Campo de la técnica

La presente invención se encuentra dentro del campo de la biomedicina, y en particular proporciona un método diagnóstico no invasivo del cáncer que comprende cuantificar los niveles de expresión de la Inl- ghrelina en plasma, suero, sangre y/u orina. La presente invención también proporciona un método diagnóstico del cáncer de vejiga y/o colon que comprende cuantificar los niveles de expresión de la Inl- ghrelina, GOAT y/o GHS-Rlb en muestras tisulares. Además, la presente invención proporciona ARN pequeños de interferencia (ARNip) para su uso en un método de tratamiento del cáncer.

Estado de la técnica anterior

La ghrelina es una hormona sintetizada fundamentalmente por el estómago (Kojima et al, 1999, Nature, 402 (6762): 656-60), aunque también se expresa en un amplio rango de tejidos donde actúa como factor paracrino o autocrino (Lago et al., 2005, Vitam Horm., 71: 405-32.; Tena-Sempere, 2005, Growth Horm IGF Res. 15 (2): 83-8.; Leite-Moreira and Soares, 2007, Drug Discov Today. 12 (7-8): 276-88.; Leontiou et al., 2007, Pituitary, 10 (3): 213- 25.; Leite-Moreira et al, 2008, Vitam Horm., 77: 207-38).

La ghrelina puede ser acilada por la ghrelin-O-aciltransferasa (GOAT); esta forma de ghrelina (AG) es el principal ligando endógeno del receptor de secretagogos de la hormona del crecimiento (GHS-R) de tipo la (GHS-Rlb). Actualmente se sabe que el sistema ghrelina-acilada (AG) / GHS-Rlb ejerce acciones en múltiples tejidos, muchos de ellos relacionados con la regulación de las funciones metabólicas (Tschop et al, 2000, Nature 407 (6806): 908-13; Horvath et al, 2001, Endocrinology . 142. (10): 4163-9; Nakazato et al, 2001, Nature. 409 (6817): 194-8; van der Lely et al, 2004, Endocr Rev., 25 (3): 426-57). La ghrelina humana es codificada por el gen GHRL, cuya transcripción da lugar a un pre-pro-péptido inmaduro de 117 residuos (pre-pro-ghrelina) que, como se menciona anteriormente, puede ser acilado por la enzima GOAT y que, en todo caso, es procesado posteriormente por convertasas de prohormonas (PCI, PC7, Furina), originando la hormona activa (AG) o la teóricamente inactiva (ghrelina no-acilada o UAG) (Zhu et al, 2006, J. Biol Chem., 281 (50): 38867- 70.; Garg, 2007, J Clin Endocrinol Metab., 92 (9): 3396-8).

Clásicamente se ha considerado que el gen de la ghrelina humana consistía en 4 exones codificantes (Ex) y un Ex (ExO) no codificante. El péptido señal de la prepro-ghrelina es codificado en Ex 1, y la secuencia codificante (CDS) de la ghrelina madura es codificada por Ex2 y Ex3 (Kanamoto et al, 2004, Endocrinology, 145 (9): 4144-53.; Nakai et al, 2004, Life Sel, 75 (18): 2193-201). Sin embargo, estudios recientes han demostrado que la prepro-ghrelina también codifica otro péptido, la obestatina (Zhang et al, 2005, Science, 310 (5750): 996-9) cuya expresión tisular difiere de la exhibida por la ghrelina y posee acciones biológicas específicas (Karaoglu et al, 2009, Mol Cell Biochem., 323 (1-2): 113-8.; Tsolakis et al, 2009, Eur J Endocrinol, 160 (6): 941-9; Volante et al, 2009, J Pathol, Aug; 218(4):458-66). Además, un examen exhaustivo de la estructura genómica de la GHRL humana ha revelado que este gen, en realidad, ocupa 7,2 kb del DNA genómico (Seim et al., 2007. BMC genomics 8:298) y de hecho, se ha identificado un nuevo Ex (-1) y varias regiones de los ExO y Exl .

La expresión de estas regiones exónicas recientemente identificadas origina múltiples transcritos tejido- específicos que pueden carecer de ghrelina u obestatina e incluso codificar nuevos péptidos (Seim I et al., 2009, Clin Exp Pharmacol Physiol, 37(1): 125-31.; Seim I et al, 2007, BMC Genomics, 8:298). Además, se han descrito variantes de la prepro-ghrelina que carecen del exón 3 y, por lo tanto, de la obestatina. Esta isoforma se ha denominado exon3- deleted-ghrelin y se presenta en varios tipos de tumores (Jeffery et al, 2002, J. Endocrinol., 172 (3): R7-11; Jeffery et al, 2005b, Endocr Relat Cáncer., 12 (4): 839-50.; Yeh et al, 2005, Clin Cáncer Res., 11(23): 8295-303). Por último, se ha descrito la ocurrencia del proceso de retención de intrones en el gen de la ghrelina murina (Kineman et al, 2007, JMol Endocrinol. 38 (5): 511-21). Específicamente, la retención del intrón 2 da lugar a una nueva isoforma de ARNm, denominada Inl -ghrelina, que contiene los Ex2 y 3, pero carece de los Exl, 4 y 5. Aunque la traducción del ARNm de la Inl-ghrelina no está aún demostrada, su expresión es entre 10 y 50 veces mayor que la de la ghrelina nativa en la hipófisis y el hipotálamo, respectivamente, y más importante, el nivel de expresión del ARNm de esta isoforma se regula bajo condiciones metabólicas extremas (ayuno y obesidad) (Kineman et al, 2007 ^' , J Mol Endocrinol, 38 (5): 511-21).

Se ha demostrado que en las células de cáncer de mama y de tumores neuroendocrinos (TNEs) e hipofisarios los niveles de ARNm que codifica a Inl-ghrelina están aumentados (Gahete et al, 2011. PLoS One. 6 (8): e23302) (Luque et al, 2015. Oncotarget. 14;6(23): 19619-33) (Ibáñez-Costa et al, 2015. Sci Rep. 5: 8714). El cáncer de mama, los TNEs, los tumores hipofisarios, tumores de ovario, de endometrio y de cérvix se han podido diagnosticar y pronosticar mediante la cuantificación del ARNm que codifica a Inl-ghrelina (ES 2 372 337 B 1).

Los métodos diagnósticos y/o pronósticos no invasivos son preferibles al análisis de muestras tisulares porque son de más fácil obtención y porque eliminan los riesgos asociados con la cirugía necesaria para obtener pruebas tisulares. El análisis de muestras de plasma es un método diagnóstico no invasivo útil para el diagnóstico de diferentes tipos de cáncer. Por ejemplo, la cuantificación de un microARN presente en el plasma se empleó para el diagnóstico del cáncer de ovario (Zheng et al , 2013, PLoS One, 8(11): e77853).

Un problema de los métodos diagnósticos y/o pronósticos no invasivos ha sido la selección de biomarcadores apropiados. Los autores de la presente invención han determinado que la Inl-ghrelina es un biomarcador adecuado para la diagnosis y prognosis del cáncer. Además, se ha demostrado que la sobreexpresión de Inl-ghrelina está asociada con la evolución y agresividad de tumores neuroendocrinos (Luque et al., 2015. Oncotarget. (6(23): 19619-33). Los autores de la presente invención han desarrollado un ARNip para el tratamiento del cáncer que silencia la expresión de la Inl-ghrelina.

Descripción de las figuras

Figura 1: Niveles de expresión de la Inl-ghrelina en biopsias de pacientes con cáncer de próstata (PCa) o controles (NP) determinados por qPCR. Los datos representan las media ± SEM. Los asteriscos (*, p<0.05) indican diferencias significativas entre los grupos.

Figura 2: Niveles de expresión de la Inl-ghrelina, GOAT y GHS-Rlb en biopsias de pacientes con cáncer de colon o controles determinados por qPCR. Los datos representan las media ± SEM.

Figura 3: Niveles circulantes de Inl-ghrelina en plasma de pacientes con cáncer de próstata (PCa) o controles (Control) determinados por RIA. Los datos representan las media ± SEM. Los asteriscos (*, p<0.05) indican diferencias significativas entre los grupos.

Figura 4: Efecto de la sobreexpresión de Inl-ghrelina y ghrelina sobre la malignidad tumoral de células derivadas de cáncer de próstata. A) Efecto de la sobreexpresión de Inl-ghrelina y ghrelina sobre la proliferación de las líneas celulares PC-3 y VCaP. B) Efecto de la sobreexpresión de Inl-ghrelina y ghrelina sobre la migración de la línea celular PC-3. Los datos representan las media ± SEM. Los asteriscos (*, p<0.05) indican diferencias significativas respecto al control (mock).

Figura 5: Efecto de la sobreexpresión de Inl-ghrelina y ghrelina sobre la malignidad de tumores inoculados en ratones atímicos. Efecto de la sobreexpresión de Inl-ghrelina y ghrelina sobre el crecimiento de los tumores inducidos por la inoculación de células PC-3 transfectadas con Inl-ghrelina, ghrelina o controles (mock). Efecto de la sobreexpresión de Inl-ghrelina y ghrelina sobre la necrosis y mitosis de los tumores inducidos por la inoculación de células PC-3 transfectadas. Los datos representan las media ± SEM. Los asteriscos o almohadillas (*, p<0.05; **, p<0.01; *** o ^### , p<0.001) indican diferencias significativas respecto al control (mock).

Figura 6: Efecto de los ARNip específicos contra la Inl ghrelina sobre la malignidad tumoral de celular derivadas de cáncer de próstata. A) Validación del efecto de los ARNip sobre la expresión de Inl- ghrelina en dos líneas de cáncer de próstata. B) Efecto de los ARNip sobre la proliferación de las mencionadas líneas celulares. C) Efecto de los ARNip sobre la secreción de PSA por las células LnCaP. Los datos representan las media ± SEM. Los asteriscos (*, p<0.05) indican diferencias significativas respecto al control (scramble).

Figura 7: Efecto de la sobreexpresión de Inl-ghrelina y/o GHS-Rlb sobre la proliferación de líneas celulares derivadas de cáncer de colon (HTB2 y HTB5). Los datos representan las media ± SEM. Las letras indican grupos entre los que no existen diferencias significativas. Breve descripción de la invención

La presente invención se dirige a un método de cuantificación de la Inl-ghrelina, a un método diagnóstico y/o a un método de pronóstico. Los niveles de expresión de la Inl-ghrelina humana están consistentemente aumentados en muestras de plasma, suero, sangre y/u orina aisladas de individuos que padecen cáncer o que están en riesgo de padecer cáncer, en comparación con los valores de referencia. La presente invención también se dirige a un método de cuantificación de los niveles de expresión de la Inl- ghrelina, GOAT y/o GHS-Rlb en una muestra tisular, y el uso de cebadores específicos para medir los niveles de ARNm. Además la presente invención se dirige a ARNips para su uso en métodos de tratamiento del cáncer.

Descripción detallada de la invención

Definiciones

Si no se menciona específicamente lo contrario, el término "comprende" se utiliza, en el contexto de esta solicitud, para indicar que la lista de componentes puede incluir aspectos opcionales mencionados o no mencionados. El término "comprende" también puede incluir el concepto "consiste en".

Un "método diagnóstico" (o "método de diagnóstico") se refiere a un procedimiento donde se examina o analiza a un paciente (o a una muestra obtenida del mismo) para obtener un conocimiento diferencial de una enfermedad a través de los signos y síntomas que la caracterizan. En breve, el término "diagnóstico" en la presente solicitud se refiere a la capacidad de discriminar entre pacientes que padecen cáncer y pacientes que no padecen cáncer. Esta discriminación tal y como es entendida por un experto en la materia no pretende ser correcta en un 100% de las muestras analizadas. Sin embargo, requiere que una cantidad estadísticamente significativa de las muestras analizadas sean clasificadas correctamente. La cantidad que es estadísticamente significativa puede ser establecida por un experto en la materia mediante el uso de diferentes herramientas estadísticas, por ejemplo, pero sin limitarse, mediante la determinación de intervalos de confianza, determinación del valor p, test de Student o funciones discriminantes de Fisher. Preferiblemente, los intervalos de confianza son al menos del 90 %, al menos del 95 %, al menos del 97 %, al menos del 98 % o al menos del 99 %. Preferiblemente, el valor de p es menor de 0.1, de 0.05, de 0.01, de 0.005 o de 0.0001. Preferiblemente, la presente invención permite detectar correctamente la enfermedad de forma diferencial en al menos el 60 %, en al menos el 70 %, en al menos el 80 %, o en al menos el 90 % de los sujetos de un determinado grupo o población analizada.

Un "método pronóstico" (o "método de pronóstico") se refiere a un procedimiento donde, a partir de análisis clínicos, se identifica la enfermedad o dolencia, como cáncer, que sufre la persona y, a partir de las experiencias con otros pacientes aquejados por la misma enfermedad o dolencia, como cáncer, se predice cómo será el estado de salud del individuo en el futuro; es decir, la evolución de la enfermedad o dolencia en el tiempo. El término "pronóstico" en la presente invención también se refiere a la capacidad de detectar pacientes o sujetos asintomáticos que presentan una alta probabilidad de padecer una enfermedad o dolencia, como cáncer, aun cuando en el momento del diagnóstico no presenten dichas patologías o manifestaciones evidentes de las mismas.

El grado de identidad existente entre dos secuencias se puede determinar por métodos convencionales, por ejemplo, por medio de algoritmos estándar de alineamiento de secuencias que son conocidos en el estado de la técnica, como por ejemplo BLAST (Altschul S.F. et al. Basic local alignment search tool. J Mol Biol. 1990 Oct 5; 215(3):403-10).

La Inl-ghrelina se refiere a una proteína cuya secuencia de amino ácidos comprende o, alternativamente, consiste en, la SEQ ID NO.: 1 o un fragmento de la misma. Por ejemplo, la Inl-ghrelina puede referirse a un fragmento de Inl-ghrelina que comprende los 19 aminoácidos del extremo N-terminal de SEQ ID NO.: 1.

SEQ ID NO.: 1

GSSFLSPEHQRVQVRPPHKAPHWPALPLSNQLCDLEQQRHLWASVFSQSTKDSGSDL TVSGRTWGLRVLNRLFPPS SRERSRRSHQPSCSPEL

Preferiblemente, la Inl-ghrelina está acilada. El ARNm de Inl-ghrelina se refiere a una secuencia que comprende o, alternativamente, consiste en, la SEQ ID NO.: 2.

SEQ ID NO.: 2

atgccctccc cagggaccgt ctgcagcctc ctgctcctcg gcatgctctg gctggacttg

gccatggcag gctccagctt cctgagccct gaacaccaga gagtccaggt gagacctccc

cacaaagccc cacatgttgt tccagccctg ccacttagca accagctctg tgacctggag

cagcagcgcc atctctgggc ttcagtcttc tcccagagca caaaggactc tgggtctgac

ctcactgttt ctggaaggac atgggggctt agagtcctaa acagactgtt tcccccttcc

agcagagaaa ggagtcgaag aagccaccag ccaagctgca gccccgagct ctag

El ARNm de GOAT se refiere a una secuencia que comprende o, alternativamente, consiste en la SEQ ID NO.: 3.

SEQ ID NO.: 3

agacagcctg gttgagatta ctcttggagg aaggcatcag ttaaggacac tggaaaagac

aggctctttt gttctggttc ctaatggagt ggctttggct gttctttctc catcctatat

cgttttacca gggggctgca tttccctttg cacttctctt caattatctc tgcatcatgg

attcattctc cactcgtgcc aggtacctct ttctcctgac tggaggaggt gccctggccg

tggctgccat gggttcctac gccgtgctcg tcttcacccc tgctgtctgc gctgtggctc tcctctgttc cctggctcct cagcaagtcc acaggtggac cttctgcttt cagatgagct ggcagacctt gtgtcaccta ggtctgcact acactgagta ttatctgcat gagcctcctt

ctgtgaggtt ctgcatcact ctttcttctc tcatgctctt gacccagagg gtcacgtccc

tctctctgga catttgtgag gggaaagtga aggcagcatc tggaggcttc aggagcagga

gctctttgtc tgagcatgtg tgtaaggcac tgccctattt cagctacttg ctctttttcc

ctgctctcct gggaggctct ctgtgctcct tccagcgatt tcaggctcgt gttcaagggt

ccagtgcttt gcatcccaga cactctttct gggctctgag ctggaggggt ctgcagattc

ttggactaga atgcctaaac gtggcagtga gcagggtggt ggatgcagga gcgggactga

ctgattgcca gcaattcgag tgcatctatg tcgtgtggac cacagctggg cttttcaagc

tcacctacta ctcccactgg atcctggacg actccctcct ccacgcagcg ggctttgggc

ctgagcttgg tcagagccct ggagaggagg gatatgtccc cgatgcagac atctggaccc

tggaaagaac ccacaggata tctgtgttct caagaaagtg gaaccaaagc acagctcgat

ggctccgacg gcttgtattc cagcacagca gggcttggcc gttgttgcag acatttgcct

tctctgcctg gtggcatgga ctccatccag gacaggtgtt tggtttcgtt tgctgggccg

tgatggtgga agctgactac ctgattcact cctttgccaa tgagtttatc agatcctggc

cgatgaggct gttctataga accctcacct gggcccacac ccagttgatc attgcctaca

tcatgctggc tgtggaggtc aggagtctct cctctctctg gttgctctgt aattcgtaca

acagtgtctt tcccatggtg tactgtattc tgcttttgct attggcgaag agaaagcaca

aatgtaactg acatctttcc ctggctttca ccttaaacac ccaggaaaca ttttagaaag

tgccagatga cgcatcgata atgcatacat ttgaactttt ccataataaa attttttcta

aagttttgga tggatatacc cagtgacttg cagtaggaat ttgtgtatct actttagcaa

gctattctgc tggtactgag gatacaaaaa ggaaaaagat gtggtttctt cccttaaggt

ttacagtcta gatgtggaag caaagattaa gtaaagtgat acá

El ARNm de GHS-Rlb se refiere a una secuencia que comprende o, alternativamente, consiste en la SEQ ID NO.: 4.

SEQ ID NO.: 4

cagcgcagtc acgtcccaga gcctgttcag ctgagccggc agcatgtgga acgcgacgcc

cagcgaagag ccggggttca acctcacact ggccgacctg gactgggatg cttcccccgg

caacgactcg ctgggcgacg agctgctgca gctcttcccc gcgccgctgc tggcgggcgt

cacagccacc tgcgtggcac tcttcgtggt gggcatcgct ggcaacctgc tcaccatgct

ggtggtgtcg cgcttccgcg agctgcgcac caccaccaac ctctacctgt ccagcatggc

cttctccgat ctgctcatct tcctctgcat gcccctggac ctcgttcgcc tctggcagta

ccggccctgg aacttcggcg acctcctctg caaactcttc caattcgtca gtgagagctg

cacctacgcc acggtgctca ccatcacagc gctgagcgtc gagcgctact tcgccatctg

cttcccactc cgggccaagg tggtggtcac caaggggcgg gtgaagctgg tcatcttcgt

catctgggcc gtggccttct gcagcgccgg gcccatcttc gtgctagtcg gggtggagca

cgagaacggc accgaccctt gggacaccaa cgagtgccgc cccaccgagt ttgcggtgcg

ctctggactg ctcacggtca tggtgtgggt gtccagcatc ttcttcttcc ttcctgtctt

ctgtctcacg gtcctctaca gtctcatcgg caggaagctg tggcggagga ggcgcggcga

tgctgtcgtg ggtgcctcgc tcagggacca gaaccacaag caaaccgtga aaatgctggg tgggtctcag cgcgcgctca ggctttctct cgcgggtcct atcctctccc tgtgccttct cccttctctc tgag

La GOAT se refiere a una proteína cuya secuencia de amino ácidos comprende o, alternativamente, consiste en la SEQ ID NO.: 5.

SEO ID NO.: 5

MEWLWLFFLHPISFYQGAAFPFALLFNYLCIMDSFSTRARYLFLLTGGGALAVAAMGSYA VLVFTPAVCAVALLCSL APQQVHRWTFCFQMSWQTLCHLGLHYTEYYLHEPPSVRFCITLSSLMLLTQRVTSLSLDI CEGKVKAASGGFRSRSS LSEHVCKALPYFSYLLFFPALLGGSLCSFQRFQARVQGSSALHPRHSFWALSWRGLQILG LECLNVAVSRWDAGAG LTDCQQFECIYWWTTAGLFKLTYYSHWILDDSLLHAAGFGPELGQSPGEEGYVPDADIWT LERTHRISVFSRKWNQ STARWLRRLVFQHSRAWPLLQTFAFSAWWHGLHPGQVFGFVCWAVMVEADYLIHSFANEF IRSWPMRLFYRTLTWAH TQLIIAYIMLAVEVRSLSSLWLLCNSYNSVFPMVYCILLLLLAKRKHKCN El GHS-Rlb se refiere a una proteína cuya secuencia de amino ácidos comprende o, alternativamente, consiste en SEQ ID NO.: 6.

SEQ ID NO.: 6

MWNATPSEEPGFNLTLADLDWDASPGNDSLGDELLQLFPAPLLAGVTATCVALFWGIAGN LLTMLWSRFRELRTT TNLYLSSMAFSDLLIFLCMPLDLVRLWQYRPWNFGDLLCKLFQFVSESCTYATVLTITAL SVERYFAICFPLRAKW VTKGRVKLVIFVIWAVAFCSAGPIFVLVGVEHENGTDPWDTNECRPTEFAVRSGLLTVMV WVSSIFFFLPVFCLTVL YSLIGRKLWRRRRGDAWGASLRDQNHKQTVKMLGGSQRALRLSLAGPILSLCLLPSL

Una "muestra de referencia" se refiere a una muestra similar obtenida de un sujeto o individuo (paciente) control que no presente la enfermedad o dolencia, tal y como el tumor o cáncer, que se pretende diagnosticar o pronosticar. La "cantidad de referencia" o "nivel de referencia " se refiere a la cantidad (o a los niveles) absoluta obtenida de la muestra de referencia. Una "muestra de referencia" puede también referirse a una muestra similar obtenida del mismo sujeto o individuo en un punto anterior en el tiempo. Un "valor de referencia" se refiere al conjunto de valores que se emplean interpretar los resultados de las pruebas diagnósticas y/o pronosticas en un sujeto o individuo (paciente). Por ejemplo, los valores de referencia para una prueba determinada se basan en los resultados de esa misma prueba en el 95% de la población sana. Los valores de referencia de una prueba pueden ser diferentes en distintos grupos de personas (por ejemplo, entre mujeres y hombres). También se puede denominar "intervalo de referencia", "límite de referencia", y "límite normal".

El término "cantidad", tal y como se utiliza en la presente descripción, se refiere pero no se limita, a la cantidad absoluta o relativa de los productos de expresión (ARNm y/o proteína), así como a cualquier otro valor o parámetro relacionado con los mismos o que pueda derivarse de éstos. Dichos valores o parámetros comprenden valores de intensidad de la señal obtenidos a partir de cualquiera de las propiedades físicas o químicas de los productos de expresión obtenidos mediante medida directa. Adicionalmente, dichos valores o parámetros incluyen todos aquellos obtenidos mediante medida indirecta, por ejemplo, cualquiera de los sistemas de medida descritos en otra parte del presente documento.

El término "anticuerpo ^' " tal como se emplea en la presente descripción, se refiere a moléculas de inmunoglobulinas y fragmentos inmunológicamente activos de moléculas de inmunoglobulinas, es decir, moléculas que contienen un sitio de fijación de antígeno que se une específicamente (inmunorreacciona) con, por ejemplo, cualquiera de los productos peptídicos de la Inl-ghrelina, de la GOAT o del GHS-Rlb. Ejemplos de fragmentos inmunológicamente activas, incluyen fragmentos F(ab) y F(ab')2 que se pueden generar tratando el anticuerpo con una enzima tal y como la pepsina. Los anticuerpos pueden ser policlonales (incluyen típicamente anticuerpos distintos dirigidos contra determinantes o epítopos distintos) o monoclonales (dirigidos contra un único determinante en el antígeno).

El anticuerpo monoclonal puede estar alterado bioquímicamente, por manipulación genética, o puede ser sintético, careciendo, posiblemente, el anticuerpo en su totalidad o en partes, de fragmentos o porciones que no son necesarias para el reconocimiento del antígeno, como por ejemplo los productos peptídicos de la Inl-ghrelina, de la GOAT o del GHS-Rlb, y estando sustituidas por otras que confieren al anticuerpo propiedades ventajosas adicionales.

El anticuerpo puede ser también recombinante, quimérico, humanizado, sintético o una combinación de cualquiera de los anteriores. Un "anticuerpo o polipéptido recombinante" (rAC) es un anticuerpo que ha sido producido en una célula hospedadora que ha sido transformada o transfectada con el ácido nucleico que codifica para el polipéptido o antígeno, o produce el polipéptido o antígeno como resultado de la recombinación homologa.

El término "no simultáneo" tal y como se emplea en la presente descripción, se refiere a la adquisición de dos o más muestras de tejido, de sangre (que también incluye plasma y suero) o de orina donde existe un intervalo de tiempo entre la adquisición de las muestras que permite un seguimiento del cáncer y/o pronóstico útil mediante la comparación entre las cantidades de ARNm y/o proteínas en las diferentes muestras. Preferiblemente, el intervalo de tiempo es de entre 1 mes y 20 años, como por ejemplo de entre 1 mes y 10 años, 1 mes y 5 años o 1 mes y 1 año. Por ejemplo, el intervalo de tiempo entre la adquisición de muestras es de aproximadamente 1 mes. Por ejemplo, el intervalo de tiempo entre la adquisición de muestras es de aproximadamente 2 meses. Por ejemplo, el intervalo de tiempo entre la adquisición de muestras es de aproximadamente 3 meses. Por ejemplo, el intervalo de tiempo entre la adquisición de muestras es de aproximadamente 6 meses. Por ejemplo, el intervalo de tiempo entre la adquisición de muestras es de aproximadamente 1 año. Por ejemplo, el intervalo de tiempo entre la adquisición de muestras es de aproximadamente 1 año y medio. Por ejemplo, el intervalo de tiempo entre la adquisición de muestras es de aproximadamente 2 años. Por ejemplo, el intervalo de tiempo entre la adquisición de muestras es de aproximadamente 3 años. Por ejemplo, el intervalo de tiempo entre la adquisición de muestras es de aproximadamente 5 años.

Método de cuantificación de la expresión de Inl-ghrelina

En un primer aspecto, la presente invención proporciona un método de cuantificación de Inl-ghrelina en una muestra aislada de plasma, suero, sangre y/u orina de un individuo que comprende la etapa de cuantificar los niveles de expresión de la Inl-ghrelina en una muestra de plasma, suero, sangre y/u orina aislada de un individuo.

El método de cuantificación de la expresión de la Inl-ghrelina de acuerdo con el primer aspecto de la presente invención es preferiblemente un método diagnóstico no invasivo del cáncer que comprende cuantificar la expresión de Inl-ghrelina en el plasma, suero, sangre y/u orina de un sujeto o individuo, preferiblemente un sujeto o individuo sospechoso de padecer cáncer y/o en riesgo de padecer cáncer.

El método de diagnóstico de la presente invención comprende las etapas de:

a. cuantificar los niveles de expresión de Inl-ghrelina en una muestra de plasma, suero, sangre y/u orina aislada de un individuo;

b. comparar los niveles obtenidos en la etapa (a) con un valor de referencia, o con los niveles de expresión de Inl-ghrelina obtenidos en una muestra de referencia; y c. asignar los pacientes que presentan unos niveles de expresión de Inl-ghrelina obtenidos en la etapa (b) superiores y estadísticamente significativos al valor de referencia o a los niveles de la muestra de referencia, al grupo de individuos con riesgo de padecer cáncer o grupo de individuos que padecen cáncer.

Preferiblemente, la "muestra de referencia" del método de acuerdo con esta realización del primer aspecto de la presente invención (método de diagnóstico no invasivo) se refiere a una muestra similar obtenida de un sujeto o individuo (paciente) control que no presenta la enfermedad o dolencia, tal y como el tumor o cáncer, que se pretende diagnosticar.

En una realización particular, el método de cuantificación de la expresión de la Inl-ghrelina de acuerdo con el primer aspecto de la presente invención es un método de pronóstico del cáncer que comprende las etapas de:

a. cuantificar los niveles de expresión de la Inl-ghrelina tal y como se define en la SEQ ID

NO.: 1 en una muestra de plasma, suero, sangre y/u orina aislada de un individuo que padece cáncer; b comparar los niveles obtenidos en la etapa (a) con un valor de referencia o con los niveles de expresión de la Inl-ghrelina tal y como se define en la SEQ ID NO.: 1 en una muestra de referencia; y

c asignar los pacientes que presentan niveles de expresión de la Inl-ghrelina obtenidos en la etapa (b) superiores y estadísticamente significativos al valor de referencia o a los niveles de expresión de la muestra de referencia, al grupo de individuos con un pronóstico desfavorable.

En esta realización, la "muestra de referencia" puede ser una muestra similar obtenida de un sujeto o individuo (paciente) control que no presente la enfermedad o dolencia, tal y como el tumor o cáncer, que se pretende pronosticar y/o una muestra similar obtenida del mismo sujeto o individuo en un punto anterior en el tiempo. Cuando la "muestra de referencia" es una muestra similar obtenida del mismo sujeto o individuo en un punto anterior en el tiempo, la secuencia de etapas (a)-(b) descrita anteriormente se puede realizar más de una vez, como por ejemplo dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, quince, veinte o más veces, en muestras de plasma, suero, sangre y/u orina obtenidas de un mismo individuo, de manera no simultánea. Esta secuencia de etapas realizada de manera no simultánea proporciona información útil en el pronóstico de la enfermedad (cáncer) en el paciente.

Por ejemplo, si los niveles de expresión de Inl-ghrelina aumentan con el tiempo, puede ser indicativo de que el paciente ha desarrollado un tumor o que ese tumor (que ya podía ser preexistente) ha incrementado su malignidad.

Los niveles de expresión de Inl-ghrelina en una muestra de plasma se cuantifican a partir de los niveles de proteína presentes en dicha muestra de plasma. Por lo tanto, en las etapas (a) y (b) de cuantificación de los niveles de expresión Inl-ghrelina en una muestra de plasma de acuerdo con el método del primer aspecto de la presente invención, en cualquiera de sus variantes, se cuantifican los niveles de la proteína tal y como se define en la SEQ ID NO. : 1.

La medida de la cantidad o la concentración de los niveles de expresión, preferiblemente de manera semi- cuantitativa o cuantitativa, se puede llevar a cabo de manera directa o indirecta. La medida directa se refiere a la medida de la cantidad o la concentración de los productos de expresión, basada en una señal que se obtiene directamente de los productos de expresión, y que está correlacionada con el número de moléculas de dichos productos de expresión. Dicha señal -a la que también podemos referirnos como señal de intensidad- puede obtenerse, por ejemplo, midiendo un valor de intensidad de una propiedad química o física de dichos productos de expresión. La medida indirecta incluye la medida obtenida de un componente secundario o un sistema de medida biológica (por ejemplo la medida de respuestas celulares, ligandos, "etiquetas" o productos de reacción enzimática). Se pueden emplear anticuerpos para realizar la cuantificación de la expresión de la Inl-ghrelina. Estos anticuerpos pueden ser anticuerpos policlonales o monoclonales capaces de reconocer la Inl-ghrelina. Los anticuerpos que reconocen la Inl-ghrelina pueden ser empleados para llevar a cabo los métodos de la presente invención mediante un inmnoensayo. En una realización preferida, la detección de la Inl- ghrelina se puede realizar, a título ilustrativo y sin que limite el alcance de la presente invención, mediante la incubación con un anticuerpo específico en un inmunoensayo. El término "inmunoensayo" , tal y como se utiliza en la presente descripción se refiere a cualquier técnica analítica que se basa en la reacción de la conjugación de una anticuerpo con la muestra obtenida. Ejemplos de inmunoensayos conocidos en el estado de la técnica son, por ejemplo, pero sin limitarse: inmunoblot, ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), radioinmunoanálisis (RIA), inmunohistoquímica o microarrays de proteína. En otra realización preferida, la detección de la Inl-ghrelina y/o los productos peptídicos de la Inl-ghrelina se puede realizar mediante un radioinmunoanálisis.

Una "muestra de plasma, suero y/o sangre" se refiere a una muestra obtenida mediante un método no invasivo. Un ejemplo no limitante y conocido por un experto en la materia sería mediante la extracción de una muestra de sangre de un individuo usando una aguja. Si se quisiese obtener una muestra de plasma o suero, se procedería a la separación del plasma/suero de los otros componentes de la sangre mediante la centrifugación. La cantidad de Inl-ghrelina puede ser analizada, por ejemplo, pero sin limitarse, en muestras de plasma, suero y/o sangre fresco o plasma, suero y/o sangre que ha sido congelado y después descongelado.

Una "muestra de orina" se refiere a una muestra obtenida mediante un método no invasivo. Un ejemplo no limitante y conocido por un experto en la materia sería mediante la colección de la orina de un individuo en un contenedor sellable. La cantidad de Inl-ghrelina puede ser analizada, por ejemplo, pero sin limitarse, en muestras de orina fresca u orina que ha sido congelada y después descongelada.

La detección de la Inl-ghrelina en una muestra de plasma, suero, sangre y/u orina en niveles superiores y/o estadísticamente significativos a los niveles de referencia es indicativa de que dicho individuo padece cáncer, o de que dicho individuo tiene riesgo de padecer cáncer. Los términos "individuo" , "paciente" o "sujeto" se usan de manera intercambiable en la presente descripción, y no pretenden ser limitativos en ningún aspecto, pudiendo ser el "individuo" , "paciente" o "sujeto" de cualquier edad, sexo y condición física.

Preferiblemente, el cáncer o tumor es cáncer de próstata, mama, ovario, endometrio, cérvix, cáncer de pulmón, cáncer de colon, cáncer renal, cáncer de vejiga, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de colon, tumores hipofisario y/o tumores neuroendocrinos. Aún más preferiblemente, el cáncer o tumor es cáncer de próstata, mama, ovario, endometrio, cérvix, cáncer de vejiga, cáncer de colon, tumores hipofisario y/o tumores neuroendocrinos. Todavía más preferiblemente, el cáncer o tumor es cáncer de próstata, vejiga y/o colon, y aún más preferiblemente, el cáncer o tumor es cáncer de próstata.

Por lo tanto, en el método de la presente invención, los niveles de expresión de la Inl-ghrelina en plasma, suero, sangre y/u orina de un sujeto se pueden medir tanto si el sujeto ya ha sido diagnosticado con la enfermedad (cáncer) como si el sujeto no ha sido (aún) diagnosticado con la enfermedad (cáncer).

En una realización preferida, el método de diagnóstico y/o pronóstico del cáncer en un paciente también comprende combinar la cuantificación de proteína tal y como se define en la SEQ ID NO.: 1 en el plasma, suero, sangre y/u orina con la detección de otro(s) biomarcador(es), preferiblemente también en plasma, que podría(n) mejorar la precisión de dicho método. Por ejemplo, pero sin limitarse, la cuantificación de la expresión de la Inl-ghrelina se podría combinar con la detección de PSA (antígeno específico del próstata), PCA3 (Prostate CAncer gene 3), GOAT, cromogranina, etc. Método de cuantificación de los niveles de expresión de la Inl-ghrelina. GOAT y/o GHS-Rlb

En un segundo aspecto, la presente invención proporciona un método de cuantificación de los niveles de expresión de la Inl-ghrelina, GOAT y/o GHS-Rlb en una muestra tisular de vejiga y/o colon aislada de un individuo que comprende la etapa de cuantificar los niveles de expresión de la Inl-ghrelina, GOAT y/o GHS-Rlb en una muestra tisular de vejiga y/o colon aislada de un individuo.

El método de cuantificación de los niveles de expresión de la Inl-ghrelina, GOAT y/o GHS-Rlb de acuerdo con el segundo aspecto de la presente invención es preferiblemente un método de diagnóstico del cáncer de vejiga y/o colon que comprende cuantificar los niveles de expresión de la Inl-ghrelina, GOAT y/o GHS-Rlb en una muestra tisular procedente de un sujeto o individuo, preferiblemente un sujeto o individuo sospechoso de padecer cáncer de vejiga y/o colon y/o en riesgo de padecer cáncer de vejiga y/o colon. Por lo tanto, la presente invención proporciona un método de diagnóstico del cáncer de vejiga y/o colon que comprende las etapas de: a. cuantificar los niveles de expresión de la Inl-ghrelina, GOAT y/o GHS-Rlb en una muestra tisular aislada de un individuo;

b. comparar los niveles obtenidos en la etapa (a) con un valor de referencia o con los niveles de expresión de la Inl-ghrelina, GOAT y/o GHS-Rlb en una muestra tisular de referencia; y

c. asignar los pacientes que presentan unos niveles de expresión obtenidos en la etapa (b) superiores y estadísticamente significativos al valor de referencia o a los niveles de expresión de la Inl-ghrelina, GOAT y/o GHS-Rlb de la muestra de referencia al grupo de individuos con riesgo de padecer cáncer de vejiga y/o colon (o grupo de individuos que padecen cáncer de vejiga y/o colon). Preferiblemente, la "muestra de referencia" del método de acuerdo con esta realización del primer aspecto de la presente invención (método de diagnóstico) se refiere a una muestra similar obtenida de un sujeto o individuo (paciente) control que no presenta la enfermedad o dolencia, tal y como el tumor o cáncer de vejiga y/o colon, que se pretende diagnosticar.

En una realización particular, el método de cuantificación de la expresión de la Inl-ghrelina, GOAT y/o GHS-Rlb de acuerdo con el primer aspecto de la presente invención es un método de pronóstico del cáncer de vejiga y/o colon que comprende las etapas de:

a. cuantificar los niveles de expresión de la Inl-ghrelina, GOAT y/o GHS-Rlb en una muestra tisular aislada de un individuo que padece cáncer;

b. comparar los niveles obtenidos en la etapa (a) con un valor de referencia o con los niveles de expresión de la Inl-ghrelina, GOAT y/o GHS-Rlb en una muestra tisular de referencia; y

c. asignar los pacientes que presentan unos niveles de expresión obtenidos en la etapa (b) superiores y estadísticamente significativos al valor de referencia o a los niveles de expresión de la Inl-ghrelina, GOAT y/o GHS-Rlb de la muestra de referencia al grupo de individuos con un pronóstico desfavorable. En esta realización, la "muestra tisular de referencia" puede ser una muestra similar obtenida de un sujeto o individuo (paciente) control que no presente la enfermedad o dolencia, tal y como el tumor o cáncer, que se pretende pronosticar y/o una muestra similar obtenida del mismo sujeto o individuo en un punto anterior en el tiempo. Cuando la "muestra tisular de referencia" es una muestra similar obtenida del mismo sujeto o individuo en un punto anterior en el tiempo, la secuencia de etapas (a)-(b) descrita anteriormente se puede realizar más de una vez, como por ejemplo dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, quince, veinte o más veces, en muestras tisulares aisladas obtenidas de un mismo individuo, de manera no simultánea. Esta secuencia de etapas realizada de manera no simultánea proporciona información útil en el pronóstico de la enfermedad (cáncer) en el paciente. Por ejemplo, si los niveles de expresión de Inl-ghrelina, GOAT y/o GHS-Rlb aumentan con el tiempo, puede ser indicativo de que ese sujeto o paciente ha desarrollado cáncer de vejiga o colon o que los cánceres preexistentes han progresado desfavorablemente.

Los niveles de expresión de Inl-ghrelina, GOAT y/o GHS-Rlb en una muestra tisular aislada se pueden cuantificar a partir de los niveles de proteína presentes en dicha muestra tisular. Por lo tanto, en un a realización de este segundo aspecto de la presente invención, en las etapas (a) y (b) de cuantificación de los niveles de expresión Inl-ghrelina, GOAT y/o GHS-Rlb en una muestra tisular del método de diagnóstico y/o pronóstico de acuerdo con el segundo aspecto de la presente invención se cuantifican los niveles de la proteína tal y como se definen en las SEQ ID NO.: 1, SEQ ID NO.: 5 y/o SEQ ID NO.: 6.

Los niveles de expresión de Inl-ghrelina, GOAT y/o GHS-Rlb en una muestra tisular se pueden cuantificar a partir de los niveles de ARNm presentes en dicha muestra tisular. Por lo tanto, en un a realización de este segundo aspecto de la presente invención, en las etapas (a) y (b) de cuantificación de los niveles de expresión Inl-ghrelina, GOAT y/o GHS-Rlb en una muestra tisular del método de diagnóstico y/o pronóstico de acuerdo con el segundo aspecto de la presente invención se cuantifican los niveles de ARNm tal y como se definen en las SEQ ID NO.: 2, SEQ ID NO.: 3 y/o SEQ ID NO.: 4.

Una "muestra tisular", "muestra de tejido" o "muestra tisular/de tejido aislada" incluye, pero sin limitarse, células y/o tejidos de un sujeto, obtenidos mediante cualquier método conocido por un experto en la materia. La muestra de tejido puede ser, por ejemplo, pero sin limitarse, una biopsia o un aspirado por aguja fina. Preferiblemente, las células son células tumorales. Tal y como se ha descrito anteriormente, la muestra tisular es muestra tisular de vejiga y/o colon.

Tal y como se ha descrito anteriormente, la medida de la cantidad o la concentración, preferiblemente de manera semi-cuantitativa o cuantitativa, puede ser llevada a cabo de manera directa o indirecta, tal y como se ha señalado anteriormente en la presente descripción. La medida directa se refiere a la medida de la cantidad o la concentración de los productos de expresión, basada en una señal que se obtiene directamente de los productos de expresión, y que está correlacionada con el número de moléculas de dichos productos de expresión. Dicha señal -a la que también podemos referirnos como señal de intensidad- puede obtenerse, por ejemplo, midiendo un valor de intensidad de una propiedad química o física de dichos productos de expresión. La medida indirecta incluye la medida obtenida de un componente secundario o un sistema de medida biológica (por ejemplo la medida de respuestas celulares, ligandos, "etiquetas" o productos de reacción enzimática).

La cuantificación de los niveles de expresión de puede realizarse por cualquier medio conocido en el estado de la técnica. Si la cuantificación de los niveles de expresión de Inl-ghrelina, GOAT y/o GHS-Rlb se realiza mediante la cuantificación de los niveles de proteína, tal y como se ha descrito anteriormente, en el contexto del primer aspecto de la presente invención, se pueden emplear anticuerpos para realizar dicha cuantificación, por ejemplo mediante la incubación con un anticuerpo específico en un inmunoensayo, tal y como se ha descrito anteriormente. Si la cuantificación de los niveles de expresión de Inl-ghrelina, GOAT y/o GHS-Rlb se realiza mediante la cuantificación de los niveles de ARNm derivado de la transcripción de los genes de Inl-ghrelina, GOAT y/o GHS-Rlb, dicha cuantificación se puede realizar, a título ilustrativo y sin que limite el alcance de la invención, mediante amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR), retrotranscripción en combinación con la reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR), retrotranscripción en combinación con la reacción en cadena de la ligasa (RT-LCR), o cualquier otro método de amplificación de ácidos nucleicos; chips de DNA elaborados con oligonucleótidos depositados por cualquier mecanismo; microarrays de DNA elaborados con oligonucleótidos sintetizados in situ mediante fotolitografía o por cualquier otro mecanismo; hibridación in situ utilizando sondas específicas marcadas con cualquier método de mareaje; mediante geles de electroforesis; mediante transferencia a membrana e hibridación con una sonda específica; mediante resonancia magnética nuclear o cualquier otra técnica de diagnóstico por imagen utilizando nanopartículas paramagnéticas o cualquier otro tipo de nanopartículas detectables funcionalizadas con anticuerpos o por cualquier otro medio.

Tanto las proteínas como el ARNm pueden ser cuantificados, por ejemplo, pero sin limitarse, en muestras de tejido fresco, tejido congelado, tejido fijado o tejido fijado y embebido en parafina. El uso de muestras de tejido fijado y embebido en parafina presenta importantes ventajas con respecto a las muestras de tejido fresco o congelado, ya que las muestras de tejido fijado y embebido en parafina son estables a temperatura ambiente, fáciles de almacenar y existe un amplio archivo de muestras clínicas disponibles junto con su información clínica y el seguimiento de la enfermedad.

En una realización preferida, el método de diagnóstico y/o pronóstico del cáncer de vejiga y/o colon en un paciente también comprende combinar la cuantificación de los niveles de expresión de Inl-ghrelina, GOAT y/o GHS-Rlb en una muestra tisular, tal y como se ha descrito anteriormente, con la detección y/o cuantificación de otro(s) biomarcador(es) que podría(n) mejorar la precisión de dicho método. Por ejemplo, pero sin limitarse, la cuantificación de los niveles expresión de Inl-ghrelina, GOAT y/o GHS- Rlb se podría combinar con, por ejemplo, la detección de KRAS (del inglés V-Ki-ras2 Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog), y/o con BRAF (del inglés v-Raf murine sarcoma viral oncogene homolog B), entre otros.

En una realización preferida, la cuantificación de la expresión de Inl-ghrelina, GOAT y/o GHS-Rlb se realiza determinando la cantidad de ARNm derivado de su transcripción, donde la cuantificación del ARNm de Inl-ghrelina, GOAT y/o GHS-Rlb se realiza mediante RT-PCR usando in vitro al menos uno de los cebadores que se indican en la SEQ ID NO.: 7 (tctgggcttc agtcttctcc), SEQ ID NO.: 8 (gttcatcctc tgccccttct), SEQ ID NO.: 9 (ttgctctttt tccctgctct c), SEQ ID NO.: 10 (actgccacgt ttaggcattc t), SEQ ID NO.: 11 (ggaccagaac cacaagcaaa) y/o SEQ ID NO.: 12 (agagagaagg gagaaggcac a). Preferiblemente, los cebadores SEQ ID NO.: 7 y SEQ ID NO.: 8 se usan para cuantificar la cantidad de ARNm que codifica Inl-ghrelina; los cebadores SEQ ID NO.: 9 y SEQ ID NO.: 10 se usan para cuantificar la cantidad de ARNm que codifica GOAT; y/o los cebadores SEQ ID NO.: 11 y SEQ ID NO.: 12 se usan para cuantificar la cantidad de ARNm que codifica GHS-Rlb. Por lo tanto, la presente invención proporciona además el uso in vitro de los cebadores tal y como se definen en las SEQ ID NO.: 7, SEQ ID NO.: 8, SEQ ID NO.: 9, SEQ ID NO.: 10, SEQ ID NO.: 11 y/o SEQ ID NO.: 12 en el método de diagnóstico y/o pronóstico del cáncer de vejiga y/o colon, y/o en el método de obtención de datos útiles para el diagnóstico y/o pronóstico del cáncer de vejiga y/o colon de acuerdo con el segundo aspecto de la presente invención.

Método para identificar sustancias químicas útiles en el tratamiento del cáncer

En un tercer aspecto, la presente invención también proporciona un método para identificar fármacos útiles en el tratamiento del cáncer de próstata, mama, vejiga y/o colon. El método comprende las etapas de: a. establecer líneas celulares de cáncer de próstata, mama, vejiga y/o colon;

b. cuantificar los niveles de expresión de la Inl-ghrelina, GOAT y/o GHS-Rlb en dichas líneas celulares;

c. administrar el "fármaco prueba" a las líneas celulares de (a);

d. cuantificar los niveles de expresión de la Inl-ghrelina, GOAT y/o GHS-Rlb en dichas líneas celulares tras la administración del "fármaco prueba" según (c); y

e. asignar al "fármaco prueba" según (c) al grupo de sustancias químicas útiles en el tratamiento del cáncer de próstata, mama, vejiga y/o colon cuando los niveles de expresión de la Inl-ghrelina, GOAT y/o GHS-Rlb cuantificados en la etapa (d) sean menores y estadísticamente significativos a los niveles cuantificados en la etapa (b).

Los niveles de expresión de Inl-ghrelina, GOAT y/o GHS-Rlb en las líneas celulares de cáncer de próstata, mama, vejiga y/o colon de acuerdo con las etapas (b) y (d) se pueden cuantificar a partir de los niveles de proteína y/o los niveles de ARNm. tal y como se ha descrito anteriormente.

Por ejemplo, los niveles de expresión de Inl-ghrelina, GOAT y/o GHS-Rlb en las líneas celulares de cáncer de próstata, mama, vejiga y/o colon de acuerdo con las etapas (b) y (d) se cuantifican a partir de los niveles de ARNm, tal y como a partir de los niveles de ARNm tal y como se define en la SEQ ID NOs.: 2, SEQ ID NO.: 3 y/o SEQ ID NO.: 4.

Alternativamente, los niveles de expresión de Inl-ghrelina, GOAT y/o GHS-Rlb en las líneas celulares de cáncer de próstata, mama, vejiga y/o colon de acuerdo con las etapas (b) y (d) se cuantifican a partir de los niveles de proteína, tal y como a partir de los niveles de proteína tal y como se define en las SEQ ID NOs.: 1, 5 y/o 6.

En una realización preferida, la primera etapa (a) comprende establecer líneas celulares de cáncer de próstata, mama, vejiga y/o colon. Las líneas celulares de cáncer se pueden establecer mediante cualquier método conocido por un experto en la materia. En otra realización preferida, se usan líneas celulares de cáncer ya establecidas como, por ejemplo, pero sin limitarse las líneas celulares de cáncer PC3, DU145, LNCaP, VCaP, MCF7, MDA-MB-231, CACO-2, HTB-38, HTB-4 y/o HTB-9. El término "fármaco prueba" se refiere a una materia con una composición química definida, compuesta por sus entidades: moléculas, unidades formulares y átomos. En una realización preferida, los fármacos prueba tienen propiedades anticancerígenas. En otra realización preferida, los fármacos prueba con propiedades anticancerígenas se identifican en una biblioteca muestrario de compuestos mediante la identificación sistemática de compuestos.

La identificación sistemática de compuestos puede ser llevada a cabo mediante cualquier método conocido por un experto en la materia. Por ejemplo, pero sin limitarse, predicciones in silico de antagonistas o moléculas inhibidoras, ensayos de screening masico (high-throughput assays o HTAs), etc. ARNip para su uso en un método de tratamiento del cáncer

En un cuarto aspecto, la presente invención proporciona ARN pequeños de interferencia (ARNips) (de aquí en adelante, ARNips de la presente invención). Los ARNips de la presente invención son útiles para su uso como medicamento, en particular en un método de tratamiento del cáncer, preferiblemente del cáncer de próstata, mama, vejiga y/o colon. Preferiblemente, los ARNips de la presente invención son útiles para su uso como medicamento, en particular en un método de tratamiento del cáncer, preferiblemente del cáncer de próstata, mama, vejiga y/o colon en pacientes que han sido asignados al grupo de individuos con cáncer o con riesgo de padecer cáncer mediante el método de diagnóstico no invasivo de la presente invención. El "ARNip" o "ARN pequeño de interferencia" o "siRNA", por sus siglas en inglés, se refiere a un tipo de ARN de interferencia que es altamente específico para la secuencia de nucleótidos de su ARNm diana, interfiriendo por ello con la expresión del gen respectivo. Los ARNip intervienen en el mecanismo denominado "interferencia de ARN' o "RNAi". En concreto, los ARNips de la presente invención son capaces de silenciar el ARNm que codifica Inl- ghrelina, y reprimir de esta manera su expresión. En una realización preferida, el ARNm diana de los ARNips de la presente invención es el ARNm de Inl-ghrelina.

Preferiblemente, uno de los ARNips de la presente invención comprende o, alternativamente, consiste en la SEQ ID NO.: 13 (cacuguuucuggaaggacatt). Por lo tanto, la presente invención proporciona un ARNip que comprende o, alternativamente, consiste en la SEQ ID NO.: 13. La presente invención proporciona el uso de este ARNip como un medicamento, en particular en un método de tratamiento del cáncer, preferiblemente cáncer de próstata, mama, vejiga y/o colon. Por lo tanto, la presente invención proporciona este ARNip para la fabricación de un medicamento, en particular para la fabricación de un medicamento útil en el tratamiento del cáncer, preferiblemente del cáncer de próstata, mama, vejiga y/o colon. Preferiblemente, otro de los ARNips de la presente invención comprende o, alternativamente, consiste en la SEQ ID NO.: 14 (gagtcctaaacagactgtt). Por lo tanto, la presente invención proporciona un ARNip que comprende o, alternativamente, consiste en la SEQ ID NO.: 14. La presente invención proporciona el uso de este ARNip como un medicamento, en particular en un método de tratamiento del cáncer, preferiblemente cáncer de próstata, mama, vejiga y/o colon, y preferiblemente en un método de tratamiento del cáncer donde el cáncer no es cáncer de hipófisis. Por lo tanto, la presente invención proporciona este ARNip para la fabricación de un medicamento, en particular para la fabricación de un medicamento útil en el tratamiento del cáncer, preferiblemente un cáncer que no es cáncer de hipófisis, preferiblemente útil en el tratamiento del cáncer de próstata, mama, vejiga y/o colon. Los términos "tratamiento" o "terapia", tal como se emplean en la presente descripción, se refieren a un conjunto de medios higiénicos, farmacológicos, quirúrgicos y/o físicos cuya finalidad es la curación o el alivio de las enfermedades y/o síntomas. Los términos "tratamiento" o "terapia" comprenden tanto métodos profilácticos como curativos, ya que ambos están dirigidos al mantenimiento o restablecimiento de la salud. Independientemente del origen de la dolencia, enfermedad o discapacidad, su alivio, mediante la administración del remedio adecuado, se entiende como terapia o uso terapéutico en el contexto de la presente invención.

En otra realización preferida, el método de tratamiento comprende el uso de cualquiera de los ARNips descritos anteriormente en combinación con uno o más agentes quimioterapéuticos (enzalutamida, abiraterona, etc), en combinación con uno o más anticuerpos terapéuticos (trastuzumab, etc) y/o en combinación con el otro ARNip de la presente invención, tal y como se ha descrito previamente.

Ejemplos

Las muestras de cáncer de próstata (n = 52) se obtuvieron de pacientes que padecen de cáncer de próstata mediante una biopsia con aguja gruesa, mientras que las muestras de cáncer de colon proceden de muestras resecadas de pacientes con dichas patologías. Muestras tisulares de referencia se obtuvieron a partir de la zona no tumoral adyacente o de pacientes que no padecían de este tipo de cáncer.

Las muestras de plasma se obtuvieron de pacientes que padecen de cáncer de próstata con diferentes niveles de riesgo (n = 30) y las muestras de referencia se obtuvieron de pacientes sanos (n = 20). Ejemplo 1: Cuantificación de los niveles de ARNm en muestras de cáncer de próstata y colon.

El ARN total fue aislado de muestras tisulares no tumorales y tumorales usando "Allprep DNA/RNA/Protein Mini Kit". El ADN fue eliminado mediante el kit "RNase-Free DNase Kit". El ARN total de las líneas celulares se extrajo con TRIzol. La concentración y pureza del ARN se analizó usando un espectrofotómetro "Nanodrop 2000" y el ARN fue retrotranscrito usando cebadores genéricos aleatorios y el "cDNA First Strand Synthesis kit".

El ADNc se amplificó mediante qPCR en paralelo a una curva estándar que se usó para cuantificar la cantidad de ARNm en la muestra. La qPCR se realizó usando "Brilliant III SYBR Green Master Mix" y el aparato "Stratagene Mx3000p". El perfil térmico consistía de un paso inicial a 95 °C por 10 minutos, seguido por 40 ciclos de desnaturalización (95 °C por 30 segundos), apareamiento (61°C por 1 minuto), y extensión (72 °C por 30 segundos), y finalmente un ciclo de melting para verificar que solo se amplificó un producto. El ARNm de Inl-ghrelina fue amplificado usando los cebadores SEQ ID NO.: 7 y 8 (tctgggcttcagtcttctcc y gttcatcctctgccccttct, respectivamente), el ARNm de GOAT fue amplificado usando los cebadores SEQ ID NO.: 9 y 10 (ttgctctttttccctgctctc y actgccacgtttaggcattct, respectivamente)y el ARNm de GHS-Rlb fue amplificado usando los cebadores SEQ ID NO.: 11 y 12 (ggaccagaaccacaagcaaa y agagagaagggagaaggcaca, respectivamente).

La presencia de los componentes asociados con el sistema de la ghrelina (Inl-ghrelina, GOAT y GHS- Rlb) se analizaron mediante qPCR. Los niveles de ARNm en las muestras que se obtuvieron de los pacientes que padecen de cáncer de próstata (n= 52) fueron comparadas con los niveles presentes en las muestras de referencia (n= 12). La Inl-ghrelina se encontró sobreexpresada en muestras de pacientes con cáncer de próstata comparada con los controles. La Figura 1 demuestra que los niveles de ARNm de Inl- ghrelina están elevados en las muestras que se obtuvieron de pacientes que padecen de cáncer de próstata cuando se comparan con los niveles que se obtuvieron en próstatas sanas.

La Figura 2 demuestra que los niveles de ARNm de Inl-ghrelina, GOAT y GHS-Rlb están elevados en las muestras que se obtuvieron de pacientes que padecen de cáncer de colon (n=15) cuando se comparan con los niveles que se obtienen en muestras sanas de colon (n=l).

Ejemplo 2: Cuantificación de proteínas en muestras de plasma

La cuantificación de Inl-ghrelina acilada se hizo mediante un radioinmunoanálisis (Número de catálogo: RK-032-42; Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA) siguiendo las instrucciones del fabricante. Los inventores de la presente invención demostraron que se pueden detectar los niveles de Inl-ghrelina acilada en el plasma y que los niveles de Inl-ghrelina acilada estaban significativamente más altos en las muestras de plasma obtenidas de pacientes que padecen de cáncer de próstata (n= 30) que en las muestras de plasma de referencia (n= 20). La Figura 3 demuestra la diferencia entre los niveles de Inl-ghrelina acilada en los dos tipos de muestras. Ejemplo 3: La sobreexpresión de In-ghrelina incrementa la proliferación y migración de células de cáncer de próstata

Las líneas celulares PC-3 and VCap se transfectaron de forma estable con el vector pCDNA3.1 que contenía un fragmento de inserción que codificaba ghrelina o Inl-ghrelina, y se seleccionaron las células transformadas. En más detalle, se sembraron 200,000 células en placas de cultivo de 6 pocilios y se transfectaron con vectores que contenían ghrelina, Inl-ghrelina o vectores vacíos, usando "Lipofectamine 2000 Transfection Reagent", siguiendo las instrucciones del fabricante. Las células transfectadas se seleccionaron con geneticina.

La viabilidad/proliferación celular se midió mediante un ensayo colorimétrico de "Alamar Blue reagent" o MTT sal de tetrazolio. Para los ensayos de "Alamar Blue", se sembraron células a una densidad de 3,000-5,000 en placas de 96 pocilios y se les privó de suero durante 24 horas. Las células se trataron con medio sin suero y 10 % "Alamar Blue" durante 3 horas. La reducción en los niveles de "Alamar Blue" se analizó mediante la excitación a 560 nm y la detección a 590 nm usando el sistema "FlexStation III". Para los ensayos de MTT, se sembraron células a una densidad de 10,000 células/pocilio en placas de 96 pocilios. Después de 36 horas de cultivo, se retiró el medio de cultivo y se añadió medio de cultivo fresco que contenía 1 % FBS. La proliferación se midió después de 24, 48 y 72 horas de incubación. Antes de medir, se incubaron las células con una solución que contenía MTT durante 2 horas, se retiró la solución y se añadió una solución con DMSO, SDS y ácido acético y las células fueron centrifugadas a 150 rpm durante 15 minutos. Las medidas se hicieron con un "FlexStation III" a 590 nm.

La migración celular se midió mediante un ensayo de cicatrización de la herida. 200,000 células PC-3 fueron sembradas en placas de cultivo de 6 pocilios y cultivadas hasta confluencia. Entonces, se hizo una estría (herida) sobre la superficie con una punta de pipeta de 200 μΐ y se incubaron las células a 37 °C durante 12 horas. Se tomaron 3 fotos independientes a 0 horas y 12 horas después de la herida. La reparación de la herida se calculó como el área del rectángulo centrado en la foto que se tomó 12 horas después de la herida contra el área del rectángulo justo después de haber estriado la superficie.

Estos estudios demostraron que la sobreexpresión de Inl-ghrelina, pero no de la ghrelina, incrementó la proliferación de VCaP y PC-3 después de 48 horas (Figura 4A). Además la sobreexpresión de Inl- ghrelina y no la ghrelina incrementó la migración de las células PC-3 (Figura 4B).

Ejemplo 4: La sobreexpresión de In-ghrelina incrementa el crecimiento de tumores xenógrafos

Ratones machos atímicos BALB/cAnNRj-Foxnlnu de 10 semanas se inocularon de manera subcutánea a ambos lados del torso con 2 x 10 ⁶ células PC-3 transfectadas con vectores que contenían ghrelina, Inl- ghrelina o vectores vacíos suspendidos en 100 μΐ de extracto de "Basement membrane extract". El crecimiento y el volumen de los tumores se midieron 1 vez a la semana durante 3 meses con un calibre digital. Cada tumor fue diseccionado, fijado y seccionado para ensayos histopatológicos. Después de teñir las muestras con hematoxilina y eosina se examinó la necrosis y mitosis. En este estudio se demostró que los tumores xenoinjertados de manera subcutánea eran más grandes si contenían células que estaban transfectadas con un vector que contenía Inl-ghrelina (Figura 5). Además, los ensayos histopatológicos demostraron que los tumores que contenían células que estaban sobreexpresando Inl-ghrelina exhibían una mayor frecuencia de necrosis sin haber cambios en la frecuencia de mitosis (Figura 5).

Ejemplo 5: El silenciamiento de la Inl-ghrelina disminuyó la proliferación celular y la secreción de PSA

Para los ensayos de silenciamiento se usaron las líneas celulares PC-3 y LnCaP. En concreto, se sembraron 200,000 células en placas de cultivo de 6 pocilios y las células fueron incubadas hasta que se logró una confluencia de 70%. Las células se transfectaron con el ARNip SEQ ID NO.: 13 (cacuguuucuggaaggacatt), diseñado para silenciar la expresión de Inl-ghrelina [denominado siRNA (1) en la figura 6], el ARNip SEQ ID NO.: 14 (gagtcctaaacagactgtt) diseñado para silenciar la expresión de Inl-ghrelina [denominado siRNA (2) en la figura 6] o con un control aleatorizado usando "Lipofectamine RNAiMAX". Después de 48 horas, se recogieron las células y se sembraron las células para estudiar su proliferación y la secreción de PSA.

Después de confirmar que los ARNip habían silenciado efectivamente la expresión de Inl-ghrelina usando qPCR (Figura 6A), se demostró que el silenciamiento de Inl-ghrelina disminuyó la proliferación celular de PC-3 y LnCaP después de 24-48 horas (Figura 6B). Además, el silenciamiento de Inl-ghrelina redujo la secreción de PSA en las células LnCaP (Figura 6C).

Ejemplo 6: La sobreexpresión de Inl-ghrelina y/o GHS-Rlb aumenta la proliferación de líneas celulares derivadas de cáncer de colon (HTB2 y HTB5).

Las líneas celulares HTB-2 and HTB-5 se transfectaron de forma transitoria con el vector pCDNA3.1 que contenía un fragmento de inserción que codificaba Inl-ghrelina o GHS-Rlb. En concreto, se sembraron 200,000 células en placas de cultivo de 6 pocilios y se transfectaron con vectores que contenían Inl- ghrelina y/o GHRS-lb o vectores vacíos, usando "Lipofectamine 2000 Transfection Reagent", siguiendo las instrucciones del fabricante. La viabilidad/proliferación celular se midió mediante un ensayo colorimétrico de "Alamar Blue reagent". Para ello, se sembraron células a una densidad de 5,000 en placas de 96 pocilios y se les privó de suero durante 24 horas. Las células se trataron con medio sin suero y 10 % "Alamar Blue" durante 3 horas. La reducción en los niveles de "Alamar Blue" se analizó mediante la excitación a 560 nm y la detección a 590 nm usando el sistema "FlexStation III".

Los resultados de este estudio demostraron que la sobreexpresión de Inl-ghrelina o de GHS-Rlb incrementa la capacidad proliferativa de las células derivadas de cáncer de colon HTB-2 y HTB-5, especialmente tras 4 días de transfección. Además, este efecto parece más pronunciado cuando se sobreexpresaron simultáneamente ambas variantes, especialmente en las HTB-5.