La invención se refiere al uso de un antagonista y/o agonista inverso de los receptores CB1 , preferentemente rimonabant, para Ia preparación de medicamentos útiles para aumentar Ia excitabilidad de las neuronas motoras a nivel de Ia corteza cerebral y/o del tronco del encéfalo y/o a nivel espinal, así como a un método para aumentar Ia excitabilidad de las neuronas motoras a través de Ia administración de un antagonista/agonista inverso de los receptores CB1 , y al uso de una composición farmacéutica que comprende un antagonista y/o agonista inverso de los receptores CB1 , preferentemente rimonabant, para aumentar Ia excitabilidad de las neuronas motoras a nivel de Ia corteza cerebral y/o del tronco del encéfalo y/o a nivel espinal. Por Io tanto, Ia presente invención pertenece al campo de Ia técnica de medicina.

ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR

El sistema cannabinoide endógeno está formado por ligandos endógenos, sus enzimas de síntesis y de degradación y por dos receptores específicos distintos clonados hasta Ia fecha: el receptor cannabinoide de tipo 1 (CB1 ), y el receptor cannabinoide de tipo 2 (CB2). Los agonistas del receptor cannabinoide tipo 1 (CB1 ) pueden reducir Ia espasticidad y el dolor en un gran número de enfermedades neurológicas, reumáticas, traumáticas y en cáncer. El agonismo del receptor CB1 , además, provoca sueño.

Rimonabant es el inn (International nonproprietary ñame) para N-

(piperidino-1-il)-5(4-clorofenil)-1 (2,4-diclorofenil)-4-metilpirazol-3- carboxamida. Este compuesto fue descrito por primera vez en Ia EP

656354 como un antagonista/agonista inverso del receptor CB1.

Rimonabant ha superado varios ensayos clínicos en los que se proponía como una nueva alternativa para tratar Ia obesidad, llegando a obtener Ia autorización de comercialización de varias agencias del medicamento entre ellas Ia Agencia Europea del Medicamento (EMEA), y se comercializó de Ia unión europea como ACOMPLIA ^® . Con esta indicación, , ACOMPLIA ^® , que comprendía una dosificación 20 mg/día de rimobadant, se utilizó como un complemento a Ia dieta y el ejercicio para el tratamiento de pacientes obesos (definidos como IMC + 30 Kg/m ² (IMC = índice de masa corporal)), o pacientes con el IMC > de 27 kilogramos/m ² que también lleven asociados factores de riesgo, tales como diabetes tipo-2 o dislipidemia. Debido a las continuas revisiones a las que se somete Ia ciencia médica, el Comité de Ia Agencia Europea del Medicamento para los productos médicos de uso humano (CHMP) decidió restringir el uso del fármaco a partir del julio de 2007. El CHMP recomendó una nueva puesta al día del uso de Acomplia ^® en mayo de 2008 y en octubre de 2008, concluyó que los beneficios de Acomplia ^® para esta indicación no compensan los riesgos observados y ha determinado suspender Ia autorización para comercializar el fármaco en toda Ia Unión Europea (UE).

Sin embargo, hasta ahora no se había determinado Ia capacidad de Acomplia ^® de aumentar Ia excitabilidad de las neuronas motoras y sus efectos sobre fatiga, Io cual extiende el uso de los antagonistas/agonistas inversos de CB1 como componentes activos en el tratamiento de un gran número de trastornos médicos.

Muchas patologías neurológicas se caracterizan por Ia disminución de Ia excitabilidad de las motoneuronas corticales y espinales y más en general por una disminución de Ia salida motora corticoespinal (por ejemplo las vasculopatias cerebrales, Ia esclerosis múltiple, Ia lesión medular, el síndrome de fatiga crónica, etc). También hay que resaltar que algunas enfermedades que no se caracterizan por una disminución de Ia excitabilidad de las motoneuronas se benefician de un aumento temporal de la excitabilidad de las motoneuronas y de un aumento de Ia salida motora corticoespinal (por ejemplo las patologías del nervio periférico, las hipotrofias musculares, Ia fatiga muscular, etc). En todas estas condiciones clínicas un aumento de Ia excitabilidad de las motoneuronas y un consecuente aumento de Ia salida cortioespinal es beneficioso. No existen por el momento tratamientos de probada eficacia para aumentar Ia excitabilidad de las motoneuronas y Ia consecuente salida corticoespinal.

Muchas patologías neurológicas se caracterizan por una excesiva somnolencia (hypersomnio, narcolepsia, síndrome de fatiga crónica, Enfermedad de Parkinson etc). En todas estas condiciones clínicas un aumento del sistema de activación ascendente (arousal system) es beneficiosa. Al momento actual existen pocos tratamientos de probada eficacia para activar el sistema de activación ascendente.

Para ninguna de estas enfermedades relacionadas con las alteraciones del movimiento no existen actualmente tratamientos de probada eficacia que cursen a través de un aumento de Ia excitabilidad de las motoneuronas.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

Los presentes inventores han encontrado que sorprendentemente los antagonistas y/o agonistas inversos de los receptores CB1 aumentan Ia excitabilidad de las neuronas motoras a nivel de Ia corteza cerebral, del tronco del encéfalo y a nivel espinal en pacientes humanos. También, los presentes inventores han encontrado que sorprendentemente los antagonistas y/o agonistas inversos de los receptores CB1 aumentan Ia actividad del sistema activador ascendente o sistema de alerta (arousal system). La presente invención también describe tratamientos para las enfermedades relacionadas con disminución de Ia excitabilidad de las motoneuronas y/o con Ia disminución de Ia activación del sistema activador ascendente o sistema de alerta, es decir trata sobre el uso de los antagonista y/o agonista inverso de los receptores CB1 para Ia preparación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades donde el aumento de Ia excitabilidad de las neuronas motoras a nivel de Ia corteza cerebral, del tronco del encéfalo y/o a nivel espinal es beneficioso.

Por tanto, el objeto de Ia presente invención es el uso de un antagonista y/o agonista inverso de los receptores CB1 para Ia preparación de un medicamento para el tratamiento de las alteraciones del movimiento, Ia fatiga, Ia reducción de Ia somnolencia diurna excesiva, Ia reducción de Ia bradiquinesial y/o Ia reducción de Ia hipoquinesia.

DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

La figura 1 muestra los valores umbral usando estimulación magnética y eléctrica transcraneal antes y después de Ia administración de 20 mg de rimonabant. El valor del umbral se expresa en porcentaje (%) de Ia máxima salida del estimulador. Las barras de error representan las desviaciones estándar. En Ia figura 1 en negro se representan los valores de Ia línea base y en blanco los valores después de Ia administración de rimonabant. La administración de rimonabant redujo de manera significante Ia media del umbral motor en activación utilizando Ia estimulación magnética transcraneal de aquí en adelante denominada AMTtms (línea base 39±4% vs 35,5±4%; P = 0,0008) mientras que el valor del umbral motor en reposo utilizando Ia estimulación magnética transcraneal de aquí en adelante denominada RMT no fue significativamente afectado (línea base 48±6% vs. 46,5±6%P = 0,0775).

La administración de rimonabant redujo de manera significante Ia media de del umbral motor en activación utilizando Ia estimulación eléctrica transcraneal de aquí en adelante denominada AMTtes (línea base 19,6±6% vs 17,5±6%; P = 0,0164).

La figura 2 muestra Ia cantidad de facilitación intracortical (ICF) antes y después Ia administración de 20 mg de rimonabant. El valor de Ia ICF se expresa en porcentaje (%) de Ia respuesta obtenida con el estimulo test en ausencia del estimulo condicionante. Las barras de error representan las desviaciones estándar. En Ia figura 2 en negro se representan los valores de Ia línea base y en blanco los valores después de Ia administración de rimonabant. La administración de rimonabant redujo de manera significante Ia media de ICF (línea base 117±21 % vs +150±40%; P =

0,0212).

La figura 3 muestra que el tratamiento de ratas con antagonistas /agonistas inversos del receptor CB1 (SR141716A en este ejemplo) disminuyó Ia latencia en las 24 horas después de Ia inyección, Io que significa que Ia inhibición de este receptor aumentó Ia resistencia a Ia fatiga en ese tiempo (Figura 3a). Este efecto puede ser observado con claridad en Ia figura 3b, en que se muestra que Ia mejora en resistencia a Ia fatiga (disminución en Ia latencia) de las ratas tratadas con antagonistas/agonistas inversos del receptor CB1 (SR141716A en este ejemplo) resultó de promedio 75 segundos mejor en los animales con SR141716A que en los animales tratados con vehículo a las 2 horas después de Ia fatiga; y de 125 segundos mejor en los animales con SR141716A que en los animales tratados con vehículo a las 24 horas después de Ia fatiga. En el eje X indica el tiempo en horas (h) y el eje Y indica el Δ de Ia latencia en segundos (a) y Ia mejora en segundos respecto al vehículo (b).

La figura 4 muestra que el tratamiento de ratas con antagonistas/agonistas inversos del receptor CB1 (AM281 en este ejemplo) disminuyó latencia en las 24 horas después de Ia inyección, Io que significa que Ia inhibición de este receptor aumentó Ia resistencia a Ia fatiga en ese tiempo (Figura 4a). Este efecto puede ser observado con claridad en Ia figura 4b, en Ia que se muestra que Ia mejora en resistencia a Ia fatiga (disminución en Ia latencia) de las ratas tratadas con antagonistas/agonistas inversos del receptor CB1 (AM281 en este ejemplo) resultó de promedio 185 segundos mejor en los animales con AM281 que en los animales tratados con vehículo a las 2 horas después de Ia fatiga; y de 207 segundos mejor en los animales con AM281 que en los animales tratados con vehículo a las 24 horas después de Ia fatiga. En el eje X indica el tiempo en horas (h) y el eje Y indica el Δ de Ia latencia en segundos (a) y Ia mejora en segundos respecto al vehículo (b).

La figura 5 muestra que los antagonistas/agonistas inversos del receptor CB1 aumentan Ia resistencia en ratas con lesión medular moderada sometidas a carrera forzada. Igual que se observó para ratas normales, el tratamiento de ratas lesionadas con rimonabant (SR141716A) disminuyó Ia latencia, esto es, aumentó Ia resistencia a Ia fatiga a las 2 horas de Ia inyección frente a los vehículos (Figura 5a). En el momento de completar el test de fatiga, 24h más tarde, el rendimiento de las ratas vehículo y SR141716A mantenía las diferencias observadas el día anterior (Figura 5a). Este efecto puede ser observado con claridad en Ia figura 5b, en Ia que se muestra que Ia mejora en resistencia a Ia fatiga (disminución en Ia latencia) de las ratas tratadas con antagonistas/agonistas inversos del receptor CB1 (SR141716A en este ejemplo) resultó de promedio 136 segundos mejor en los animales con SR141716A que en los animales tratados con vehículo a las 2 horas después de Ia fatiga; y de 200 segundos mejor en los animales con SR141716A que en los animales tratados con vehículo a las 24 horas después de Ia fatiga. En el eje X indica el tiempo en horas (h) y el eje Y indica el Δ de Ia latencia en segundos (a) y Ia mejora en segundos respecto al vehículo (b). DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

El sorprendente efecto de los antagonistas y/o agonistas inversos de los receptores CB1 de aumentar Ia excitabilidad de las neuronas motoras a nivel cortical y/o del tronco del encéfalo y/o a nivel espinal se puede utilizar para tratar enfermedades o patologías relacionadas con las alteraciones del movimiento y/o Ia recuperación de Ia función motora en enfermedades del sistema nervioso central caracterizadas por Ia disfunción motora, como el ictus, Ia esclerosis múltiple o Ia lesión de Ia médula espinal. Todas estas patologías están caracterizada por presentarse con una disminución de Ia salida motora corticoespinal y/o con una disminución de Ia excitabilidad de las motoneuronas (Ward, Curr Opin Neurol. 2004 Dec, 17(6), 725-30, Thickbroom y otros, J Neurol. 2006 Aug, 253(8), 1048-53). Por esta razón, un aumento de Ia salida motora corticoespinal y/o con aumento de Ia excitabilidad de las motoneuronas es beneficiosa. El efecto de aumentar Ia excitabilidad de las neuronas motoras a nivel cortical, del tronco del encéfalo y/o a nivel espinal puede estar acompañado por ejercicio o rehabilitación para potenciar Ia recuperación motora. En una realización particular Ia alteración del movimiento relacionado con el sistema nervioso central es ictus, en otra realización es esclerosis múltiple, y una tercera realización trata del uso para el tratamiento de lesiones de Ia médula espinal.

La utilización de los antagonistas y/o agonistas inversos de los receptores CB1 no se limitan a alteraciones del movimiento del sistema nervioso central, sino que también son útiles para el tratamiento de las alteraciones del movimiento relacionadas con el sistema nervioso periférico, como por ejemplo Ia parálisis. La rehabilitación de estas lesiones nerviosas se beneficia de una mayor activación del nervio alterado (para una revisión Grasso y otros, Clin Ter. 1997 Sep, 148(9), 351-92). Un aumento de Ia excitabilidad de las motoneuronas produce una mayor activación del nervio y por esto es beneficiosa.

Al aumentar Ia excitabilidad de las neuronas motoras a nivel cortical, del tronco del encéfalo y/o a nivel espinal, se puede permitir o mejorar Ia recuperación de Ia función motora en aquellas enfermedades caracterizadas por disfunción motora causada por afecciones del sistema nervioso periférico, tales como las neuropatías de los nervios craneales (p.ej. facial) y espinales (p.ej. parálisis de Bell, síndrome de Guillain Barré, neuropatías motoras y sensorio-motoras). El efecto de aumentar Ia excitabilidad de las neuronas motoras a nivel cortical, del tronco del encéfalo y/o a nivel espinal puede estar acompañado por ejercicio o rehabilitación para potenciar Ia recuperación motora. La rehabilitación de estas lesiones nerviosas se beneficia de una mayor activación del nervio alterado (para una revisión Grasso y otros, Clin Ter. 1997 Sep, 148(9), 351-92). Un aumento de Ia excitabilidad de las motoneuronas produce una mayor activación del nervio y por esto es beneficioso.

En una realización preferente, dicha enfermedad del sistema nervioso periférico es Ia neuropatía motora de los nervios craneales y espinales.

En otra realización preferente, dicha enfermedad del sistema nervioso periférico es Ia parálisis de Bell.

En una realización preferente, dicha enfermedad del sistema nervioso periférico es el síndrome de Guillain Barré.

La fatiga es una disminución de Ia capacidad de producir voluntariamente fuerza muscular máxima. La fatiga se produce en numerosas partes de Ia vía motora, incluyendo las neuronas motoras, Ia corteza motora y Ia medula espinal. La fatiga es causada por diferentes mecanismos nerviosos centrales y periféricos. La fatiga se caracteriza por una disminución de Ia excitabilidad de las motoneuronas corticales y espinales (Thickbroom y otros, J Neurol. 2006 Aug, 253(8), 1048-53; Gandevia, Physiol Rev. 2001 Oct, 81(4), 1725-89) y por Ia disminución de Ia salida motora cortical (Gandevia, Physiol Rev. 2001 Oct, 81(4), 1725-89). Un aumento de Ia excitabilidad de las motoneuronas y el consecuente aumento de Ia salida motora cortical es beneficioso. Los presentes inventores han encontrado que los antagonistas y/o agonista inverso de los receptores reducen Ia sensación de fatiga, en especial de Ia fatiga asociada a ictus, a esclerosis múltiple y/o el síndrome de fatiga crónica. En una realización preferente dicha enfermedad caracterizada por fatiga excesiva es el ictus. En otra realización preferente dicha enfermedad caracterizada por fatiga excesiva es Ia esclerosis múltiple. Y en otra realización preferente dicha enfermedad caracterizada por fatiga excesiva es el síndrome de fatiga crónica.

En otra realización particular trata del uso de los antagonistas y/o agonistas inversos de los receptores CB1 para el tratamiento de Ia disfunción de Ia motoneuronas.

El aumento en Ia excitabilidad de las neuronas motoras a nivel cortical, del tronco del encéfalo y/o a nivel espinal se puede utilizar para mejorar temporalmente Ia función motora en desórdenes de las neuronas motoras como Ia Esclerosis Lateral Amiotrófica y Ia Esclerosis Lateral Primaria. En una realización preferente dicha enfermedad es Ia Esclerosis Lateral

Amiotrófica. En una realización preferente dicha enfermedad es Ia Esclerosis Lateral Primaria.

El aumento de Ia actividad de los sistemas de alerta y vigilia (Arousal systems), se puede utilizar para reducir Ia excesiva somnolencia diurna que se produce en Ia narcolepsia y en los desórdenes de sueño caracterizados por hipersomnio. La narcolepsia se caracteriza por una reducción de Ia excitabilidad cortical (Oliviero y otros, J Neurol. Enero de 2005, 252 (1 ), 56-61 ) por lo que el aumento de esta excitabilidad resulta en una reducción de Ia esta. La posibilidad de aumentar Ia actividad de los sistemas de alerta y vigilia es beneficioso para Ia somnolencia excesiva diurna y el hipersomnio que están asociadas a disminución de Ia actividad de los sistemas de alerta y vigilia y que se presentan también con una disminución de Ia excitabilidad de las motoneuronas corticales (De Gennaro y otros, Neuroimage. 2007 JuI 15, 36(4), 1277-87).

El aumento en Ia excitabilidad de las neuronas motoras a nivel cortical, del tronco del encéfalo y/o a nivel espinal, se puede utilizar para el tratamiento de Ia bradiquinesia y/o de Ia hipoquinesia (p.ej. enfermedad de Parkinson y Parkinsonismos). La sintomatología de Ia Enfermedad de Parkinson y de los parkinsonismos mejora cuando con técnicas de neuromodulación no farmacológica se aumenta Ia excitabilidad de Ia corteza cerebral (por una revisión Wu y otros, Neurotherapeutics. 2008 Apr, 5(2), 345-61 ). Un aumento de Ia excitabilidad de las motoneuronas, y el consecuente aumento de Ia salida motora cortical, es beneficioso en Ia Enfermedad de Parkinson y en los Parkinsonismos.

Es un objeto particular adicional de Ia invención un método para mejorar Ia función motora normal y/o acelerar Ia recuperación después de una lesión de cualquier origen (vascular, inflamatoria, traumática, etc.) del sistema nervioso central y/o sistema nervioso periférico y/o muscular. La rehabilitación de estas lesiones nerviosas se beneficia de una mayor activación de las funciones motoras alteradas (para una revisión Grasso y otros, Clin Ter. 1997 Sep, 148(9), 351-92). Un aumento de Ia excitabilidad de las motoneuronas produce una mayor activación funcional de las funciones motoras y por esto puede ser beneficiosa.

Otro objeto de Ia presente invención es el uso de una composición que comprende un antagonista y/o agonista inverso de los receptores CB1 para mejorar el entrenamiento en deportistas. El entrenamiento de los deportistas se beneficia de una mayor activación de las funciones motoras, por Io que es beneficioso el aumento de Ia excitabilidad de las motoneuronas, al producir una mayor activación motora (para una revisión Lehmann y otros, J Sports Med Phys Fitness. 1997 Mar, 37(1 ), 7-17).

Las ventajas de Ia presente invención están asociadas a los receptores cannabinoides presentes a nivel cortical y/o del tronco del encéfalo y/o a nivel espinal, por Io que los efectos sorprendentes de Ia presenta invención son aplicables a todos los agonistas inversos y/o antagonistas de Ia CB1. El término "antagonista CB1" está destinado a designar un antagonista del receptor cannabinoide CB1. Este es un compuesto que se une al receptor y carece de capacidad sustancial para activar el receptor de Ia misma. Un antagonista previene o reduce Ia activación funcional o Ia ocupación del receptor por parte de un agonista, como Ia anandamida. En algunas realizaciones, el antagonista tiene una IC50 de alrededor de 1 μM a alrededor de 1 nM. En otras realizaciones, el antagonista tiene una IC ₅₀ de de alrededor de 0,1 μM a 0,01 μM, 1 ,0 μM M a 0,1 μM, o un 0,01 por μM a 1 nm. En algunas realizaciones, el antagonista compite con el agonista en Ia unión a un sitio de unión compartido en el receptor. Estos compuestos son muy conocidos y están muy definidos en Ia técnica. Por ejemplo las patentes US 5,747,524 y US 6,017,919 describen algunos de los métodos válidos para el screening de Ia actividad frente a CB1 , el cual permite Ia identificación de los compuestos útiles en Ia invención.

En el modelo clásico de activación de receptores acoplados a Ia proteína G, el modelo clásico de dos estados (two-stage model), los ligandos agonistas estabilizan o incrementan Ia fracción de receptor en estado activo, de forma que puede interaccionar y activar a una proteína G transductora de señal y los subsecuentes efectores. Los ligandos denominados agonistas inversos estabilizan o aumentan Ia fracción del receptor en estado inactivo, mientras que los antagonistas neutros no alteran el equilibrio entre los estados activo o inactivo del receptor. La primera generación de antagonistas de receptores cannabinoides desarrollados en los años 90, como por ejemplo, el SR141716A, ligando selectivo para CB1 (Rinaldi-Carmona y otros, FEBS Lett. 1994 Aug 22; 350(2-3):240-4), el LY320135 o las moléculas diseñadas por Alexandros Makriyannis: el AM251 y el AM281 que son análogas al SR141716A, producían efectos contrarios a los de los agonistas CB1. Estos efectos cannabinomiméticos inversos se producían en ausencia de liberación de cannabinoides endógenos, Io que sugirió que los receptores cannabinoides CB1 podían existir en un estado de activación constitutiva en ausencia de ligando agonista, de forma que los agonistas inversos desplazaban el estado activado del receptor a un estado inactivo. Los agonistas inversos producen efectos opuestos al de los agonistas en alguno de los bioensayos de receptores. Por ejemplo, "in vivo" el agonismo inverso incluye los signos de hiperalgesia en modelos de dolor inflamatorio o neuropático (test de Ia formalina), Ia inhibición del edema en Ia pata producida por carragenina (carrageenan-induced paw oedema), Ia estimulación de Ia motilidad intestinal, o Ia supresión del consumo de alimento, mientras que "in vitro" se produce un aumento de Ia liberación de neurotransmisores (acetil colina, noradrenalina o gamma aminobutírico) o inhibición de Ia unión del [ ³⁵ S]GTPyS en preparaciones de membrana (para una revisión Pertwee RG in International Journal of Obesity 2006, 30, S13-S18)

Un primer grupo de antagonistas de los receptores cannabinoides CB1 son los derivados del pirazol. Las patentes EP 576357 y EP 658546 describen ejemplos de derivados del pirazol que tienen afinidad por los receptores cannabinoides. Más particularmente, Ia patente EP 656354 muestra ejemplos de derivados de pirazol y describe el compuesto N-piperidina-5- (4-clorofenil)-1 -(2,4-diclorofenil)-4-metilpirazol-3-carboxamida, o SR 141716, y sus sales farmacéuticamente aceptables, los cuales tienen una buena afinidad por los receptores cannabinoides centrales.

Otro ejemplo adicional de antagonista de los receptores CB1 se muestra en Ia patente US 5,596,106, Ia cual describe que los compuestos arilbenzo[b]tiofeno y benzo[b]furano, como inhibidores o bloqueadores de los receptores cannabinoides en mamíferos.

Preferiblemente, el antagonista cannabinoide es selectivo del receptor CB1 y tiene una IC50 respecto al receptor CB1 que es una cuarta parte o menos que Ia IC50 para el receptor CB2, o más preferiblemente una décima parte o menos de Ia IC50 del receptor CB2, y aún más preferiblemente una centésima parte de Ia IC ₅₀ de los receptores CB2.

Cada una de las referencias anteriormente citadas se incluye por referencia en su totalidad.

Otro ejemplo representativo es Ia yodopravadolina (AM-630). El AM-630 es un antagonista de los receptores CB1 , pero a veces se comporta como agonista parcial débil (Hosohata, K.; Quock, R. M.; Hosohata, Y.; Burkey, T. H.; Makriyannis, A.; Consroe, P.; Roeske, W. R.; Yamamura, H. I. Life Sc. 1997, 61 , PL115). Más recientemente, los investigadores de EIi Lilly describieron arilaroilos sustituyendo a los benzofuranos como antagonistas de los receptores CB1 (p.ej. LY-320135) (Felder, C. C; Joyce, K. E.; Briley, E. J.; Glass, M.; Mackie, K. P.; Fahey, K. J.; Cullinan, G. J.; Hunden, D. C; Johnson, D. W.; Chaney, M. O.; Koppel, G. A.; Brownstein, M. J. Pharmacol. Exp. Ther. 1998, 284, 291 ). Recientemente fueron descritas las 3-alquill-5,5'-difenillimidazolidinadionas como ligandos de los receptores cannabinoides que indicaban ser antagonistas de los receptores cannabinoides (Kanyonyo, M., Govaerts, S. J.; Hermans, E.; Poupaert, J. H., Lambert, D. M. Biorg.Med. Chem. Lett. 1999, 9, 2233). Sorprendentemente, muchos antagonistas de los receptores CB1 han sido descritos con comportamiento de agonistas inversos in vitro (Landsman, R. S.; Burkey, T. H.; Consroe, P.; Roeske, W. R.; Yamamura, H. I. Eur. J. Pharmacol. 1997, 334, R1 ). Recientes revisiones proporcionan una buena descripción del estado actual en el área de investigación de los cannabinoides (Mechoulam, R.; Hanus, L.; Fride, E. Prog. Med. Chem. 1998, 35, 199. Lambert, b. M. Curr. Med. Chem. 1999, 6, 635. Mechoulam, R.; Fride, E.; Di Marzo, V. Eur. J. Pharmacol. 1998, 359, 1 ).

En Ia WO 01/70700 se da a conocer Ia potente y selectiva actividad antagonista sobre los receptores CB1 de los compuestos 4,5-dihidro-1 H- pirazol.

También son útiles como antagonistas de los receptores cannabinoides CB1 los compuestos de fórmula:

Donde los sustituyentes Ri, R2, R3, R ₄ , y R5 están definidos en Ia patente US 5,596,106 que se incorpora por referencia en su totalidad. Esta referencia describe ejemplos adicionales de derivados de aril- benzo[b]tiofenos y arilbenzo[b]furanos y su uso de acuerdo con Ia presente invención.

Los antagonistas cannabinoides con Ia fórmula siguiente son particularmente útiles de acuerdo con Ia presente invención.

Donde Ri es hidrogeno, un fluoruro, un hidroxilo, un (Ci-Csjalcoxi, un (d- C ₅ )tioalquilo, un hidroxil(Ci-C5)alcoxi, un grupo -NR10R11, un ciano, un (d- C ₅ )alquilsulfonilo o un (Ci-C ₅ ) alquilsulfinilo; R ₂ y R ₃ son independientemente un (d-C4)alquilo o bien, forman un radical heterocíclico de 5 a 10 miembros junto con el nitrógeno al cuál están enlazados el cuál no está sustituido o bien está monosustituido o polisustituido por un (CrC ₃ )alquilo o bien por un (Ci-C ₃ )alcoxi; R ₄ , R ₅ , R ₆ , R7, Re y R9 son independientemente hidrogeno, halógeno o trifluorometil, y si Ri es un fluoruro, R ₄ , R ₅ , R ₆ , R7, Re y/o Rg también pueden ser un fluorometil, con Ia condición de que como mínimo uno de los sustituyentes R ₄ o R7 es otro sustituyente que no sea hidrógeno; y R10 y Rn son independientemente hidrogeno o un (Ci-C ₅ )alquilo, o bien R ₁₀ y Rn, junto con el nitrógeno al cuál están enlazados forman un radical heterocíclico seleccionado de entre pirrolidina-1-ilo, piperidina-1-ilo, morfolina-4-ilo y piperazina-1-ilo, los cuales están o no sustituidos por un (Ci-C ₄ )alquilo, y sus sales y solvatos.

Otros ejemplos selectivos de compuestos antagonistas de los CB1 son útiles en el contexto de Ia presente invención incluyendo (pero no limitando): 1 ) Diarilpirazoles análogos descritos por Sanofi como antagonistas selectivos de los CB1 , como ejemplo representativo son los compuestos SR-141716A, SR-147778, SR-140098, rimonabant y compuestos relacionados descritos en las patentes EP 0969835 y EP 1150961 (Central mediation of the cannabinoid cue: activity of a selective CB1 antagonista, SR 141716A Perio A, Rinaldi-Carmona M, Maruani J Behavioural Pharmacology 1996, 7:1 (65-71 )); WIN-54461 descrito por Sanofi-Winthrop (Cannabinoid receptor ligands: Clinical y neuropharmacological considerations relevant to future drug discovery y development. Pertwee R G, Expert Opinión on Investigational Drugs 1996, 5:10 (1245-1253)).

La N-piperidina-5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4-metilpi razol-3- carboxamida (SR 141616, CAS number: 168273-06-1 ), y sus sales farmacéuticamente aceptables y sus solvatantes han sido útilmente descritos en Ia preparación de fármacos para el tratamiento de desordenes del apetito.

SR 141716, (inn: rimonabant) está representado por Ia formula:

Rimonabant está especialmente descrito en Ia patente EP 656354 o en el articulo de M. Rinaldi-Carmona et al. (FEBS Lett., 1994, 350, 240-244). La patente EP1446384 A1 describe nuevos derivados del rimonabant, Ia formulación que comprende rimonabant esta descrita en WO2003082256, y el uso de rimonabant en desordenes del apetito está descrito en Ia patente WO99/00119.

2) Aminoalquilindoles han sido descritas como antagonistas de los receptores CB1. Un ejemplo representativo es el compuesto

Yodopravadolina (AM-630).

3) Aril-aroilo sustituyen a los benzofuranos descritos por EIi Lilly como antagonistas selectivos de los receptores CB1 , p. ej. LY-320135 (Cannabinoid receptor ligands: Clinical y neuropharmacological considerations relevant to future drug discovery y development. Pertwee R G, Expert Opinión on Investigational Drugs1996,5:10-(1245-1253)).

4) Los compuestos descritos Merck & Co, p. ej. AM 251 y AM 281 (Conference: 31 st Annual Meeting of the Society for Neuroscience, San

Diego, USA, 10-15, Nov. 2001 ), y los derivados de imidazolilos sustituidos descritos en p.ej. US 2003114495 o bien WO 03/007887.

5) Los derivados de azetidina descritos por Aventis Pharma p. ej. en Ia patente WO 02/28346 o en EP 1328269.

6) El CP-55940 de Pfizer Inc. (Comparison of the pharmacology y signal transduction of the human cannabinoid CB1 y CB2 receptors, Felder C C, Joyce K E, Briley E M, Mansouri J, Mackie K, Blond O, Lai Y, Ma A L, Mitchell R L, Molecular Pharmacology 1995, 48, 3 (443)).

7) Los derivados de diaril-pirazin-amida de Astra Zeneca descritos p. ej. en Ia patente WO 03/051851.

8) ACPA y ACEA del Med. CoII. Wisconsin (Univ. Aberdeen), ("Effects of AM 251 & AM 281 , cannabinoid CB1 antagonistas, on palatable food intake in lewis rats" J. Pharmacol. Exp. Ther. 289, No 3,1427-33, 1999).

9) Los derivados de pirazol descritos por Ia Universidad de Conneticut p. ej. en Ia patente WO 01/29007.

10) HU-210 (International Association for the Study of Pain-Ninth World Congress (Part II) Vienna, Austria, Dickenson A H, Carpenter K, Suzuki R, IDDB MEETING REPORT 1999, Aug. 22-27) y HU-243 (Cannabinoid receptor agonists y antagonistas, Barth F, Current Opinión in Therapeutic Patents 1998, 8, 3 (301-313)) de Yissum R&D Co Hebrew Univ. de Jerusalem.

11 ) O-823 de Organix Inc. (Drug development pipeline: O-585, O-823, O- 689, O-1072, nonamines, Orgaix, Altropane Organix Inc, Company

Communication 1999, Aug. 10; IDDb datábase) y O-2093 del Consiglio Nazionale delle Ricerche ("A structure/activity relationship study on arvanil, endocannabinoid y vanilloid hybrid.", Marzo D V, Griffin G, Petrocellis L, Brandi I, Bisogno T, Journal of Pharmacology y Experimental Therapeutics 2002, 300, 3 (984-991 )).

12) Las 3-alquilo-5,5'-difeniloimidazolidinadionas descritas como ligandos de los receptores cannabinoides.

13) Los compuestos antagonistas de los CB1 actualmente bajo desarrollo por Bayer AG (IDDb datábase: company communication 2002, Feb. 28).

14) Los derivados de pirazol antagonistas de los CB1 de acuerdo con Ia formula (I) de Ia patente US 6,028,084 incorporada como referencia en su totalidad. 15) La patente US 6,017,919 describe otro grupo apropiado de antagonistas de los receptores cannabinoides y su uso de acuerdo con Ia presente invención, con fórmula general:

Donde los sustituyentes están definidos en Ia patente US 6,017,919 que se incorpora como referencia en su totalidad.

16) La actividad antagonista en los receptores CB1 de los derivados de 4,5, dihidro-1 H-pirazol se mostró en Ia patente US 5,747,524 y en US 2001/0053788 A1 publicada el 20 de diciembre de 2001.

17) El derivado de 4,5,dihidro-1 H-pirazol con actividad antagonista de los receptores CB1 descrito en Ia patente US 2001/0053788A1 y particularmente descrito por Ia formula (I) contenida en Ia patente anteriormente citada, publicada el 20 de diciembre de 2001 y Ia cuál se incorpora como referencia en su totalidad.

18) Los antagonistas de los receptores CB1 descritos en Ia patente WO 2005049615 especialmente los compuestos descritos en los ejemplos 1 a 8.

19) Los antagonistas de los receptores CB1 descritos en Ia solicitud de patente WO 2005047285 especialmente los compuestos descritos en los ejemplos 1 a 99. 20) El antagonista de los receptores CB1 (4R)-3-(4-clorofenil)-4,5-dihidro- N-metil-4-fenilo-N'-[[4-(trifluorometil)fenil]sulfonilo]-1 H-pirazol-1- carboximidamida (SLV 326-34th Neuroscience, Abs 1009.4, October 2004) desarrollado por Solvay (WO 0170700 A1 ).

. ÍI V IJ

Los antagonistas de los receptores CB1 desarrollados por Solvay están descritos en los ejemplos de las patentes WO 2005040130 A1 , WO 2005028456 A1 , WO 2005020988 A1 , WO 2004026301 A1 , WO 2003078413 A1 , WO 2003027076 A2, WO 2003026648 A1 , WO 2003026647 A1 , WO 2002076949 A1 y WO 0170700 A1.

Particularmente preferidos son los antagonistas de los receptores CB1 seleccionados del grupo consistente en rimonabant, AM-630, AM251 , AM281 , LY-320135, HU-210, HU-243, O-823, O-2093, SLV 326 y SR147778, preferiblemente rimonabant, AM251 o SR147778, más preferiblemente rimonabant; y según el caso sus sales farmacéuticamente aceptables.

A continuación se enumeran algunas solicitudes adicionas de patentes en las cuales se describen antagonistas y/o agonistas inversos de Ia CB1 : US 2008015228, US 2008015229, US 2008058381 , US 2008119653, US 2008200510, US 2008221078, US 2009005361 , US 2009124643, US 2009215755, US 2009221692, US 2009281143 y US 2009306037.

Algunas de las sustancias anteriormente citadas en documentos científicos, patentes o bien por referencia a otras patentes y sus respectivas clases se consideran potencialmente útiles para las realizaciones de Ia presente invención, por Io que el contenido de estas se incorpora en su totalidad a Ia presente solicitud por referencia.

En otra realización particular el antagonista y/o agonista inverso de los receptores CB1 comprende Ia siguiente subestructura y cualquiera de sus tautómeros y/o sales farmacéuticamente aceptables:

Siendo X e Y seleccionado independientemente entre carbono y nitrógeno. Especialmente preferidos son las sub estructuras que en el anillo de fenilo está sustituido al menos por un grupo halógeno, preferiblemente Cl, Br o I, y más preferiblemente en Ia posición para.

A continuación se listan una serie de antagonistas y/o agonistas inversos de los receptores CB1 particulares útiles para Ia presente invención, ya sea en forma de base libre o en forma de sal farmacéuticamente aceptable:

AM281

AM251

El término "sales farmacéuticamente aceptables" se refiere a una sal no tóxica de uso común en Ia industria farmacéutica que puede ser preparado de acuerdo con métodos bien conocidos en el arte. Las sales preferidas para los compuestos de Ia invención son las formadas por HCI, HBr, Hl, H2SO4, ácido oxálico y ácido benzoico.

El término "tratamiento" se entiende Ia gestión y el cuidado de un paciente con el fin de Ia lucha contra Ia enfermedad o trastorno.

Los compuestos de Ia se administran en una dosis terapéuticamente efectiva. El término "terapéuticamente efectiva" se refiere a una cantidad de un medicamento o un agente terapéutico que provocan Ia respuesta deseada biológica o médica de un tejido, un sistema o un animal (incluido el hombre) que está siendo buscado por un investigador o clínico.

La dosis de antagonista y/o agonista inverso de Ia CB1 dependerá del Ia salud del sujeto tratado, y Ia extensión deseada del tratamiento, Ia naturaleza y el tipo de terapia, Ia frecuencia del tratamiento y naturaleza del efecto deseado. En general, Ia dosis del agente está en el intervalo de sobre 0,001 a sobre 50 mg/kg de peso del paciente por día, preferentemente expresado en dosis diaria por paciente humano entre 1 y 2000 mg/día y aun más preferiblemente entre 5 y 500 mg , administrados en un dosis única o dividida. Sin embargo, una cierta variabilidad en el rango de dosis también puede ser necesaria dependiendo de Ia edad, el peso y al tipo de paciente, siendo también dependiendo de Ia ruta prevista de administración y el avance y el grado de severidad de Ia enfermedad o condición.

Una dosis diaria indicativa está en el rango de entre 1 a 500 mg, preferentemente de 1 a 100 mg de agente activo, especialmente cuando se trata de uso oral. La dosis se puede administrar en una vez o en dosis divididas. De forma preferida los antagonistas y/o agonistas inversos de Ia CB1 son administrados de forma de dosificación adecuada de unidad, por ejemplo, una cápsula o tableta, y que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz, por ejemplo, de alrededor 2 a alrededor 200 mg. La aplicación del principio activo puede producir hasta tres veces al día, preferiblemente una o dos veces al día. La dosis recomendada mismo se seleccionan para las combinaciones fijas. La dosis diaria de rimonabant requerida en Ia práctica del método de Ia presente invención puede variar dependiendo de, por ejemplo, el modo de administración y Ia gravedad de Ia enfermedad a tratar. Una dosis diaria de rimonabant se indica en el rango de entre 1 a alrededor de 100 mg, preferiblemente entre 5 a 40 mg o 5 a 20 mg, de agente activo de uso oral, convenientemente administrado una vez o en dosis divididas. Preferiblemente rimonabant se administra en forma de composición farmacéutica comprendiendo al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable siendo esta composición oral preferiblemente en forma de sólido oral, como por ejemplo comprimidos, cápsulas o granulos.

La administración de Ia cantidad efectiva puede realizarse de diferentes formas como por ejemplo administración oral, sublingual, subcutáneo, intramuscular, intravenoso, tópico, local, intratraqueal, intranasal, transdérmico y rectal. La forma más preferida es Ia es una composición farmacéutica es oral y sólida, preferiblemente en forma de cápsulas o comprimidos.

Preferentemente el antagonista o agonista inverso de Ia CB1 se administra en forma de composición farmacéutica que comprende entre 1 y 2000 mg de antagonista y/o agonista inverso de los receptores CB1 y al menos un excipiente o vehículo farmacéuticamente aceptable, preferiblemente entre 5 y 500 mg.

El término "excipiente farmacéuticamente aceptable" se entiende cualquier ingrediente que no tienen actividad terapéutica y que no tóxicos y, por tanto adecuado como excipiente. Excipientes adecuados incluyen los excipientes de uso común en productos farmacéuticos, como, por ejemplo, celulosa microcristalina, lactosa, almidón, estearato de magnesio, crosspovidona, povidona y talco.

EJEMPLOS

Ejemplo 1 : Excitabilidad de las motoneuronas

Los experimentos siguientes fueron realizados usando rimonabant, pero se debe entender que de ninguna manera el alcance de Ia presente invención se deba limitar al ejemplo abajo propuesto. Por el contrario, Io que se prueba para rimonabant se puede ampliar a otros antagonistas/agonistas inversos de los receptores CB 1.

Rimonabant, un antagonista de los receptores CB1 , penetra Ia barrera hematoencefálica y se conoce bien que, a las dosis normalmente usadas (20mg por día), produce efectos psicológicos en seres humanos sanos con una amplia gama de síntomas. El objetivo de los presentes experimentos fue utilizar estimulación magnética y eléctrica transcraneal para probar los efectos de una única dosis de 20 mg de rimonabant en Ia excitabilidad de Ia corteza motora y de las motoneuronas espinales.

Se realizó un examen neurofisiológico antes y 24 horas después de Ia administración de una única dosis de 20 mg de rimonabant.

Utilizando estimulación magnética transcraneal (EMT) evaluamos los umbrales de respuesta electromiográfica en el primer músculo dorsal interóseo (FDI) en reposo y durante contracción voluntaria. Utilizando estimulación eléctrica transcraneal (EET) evaluamos el umbral de respuesta electromiográfica en el primer músculo dorsal interóseo durante contracción voluntaria. La estimulación eléctrica transcraneal tiende a activar los axones de las neuronas corticoespinales en Ia sustancia blanca mientras que Ia estimulación magnética activa las mismas fibras trans- sinápticamente (Hallett, 2000 JuI 13, 406 (6792): 147-50). Por tanto, las respuesta evocadas eléctricamente no son tan sensibles a cambios en Ia excitabilidad cortical como las evocadas por estimulación magnética. Evaluamos también Ia facilitación intracortical de corta latencia (ICF). ICF fue estudiada utilizando Ia técnica de Kujirai y otros (J Physiol. 1993

Nov;471 :501 -19).

Se aplicaron dos estímulos magnéticos con Ia misma bobina de estimulación, usando un módulo Bistim (Magstim Co.,Whitland, UK) sobre Ia corteza motora y se estudió el efecto del primer estímulo (condicionante) sobre el segundo estímulo (test). Se fijó el estímulo condicionante a una intensidad del 90 % del umbral en activación.

Se ajustó Ia intensidad del estímulo test para evocar un potencial motor evocado (MEP) en reposo en el FDI con una amplitud de, aproximadamente, 1 mV de pico a pico. Se alteró Ia programación en el tiempo del estímulo condicionante en relación al estímulo test. Se investigaron posteriormente los intervalos interestímulo (ISIs) de 10, 15 y 25 ms. Se aplicaron cinco estímulos en cada ISI.

Se promedió después Ia facilitación de las respuestas condicionadas a los tres diferentes ISIs estudiados para dar un valor medio magnificado. Se expresó Ia amplitud de los potenciales evocados motores condicionados como porcentajes de amplitud de los potenciales evocados motores de los tests. La ICF es una forma de facilitación de las vías corticoespinales que ocurre a nivel cortical.

Sujetos

Nueve voluntarios sanos (media de edad ± D. S. 32,1 ± 5,8 años) participaron en todos los experimentos usando EMT (estimulación transcraneal magnética, en inglés TMS) y seis participaron en los experimentos con estimulación eléctrica. Todos los sujetos dieron su consentimiento informado por escrito. El estudio fue desarrollado de acuerdo a Ia Declaración de Helsinki y aprobado por el Comité Ético Local. La estimulación magnética fue desarrollada usando dos estimuladores magnéticos de alta potencia Magstim 200 (Magstim Co.,Whitland, UK) conectados al Módulo Bistim durante todas las medidas. Se colocó una bobina en forma de ocho con un diámetro externo de 9 cm sobre Ia corteza motora derecha, en una posición de Ia cabeza óptima para provocar una respuesta motora en el primer dorsal interóseo contralateral. La corriente inducida fluía en dirección posteroanterior. El umbral motor en reposo (RMT) fue definido como el estímulo de mínima intensidad capaz de producir una respuesta motora evocada en reposo (de unos 50 μV en el 50 % de los 10 intentos). El umbral motor en activo (AMTtms) fue definido como el estímulo de mínima intensidad que produce una respuesta motora evocada (en torno a 200 μV en el 50 % de los 10 intentos) durante Ia contracción isométrica del músculo testado al 20 % aproximadamente del máximo. Se mantuvo un nivel constante de contracción voluntaria mediante un osciloscopio visualizador de electromiograma colocado delante del sujeto.

En seis sujetos también practicamos estimulación eléctrica de Ia corteza motora durante contracción voluntaria. Ésta fue desarrollada con un estimulador Digitimer D180A con una constante de tiempo de 50 μs. El cátodo fue colocado en el vértex y el ánodo a 7 cm lateralmente (estimulación anódica). Evaluamos el umbral motor eléctrico en activo (AMTtes) definido como el estímulo de mínima intensidad que produce una respuesta motora evocada de unos 200 μV en el 50 % de diez intentos durante Ia contracción voluntaria. Los efectos del rimonabant sobre Ia atención fueron moderados y no interfirieron con Ia capacidad de los sujetos para cumplir por completo con los requerimientos del protocolo experimental. Tres de los sujetos experimentaron agitación y ansiedad (este efecto duró una media de 6 horas) y uno sufrió nauseas (durante 24h).

Se comparó el RMT, el AMTtms y el AMTtes antes y después de Ia toma de rimonabant usando un t-test pareado aplicando Ia corrección de Bonferroni (0,05/3=0,017). Se comparó el ICF antes y después del rimonabant usando un t-test pareado.

La administración de rimonabant redujo significativamente Ia media de AMTtms (línea de base 39 ± 4% vs 35,5 ± 4%; P=0,0008) mientras que el RMT no se vio afectado (línea de base 48 ± 6% vs 46,5 ± 6% P=O, 0775). La administración de rimonabant redujo significativamente Ia media de AMTtes (línea de base 19,6 ± 6% vs 17,5 ± 6%; P=O, 0164). La administración de rimonabant incrementó significativamente Ia media de ICF (línea de base 117 ± 21 % vs +150 ± 40%; P=0,0212).

Rimonabant redujo AMTtms y AMTtes pero no presentó efectos sobre el umbral motor en reposo.

RMT y AMTtms reflejan las propiedades de excitabilidad de las neuronas corticoespinales moduladas intrínsecamente y extrínsecamente (Hallett, 2000). A nivel cortical, AMTtms refleja Ia actividad de una onda descendente: Ia onda 11 (Di Lazzaro y otros, Clin Neurophysiol. 1998, 109 (5):397-401 ). Pero también un cambio en Ia excitabilidad de Ia motoneurona espinal puede afectar el AMTtms. Basándonos en estas consideraciones hemos demostrado que las ondas 11 o motoneuronas de Ia médula espinal son facilitadas por el agonista inverso de CB1 rimonabant.

La estimulación eléctrica transcraneal tiende a activar los axones de las neuronas corticoespinales en Ia sustancia blanca mientras que Ia estimulación magnética activa las mismas fibras transinápticamente (Hallett, 2000 JuI 13, 406 (6792): 147-50). Por tanto las respuestas eléctricamente evocadas no son sensibles a cambios en Ia excitabilidad cortical como las evocadas por estimulación magnética.

Por tanto, un efecto similar al rimonabant en las respuestas electromiográficas evocadas por estimulación magnética y eléctrica demuestra que el aumento en Ia excitabilidad tiene lugar - puede que no exclusivamente - a nivel de los circuitos de Ia médula espinal. El presente resultado proporciona Ia primera evidencia de que Ia excitabilidad de los circuitos motores espinales, comprobada mediante estimulación magnética y eléctrica transcraneal, puede ser incrementada mediante el bloqueo de los receptores CB1 usando rimonabant. No obstante, es difícil excluir un papel cortical en Ia presencia de cambios en Ia excitabilidad de los circuitos motores a nivel espinal usando solo estudios de umbrales mediante estimulación transcraneal.

Otra observación importante es que rimonabant aumenta Ia facilitación intracortical. ICF ocurre a nivel cortical (Hallett, 2000 JuI 13, 406(6792): 147-50) por Io que podemos concluir que los resultados presentes proporcionan Ia primera evidencia de que Ia excitabilidad de las motoneuronas corticales puede ser incrementada en humanos mediante el bloqueo de CB1 utilizando rimonabant.

Ejemplo 2. Fatiga.

El objetivo de este estudio consistió en determinar los efectos de antagonistas/agonistas inversos del receptor cannabinoide CB1 (Rimonabant -SR141716A-, AM281 ) sobre Ia fatiga en ratas producida por cinta rodante.

MATERIAL Y MÉTODOS

Animales. Se han empleado ratas Wistar macho adultas (300-350 g; 12 semanas de edad), obtenidas de Harlan-lnterfauna Ibérica (Barcelona, España) mantenidas en nuestro animalario en un ciclo de luz:oscuridad de 12:12 horas, recibiendo comida y agua ad libitum. El manejo de los animales se produjo de acuerdo con las guías publicadas en Ia "NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animáis", los principios contemplados por las "Guidelines for the Use of Animáis in Neuroscience Research" publicados por Ia Sociedad de Neurociencia Americana, y las Directrices de Ia Unión Europea (Directiva 86/609/EEC). Se asignó a las ratas a los grupos con inyección de vehículo o los antagonistas /agonistas inversos CB1 rimonabant (SR141716A) ó AM281. Se emplearon cinco animales no lesionados y 3 animales lesionados para cada grupo.

Protocolo de carrera forzada utilizando Ia cinta rodante y tratamientos. Se aclimató a las ratas a Ia cinta rodante haciéndolas caminar en Ia cinta a baja velocidad. El protocolo de carrera forzada consistió en una primera sesión de 15 minutos de carrera (20 m/min, inclinación del 5%) seguida por una segunda sesión 2 horas más tarde (Fatiga 2h). Se repitió el mismo protocolo al día siguiente, para estudiar Ia permanencia de los efectos observados con el tratamiento (Fatiga 24h). Para mantener a las ratas corriendo durante todo el estudio, se utilizó un choque eléctrico suave (20 mV, 1 ,67 Hz) y, eventualmente, suaves toques con Ia mano por parte del experimentador. La administración de las drogas se realizó inmediatamente tras Ia primera sesión del primer día. Los tratamientos consistieron en una sola inyección intraperitoneal de SR141716A (0,25 mg/Kg), o AM281 (0,25 mg/Kg), o vehículo (2,5% Albúmina Sérica Bovina, SIGMA, España, en 0,9% NaCI).

Se definió latencia como el número de segundos durante el experimento en los que los animales tocaban Ia rejilla localizada al final de Ia cinta rodante. Los animales que permanecían más de dos veces en Ia rejilla eléctrica recibiendo descargas durante más de 10 segundos se consideraron exhaustos y fueron devueltos a sus jaulas. En este caso, se consideró también tiempo de latencia el tiempo remanente hasta el final del protocolo. El incremento de latencia (Δ latency) se calculó como Ia diferencia entre Ia actuación de Ia rata en cada tiempo menos los valores de Ia primera sesión. Por tanto, las medidas negativas reflejan una disminución en Ia latencia, y, por tanto, una mejora de Ia capacidad motora.

RESULTADOS Los antagonistas /agonistas inversos del receptor CB1 aumentan Ia resistencia en ratas sometidas a carrera forzada.

El tratamiento de ratas con antagonistas /agonistas inversos del receptor CB1 (SR141716A o AM281 ) disminuyó Ia latencia 2 horas después de Ia inyección, Io que significa que Ia inhibición de este receptor aumentó Ia resistencia a Ia fatiga en ese tiempo. Al día siguiente, en Ia segunda medida del test de fatiga, las ratas tratadas con vehículo realizaron Ia tarea de manera similar al día anterior mientras que en los grupos con antagonistas /agonistas inversos del receptor CB1 (SR141716A o AM281 ), no sólo se mantuvo Ia mejora en observada en Ia resistencia sino que aumentó por encima de los niveles del día anterior (Figuras 3a y 4a). Este efecto puede ser observado con claridad en las figuras 3b y 4b, en las que se muestra que Ia mejora en resistencia a Ia fatiga (disminución en Ia latencia) de las ratas tratadas con antagonistas /agonistas inversos del receptor CB1 (SR141716A, AM281 ) resultó de promedio 75 y 185 segundos mejor en los animales con SR141716A o AM281 que en los vehículo a las 2 horas después de Ia fatiga; y de 125 y 207 segundos mejor en los animales con SR141716A o AM281 que en los vehículo a las 24 horas después de Ia fatiga.

Ejemplo 3. Lesión medular moderada.

El objetivo de este estudio consistió en determinar los efectos de antagonistas/agonistas inversos del receptor cannabinoide CB1 (Rimonabant -SR141716A) en ratas con lesión medular moderada sobre Ia locomoción y Ia fatiga producida por cinta rodante.

MATERIAL Y MÉTODOS Se sometió a 6 animales a una lesión medular moderada por contusión, utilizando el sistema motorizado "Infinite Horizon" (Precisión Systems & Instrumentation, [PSI], Lexington, KY). Se anestesió a los animales con una inyección intraperitoneal de pentobarbital sódico (45 mg/kg, Normon Veterinary División, Madrid, España) y Xilagesic (2% Xilacina, 10 mg/kg, Calier, Barcelona, España). Cuando se comprobó ausencia de reflejos, se inyectó a las ratas con una dosis baja de atropina (50 μg/kg de peso corporal; Brown Medical, Barcelona, España) para reducir las secreciones salivares y bronquiales, y para evitar Ia presencia de bradicardia y un posible paro cardiaco provocado por Ia cirugía o por Ia xilazina. Se aplicaron lágrimas artificiales en los ojos para prevenir Ia abrasión corneal y Ia infección. Tras retirar las apófisis espinales y Ia lámina dorsal de Ia octava vértebra torácica, se estabilizó Ia columna vertebral del animal con unas pinzas y se realizó Ia lesión con un percutor controlado por ordenador que golpeó Ia superficie de Ia médula con una fuerza de 150 Kdyn. Después de cerrar el sitio de lesión, se hidrató a los animales y fueron colocados en mantas calientes durante una hora. El cuidado postoperatorio incluyó una inyección subcutánea de Buprex (Buprenorfina, 0,05 mg/kg; Schering Plough, Madrid, España) y Ia inyección profiláctica de antibiótico 1 hora tras Ia lesión y al día siguiente (Baytril, Enrofloxacina, 1 mg/kg; Bayer, Kiel, Alemania). Se alimentó a los animales con comida para roedores extrusionada y se realizó el vaciado manual de Ia vejiga hasta que recuperaron el control autónomo del vaciado. Se monitorizó el estado de hidratación y Ia presencia de infecciones eventuales en a los animales hasta el final del experimento. Los experimentos con Ia cinta rodante se realizaron 7 días después de Ia lesión.

Protocolo modificado de carrera forzada en cinta rodante para las ratas lesionadas Como la lesión medular produjo claros déficits en Ia locomoción de los animales, se modificó el protocolo de fatiga para adaptarlo: Manteniendo Ia misma estrategia de dos sesiones por día, cambiamos los settings de Ia cinta rodante, forzando Ia carrera de manera más progresiva y prolongada. De este modo, las ratas fueron sometidas a un ritmo de 10m/min durante 10 minutos, 15m/min durante 5 minutos, y, finalmente, a 20m/min durante otros 5 minutos (siempre con una inclinación de 5 ^o ). La adminsitración de las drogas se realizó como en el resto de los grupos no lesionados.

RESULTADOS

Los antagonistas /agonistas inversos del receptor CB1 aumentan Ia resistencia en ratas con lesión medular sometidas a carrera forzada.

Igual que se observó para ratas normales, el tratamiento de ratas lesionadas con rimonabant disminuyó Ia latencia, esto es, aumentó Ia resistencia a Ia fatiga a las 2 horas de Ia inyección frente a los vehículos (promedio de 136 segundos de diferencia a favor de los animales tratados con SR141716A; Figura 5). En el momento de completar el test de fatiga, 24h más tarde, el rendimiento de las ratas vehículo y SR141716A mantenía las diferencias observadas el día anterior (promedio de 200 segundos de diferencia a favor de los animales tratados con SR141716A; Figura 5).