapport, en poids, est de 50 parties d'agent actif pour une partie de particule, -dans le cas de la morphine, le rapport, en poids, est de 2500 parties d'agent actif pour une partie de particule.

Ce rapport est inverse de celui décrit dans l'art antérieur pour l'utilisation des BVSM comme transporteur d'agent actif.

On préfère tout particulièrement utiliser une dose de particule, dans la composition pharmaceutique pour l'administration par voie nasale, comprise entre quelques nanogrammes et quelques milligrammes.

L'invention concerne donc aussi l'utilisation d'une composition aqueuse comprenant : -des particules (i) composées d'un noyau formé d'un polymère hydrophile portant ou non des ligands ioniques et éventuellement recouvert d'une couche de composés amphiphiles, (ii) présentant une

taille comprise entre environ 20 et 200 nm et avantageusement entre environ 50 et 100 nm, et -au moins un agent actif qui n'est pas lié aux particules dans ladite composition, pour la préparation d'un médicament pour administration nasale à utiliser en diagnostic ou thérapie d'une affection du SNC chez un sujet humain ou animal.

Selon la nature et les propriétés de l'agent actif, l'invention concerne tant le domaine du diagnostic que ceux du traitement et de la prévention d'une affection du SNC.

A titre, d'agent thérapeutique, on peut citer ceux choisis parmi : les analgésiques, anesthésiques, antalgiques, antispasmodiques, antiparkinsoniens, antiépileptiques, antimigraineux, ou tout autre agent utile dans le traitement des maladies neurodégénératives, psychiatriques ou du trouble du comportement, anticancéreux, antiviraux, antiprions, antibiotiques, ou encore des agents actifs comme des facteurs de croissance, des acides nucléiques, des vitamines, des hormones, etc....

A titre, d'agent de diagnostic, on peut citer ceux choisis parmi : les anticorps et molécules permettant de cibler des récepteurs du CNS, les agents d'imagerie médicale utilisés en IRM, scintigraphie, PET, ultrason.

Les BVSM utilisés pour l'administration par voie nasale selon l'invention, peuvent être présentés dans un médicament contenant ou non également l'agent actif. Dans le cas ou le médicament contenant les BVSM ne contient pas aussi l'agent actif, on peut envisager une administration par voie nasale différée des BVSM et du (ou des) agent (s) actif (s), successivement dans un ordre ou dans l'autre.

Dans l'utilisation selon l'invention, la composition pharmaceutique pour l'administration par voie nasale peut contenir également tout véhicule pharmaceutiquement compatible avec les BVSM et/ou l'agent actif, ainsi que éventuellement un agent de perméabilisation de la muqueuse nasale.

Dans l'utilisation selon l'invention, le principe actif est un agent thérapeutique ou de diagnostic.

L'invention concerne aussi une composition pharmaceutique aqueuse pour l'administration nasale d'au moins un agent actif à délivrer au SNC, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un agent actif et des particules (i) composées d'un noyau formé d'un polymère hydrophile portant ou non des ligands ioniques et éventuellement recouvert d'une couche de composés amphiphiles, (ii) présentant une taille comprise entre environ 20 et 200 nm et avantageusement entre environ 50 et 100 nm, le (s) dit (s) agent (s) actif n'étant pas lié (s) aux particules dans ladite composition.

La composition pharmaceutique selon l'invention est remarquable en ce qu'elle permet d'obtenir et/ou d'augmenter le passage de l'agent actif administré par voie nasale jusqu'au SNC.

L'obtention et/ou l'augmentation du passage d'un agent actif administré par voie nasale jusqu'au SNC se traduit dans le cas ou l'agent actif est une substance pharmacologiquement active au niveau du SNC par l'obtention et/ou l'augmentation de l'efficacité de ladite substance, administrée par voie nasale, au niveau du SNC.

Dans la composition de l'invention, le ou les agents actifs ne sont pas fixés sur les particules mais simplement mélangés avec les particules. En effet, comme indiqué précédemment, La quantité de particules dans la composition pharmaceutique selon l'invention est

inférieure et avantageusement très inférieure, en poids à la quantité d'agent actif.

Ainsi, comme indiqué précédemment les doses de particules hydrophiles et d'agent (s) actif (s) dans la composition pharmaceutique pour l'administration par voie nasale selon l'invention, sont indépendantes, et, de façon tout à fait inattendu, la dose de particules dans ladite composition permettant le transport de l'agent actif est fixe quelque soit l'agent actif.

On préfère tout particulièrement utiliser une dose de particule, dans la composition pharmaceutique pour l'administration par voie nasale, comprise entre quelques nanogrammes et quelques milligrammes.

Dans une forme particulière de réalisation des compositions de l'invention, la dose de particule est comprise entre 10 ng et 1 mg quelque soit la quantité d'agent actif administrée par voie nasale.

A titre d'exemple, le rapport en poids de la quantité de particule de polymère hydrophile par rapport la quantité d'agent actif est la suivante : -dans le cas du DAGO, le rapport, en poids, est de 50 parties d'agent actif pour une partie de particule, -dans le cas de la morphine, le rapport, en poids, est de 2500 parties d'agent actif pour une partie de particule.

Ce rapport est inverse de celui décrit dans l'art antérieur pour l'utilisation des BVSM comme "transporteur"d'agent actif.

Comme indiqué précédemment, les BVSM utilisés pour l'administration par voie nasale selon l'invention, peuvent être présentés dans une composition pharmaceutique contenant ou non également l'agent actif.

Ainsi, l'administration nasale des BVSM et du ou des agents actifs peut être réalisée grâce aux compositions

précédentes comprenant ces deux composants, ou consister en la prise successive de l'un puis de l'autre de ces constituants, chacun présenté dans une composition pharmaceutique séparée, à des doses respectives conformes à celles utilisées pour une composition contenant les deux composants.

L'invention concerne donc également une composition pharmaceutique contenant comme substance active uniquement des BVSM dans les proportions définies ci-dessus par rapport à l'agent actif à délivrer au niveau du SNC lequel est contenu dans une composition contenant ou non des BVSM. L'invention se rapporte donc à une trousse pharmaceutique comprenant : -une première composition comprenant les BVSM avantageusement associés à un véhicule pharmaceutiquement acceptable et compatible avec les BVSM, -une seconde composition comprenant au moins un agent actif associé à un véhicule pharmaceutiquement acceptable et compatible avec ledit agent actif, Une forme d'utilisation, particulière de cette trousse pharmaceutique, consiste à regrouper les deux compositions sur un applicateur nasal commun de façon à délivrer simultanément lesdites deux compositions. Dans le cas d'une administration successive des deux compositions, l'administration nasale des BVSM peut être réalisée avant ou après l'administration nasale du ou des agents actifs.

La composition pharmaceutique pour l'administration par voie nasale de l'invention peut contenir également tout véhicule pharmaceutiquement compatible avec les BVSM et/ou l'agent actif, ainsi qu'éventuellement un agent de perméabilisation de la muqueuse nasale. Ces compositions peuvent se présenter sous toute forme adaptée à l'administration par voie nasale comme des crèmes, des gels, de sprays, des poudres coatées ou non sur un support, etc....

Dans la composition pharmaceutique pour l'administration par voie nasale de l'invention, le principe actif est un agent thérapeutique ou de diagnostic.

Comme précédemment, à titre, d'agent thérapeutique, on peut citer ceux choisis parmi : les analgésiques, anesthésiques, antalgiques, antispasmodiques, antiparkinsoniens, antiépileptiques, antimigraineux, ou tout autre agent utile dans le traitement des maladies neurodégénératives, psychiatriques ou du trouble du comportement, anticancéreux, antiviraux, antiprions, antibiotiques, ou encore des agents actifs comme des facteurs de croissance, des acides nucléiques, des vitamines, des hormones, etc....

Comme précédemment, à titre, d'agent de diagnostic, on peut citer ceux choisis parmi : les anticorps et molécules permettant de cibler des récepteurs du CNS, les agents d'imagerie médicale utilisés en IRM, scintigraphie, PET, ultrason.

Les compositions pharmaceutiques selon l'invention peuvent aussi comprendre un ou plusieurs agents perméabilisant la muqueuse nasale, du type de ceux définis précédemment.

L'invention concerne enfin un procédé de préparation d'une composition pharmaceutique décrite précédemment pour l'administration nasale d'un agent actif à délivrer au SNC, consistant à mélanger au moins un agent actif et une quantité inférieure et avantageusement très inférieure en poids par rapport à la quantité dudit principe actif, de particules (i) composées d'un noyau formé d'un polymère hydrophile portant ou non des ligands ioniques et éventuellement recouvert d'une couche de composés amphiphiles, (ii) présentant une taille comprise entre environ 20 et 200 nm et avantageusement entre environ 50 et 100 nm. On

préfère plus particulièrement, dans le procédé de l'invention, mélanger le principe actif et une quantité de particules comprise entre quelques nanogrammes et quelques milligrammes. Dans une forme particulière de réalisation de ce procédé, la dose de particule est comprise entre 10 ng et 1 mg quelque soit la quantité d'agent actif administrée par voie nasale.

D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront à la lecture des exemples qui suivent concernant la disponibilité des BVSM dans la cavité nasale, leur toxicité, leur préparation et leur utilisation dans des compositions pharmaceutiques pour l'administration par voie nasale d'agents actifs, et se référant aux dessins en annexe dans lesquels : -La figure 1 montre le temps de résidence de BVSM light cationiques marqués à l'indium 111 dans la cavité nasale humaine en pourcentage de la dose administrée et en fonction du temps.

-La figure 2 représente une comparaison de 1'effet de l'administration de 500 ug de morphine par voie nasale, seule ou en présence de BVSM Light cationique à différentes doses : 0,2 ug, 2 ug, 10 ug.

-La figure 3 représente une comparaison de 1'effet de l'administration de 500 ug de morphine par voie nasale, seule ou en présence de BVSM Light cationique à la dose de 2 ug.

-La figure 4 représente une comparaison de 1'effet de l'administration de 500 ug de morphine par voie nasale, seule ou en présence de 0,2 ug de NSP cationique.

-La figure 5 représente une comparaison de 1'effet de l'administration de 500 ug de morphine par voie nasale seule ou en présence de BVSM Light anionique à une dose de 2 ug.

-La figure 6 représente une comparaison de 1'effet antinociceptif de 500 ug de morphine seule par voie sous cutanée avec l'administration de morphine 500

ug en présence de BVSM Light cationique 2 ug par voie nasale.

-La figure 7 représente 1'effet d'un agent perméabilisant de la muqueuse nasale sur l'activité biologique de la morphine. Comparaison de 1'effet de l'administration de 500 pg de morphine avec 1 % de NaDoc avec l'administration de morphine 500 pg en présence de BVSM Light cationique 2 ug.

-Les figures 8 et 9 représentent une comparaison des aires sous courbes des figures précédentes.

-La figure 10 est une comparaison de l'administration intra nasale de 100 ug de DAGO, seul et en présence de BVSM Light cationique 2 pg.

-La figure 11 est une comparaison de l'administration de 100 ig de DAGO par voie sous cutanée et en présence de BVSM Light cationique 2 pg par voie intra nasale.

-La figure 12 représente 1'effet d'un agent perméabilisant sur l'administration intra-nasale de 100 pg de DAGO.

-La figure 13 représente l'effet d'un agent perméabilisant et du BVSM Light cationique 2 ig sur l'administration intra-nasale de 100 pg de DAGO.

-La figure 14 représente une comparaison de l'administration de 100 ig de DAGO en présence de BVSM Light cationique 2 pg par voie nasale avec l'administration de 0,05 pg de DAGO par voie ICV.

-La figure 15 représente une comparaison des aires sous courbes des graphes précédents (14,13,12,11,10) -La figure 16 représente 1'effet de l'administration de 500 ug de morphine par voie nasale et l'administration différée de 2 ug de BVSM Light cationique.

-La figure 17 représente les aires sous courbe de l'administration différée de 500 pg de

morphine par voie nasale puis de 2 ug de BVSM Light cationique comparée à : . l'administration simultanée des deux, . l'administration de la morphine seule par voie nasale et sous-cutanée, . 1'administration de la morphine avec 1 % de NaDoc par voie nasale.

-La figure 18 représente 1'effet de l'administration par voie sous cutanée et nasale de 1 ug de butorphanol.

-La figure 19 représente 1'effet de l'administration de 1 ug de butorphanol avec 1% de NaDOC par voie nasale, et de l'administration sous cutanée et nasale de 1 ug de butorphanol.

-La figure 20 représente 1'effet de l'administration nasale de 1 ug de butorphanol, et de l'administration nasale de 1 ug de butorphanol avec 0,1 ug de NSP cationique.

-La figure 21 représente les aires sous courbe de l'administration nasale de 1 ug de butorphanol, et l'administration nasale de 1 ug de butorphanol avec 0,1 ug de NPS cationique.

-La figure 22 représente 1'effet de l'administration nasale et sous cutanée de 1 ug de buprénorphine, et de l'administration nasale de 1 ug de buprénorphine avec 0,1 ug de NPS cationique.

-La figure 23 représente 1'effet de l'administration nasale et sous cutanée de 8,5 ug de buprénorphine, et de l'administration nasale de 8,5 ug de buprénorphine avec 0,1 ug de NPS cationique (NPS QAE).

-La figure 24 représente les aires sous courbe de l'administration nasale et sous cutanée de 8,5 ug de buprénorphine, et de l'administration nasale de 8,5 ug de buprénorphine avec 0,1 ug de NPS cationique.

-La figure 25 représente 1'effet de l'administration de 8,5 Ug de buprénorphine, et de

l'administration de 8,5 ug de buprénorphine avec 1 ug de vitamine B12.

-La figure 26 représente la comparaison de 1'effet de l'administration de 8,5 ug de buprénorphine avec 1 ug de vitamine B12 et 1'effet de l'administration de 8,5 pg de buprénorphine avec 0,1 ug de NPS cationique.

-La figure 27 représente 1'effet de l'administration nasale de 50 pg de FK33-824 seul ou avec 0,1 pg de NPS cationique.

-La figure 28 représente 1'effet de 1'administration nasale de 100 ug de FK33-824 (DAMME) seul ou avec 0,1 pg ou 0,05 ug de NPS cationique.

-La figure 29 représente les aires sous courbe de l'administration nasale de 100 ug de FK33-824 seul ou avec 0,1 ug ou 0,05 ug de NPS cationique.

-La figure 30 représente la pharmacocinétique sanguine de l'administration nasale ou sous cutanée de FK33-824 seul, et de l'administration nasale de FK33-824 avec des NPS cationiques (0,1 pg).

-La figure 31 représente la pharmacocinétique au site d'administration de l'administration nasale ou sous cutanée de FK33-824 seul, et de l'administration nasale de FK33-824 avec 0,1 pg de NPS cationiques (NPS QAE).

-La figure 32 représente les résultats de l'étude par autoradiographie de la localisation du peptide FK33-824 dans le cerveau : . en A, après l'administration par voie nasale de 100 ug FK33-824 ; . en B, après l'administration par voie nasale de 100 ug FK33-824 avec 0,1 pg de NPS QAE (B1) et réversion par la naloxone (B2) ; . en C, après l'administration par voie sous-cutanée de 100 ug FK33-824 (C1) et réversion par la naloxone (C2).

-La figure 33 représente les aires sous courbe de l'administration par voie nasale de 500 µg de

morphine seule ou en présence de 0,01 ug à 2 ig de NPS cationique (NPS QAE).

-La figure 34 représente les aires sous courbes de l'administration par voie nasale de 500 ug de morphine seule ou en présence de 0,2 à 130 ug de BVSM light cationique.

Exemple 1 : Etude du temps de résidence des BVSM dans la cavité nasale humaine.

1) Préparation d'une formulation radiomarquée (indium 111) de BVSM liaht cationiques.

Une solution 1llInCl3 (Cisbio, France) à 370 MBq/ml est mélangée à une solution InCl3 (Fluka, France) (InCl3 15 mM, citrate de sodium 2mM, pH6,0). Cette solution est ajoutée à une suspension de BVSM correspondant à 1'exemple 3. Ainsi la suspension finale possède les caractéristiques suivantes : BVSM 15mg/ml ; InCl3 0,3 mM ; Citrate de sodium lmM, pH 6,0.

La concentration d'Indium libre est déterminée sur un compteur gamma après dilution au 1/10 en tampon citrate 1mM pH 6,0 et ultrafiltration sur microcon 100 Kd (Amicon).

La suspension ainsi préparée est stérilisée par filtration (0,2 um) conservé à 4°C jusqu'à l'administration. Pour l'administration, 120 ul de suspension sont introduits dans des monosprays (Pfeiffer, UK) permettant l'administration de 100 ul/spray.

Le tableau I résume les résultats obtenus pour la préparation des lots utilisés dans l'étude pharmacocinétique humaine. Dans ces conditions, le marquage des BVSM par 1'InCl3 est pratiquement quantitatif avec des rendements d'association de 87,5 9,8%. De plus les doses de radioactivité (0,39 0,03 MBeq/dose) sont parfaitement compatibles avec un suivi

scintigraphique après administration nasale chez l'homme des BVSM.

Le tableau I ci-dessous indique les caractéristiques des préparation de BVSM cationiques marqués à l'Indium 111 utilisées dans l'étude de pharmacocinétique humaine.

Tableau I Moyenne SD PSC (mg/ml) 12,7 1,7 DPPC (mg/ml) = Cholestérol (mg/ml) 0,67 0, 06 Radioactivité (MBq/dose) 0,39 0, 03 2) Temps de résidence des biovecteurs dans la cavité nasale humaine.

On administre à 10 mâles non fumeurs, en bonne santé et à jeun, âgés de 18 à 35 ans, 1.5 mg de la formulation BVSM light cationiques et In dans chaque narine (100 ul/narine). Cette dose est équivalente à environ 0,02 mg/kg pour un poids d'environ 75 kg.

L'étude est une étude non randomisée. Après administration, des images scintigraphiques sont collectées avec une caméra gamma pour suivre la radioactivité administrée. Une série continue de plans latéraux de la tête est collectée.

La quantité de radioactivité dans la cavité nasale baisse de façon stable pendant la durée de l'étude, 20 % de la dose est encore détectée à 12 heures et 7% à 24 heures, ce qui est un temps de rétention important comparé à l'état de l'art antérieur. La demi- vie d'élimination de la dose de la cavité nasale est d'environ 2,3 heures, avec un modèle à 2 compartiments.

Ces résultats confirment le potentiel des BVSM pour la délivrance de substances par la voie nasale.

La figure 1 illustre les quantités moyennes de radioactivité dans la cavité nasale (en pourcentage de la dose administrée) en fonction du temps.

Exemple 2 : Etude de la toxicité des BVSM administrés aux chiens beagle et aux lapins.

1) Chien : L'objectif de cette étude est d'évaluer la toxicité potentielle des BVSM Light cationiques et des BVSM Light anioniques par administration intranasale 2 fois par jour pendant 4 semaines chez les chiens beagle.

Des tests classiques : mortalité, signes cliniques, poids corporel, consommation alimentaire sont réalisés pendant les 4 semaines. De même des tests de laboratoire : analyses hématologiques, analyse biochimique du sang et analyse d'urines sont réalisés avant le début de la période de traitement et en semaine 4. En même temps des examens électrocardiographiques, de la pression sanguine et ophtalmologiques sont effectués.

En plus, à la semaine 4, une heure après la première administration quotidienne, la vitesse de clearance mucociliaire est estimée en mesurant la vitesse de transit de particules de glucose du nez vers le pharynx. La distance de l'ouverture de la narine au nasopharynx est mesurée à l'autopsie.

Enfin, tous les animaux sont soumis à une autopsie. Les organes sont pesés et conservés. Un examen microscopique est réalisé sur toutes les lésions macroscopiques et sur les tissus des organes.

Les mesures de clearance mucociliaires montrent clairement que l'administration de BVSM light anionique ou BVSM light cationique n'altère ni les propriétés de la muqueuse ni le mouvement ciliaire à l'intérieur de la cavité nasale.

Aucune modification biologique significative ne peut être attribuée aux substances testées. Aucune observation macroscopique ou microscopique ne peut être considérée comme toxicologiquement significative, en particulier aucune anomalie macroscopique ou microscopique n'a été observée dans les cavités nasales.

En conséquence, les"No Observable Adverse Effect Level" (NOAEL), en terme de signes cliniques, poids corporel, consommation alimentaire, ophtalmologie, électrocardiographie, pression sanguine et examens de laboratoire sont supérieurs à 3,68 mg BVSM light cationique/animal/jour et à 3,80 mg BVSM light anionique/animal/jour par la voie intranasale.

2) Lapin.

Le but de cette étude est d'évaluer la tolérance locale de 4 formulations de BVSM (BVSM light anioniques et cationiques, BVSM, PSC cationiques et anioniques) après administration intranasale 2 fois par jour pendant 7 jours consécutifs chez le lapin.

Des tests de toxicité classiques : mortalité, signes cliniques, poids corporel, consommation alimentaire sont réalisés quotidiennement pendant l'étude. A la fin de la période de traitement les animaux sont sacrifiés. Toutes les lésions macroscopiques et le système pulmonaire et les cavités nasales sont conservées. L'examen histologique des cavités nasales (6 niveaux), de la trachée (2 niveaux), des bronches principales et des poumons sont réalisés sur tous les animaux.

Toxicité générale : Aucun signe de réaction générale n'est noté durant l'étude. En particulier, le poids corporel, la consommation alimentaire des animaux traités est comparable à celle des animaux de contrôle.

Examen microscopique : L'examen histologique des cavités nasales révèle l'absence de toute modification inflammatoire et/ou hyperplastique liée au traitement à tout niveau d'examen. Les petits événements observés en microscopie dans les cavités nasales, les trachées, les bronches et poumons sont ceux couramment notés chez les lapins de laboratoire non traités et ne peuvent pas être considérés comme ayant une importance toxicologique.

Quelques signes cliniques ont été notés chez les animaux de contrôle et les animaux traités et sont donc attribuables à l'administration répétée par voie nasale. Les effets sont comparables pour toutes les substances testées, quelle que soit leur nature. Sur le plan histologique, ces signes cliniques ne sont pas corrélés à des observations microscopiques.

Les substances testées sont bien tolérées par le lapin lorsqu'on les administre 2 fois par jour pendant 7 jours par voie nasale.

Exemple 3 : Synthèse des BVSM.

1) Synthèse des BVSM-PSC anioniques.

500 g de maltodextrine Glucidex (ROQUETTE, Lestrem, France) sont introduits dans un réacteur de 10 litres (TRIMIX) avec 2 litres d'eau déminéralisée. Après solubilisation à 4°C, 500 ml d'hydroxyde de sodium (NaOH) à 10M sont ajoutés sous agitation mécanique.

Quand la température de la solution est stabilisée à 4°C, 1700 ml de NaOH 10 M et 283,3 ml d'oxychlorure de phosphore (POC13) sont introduits sous débits contrôlés. La réaction de réticulation se déroule sous agitation mécanique durant 20 heures. En fin d'addition des réactifs, le mélange réactionnel est agité pendant 15 minutes. Un volume de 5 litres d'eau déminéralisée est alors ajouté. Le pH est ramené à 7.0 avec de l'acide acétique glacial.

L'hydrogel obtenu est broyé par l'intermédiaire d'un homogénéisateur à haute pression (RANNIE Lab). La pression exercée est de 500 bars. A l'issue de cette étape, les matrices dispersées ont un diamètre moyen de 60 nm.

La purification s'opère par des étapes successives de (1) microfiltration 0.45 um pour éliminer les particules de taille trop importante, (2)

diafiltration à volume constant pour éliminer les petites molécules (sels, fragments polysaccharidiques).

Enfin, les noyaux polysaccharidiques [PSC] anioniques sont concentrés et récupérés dans des flacons stériles.

2) Synthèse de BVSM-Light anioniques.

Les noyaux polysaccharidiques anioniques sont dilués avec de 1'eau osmosée dans la proportion de 1mg/1m1 (exemple : 250 mg PSC/250 ml). La dispersion est soumise à agitation magnétique (5-10 minutes) puis homogénéisée (RANNIE Minilab) à 400 bars durant 3 minutes. La dispersion de PSC est placée dans un bain- marie à 80°C.

Les lipides (exemple : DPPC, mélange de DPPC et cholestérol), sous forme de poudre, sont pesés de telle sorte que la masse totale représente, par exemple, 30% (w/w) de la masse des PSC (75 mg de lipides pour 250 mg de PSC). Les lipides constitutifs de la membrane sont mélangés et solubilisés avec 2 ml d'éthanol 95% (v/v).

L'homogénéisateur est amené à une température de 60°C. Concomitamment, les PSC dispersés à 80°C sont soumis à agitation magnétique et la solution éthanolique de lipide est injectée dans la dispersion de PSC.

Les BVSM Light anioniques ainsi obtenus sont alors entreposés dans des conditions stériles après filtration sur 0.2 um.

3) Synthèse des PSC cationiques.

500 g de maltodextrines Glucidex (ROQUETTE) sont solubilisés avec 0,880 litres d'eau à 20°C sous agitation. Puis, l'on introduit 7 g de NaBH4 et on laisse 1 heure sous agitation.

220 ml de NaOH 10 M sont rajoutés puis 30,25 ml d'épichlorydrine (Fluka). Après 12 heures de réaction, 382.3 g de glycidyltriméthylammonium chloride

(Fluka) sont introduits et le mélange est maintenu sous agitation durant 10 heures.

Le gel obtenu est dilué avec 8 litres d'eau déminéralisée et ramené à Ph 7 avec de l'acide acétique glacial.

Il est ensuite broyé par l'intermédiaire d'un homogénéisateur à haute pression (RANNIE Lab). La pression exercée est de 400 bars. A l'issue de cette étape, les matrices dispersées ont un diamètre moyen de 60 nm.

La purification s'opère par des étapes successives de (1) microfiltration 0.45 um pour éliminer les particules de taille trop importante, (2) diafiltration à volume constant pour éliminer les petites molécules (sels, fragments polysaccharidiques).

Enfin, les PSC cationiques sont concentrés et récupérés dans des flacons stériles 4) Synthèse de BVSM Light cationiques.

Les noyaux polysaccharidiques cationiques sont dilués avec de 1'eau osmosée dans la proportion de 1 mg de PSC/1 ml d'eau. La dispersion est placée dans un premier temps sous agitation magnétique (5-10 minutes) puis homogénéisée (RANNIE Minilab) à 400 bars durant 3 minutes. La dispersion de PSC est placée dans un Bain- marie à 80°C.

Les lipides (exemple : DPPC, ou mélange de DPPC avec cholestérol), sous forme de poudre, sont pesés de telle sorte que la masse totale représente, par exemple 30% (w/w) de la masse des PSC (75 mg de lipides pour 250 mg de PSC). Les lipides constitutifs de la membrane sont mélangés et solubilisés avec 2 ml d'éthanol 95% (v/v).

L'homogénéisateur, est amené à une température de 60°C minimum par circulation d'eau en circuit fermé.

Concomitamment, les PSC dispersés à 80°C sont soumis à agitation magnétique et la solution

éthanolique de lipide est injectée dans la dispersion de PSC.

Les BVSM Light cationiques ainsi obtenus sont alors entreposés dans des conditions stériles après filtration sur 0,2 um.

5) Synthèse des BVSM PSC neutres.

500 g de maltodextrines Glucidex (ROQUETTE) sont solubilisés avec 0,880 litres d'eau dans un réacteur thermostaté à 20°C sous agitation. Introduire environ 7 g de NaBH4 et laisser 1 heure sous agitation.

220 ml de NaOH 10M sont rajoutés puis 30.25 ml d'épichlorydrine (Fluka). Après 12 heures de réaction, diluer le gel avec 8 litres d'eau déminéralisée et neutraliser par ajout d'acide acétique glacial.

L'hydrogel obtenu est broyé par l'intermédiaire d'un homogénéisateur à haute pression (RANNIE Lab). La pression exercée est de 400 bars. A l'issue de cette étape, les matrices dispersées ont un diamètre moyen de 60 nm.

La purification s'opère par des étapes successives de (1) microfiltration 0.45 um pour éliminer les particules de taille trop importante, (2) diafiltration à volume constant pour éliminer les petites molécules (sels, fragments polysaccharidiques).

Enfin, les PSC sont concentrés filtrés stérilement et récupérés dans des flacons stériles.

6) Synthèse des BVSM light neutres.

Les noyaux polysaccharidiques neutres sont dilués avec de 1'eau osmosée dans un réceptacle en verre (250 mg PSC/250 ml). La dispersion est placée dans un premier temps sous agitation magnétique (5-10 minutes) puis homogénéisée (RANNIE Minilab) à 400 bars durant 3 minutes. La dispersion de PSC est placée dans un bain- marie à 80°C.

Les lipides (exemple : DPPC), sous forme de poudre, sont pesés de telle sorte que la masse totale

représente, par exemple, 30% (w/w) de la masse des PSC.

Les lipides constitutifs de la membrane sont solubilisés avec 2 ml d'éthanol 95% (v/v).

Cette nouvelle dispersion est homogénéisée à 450 bars pendant 25 minutes en circuit fermé à 60°C minimum. A l'issue de cette étape, la préparation est introduite dans un ballon en verre puis soumis à basse pression à 60°C pour éliminer l'éthanol resté en solution.

Les BVSM Light neutres ainsi obtenus sont alors entreposés dans des conditions stériles après filtration sur 0,2 um.

Exemple 4 : Préparation des formulations de substances actives.

1) DAGO.

Tampon PBS 150 mM : Un sachet de PBS (Sigma 1000-3) est dissout dans 1 litre d'eau distillée.

Solution de NaDOC à 10% : 1 g de NaDOC (Déoxycholate de sodium, Sigma D6750) est dissout dans 10 ml d'eau distillée. a) Témoin DAGO (administration i. n.) : -100 ug de DAGO/dose/10 ul -conditionnement en PBS 15 mM -Volume final pour une dose = 10 pi Préparation du témoin DAGO (volume total de 300 pi) : 3 mg de DAGO (Sigma E7384) sont dissous dans 270 ul d'eau distillée. On ajoute 30 pi de PBS 150 mM.

La solution est ensuite vortexée. b) Administration nasale de DAGO et NaDOC 1%.

-100 ug de DAGO/dose/10 ul -0,1 pg de NaDOC (soit 1 %) -conditionnement en PBS 15 mM Volume final = 10 pi = 1 dose.

Préparation du témoin DAGO : 3 mg de DAGO (Sigma E7384) sont solubilisés dans 27C ul d'eau

distillée, 30 pi de PBS 150 mM. La solution est ensuite vortexée.

Préparation de la solution de NaDOC à 1% : 50 ul de solution de NaDOC 10 % dans 450 ul d'eau.

On administre 5 ul par narine de NaDoc puis 2 à 3 mn après on administre 5 pi par narine de DAGO. c) Témoin DAGO (administration s. c.) : -100 ug de DAGO -conditionnement en PBS 15 mM -Volume final = 10 pi = 1 dose.

Préparation d'une solution de DAGO à 5 mg/ml : 3 mg de DAGO sont solubilisés dans 600 ul d'eau distillée.

Préparation de l'échantillon à administrer : 400 ul de solution de DAGO à 5 mg/ml. On ajoute 3.2 ml d'eau distillée et 400 ul PBS 150 mM. La solution est ensuite vortexée. d) Formulation DAGO/BVSM (administration i.n.) : -100 ug de DAGO -2 ug de BVSM -conditionnement en PBS 15 mM -Volume final = 10 pi = 1 dose.

Préparation des Biovecteurs : Les BVSM type Light cationiques sont dilués dans de 1'eau osmosée pour obtenir une concentration de 1,31 g de PSC par litre.

Préparation de la formulation (volume total de 300 ul) : 3 mg de DAGO (Sigma E7384) sont solubilisés dans 224,2 ul d'eau distillée, on ajoute 45,8 pi de BVSM à 1,31 g de PSC/litre et 30 ul de PBS 150 mM. La solution est ensuite vortexée. e) DAGO 0,05 ma Administration ICV.

0,05 mg DAGO/dose/5 ul (PBS 15mM) Préparation d'une solution de DAGO à 6mg/ml : on dilue au 10 ème pour obtenir une concentration de 0,6 mg/ml : -10 ul solution DAGO à 0,6mg/ml -530 ul d'eau

-60 pi PBS 150mM 2) Morphine.

Préparation du tampon PBS 150 mM : Un sachet de PBS est dissout dans 1 litre d'eau distillée.

Préparation d'une solution de NaDOC à 10 % : 1 g de NaDOC (Déoxycholate de sodium, Sigma D6750) est dissout dans 10 ml d'eau distillée. a) Témoin morphine (administration i. n.) : -500 ug de Morphine -conditionnement en PBS 15 mM -Volume final = 10 pi = 1 dose.

Préparation du témoin Morphine : 10 mg de Morphine chlorydrate (Francopia, France) sont solubilisés dans 180 ul d'eau distillée et 20 ul de PBS 150 mM. La solution est ensuite vortexée. b) Administration nasale de Morphine et NaDOC 1 % : -500 ug de Morphine/dose/10 ul -0,1ig-0,1ig de NaDOC (soit 1 %) -conditionnement en PBS 15 mM -Volume final = 10 pi = 1 dose.

Préparation du témoin Morphine : 10 mg de Morphine sont pesés puis mis dans un tube Vénoject. On ajoute 180 pi d'eau distillée et 20 ul de PBS 150 mM. La solution est ensuite vortexée.

Préparation de la solution de NaDOC à 1% : 50 ul de solution de NaDOC 10 % dans 450 pi d'eau.

On administre 5 pi par narine de NaDoc puis 2 à 3 mn après on administre 5 ul par narine de morphine. c) Témoin morphine (administration s. c.) : -500 ug de Morphine.

-conditionnement en PBS 15 mM.

-Volume final = 10 pi = 1 dose.

Préparation de l'échantillon à administrer : 10 mg de Morphine sont solubilisés dans 3,6 ml eau

distillée et 400 ul PBS 150 mM. La solution est ensuite vortexée. d) Formulation Morphine/BVSM (administration i. n.) : -BVSM Light cationicrue 2 ig . 500 ug de Morphine . 2 ug de BVSM . volume final : 10µl en PBS 15 mM Préparation des BVSM : Les BVSM Light cationiques sont dilués dans de 1'eau osmosée pour obtenir une concentration de 1,31 g de PSC par litre.

Préparation de la formulation (volume total de 200 ul) : 10 mg de Morphine sont solubilisés dans 149,5 pi d'eau distillée, 30,5 ul de Biovecteur dilué à 1,31 g/1 et 20 pi de PBS 150 mM. La solution est ensuite vortexée.

-BVSM Light cationique 0,2 lig . 500 ug de morphine . 0, 2 ug de BVSM Light cationique . Volume final : 10 ul en PBS 15mM Préparation des BVSM : Les BVSM Light cationiques sont dilués dans de 1'eau de manière à obtenir une concentration de 0,131 g/1 en PSC.

Préparation de la formulation (Volume total de 200 zip idem exemple précédent.

-BVSM Light cationique 10 µg : . 500 ug morphine 10 pg BVSM Light cationique . Volume final 10 ul en PBS 15mM.

Préparation des BVSM : Les BVSM Light cationiques sont à 13,1 g/1 PSC.

Préparation de la formulation (Volume total 200 ul) : 10 mg de morphine sont solubilisés dans 164,7 ul d'eau distillée 15,3 ul de biovecteur à 13,1 g/1 et 20 ul de PBS 150 mM. La solution est ensuite vortexée.

-PSC cationiaue 0,2 µg : . 500 ug morphine 0,2 ug PSC cationique

. Volume final 10 ul en PBS 15 mM Préparation des BVSM : les PSC cationiques sont dilués dans 1'eau de manière à obtenir une concentration en PSC de 0,27 g/1 Préparation de la formulation (Volume total 200 pi) : 10 mg de morphine sont solubilisés 165,2 ul d'eau distillée, 14,8 ul de biovecteur à 0,27g/l en PSC et 20 pi de PBS 150mM.

-BVSM Light anioniaue (Phosphate) 2 uq : . 500 ug morphine . 2 ug BVSM Light anionique . Volume final 10 ul en PBS 15mM Préparation des BVSM : Les BVSM Light anioniques sont dilués au 10 ème dans 1'eau de manière à obtenir une concentration en PSC de 0,61 g/1 Préparation de la formulation (Volume total 200 ul) : 10 mg de morphine sont solubilisés dans 114,4 pi d'eau, 65,6 ul de PSC à 0,61 g/1 et 20 ul PBS 150ml.

Exemple 5 Résultats.

Les activités antinociceptives des différentes préparations ont été quantifiées (Test d'Amour & Smith) comme étant l'augmentation du temps de latence du retrait de la queue de la souris soumise à une stimulation nociceptive (faisceau lumineux dirigé sur l'extrémité de la queue). Les temps de latence sont mesurés deux fois avant l'administration des formulations et à 15 mn, 30,60,90,120,240,360 minutes après administration. Chaque lot est composé de 10 souris Swiss de 25-30 grammes (Souches Charles Rivers, USA). Un seuil maximum de 6 ou 8 secondes de stimulation est fixé pour empêcher la brûlure des tissus. Lorsque l'animal n'a pas répondu à ce"cut-off", l'analgésie est considérée de 100 %.

Un effet antinociceptif de 15 % est considéré comme minimal pour être pris en considération.

1) Protocoles d'administration. a) Administration nasale (i. n.).

5 ul d'échantillon sont instillés à l'aide d'une pipette P20 dans chaque narine. Soit un volume total administré de 10 ul.

Pour l'essai Principe actif + NaDOC.

Administration de 2 * 5 pi par narine de NaDOC 1% puis 2 à 3 minutes après, administration de 2 * 5 pi par narine de principe actif. b) Administration sous cutanée (s. c.).

200 ul d'échantillon sont injectés par voie sous cutanée à chaque souris au niveau de la cuisse arrière.

2) Résultats avec la Morphine.

Les figures 2 et 3 montrent que la morphine administrée par voie nasale a un effet antinociceptif.

Cet effet est maximal à 30 minutes et décroît rapidement une heure après l'administration.

En présence de BVSM Light cationiques nous observons un effet antinociceptif maximal à 30 minutes et une durée de cet effet supérieure à celui de la morphine seule, avec une décroissance à partir de 2 heures.

La figure 4 montre, en présence de BVSM-PSC cationique, un effet antinociceptif maximal plus tardif que celui de la morphine seule, mais sa durée est comme pour le BVSM Light cationique supérieure à celui de la morphine seule.

Les BVSM (de type Light et de type PSC) permettent d'accroitre la durée d'action de la morphine administrée par voie nasale.

La figure 5 montre, en présence de BVSM Light anionique, un effet supérieur et une durée d'action supérieure à ceux de la morphine seule.

Sur la figure 6, on observe que la morphine administrée par voie sous cutanée induit un effet antinociceptif rapide (90't, environ au bout de 15

minutes). L'effet maximal décroît à partir de 90 minutes. La morphine administrée par voie nasale en présence de BVSM a un effet antinociceptif maximal un peu plus faible (environ 80 %). Cet effet décroît à partir de 90 minutes, moins rapidement que la morphine seule par voie systémique. 30 à 40 % d'effet antinociceptif est encore enregistré au bout de 4 heures en présence de BVSM administrés par voie nasale.

La figure 7 montre l'effet du NaDOC à 1 %, substance connue pour favoriser le passage des substances actives du nez vers le sang. En utilisant du Na DOC lors de l'administration nasale de la morphine, on n'observe pas d'augmentation de 1'effet antinociceptif par rapport à la morphine seule. Cette observation incite à penser que l'activité observée après administration nasale de morphine ne serait pas due à un passage de la morphine de la muqueuse nasale vers le sang mais plutôt à un passage direct du nez au cerveau (le LCR notamment). Ce résultat confirme les résultats obtenus par T. Sakane et al. (STP Pharma Sciences 7 (1) 98-106 (1997)).

Comme constaté sur la figure 3, on observe une durée d'effet supérieure à celui de la morphine en présence de perméabilisant.

Les figures 8 et 9 montrent que dans tous les cas où la morphine est mélangée à un biovecteur, quel que soit son type, l'aire sous courbe est supérieure à celle correspondant à la morphine seule par voie nasale, phénomène lié à l'augmentation de la durée de 1'effet antinociceptif dans le cas de l'utilisation des BVSM.

La morphine en présence de BVSM par voie nasale semble avoir un effet proche de celui de la morphine seule par voie systémique. On observe une bioéquivalence des voies d'administration en utilisant les BVSM.

3) Résultats avec le DAGO.

La figure 10 montre que le DAGO seul par voie nasale n'est pas actif (effet antinociceptif en dessous du seuil de 15%) la présence des BVSM permet le passage du DAGO au cerveau et on observe une activité antinociceptive importante.

Sur la figure 11, on observe que le DAGO administré par voie systémique induit un pic d'antinociception de 40% une demie heure après l'administration. Cet effet est fugace et se retrouve en dessous du seuil de 15% en moins d'une heure. Le DAGO administré par voie nasale en présence de BVSM induit un effet antinociceptif légèrement décalé dans le temps, mais pour arriver à la même intensité (40%) une heure après l'administration. Par contre, cet effet est encore décelable 2 heures après l'administration. Une dose donnée de DAGO par voie nasale en présence de BVSM est donc plus efficace que la même dose par voie systémique.

Cette observation plaide pour l'hypothèse d'un passage du DAGO depuis le nez jusqu'au cerveau qui serait induit par les BVSM et qui n'emprunterait pas la voie sanguine.

La figure 12 montre que le NaDOC induit un léger effet antinociceptif du DAGO. Il permet donc un passage du DAGO de la muqueuse nasale vers le cerveau.

La figure 13 indique toutefois que le Na DOC permet au DAGO d'atteindre le cerveau et d'exprimer une activité antinociceptive. Cependant, cette activité est inférieure à celle observée en présence de BVSM. Le Na DOC est un agent perméabilisant puissant (et toxique) des muqueuses qui favorise le passage des substances dans le sang. Les BVSM ne sont pas toxiques au niveau mucosal. Ils sont toutefois plus puissants que le Na DOC pour l'activation du passage du nez au cerveau, soit en empruntant la voie sanguine, soit en empruntant un autre passage.

La figure 14 montre qu'en présence de BVSM, 1'effet antinociceptif est moins rapide et un peu moins important, mais là encore la durée d'action est plus longue.

Ce résultat est confirmé par la figure 15 où l'on note que l'aire sous courbe correspondant à l'administration de DAGO et de BVSM est plus importante que les aires correspondant à l'administration (quel qu'en soit le mode) de DAGO seul ou en présence du perméabilisant NaDOC.

En ce qui concerne l'administration différée, on remarque sur la figure 16, que l'allure des courbes correspondant à l'administration de morphine puis de BVSM ou de BVSM puis de morphine est très semblable à celle correspondant à l'administration conjointe de morphine et de BVSM de la figure 4. Ceci est confirmé sur la figure 17, où l'on note une aire sous courbe pour l'administration différée de morphine voisine de celle correspondant à l'administration conjointe de morphine et de BVSM. Ces résultats montrent clairement que le concept de"transporteur"attribué dans l'art antérieur aux BVSM n'est pas applicable ici.

Exemple 6 : Étude de 1'effet antinociceptif du butorphanol.

1) Préparation des formulations de substances actives.

-Produits administrés.

Lots de vecteurs utilisés : NPS cationiques : type K lot 7108 à 23,8 g/1 Butorphanol (tartrate salt) : Sigma B9156 lot 47H1023 (France) PBS : Sigma (France) Déoxycholate de sodium (NaDOC) : Sigma D6750 lot 102H0811 (France) -Préparation des Vecteurs.

Les vecteurs sont dilués en eau : NPS cationique à 0,5 g/1 : 1 ml de vecteur + 3,76 ml eau puis cette solution est diluée au 1/10 en eau.

NPS cationique à 0,1 g/l : dilution au 1/5 de la solution à 0,5 g/1.

-Préparation d'une solution de NaDOC 1%.

On solubilise 0.1 g de NaDOC dans 10 ml eau.

-Préparation d'une solution de Butorphanol.

Butorphanol à 1 mg/ml : solubilisation de 2 mg de Butorphanol dans 2 ml d'eau.

2) Préparation des échantillons.

-Butorphanol seul.

La préparation des échantillons est réalisée extemporanément, dans des tubes Vénojects par ajout successif de : Dose de butorphanol 1 pg 1 ig Volume administration 10 ul 200 ul Mode administration I. N. S. C.

Solution butorphanol 20 ul 12.5 ul Eau 160 pi 2237.5 ul PBS 150 MM 20 ul 250 pi Volume total 200 pi 2,5 ml -Butorphanol en présence de NPS cationiques.

La préparation des échantillons est réalisée extemporanément, dans des tubes Vénojects par ajout successif de : Dose de butorphanol 1 pg Dose de vecteurs 0.1 pg Volume administration 10 pi Mode administration I. N.

Solution butorphanol 20 pi NPS cationiques à 0,1 g/1 20 ul Eau 140 ul PBS 150 mM 20 ul Volume total 200 ul -Butorphanol + 1% NaDOC.

Dose de butorphanol 1 ug Dose de NaDOC 1% Volume administration 10 pi voie administration nasal 3) Protocoles d'administration.

Par voie nasale et par voie sous-cutanée, les protocoles sont ceux décrits dans 1'exemple 5.

Pour une administration nasale en présence de NaDOC, 10ul de solution de NaDOC 1% sont instillés à des souris non anesthésiées (5ul par narine) à l'aide d'un pipetman (P20) puis 2-3 minutes après on administre de la même manière l0ul de solution de butorphanol.

4) Résultats.

Les activités antinociceptives des différentes préparations ont été quantifiées comme indiqué dans 1'exemple 5 La figure 18 montre qu'une administration de 1 ug de Butorphanol par voie sous cutanée ne donne aucun effet antinociceptif significatif, la figure 19 que la présence de 1 % de NaDOC (détergent capable de détruire la muqueuse nasale) susceptible de favoriser un passage nez-sang ne permet pas d'améliorer 1'effet antinociceptif du Butorphanol. Ceci n'est pas très surprenant puisque 1 ug de butorphanol par voie sous cutanée ne donne aucun effet antinociceptif. Par contre sur la figure 20, on constate que la présence de 0.1 ug de NPS cationique pour 1 ug de Butorphanol permet d'obtenir un effet antinociceptif supérieur à celui obtenu avec le butorphanol seul, résultat confirmé sur la figure 21 présentant une comparaison des aires sous courbe.

Une dose de 0,1 ug de NPS cationique permet d'améliorer de manière significative l'activité antinociceptive du Butorphanol pour une dose de 1 ug par voie nasale. L'effet observé est également supérieur à

celui observé par voie sous cutanée pour une dose de 1 ug de butorphanol.

Exemple 7 : Etude de 1'effet antinociceptif de la Buprenorphine en présence de vecteurs NPS cationiques ou de vitamine B12.

1) Préparation des formulations de substances actives.

-Produits administrés.

Lots de vecteurs utilisés : NPS cationiques : type K lot 7108 à 23.8 g/1 Buprénorphine hydrochloride : Sigma B9275- France PBS 150 mM (NaH2PO4/Na2HPO410mM, NaCl120mM, KCl 2,7mM) : Sigma-France Vit B12 : Sigma V2876 France -Préparation des Vecteurs Les vecteurs sont dilués en eau : NPS cationique à 0.2 g/l 1 ml de vecteur + 3,76 ml eau puis cette solution est diluée au 1/25 en eau.

-Préparation de solution de Vit B12.

Vitamine B12 à 10 mg/ml : solubilisation de 10 mg de vitamine B12 dans 1 ml d'eau.

Vitamine B12 à 1 mg/ml : 100 ul de vitamine B12 à 10 mg/ml dans 900 pi d'eau.

-Préparation d'une solution de Buorénoruhine.

Buprenorphine à 1 mg/ml : solubilisation de 1 mg de Buprénorphine dans 1 ml d'eau. On vortexe bien car la Buprénorphine est lipophile. La présence de PBS 15 mM fait précipiter la Buprenorphine.

2) Préparation des échantillons.

-Préparation des échantillons.

La préparation des échantillons est réalisée extemporanément, dans des tubes Vénojects par ajout successif de : seule.-Buprénorphine Dose de Buprénorphine 1 ig 8.5 ug 8.5ug Volume administration 10 ul 10 pi 200u1 Mode administration i. n. i. n. s. c.

Buprénorphine à 1 mg/ml 20 pi 170 ul 170pl Eau 180 pi 30 pi 3830pl -Buprénorphine en présence de BVSM.

Dose de Buprénorphine 1 ug 8.5 ug Dose de NPS cationique 0.1 ug 0.1 ug Volume administration 10 ul 10 ul Voie administration nasale nasale Buprénorphine à 1 mg/ml 20 ul 170 pi NPS cationique à 0.2 g/1 10 pi 10 ul Eau 170 ul 20 ul -Buprénorphine en présence de Vit B12.

Dose de Buprénorphine 8.5 ug Dose de vitamine B12 1 µg Volume administration 10 ul Voie administration nasale Buprénorphine à 1 mg/ml 170 ul Vitamine B12 à 1 g/1 20 ul Eau 10 ul 2) Protocoles d'administration.

Par voie nasale et par voie sous-cutanée, les protocoles sont ceux décrits dans 1'exemple 5.

3) Résultats.

La figure 22 montre que la présence de 0, 1 pg de NPS cationique pour 1 ig de Buprénorphine ne permet pas d'améliorer l'activité antinociceptive du principe actif administré par voie nasale.

Les figures 23 et 24 montrent que la présence de 0,1 ug de NPS cationique pour 8,5 ug de Buprénorphine permet d'améliorer l'activité antinociceptive du principe actif administré par voie nasale.

Ceci confirme que la quantité de particule nécessaire à l'augmentation de l'activité antinociceptive est très inférieure à la quantité d'agent actif et donc que 1'effet"transporteur"du biovecteur n'est pas mis en jeu.

La figure 25 montre que la présence de 1 ug de Vit B12 pour 8,5ug de buprénorphine permet d'améliorer l'activité antinociceptive de la buprénorphine administée par voie nasale. La figure 26 permet la comparaison des effets de la Vit B12 et des NPS sur l'activité antinociceptive de la buprénorphine.

On constate que ces effets présentent un haut degré de similitude. Il est connu que la vitamine B12 favorise 1'endocytose (J. A. Robertson, N. D. Gallagher, 1985, "In vivo evidence that colabaminin is absorbed by receptor-mediated endocytosis in the mouse", Gastroenterology, 88,908-12). Le mécanisme impliqué pourrait être le même.

Exemple 8 : : Étude de 1'effet antinociceptif du peptide FK33-824.

L'étude sur le passage de la barrière hématoencéphalique de molécules hydrophiles ou lipophiles est complétée par l'utilisation d'un peptide, le FK33-824 (OU DAMME) de nature hydrophile tout comme le DAGO. Le FK33-824 de masse molaire 603 répond à la formule suivante : Tyr-D-Ala-Gly-[N-Methyl-Phe]-Met [0]-ol 1) Préparation des formulations de substances actives.

-Produits administrés.

Lots de vecteurs utilisés : NPS cationiques : type K lot 7108 à 23,8 g/1 FK33-824 (ou DAMME) : 100 mg ont été synthétisés par IPBS-France PBS : Sigma (France) -Préparation des vecteurs.

NPS cationique à 0,5 g/1 : 1 ml de vecteur + 3.76 ml eau puis cette solution est diluée au 1/10 en eau.

NPS cationique à 0.1 g/l : dilution au 1/5 de la solution à 0.5 g/1.

NPS cationique à 0.05 g/1 : dilution au 1/2 de la solution à 0.1 g/1.

-Préparation d'une solution de FK33-824 à 14 m/ml.

Solubilisation de 6 mg de FK33-824 dans 428,5 ul d'eau.

2) Préparation des échantillons.

-FK33-824E seul.

La préparation des échantillons est réalisée extemporanément, dans des tubes Vénojects par ajout successif conformément au tableau II ci-dessous : Tableau II 50 ug FK33-824 100 pg FK33-824 /10 µl/10 Solution FK33-824A 53.5 1 107 µl Eau 81.5 pi28 pi PBS 150 mM 15 ul 15 ul -FK33-824 en présence de Biovecteurs.

La préparation des échantillons est réalisée extemporanément, dans des tubes Vénojects par ajout successif conformément au tableau ci-dessous : Tableau III 50 µg µgFK33-100µgFK33-100 + 0,1 µg NPS824 + 0,1 0,05µg824+ cationique NPS cationique NPS cationique dans 10 1 dans 10 1 dans 10 pi Solution 68 ul 107 ul 107 ul FK33-824 NPS 38 pi cationique à 0,05 gel NPS-15 ul 7.5 ul cationique à 0,1 g/1 Eau 65 1 13 pi 20.5 pi PBS 150 mM 19 ut pi15 pi

3) Protocoles d'administration.

Par voie nasale et par voie sous-cutanée, les protocoles sont ceux décrits dans 1'exemple 5.

4) Résultats.

Les activités antinociceptives des différentes préparations ont été quantifiées comme indiqué dans 1'exemple 5. la figure 27 montre que la présence de 0,1 ig de NPS cationique pour 50 ig de FK33-824 permet d'obtenir un effet antinociceptif de 20% +/-10% à 30 minutes alors que le peptide seul est inactif à cette dose. les figures 28 et 29 montrent que la présence de 0,05 ug ou 0,1 ig de NPS pour 100 pg de FK33-824 permet d'améliorer de façon significative l'activité antinociceptique du peptide. On obtient un effet antinociceptif de 40-50% à 60-90 minutes alors que le peptide seul donne un effet maximum de 20%.

Exemple 9 : : Evaluation du passage systémique du FK33-824-Iodel25 en présence de BVSM après administration nasale chez la souris.

Une dose de 0,05 pg ou 0,1 µg de NPS cationique permet d'améliorer de manière significative l'activité antinociceptive du FK33-824 à la dose de 100 pg par voie nasale chez la souris Swiss en utilisant le tail flick test.

Afin de mieux comprendre le mécanisme d'action des BVSM, la pharmacocinétique sanguine (passage nez-sang) du FK33-824-iodel25 a été étudiée en présence de NPS cationique après administration nasale ou sous cutanée chez la souris Swiss.

1) Préparation des formulations de substances actives.

-Produits administrés.

Lot de BVSM utilisé : NPS cationique (type K LOT 7108) à 23,8 g/l.

FK33-824 (ou DAMME) : 100 mg ont été synthétisés par IPBS-France Iode 125 en NAOH 0,05N : CIS bio international I125-S-4 à 1 mCI/10 ul.

Iodogène : Simiod (Cérébio) PBS 150 mM (NAH2PO4/NA2HPO10mM, NACl120mM, KCl 2,7mM) (Sigma-France) TRIS (Sigma-France) -Préparation des solutions.

Solution de FK33-824 à 14 mg/ml : soit 3 mg de FK33-824 dans 0.21 ml d'eau (exemple).

Tampon TRIS 50 mM, pH 7,4.

Solvant HPLC : méthanol 43%/acide acétique 1%/eau 56% (dégazé).

-Marquage du FK33-824 à l'iode125 L'iode 125 se lie de façon covalente en position para des tyrosine du peptide.

Utilisation comme oxydant de la réaction : iodogéne.

Dans un tube en polypropylène (5 ml) : 100 ul de tampon Tris 50 mM pH 7.4 10 ul de FK33-824 à 10 mg/ml 10 ul iode125 (1 mCi) agitation douce 1 bille iodogène

agitation douce (à la main) pendant exactement 1 minute on enlève la bille d'iodogène et on rince avec 100 pi d'un mélange eau/méthanol (50/50) Volume final de marquage : 220 ul.

-Purification du FK33-824 marqué à l'iode125 Cette étape consiste à séparer le peptide marqué à l'iode du peptide non marqué par HPLC (solvant HPLC).

-Concentration du FK33-824-I125 La solution de FK33-824-I125 est en méthanol 43%/acide acétique 1%/eau 56%. Afin d'administrer cette solution aux souris, il est nécessaire d'éliminer au maximum le méthanol.

Pour cela, on met un souffle d'azote sur la solution de K33-824-I15 récupérée par purification par HPLC.

Au bout de 2h00, on a concentré de deux fois la solution par évaporation du méthanol.

-Activité du FK33-824-I:1mCi/ml.

Comme le rendement du compteur est de 80% : 333333/0.8 = 416666 Becquerel (Bq) pour 10 ul Comme 1 mCi correspond à 3.7.107 Bq : soit 0.01 mCi pour 10 ul ou 1 mCi/ml 2) Préparation des échantillons.

--FK33-824 FK33-824-I125/10µlµCi Dans un tube en polypropylène, ajout successif de : 178.8 ul de FK33-824 à 14 mg/ml 25 ul de FK33-824-I125 21.2 ul eau 25 pi PBS 150 mM -FK33-824 100µg + 0.1 ua NPS OAE + 1 uCi FK33-824-I12'/10 ul Dans un tube en polypropylène, ajout successif de :

178,8 ul de FK33-824 à 14 mg/ml 25 ul de FK33-824 _ 121 12.5 ul NPS QAE K7108 à 0.2 g/1 8.7 ul eau 25 ul PBS 150 mM -FK33-824 100µg+1µCi FK33-824-I1Q5/200 ul Dans un tube en polypropylène, ajout successif de : 178.8 pi de FK33-824 à 14 mg/ml 25 ul de FK33-824-Il25 4296.2 ul eau 500 pi PBS 150 mM 3) Administration.

Pour une administration nasale, 10pl de formulation sont instillés à des souris non anesthésiées (5ul par narine) à l'aide d'un pipetman (P20).

Pour une administration sous cutanée, 200 ul sont injectés au niveau dorsal à l'aide d'une seringue (type insuline codan 621612) et d'une aiguille 26G1/2 (térumo NN2613R).

Les administrations seront réalisées derrière une plaque de plexiglass afin d'éviter les risques de contaminations.

4) Prélèvement des oraanes.

Pour les temps (0--5-15-30-60-90-120 et 240 minutes), après administration 3 souris sont pesées puis sacrifiées par décapitation en absence d'anesthésie.

Pour chaque animal : -au niveau sanguin : le sang est récupéré et pesé dans un tube en polypropylène.

-au site d'administration : on récupère et on pèse les nasaux ou la cuisse arrière selon la voie d'administration.

5) Comptage et exploitation des résultats

Les échantillons sanguins et sites d'administration sont placés dans un compteur gamme de rendement de 80%.

Les cpm mesurés sont ramenés en cpm/g d'organes et normalisés pour une dose de 1000000 cpm administrés.

6) Résultats.

-Pharmacocinétique sanguine La figure 30 montre que par voie sous cutanée, on observe un pic de FK33-824-I à 15-30 minutes après administration alors que la voie nasale ne semble pas permettre une arrivée massive de produit au niveau sanguin que ce soit en présence ou non de vecteurs.

-Pharmacocinétique au site d'administration La figure 31 montre que les vecteurs augmentent la quantité de peptide et leur temps de résidence au niveau nasal.

La pharmacocinétique sanguine permet de constater qu'il n'y a pas de différence due à la présence du vecteur, alors que l'addition de celui-ci permet d'augmenter l'activité antinociceptive de lOOug de FK33-824. Il n'y a pas de lien direct entre la délivrance plasmatique et l'activité pharmacologique en présence de vecteurs. Ce résultat semble plaider en faveur d'un passage direct nez-cerveau. Il semblerait que l'administration par voie nasale du peptide en présence de biovecteur permette une résidence nasale plus grande du FK33-824 probablement dans l'epithélium mucosal. Le mécanisme impliqué pourrait être l'activation de 1'endocytose des cellules épithéliales par le biovecteur à des doses de biovecteur bien définies.

La localisation du peptide FK33-824 à l'intérieur du cerveau après administration nasale a été étudiée.

Exemple 10 : : Localisation du peptide FK33- 824 Iode125 aDrès administration par voie nasale en présence ou non de vecteur NPS cationique.

La localisation du peptide FK33-824 Iode~25 dans le cerveau est étudié par autoradiographie après administration par voie nasale et sous-cutanée du peptide seul, ainsi qu'après administration par voie nasale du peptide et du vecteur NPS cationique.

Les solutions de peptide iodé en présence ou non de vecteur NPS cationique, sont les mêmes que celles utilisées à 1'exemple précédent. La méthode d'administration est également la même que celle utilisée à 1'exemple 9 (4 à 5 uCi Iodel25 au lieu de 1 uCi).

1) Mode opératoire.

Dix, 30 et 90 minutes après l'administration, on sacrifie les souris par décapitation. le cerveau est coupé en deux et plongé dans l'isopentane à-45° pendant une minute. il est ensuite stocké à-80°.

On réalise des coupes de 20. um d'épaisseur.

La révélation des lames a lieu après 4 jours ou un mois d'exposition suivant le film et les photos sont scannérisées conduisant à la figure 32.

2) Résultats.

En C1, correspondant à l'administration du peptide seul par voie sous-cutanée, la marque de radiactivité se fait de façon diffuse dans l'ensemble du cerveau. le peptide pénètre le cerveau de manière

homogène à travers la barrière hematoencéphalique, ce qui est caractéristique de la voie sanguine.

Si le peptide est administré seul par voie nasale (A1), rien n'est visible. Le peptide ne semble pas atteindre le cerveau. Il n'utilise pas la voie sanguine.

Par contre en B1, correspondant à l'administration par voie nasale du peptide en présence du vecteur NPS, le peptide atteint le cerveau et plus particulièrement la périphérie des lobes olfactifs.

Il a été vérifié que la radioactivité observée en B1 est bien spécifique du peptide FK33-824 et non pas due à des produits de dégradation du peptide.

Pour cela, il a été effectué une expérience de réversion du peptide par la naloxone. La naloxone est une molécule antagoniste qui chasse le peptide de ses récepteurs (récepteurs u des opiacés) en se fixant à sa place.

3) Expérience de réversion à la naloxone.

-Produit utilisé.

Naloxone hydrochloride Sigma France -Préparation d'une solution de naloxone à 2 m/ml.

1 mg de naloxone + 5 ml d'eau.

-Mode d'administration.

300 ul de solution de naloxone à 2 mg/ml (soit 2,4 mg/kg souris) sont injectés par voie sous- cutanée juste après l'administration des échantillons.

-Résultats.

On observe en B2 l'absence de marquage des bulbes olfactifs. la naloxone semble bien avoir chassé le peptide FK33-824 des récepteurs.

4) Conclusions.

L'ajout de 0,1 ug de vecteur NPS cationique pour 100 ug de FK33-824, permet d'activer le passage du

peptide du nez directement vers les lobes olfactifs du cerveau.

Exemple 11 : : Effet de la dose de NPS cationiques sur l'activité de la morphine administrée par voie nasale.

Les essais réalisés in vivo à 1'exemple 5 ont montré que la présence de biovecteurs NPS cationiques permet d'augmenter de manière significative l'activité antinociceptive de la morphine par administration nasale.

Le but de cette étude est de déterminer 1'effet de la dose de NPS cationiques administrés par voie nasale avec une dose constante de morphine de 500 ug et le comparer à la morphine seule administrée par voie nasale.

1) Préparation des formulations de substances actives.

-Produits administrés.

Lots de vecteurs utilisés : NPS cationiques F396 R à 27 g/1 Morphine utilisée : morphine chlorhydrate (Francopia-France).

PBS 150 mM (NAH2PO4/NA2HP0410mM, NAC1120mM, KCL 2.7MM) (Sigma-France) -Préparation des échantillons.

. préparation des vecteurs.

Les vecteurs sont dilués en eau à une concentration finale de 5 g/l. puis dilués comme indiqué dans le tableau ci-dessous : Solution 2,5g/1 1g/l 0,5g/1 0,2g/1 0, lg/1 0,05g/1 0,02gel a pi 250 100 200 100 100 200 100 vecteur (à 5g/1) (à 5g/1) (à lg/1) (à 1g/l) (à 0,5g/1) (à 0, lg/1) (à 0,1g/l) ul eau 250 400 200 400 400 200 400

Préparation d'une solution de morphine à 60 mg/ml (solution A).

Ajout sur 120 mg de morphine chlorhydrate de 2 ml d'eau.

La solution est ensuite vortexée.

. Préparation des formulations nasales (500 ua de morphine/dose 10 ul).

La préparation des formulations est réalisée extemporanément, dans des tubes vénojects par ajout successif comme indiqué dans le tableau ci-dessous : ug NPS 0 ug 0, Olug 0,025 0, 2 0,4 1 µg 2 ug pg ug ug ug ug solution 104,2 104,2 104,2 104,2 µlµlµlµlµlµlµlµlmorphineµl solution _ 6,3 ul 6.3 ul 6,3 ul 6, 3ul 5 µl 5 µl 5 µl 5 ul NPS (à 0,02 (0,05 (0,1 (0.2 (0, 5 (1 (2,5 (5 g/1) g/1) g/1) g/1) g/1) g/1) g/1) g/1) eau 8,3 2 pi 2 ul 2 ul 2 ul 3, 3 3,3 3, 3 3, 3 µlµlµlµlµl PBS 150 mM 12,5 12,5 12,5 12, 5 ul pi ul ul ul ul ul ul ul 2) Administration.

Pour une administration nasale, 10ul de formulation est instillé à des souris non anesthésiées (5ul par narine) à l'aide d'un pipetman (P20).

3) Mesure de l'effet antinociceptif.

Celle-ci est réalisé comme dans les exemples précédents.

4) Résultats et conclusions.

Ces résultats sont donnés sur la figure 33.

On constate qu'un effet antinociceptif supérieur à celui obtenu avec une dose de 500ug de morphine seule est obtenu losque l'on administre la morphine en présence de 0,025pg à 0,2ug de NPS cationiques. ce résulta confirme que la quantité de particules nécessaire à l'augmentation de 1'effet antinociceptif est très inférieure à la quantité de principe actif administré par voie nasale et donc qu'il n'y a pas d'association

entre le vecteur et le principe actif. les NPS cationiques ne jouent pas ici le rôle de"transporteur".

Exemple 12 : : Effet de la dose de vecteurs light cationiques sur l'activité de la morphine administrée par voie nasale.

Les essais réalisés in vivo à 1'exemple 5 ont montré que la présence de biovecteurs light cationiques permet d'augmenter de manière significative l'activité antinociceptive de la morphine par administration nasale.

Le but de cette étude est de déterminer 1'effet de la dose de biovecteurs light cationiques administrés par voie nasale avec une dose constante de morphine de 500 ug et le comparer à la morphine seule administrée par voie nasale.

1) Préparation des formulations de substances actives. a) Produits administrés.

Lots de biovecteurs utilisés : BVSMO light cationiques KY7026.

Morphine utilisée : morphine chlorhydrate (Francopia-France).

PBS 150 mM (NaH2PO9/Na2HP010mM, NaCl120mM, KCl 2,7mM) (Sigma-France). b) Préparation des échantillons.

-Préparation des vecteurs.

Les Biovecteurs sont dilués en eau à une concentration finale de NPS de 5 g/l.

-Préparation d'une solution de morphine à 60 m/ml (solution A).

Ajout sur 120 mg de morphine chlorhydrate de 2 ml d'eau.

La solution est ensuite vortexée.

Préparation des formulations nasales (500 Lia de morphine/dose) en présence des vecteurs.

La préparation des formulations est réalisée extemporanément, dans des tubes Vénojects par ajout successif conformément au tableau ci-dessous : BVSM ug 0 0,2 2 2,5 3 10 130 (en NPS) Solution 104,2 104,2 104.2 104,2 104,2 15 15 morphine pi pi ul ul ul ul ul ul mg mg Solution-5 ni 5 ul 6,3 3,7 30 ul 298 BVSM à 0.5 ul ul ul à 5 pi pi à 10 pi g/1 à 2.5 6 5 A 5 g/1 à 5 à 10 g/1 pur g/l g/l g/l g/l g/l Eau 8,3 3,3 3,3 2 ul 4,6 240 2 ul ul ul ul ul ul ul ul ul PBS 12,5 12,5 12,5 12,5 12,5 30 pi 150mM ul ul ul ul ul ul ul ul Les solutions sont ensuite vortexées.

2) Administration.

Pour une administration nasale, 10 pi de formulation sont instillés à des souris non anesthésiées (5ul par narine) à l'aide d'un pipetman (P20).

3) Mesure de 1'effet antinociceptif.

Est réalisé comme dans les exemples précédents.

4) Résultats et conclusions.

Ces résultats sont donnés sur la figure 34. On constate qu'un effet antinociceptif supérieur à celui obtenu avec une dose de 500ug de morphine seule est obtenu lorsque l'on administre la morphine en présence de 1,5 ug à 2,5 ug de vecteurs light cationiques. Ce résultat confirme que la quantité de particules nécessaire à l'augmentation de 1'effet antinociceptif est très inférieure à la quantité de principe actif administré par voie nasale et donc qu'il n'y a pas d'association entre le vecteur et le principe

actif. Les vecteurs light cationiques ne jouent pas ici le rôle de"transporteur".

Exemple 13 : : Mise en évidence de la non association du principe actif (morphine) avec le vecteur.

Le pourcentage d'association de morphine aux biovecteurs est évalué par ultrafiltration sur microcon 100Kd. Par cette technique, les vecteurs restent sur le filtre du microcon, on peut ainsi évaluer la morphine libre ou associée aux vecteurs. On suit la morphine marquée au tritium H3.

1) Préparation des formulations de substances actives.

-Préparation des vecteurs.

BVSM QAE (light cationiques) : dilution à 3,46 g/1 en NPS soit 176, 6µl de vecteur + 823,4 ul eau.

NPS QAE : dilution à 0,173g/l soit 100pl de vecteur + 900 ul d'eau puis dilution 73 pi + 927 pi d'eau.

-Préparation solution de morphine.

Solution A : solution mère de morphine tritiée à 60 mg/ml et 2 200 000 cpm/ml soit 300 mg de morphine + 10 pi morphine-H3 + 5 ml eau -Préparation des échantillons.

Les échantillons sont préparés extemporanément de la façon indiquée dans le tableau ci- dessous dans des tubes vénoject. Morphine H3 Morphine H3 500ug/10ul 500ug/10ul 18 000 cpm/10ul 18 000 cpm/lOul NPS cationique BVSM light cationique 0,1 pg/lOP1 2pg/10pl Solution A 416,6 ni416,6 pi Vecteurs dilués 29 ni NPS 29 pl BVSM Eau 4,4 ni4,4 pi PBS 150 mM 50 ul 50 ul

2) Evaluation de l'association.

Les échantillons sont déposés (200µl) sur microcon 100Kd puis centrifugés pendant 15 minutes à 1000 rpm. Puis sur 50 pi de rétentat et d'ultrafiltrat, on ajoute 4 ml de liquide scintillant. La radioactivité est mesurée dans un compteur bêta (2 minutes de comptage). Les résultas sont rapportés dans le tableau ci-dessous. % Ultrafiltrat % Association Morphine H à 50 mg/ml100 % Morphine H3/BVSM light 100 % 0 % µg/10µlcationique2 Morphine H'/NPS 100 % 0 % cationique 0,1, ug/10 ul 3) Conclusions.

On n'observe aucune association de la morphine aux vecteurs NPS ou light cationiques dans ces conditions de formulation.