L'invention est relative à des peptides solubles de l'élastine utilisés pour la préparation d'une composition pharmaceutique ou cosmétique apte à réparer et/ou régénérer au moins un des tissus du parodonte. L'invention est également relative à une composition comprenant au moins un peptide particulier de la kappa-élastine. Contexte de l'invention

Les maladies parodontales se définissent comme une inflammation tissulaire d'origine multifactorielle. Elles se caractérisent par une inflammation évolutive associée à une destruction progressive des tissus de soutien de la dent, conduisant à la perte éventuelle de cette dernière.

Les maladies parodontales affectent 40 à 50 % de la population adulte des pays industrialisés. Le plus souvent, comme dans le cas des gingivites, elles commencent par atteindre les tissus superficiels parodontaux (gencive). Si aucun traitement n'est mis en place, les tissus plus profonds (os, ligament alvéolo-dentaire) sont ensuite touchés. On parle alors de parodontites. En phase terminale de la maladie, la dent peut être perdue. Ainsi, les maladies parodontales sont à l'origine de l'extraction de 30 à 40% des dents extraites en cabinet dentaire et cette tendance augmente avec l'âge des patients.

De plus, il est reconnu que les maladies parodontales peuvent être liées, plus ou moins directement, à certains troubles de santé générale ou maladies systémiques, comme le diabète, les maladies cardio-vasculaires, l'accouchement prématuré, etc.

Dans les maladies parodontales, l'inflammation est en partie due à l'apparition et à la prolifération de bactéries dites «parodonto-pathogènes», comme Porphyromonas Gingivalis, participant à la destruction des tissus parodontaux. Dès l'accumulation du biofilm bactérien dans le sulcus, un infiltrât inflammatoire se forme, caractérisé par le recrutement de leucocytes.

Plusieurs types de cellules du tissu parodontal, tels que les polymorphonucléaires neutrophiles, les fîbroblastes gingivaux et les ostéoblastes, répondent à l'agression bactérienne en sécrétant une variété de molécules pro- inflammatoires (IL-1, PGE ₂ ) à l'origine de la sur-expression d'enzymes protéolytiques impliquées dans la dégradation matricielle parodontale (Cox et ail, 2006), entraînant une lyse tissulaire. Ces enzymes, à activités collagénolytique et élastolytique, sont essentielles à la dégradation pathologique des tissus parodontaux. Ces enzymes sont douées d'activité collagénolytique (MMPs-1, -13, etc.) mais aussi élastolytique (MMPs -2, 9, l'élastase leucocytaire, etc.). Ainsi, 70% du collagène in situ est détruit après 4 à 7 jours d'accumulation bactérienne, destruction à laquelle s'ajoute la lyse des fibres élastiques du tissu conjonctif gingival. L'élastolyse induite, outre son influence sur la fonctionnalité des tissus, génère alors des fragments peptidiques qui possèdent la capacité de moduler en retour, le phénotype de nombreux types cellulaires.

Ainsi, les maladies parodontales peuvent conduire à une destruction au moins partielle des structures d'ancrage de la dent, et notamment de la gencive, de l'os alvéolaire, du ligament dento-alvéolaire et du cément radiculaire.

Actuellement, en prévention et/ou pour soigner ces maladies parodontales, il est connu par exemple d'utiliser des techniques de chirurgie parodontale muco- gingivale ou osseuse, comme la greffe gingivo-dentaire ou la greffe osseuse. De telles greffes nécessitent deux sites opératoires, respectivement un site donneur où des tissus sont prélevés et le site à traiter, et entraînent des douleurs substantielles.

Il existe donc un réel besoin d'alternatives moins coûteuses et moins douloureuses aux solutions prophylactiques et/ou thérapeutiques actuellement disponibles pour la prévention et/ou le traitement de ces pathologies inflammatoires du parodonte.

Résumé de l'invention

La présente invention permet de palier les inconvénients des solutions thérapeutiques de l'état de la technique, et fournit notamment une alternative aux interventions chirurgicales actuellement utilisées.

En effet, les inventeurs ont découvert que des peptides so lubies, issus de l'hydrolyse partielle de l'élastine, appelés peptides de la kappa-élastine, peuvent améliorer la structure tissulaire gingivale, en favorisant la synthèse du collagène et de l'élastine. Les inventeurs ont également découvert que ces peptides peuvent agir sur la structure osseuse du parodonte, notamment sur la différenciation ostéoblastique, en favorisant l'expression de protéines de la matrice osseuse et en favorisant la minéralisation de la matrice osseuse. L'invention vise ainsi notamment l'utilisation d'au moins un peptide de la kappa-élastine pour agir de manière bifonctionnelle sur les tissus mous et les tissus durs (osseux) du parodonte.

Jusqu'à présent, les peptides de la kappa-élastine, couramment obtenus par hydrolyse partielle d'élastine provenant de ligament nucal animal, sont utilisés dans des applications topiques, pour lutter contre la perte d'élasticité et le vieillissement des cellules superficielles de la peau. Rien ne laissait présager que ces peptides puissent agir au niveau des tissus du parodonte, tels que la gencive, puisque les fîbroblastes (cellules au niveau desquelles la kappa-élastine doit agir) de la peau et de la gencive présentent de nombreuses différences phénotypiques. De plus, rien ne laissait présager que ces peptides puissent permettre une régénération des tissus, allant au-delà de la simple réparation tissulaire.

Une telle découverte est particulièrement surprenante et permet d'envisager de nombreuses applications bucco-dentaires, tant au niveau préventif en luttant contre le vieillissement des tissus du parodonte et en favorisant le maintien de la structure biologique de la gencive, qu'au niveau thérapeutique, en permettant non seulement la cicatrisation mais également la régénération des tissus mous et/ou durs.

Aussi, l'invention propose d'utiliser au moins un des peptides de la kappa- élastine pour la préparation d'une composition destinée à favoriser la création de tissus parodontaux absents ou insuffisants en améliorant la production de protéines matricielles comme le collagène et l'élastine, et/ou en favorisant la minéralisation osseuse.

L'invention propose également d'utiliser au moins un peptide de la kappa- élastine pour la préparation d'une composition destinée à favoriser la régénération et la réparation des tissus dégradés au cours des maladies parodontales, comme le tissu conjonctif gingival et/ou le tissu osseux alvéolaire.

L'invention propose également d'utiliser une composition selon l'invention, ou plus généralement un peptide selon l'invention, pour favoriser l'augmentation de la hauteur et/ou de l'épaisseur de la gencive attachée, dont le rôle est important dans le maintien des tissus mous sur les surfaces dentaires, et/ou de la masse osseuse. Une telle utilisation permet par exemple d'éviter les greffes gingivo-dentaires.

L'invention a donc pour objet une composition thérapeutique, pharmaceutique ou cosmétique comprenant au moins un peptide de la kappa-élastine pour une utilisation dans la réparation et/ou la régénération d'au moins un tissu du parodonte chez le mammifère humain ou non humain.

L'invention a également pour objet l'utilisation d'au moins un peptide de la kappa-élastine, en tant que principe actif, dans une composition thérapeutique, pharmaceutique ou cosmétique destinée à la réparation et/ou la régénération d'au moins un tissu du parodonte chez le mammifère humain ou non humain.

L'invention a également pour objet un peptide de la kappa-élastine pour une utilisation en tant que principe actif, dans une composition thérapeutique, pharmaceutique ou cosmétique destinée à la réparation et/ou la régénération d'au moins un tissu du parodonte chez le mammifère humain ou non humain.

L'invention a également pour objet l'utilisation d'une composition selon l'invention, ou plus généralement d'un peptide selon l'invention, pour la réparation et/ou la régénération d'au moins un tissu du parodonte chez le mammifère humain ou non humain.

L'invention a également pour objet tout procédé de traitement thérapeutique et/ou prophylactique et/ou cosmétique utilisant un peptide de la kappa-élastine pour la réparation et/ou la régénération d'au moins un tissu du parodonte chez le mammifère humain ou non humain. Avantageusement, la composition selon l'invention, ou plus généralement le peptide selon l'invention, est apte à agir sur au moins un tissu mou du parodonte parmi le tissu gingivale et les ligaments dento-alvéolaires. De manière alternative ou cumulative, la composition selon l'invention, ou plus généralement le peptide selon l'invention, est apte à agir sur au moins un tissu dur du parodonte parmi l'os alvéolaire et le cément radiculaire.

Les inventeurs ont découvert que les peptides de kappa-élastine comportant au moins six acides aminés consécutifs selon la séquence consensus (XiGX ₂ X ₂ PG)n (SEQ ID N°l), n étant un nombre entier compris entre 1 et 10, présentent une conformation tridimensionnelle en coude telle qu'elle potentialise l'action médiée par la kappa-élastine.

Dans un exemple de réalisation de l'invention, on utilise au moins un peptide de la kappa-élastine comportant au moins la séquence (XiGX ₂ X ₂ PG)n, dans laquelle Xi représente n'importe quel acide aminé et X ₂ représente un acide aminé non polaire et n est un nombre entier compris entre 1 et 10, préférentiellement entre 1 et 7, et plus préférentiellement n égal 3. Plus particulièrement, l'invention propose d'utiliser au moins un peptide de la kappa-élastine comportant au moins la séquence (VGVAPG)n (SEQ ID N°2) et/ou (PGAIPG)n (SEQ ID N°3), où n est un nombre entier compris entre 1 et 10, préférentiellement entre 1 et 7, et plus préférentiellement n égal 3.

Selon l'invention, de tels peptides peuvent comporter, à droite et à gauche de ces séquences et/ou entre chacune de ces séquences préférées au moins un autre acide aminé.

Avantageusement, au moins un peptide de l'invention peut être obtenu par synthèse chimique, de sorte qu'il est possible de s'affranchir des inconvénients liés à l'utilisation de produits issus de la digestion protéolytique d'élastine provenant de ligament nucal de mammifère.

Dans un exemple particulier, on utilise l'ensemble des peptides de la kappa- élastine obtenus par hydrolyse partielle d'élastine. Ainsi, selon un mode de réalisation, la composition selon l'invention comporte l'ensemble des peptides de la kappa-élastine obtenus par hydrolyse partielle d'élastine pour leur utilisation en tant que principe actif pour la réparation et/ou la régénération d'au moins un tissu du parodonte chez le mammifère humain ou non humain.

Dans un exemple de réalisation de l'invention, le ou les peptides de la kappa- élastine sont utilisés à une concentration au moins égale à 25μg/mL, préférentiellement au moins 75μg/mL et de manière plus préférentielle au moins égale à 100μg/mL. Ainsi, une composition selon l'invention comporte avantageusement au moins 25μg/mL, préférentiellement au moins 75μg/mL et de manière plus préférentielle au moins égale à 100μg/mL de peptides de la kappa- élastine. Description détaillée de l'invention

Dans la cavité buccale, l'élasticité et la résilience des tissus soumis à de fréquentes déformations et tensions, telles que la mastication et les forces occlusales, sont assurées par des fibres élastiques. Les propriétés rhéologiques de ces fibres élastiques sont particulièrement assurées par l'élastine qui constitue la structure amorphe des fibres élastiques. L'élastine est un composant majeur des fibres élastiques mâtures, particulièrement abondantes dans la gencive (6%). D'une manière générale, l'élastolyse conduit à la production de fragments d'élastine particuliers. Ces peptides sont appelés « matrikines » ou « élastokines » du fait de leur activité « cytokine-like » médiée par leur liaison à la protéine EBP (« Elastin Binding Protein ») (Duca et ail., 2004), appelée encore S-Gal. Les inventeurs ont découvert que des peptides de la kappa-élastine sont aptes à mimer les effets de l'élastine en se fixant aux récepteurs EBP. De plus, les inventeurs ont découvert que les fïbroblastes gingivaux, comme les cellules osseuses de type ostéoblastique, possèdent sur leur membrane plasmique le récepteur EBP, et que l'action de la kappa-élastine passe majoritairement par ce récepteur.

Aussi, les inventeurs proposent d'utiliser un ou des peptides de la kappa- élastine pour favoriser la réparation et/ou la régénération de la structure biologique du parodonte. L'invention a plus particulièrement pour objet au moins un peptide de la kappa-élastine pour une utilisation en tant que principe actif dans la préparation d'une composition pharmaceutique ou cosmétique destinée à la réparation et/ou la régénération d'au moins un tissu du parodonte chez le mammifère. L'invention a également pour objet une composition pharmaceutique ou cosmétique comprenant au moins un peptide de la kappa-élastine pour une utilisation en tant que principe actif pour la réparation et/ou la régénération d'au moins un tissu du parodonte chez le mammifère. L'invention a également pour objet tout traitement thérapeutique et/ou prophylactique et/ou cosmétique pour la réparation et/ou la régénération d'au moins un tissu du parodonte chez le mammifère utilisant au moins un peptide de la kappa- élastine. Selon l'invention, la kappa-élastine correspond à un mélange de peptides d'élastine so lubies dont les poids moléculaires varient entre 1000 et 100000 Da. De préférence, environ 60% des peptides ont une taille située entre 1000 et 60000 Da.

La kappa-élastine comporte majoritairement des acides aminés non polaires, qui permettent les fonctions d'élasticité. Plus précisément, la kappa-élastine contient 75% d'acides aminés hydrophobes (apolaires), et de manière prépondérante de la Glycine (qui représente un acide aminé sur trois), de l'Alanine (qui représente un acide aminé sur 4), de la Proline et de la Valine (qui représentent chacun un acide aminé sur 9). La kappa-élastine comporte des peptides de séquence (XiGX ₂ X ₂ PG)n.

Préférentiellement, le au moins un peptide de la kappa-élastine utilisé a un poids moléculaire compris entre 1000 et 60000 Da, afin de favoriser sa pénétration et/ou diffusion dans le tissu sur lequel il est appliqué.

La kappa-élastine peut notamment être obtenue par hydrolyse partielle d'élastine extraite du ligament nucal d'un bovin ou autre mammifère, par de la potasse à 0.1M repris dans de l'éthanol à 80°C, selon la méthode proposée par Jacob et al. (Jacob et ail., 1984), la kappa-élastine correspondant alors à l'ensemble des peptides solubles issus de cette hydrolyse.

Selon l'invention, il est possible d'utiliser tout ou partie des peptides issus d'une telle hydrolyse partielle d'élastine.

Dans l'ensemble de la présente description, lorsqu'il est fait référence à la kappa-élastine, on entend l'ensemble des peptides de la kappa-élastine obtenus par hydrolyse partielle d'élastine. De même, lorsqu'il est fait référence à un peptide de la kappa-élastine, on entend un quelconque des peptides de la kappa-élastine. Lorsqu'on souhaite faire référence à un ou plusieurs peptides particuliers de la kappa-élastine, ils sont spécifiés.

Le ou les peptides de l'invention peuvent notamment provenir de kappa- élastine achetée dans le commerce.

Le ou les peptides de la kappa-élastine selon l'invention peuvent également être obtenus par synthèse chimique. Dans ce cas, le ou les peptides comporte(nt) au moins une séquence conforme à la séquence d'au moins un peptide de la kappa- élastine obtenu par hydrolyse partielle d'élastine.

Dans le cas d'une synthèse chimique, les acides aminés du ou des peptides selon la présente invention peuvent être naturels ou non. Par acide aminé non- naturel, on entend un analogue ou dérivé d'un acide aminé naturel. Par exemple, un acide aminé non naturel peut présenter une chaîne latérale allongée, plus courte, ou variante présentant des groupements fonctionnels appropriés. Bien entendu, les stéréoiso mères L et D sont envisagés. De plus, les liaisons peptidiques peuvent être modifiées pour les rendre résistantes à la protéolyse. Par exemple, au moins une liaison peptidique (-CO-NH-) peut être remplacée par une liaison divalente choisie parmi (-CH ₂ -NH-), (-NH-CO-), (-CH ₂ -0-), (-CH ₂ -S-), (-CH ₂ -CH ₂ -), (-CO-CH ₂ -), (- CHOH-CH ₂ -), (-N=N-), et (-CH=CH-).

Les résidus des séquences décrites ci-dessus peuvent varier de façon conservative. Par conservative, on entend que le résidu variant présentera des caractéristiques physico-chimiques comparables. Parmi les caractéristiques physicochimiques prises en compte, on trouve l'encombrement stérique, la polarité l'hydrophobie, ou la charge.

Ainsi, dans l'invention, on entend par «peptide de la kappa-élastine» tout peptide comportant au moins une séquence d'acides aminés identique à la séquence d'acides aminés d'un peptide issu de l'hydrolyse partielle de l'élastine, que le peptide soit issu d'une telle hydrolyse ou soit obtenu par synthèse chimique.

Préférentiellement, l'invention concerne au moins un peptide de la kappa- élastine comportant au moins six acides aminés consécutifs, afin de favoriser la liaison aux récepteurs EBP, et son utilisation pour la réparation et/ou la régénération d'au moins un tissu du parodonte. Par exemple, selon l'invention, on utilise au moins un peptide de la kappa-élastine comportant au moins six acides aminés consécutifs en tant que principe actif pour la réalisation d'une composition destinée à réparer et/ou régénérer au moins un tissu du parodonte.

Dans l'invention, on entend par parodonte l'organe composé de deux tissus durs (os alvéolaire et cément radiculaire) et de deux tissus mous (gencive et ligament dento- alvéolaire). L'ensemble de ces tissus durs et mous forme le support de la dent et participe au maintien sa fonction au sein de la cavité buccale.

Dans l'invention, par réparation parodontale on entend la cicatrisation des tissus du système d'attache de la dent, sans restauration totale de l'architecture et/ou de la fonction des tissus lésés. Par régénération parodontale, on entend une restauration ad integrum des tissus lésés, correspondant à la formation d'un nouveau cément et/ou à la formation de nouvelles fibres de collagène fonctionnelles et/ou à la formation d'un nouvel os alvéolaire.

Selon l'invention, on utilise au moins un peptide de la kappa-élastine apte à agir sur au moins un tissu mou du parodonte, parmi le tissu gingival et les ligaments dento-alvéolaires, et/ou sur au moins un tissu dur du parodonte parmi l'os alvéolaire et le cément radiculaire.

La gencive, ou tissu gingival, est une fïbromuqueuse buccale qui recouvre l'os alvéolaire et entoure les dents dans leur zone cervicale. Le tissu conjonctif gingival, ou lamina propria, possède une architecture complexe qui anticipe ses fonctions. Il est constitué essentiellement de fibres de collagène (60% environ du volume tissulaire), de protéoglycannes, de fïbronectine, d'élastine (environ 6%), de fîbroblastes (5% environ du volume total du tissu, 65% des cellules totales), de vaisseaux, nerfs et substances fondamentales (environ 35%). Le collagène de type I est le composant collagénique majeur de la gencive (91% du collagène total). Les fibres collagéniques, préférentiellement de type I s'organisent en paquets de fibres épaisses et participent à la formation de l'appareil fibreux gingival supra-alvéolaire, conférant à la gencive une certaine tonicité et résistance biomécanique (Bartold et ail, 2000 ; Bartold et Narayanan, 2006).

Les inventeurs ont montré que les peptides de la kappa-élastine permettent d'augmenter l'expression de collagène de type I par les fîbroblastes gingivaux humains, suggérant que ces peptides peuvent favoriser la cicatrisation et la réparation des tissus gingivaux. Cette cicatrisation et cette réparation des tissus gingivaux pourraient permettre de prévenir, voire de compenser la perte tissulaire survenant au cours de maladies parodontales.

Le ligament dento- alvéolaire, ou desmodonte, est un tissu conjonctif fïbro- cellulaire dense, hautement vascularisé, qui occupe un espace d'environ 0,25 mm (0,15 à 0,38mm) entre la racine de la dent et l'alvéole osseuse. Il est en continuité avec le tissu conjonctif gingival au niveau de la crête alvéolaire, et le tissu conjonctif pulpaire au niveau du foramen apical. Cette contiguïté tissulaire explique d'une part, l'aggravation des parodontopathies superficielles vers le parodonte profond et d'autre part, l'extension de pathologies infectieuses pulpaires vers les tissus de soutien de la dent. Comme tout tissu conjonctif, le ligament parodontal est constitué d'un compartiment cellulaire et d'un compartiment extracellulaire, lui même comprenant des fibres collagéniques de type I préférentiellement (80%), empaquetées dans une substance fondamentale. Bien que la composante fibroblastique y soit prédominante, le desmodonte contient une population cellulaire hétérogène comme des fîbroblastes, des ostéoblastes, des cémentoblastes, des cellules mésenchymateuses indifférenciées capables de se différencier en fîbroblastes, en ostéoblastes par exemple. En outre, le ligament dento-alvéolaire partage des propriétés communes avec les tissus mésenchymateux embryonnaires qui le font assimiler à un tissu conjonctif fœtal.

L'os alvéolaire est la partie spécialisée des os maxillaire et mandibulaire contenant les alvéoles dentaires. Il constitue le lieu d'insertion des fibres extrinsèques du ligament dento-alvéolaire, permettant le maintien de la dent dans son alvéole. La matrice osseuse est constituée essentiellement d'une matrice inorganique (67% du volume total) comprenant des cristaux d'hydroxyapatite (Cai ₀ (PO ₄ )6(OH) ₂ ) et d'une matrice organique, contenant majoritairement du collagène (80 à 90%). Le collagène de type I est la protéine collagénique la plus représentée (90%>). D'autres protéines non collagéniques, incluant l'ostéocalcine et l'ostéonectine, sont également contenues dans la matrice organique osseuse. Bien que fondamentalement comparable à d'autres sites osseux de l'organisme, l'os alvéolaire est sujet à un remodelage rapide et continu sous l'influence de la migration physiologique des dents en direction mésiale, des forces orthodontiques et des forces masticatoires. Son existence est déterminée par la présence des dents. Dans un état physiologique, l'os est en perpétuel remaniement, impliquant un couplage coordonné entre la dégradation de la matrice extracellulaire et de sa partie minérale associée, et la néosynthèse de composants matriciels.

Le cément radiculaire est un élément anatomique de la dent, qui par sa fonction constitue un composant du parodonte. Le cément radiculaire est la couche de tissu minéralisé qui recouvre la surface radiculaire des dents humaines, y compris le foramen apical et occasionnellement, des petites zones coronaires. C'est un tissu hautement spécialisé qui constitue l'interface entre la dentine radiculaire et les tissus conjonctifs, desmodontal et gingival. Il sert de pôle d'insertion des fibres ligamentaires à la surface radiculaire de la dent, unissant ainsi celle-ci, à la paroi osseuse et à la gencive. Il constitue un élément essentiel du système d'attache de la dent à son alvéole osseuse. La structure et la composition du cément radiculaire lui confèrent certaines analogies avec le tissu osseux. Cependant, il n'est pas vascularisé, ni innervé. Il est constitué de 65% en masse humide de substances inorganiques (essentiellement sous forme de Cai ₀ (PO ₄ )6(OH) ₂ ), 50% en masse sèche, de 23%o de substances organiques et de 12% d'eau.

On sait que le remodelage osseux implique essentiellement la coordination des activités de deux types cellulaires d'origine distincte, les ostéoblastes et les ostéoclastes, les premiers permettant la formation osseuse et l'activation et la différenciation des ostéoclastes, les seconds, la résorption osseuse.

L'ostéoblaste est une cellule à multiples activités, participant à la formation du tissu osseux. L'ostéoblaste évolue selon une séquence linéaire de maturation, depuis la cellule mésenchymateuse indifférenciée de la moelle osseuse à la cellule ostéoprogénitrice, puis au stade de pré-ostéoblaste, d'ostéoblaste post-mitotique et enfin pour finir, d'ostéocyte mâture emmuré dans sa matrice osseuse minéralisée. Au cours des étapes précoces de différenciation ostéoblastique, les cellules produisent du collagène de type I, des facteurs de transcription comme Runx-2 (Runt-related transcription factor 2), Dlx5 (Distal-less homeobox 5), Msx2 (Msh homeobox 2), certaines enzymes comme celles de la famille des métalloprotéinases (MMP-13 et MMP-14) assurant la formation puis la réorganisation de la matrice osseuse.

Les inventeurs ont montré que tout ou partie des peptides de la kappa-élastine permettent d'augmenter l'expression génique de facteurs de transcription (Runx-2, Dlx5, Msx2, TAZ, cathénine, etc.) favorables à la différenciation des ostéoblastes. De même, les inventeurs ont montré que tout ou partie des peptides de la kappa- élastine permettent d'augmenter l'expression de protéines constitutives de la matrice osseuse (Ostéocalcine, sialoprotéine osseuse, collagène de type I, ostéonectine...).

Les inventeurs ont également montré que tout ou partie des peptides de la kappa-élastine permettent d'augmenter l'activité phosphatase alcaline osseuse par les cellules de type ostéoblastique, comparativement à des cultures cellulaires sans traitement.

Les inventeurs ont aussi montré que les peptides de la kappa-élastine permettent de diriger le phénotype ostéoblastique vers une formation osseuse, en favorisant l'augmentation des expressions génique et protéique de l'ostéoprotégérine et la diminution de celle de la protéine RANK-L, favorable à la différenciation et l'activation des ostéoclastes, en relation avec la résorption osseuse. De même, les inventeurs ont montré que tout ou partie des peptides de la kappa-élastine permettent de favoriser la différenciation de cellules mésenchymateuses indifférenciées, issues de la moelle osseuse en ostéoblastes humains, de même que la différenciation des ostéoblastes humains. Les peptides objets de l'invention, de même que les compositions selon l'invention comportant de tels peptides, présentent l'avantage de fournir un complément exogène de précurseurs d'élastine, qui pénètre dans les tissus sur lesquels ils sont appliqués, qui contiennent de l'élastine ou des dérivés endogènes. On sait que l'élastine est synthétisée sous forme d'un précurseur soluble : la tropoélastine (Vrhovski, 1998 ; Wise et Weiss, 2009). Plusieurs types cellulaires, incluant les cellules musculaires lisses, les cellules endothéliales et les fïbroblastes gingivaux humains sécrètent de la tropoélastine de masse moléculaire 70 kDa (Uitto et ail. ; Tsuruga et ail., 2002, 2005). Chez l'homme, le domaine codé par l'exon 24 du gène de la tropoélastine présente 6 répétitions de l'hexapeptide (VGVAPG) (SEQ ID N°2) qui est considéré comme le domaine de liaison de l'élastine à son récepteur (Boom et ail., 2006). La séquence de fixation du récepteur à l'élastine (appelée V14) est (VVGSPSAQDEASPL) (SEQ ID N°5). Les inventeurs ont également découvert que les peptides de la kappa-élastine comportant au moins la séquence (XiGX ₂ X ₂ PG)n (SEQ ID N°l), préférentiellement la séquence (VGVAPG)n (SEQ ID N°2), et/ou (PGAIPG)n (SEQ ID N°3), et de manière encore préférée la séquence (VGVAPG)3 (SEQ ID N°4), présentent une capacité accrue de réparation et/ou régénération des tissus parodontaux.

Dans les séquences ci-dessus, Xi représente n'importe quel acide aminé et X ₂ représente un acide aminé non polaire.

De préférence, Xi représente un quelconque acide aminé choisi parmi les vingt acides aminés naturels. De manière encore préférée, Xi est un acide aminé non polaire. Par acides aminés non polaires, on entend les neuf acides aminés hydrophobes que sont l'alanine, la phénylalanine, la glycine, l'isoleucine, la leucine, la methionine, la proline, la valine et le tryptophane. Préférentiellement, les acides aminés non polaires sont choisis parmi la valine, la glycine, l'alanine et la proline.

II est entendu que les deux résidus X ₂ ne sont pas forcément identiques.

Dans les séquences ci-dessus, n est un nombre entier compris entre 1 et 10, préférentiellement entre 1 et 7, et plus préférentiellement n est égal à 3

Selon un exemple de réalisation de l'invention, le ou les peptides de la kappa- élastine sont utilisés à une concentration au moins égale à 25μg/mL, préférentiellement au moins 75μg/mL et de manière plus préférentielle au moins égale à 100μg/mL.

L'invention a également pour objet une composition thérapeutique, cosmétique ou pharmaceutique pour la réparation et/ou la régénération d'au moins un tissu du parodonte comprenant au moins un peptide de séquence (XiGX ₂ X ₂ PG)n (SEQ ID N°l), dans laquelle Xi représente n'importe quel acide aminé et X ₂ représente un acide aminé non polaire, et n est un nombre entier compris entre 1 et 10, préférentiellement entre 1 et 7, et de manière encore préférée n est égal à 3. Dans un exemple de réalisation, X ₂ est un acide aminé non polaire, préférentiellement choisi parmi la valine, la glycine, l'alanine et la proline.

Avantageusement, la concentration en peptide de séquence (XiGX ₂ X ₂ PG)n (SEQ ID N°l) dans la composition selon l'invention est au moins égale à 25μg/mL en poids de la composition, préférentiellement au moins 75μg/mL et de manière plus préférentielle au moins égale à 100μg/mL en poids de la composition.

Dans un exemple particulier, la composition selon l'invention comporte au moins un peptide de séquence (VGVAPG)3 (SEQ ID N°4). Avantageusement, la concentration en peptide de séquence (VGVAPG)3 dans ladite composition est au moins égale à 25μg/mL en poids de la composition, préférentiellement au moins 75μg/mL et de manière plus préférentielle au moins égale à 100μg/mL en poids de la composition.

La composition selon l'invention peut être liquide, en suspension aqueuse ou non, en poudre, etc. Par exemple, la composition selon l'invention peut être une pâte dentifrice, une solution pour bain de bouche, une crème, un gel ou autre formulation permettant une application locale, orale, topique etc. La composition selon l'invention peut également être sous la forme d'une formulation apte à être injectée dans un tissu mou profond du parodonte.

Le ou les peptides selon l'invention peuvent être, par exemple, inclus dans des pâtes dentifrices, des bains de bouche, de même que des crèmes, des gels etc., ou toute formulation apte à être appliquée sur, ou injectée dans un tissu du parodonte.

Par exemple, la composition selon l'invention peut être une composition destinée à une application orale sur des tissus du parodonte ayant perdu leur élasticité et/ou leur tonicité et/ou leur fonction élastique nécessaires à leur maintien sur l'os et la dent.

L'invention vise également un procédé de traitement thérapeutique et/ou prophylactique d'au moins un tissu du parodonte ayant perdu son élasticité et/ou sa tonicité et/ou sa fonction élastique utilisant une composition selon l'invention, ou plus généralement utilisant au moins un peptide de la kappa-élastine selon l'invention.

La composition selon l'invention peut être une composition de prévention, par exemple destinée à lutter contre le vieillissement du parodonte et/ou permettant le maintien de la structure biologique du parodonte notamment superficielle (gencive), afin de lutter plus facilement contre des attaques bactériennes et/ou mécaniques (brossage dentaire ou autre). Une telle composition favorise l'augmentation de la synthèse des protéines constitutives de la lamina propria gingivale, comme le collagène de type I.

L'invention vise également un procédé de traitement thérapeutique et/ou prophylactique d'au moins un tissu du parodonte contre des attaques bactériennes et/ou mécaniques utilisant une composition selon l'invention, ou plus généralement utilisant au moins un peptide selon l'invention.

La composition selon l'invention peut également être une composition thérapeutique, destinée par exemple à régénérer le parodonte superficiel (gencive) et/ou profond (os), en augmentant la production des protéines matricielles, comme le collagène de type I gingival et osseux, mais aussi d'autres protéines de la matrice osseuse. Cette application peut être particulièrement intéressante dans le cas d'une perte matricielle parodontale importante due aux maladies parodontales (comblement de défauts intra-osseux parodontaux), mais aussi après résection radiculaire, apicectomie et cystectomie.

L'invention vise également un procédé de traitement thérapeutique et/ou prophylactique d'une perte matricielle parodontale, par exemple suite à une maladie parodontale ou suite à une intervention chirurgicale au niveau du parodonte, ledit procédé utilisant une composition selon l'invention, ou plus généralement utilisant au moins un peptide selon l'invention.

La composition selon l'invention peut également favoriser la cicatrisation et/ou la régénération osseuse d'une alvéole dentaire après avulsion de la dent, après exérèse de kystes volumineux ou lors de défauts paro-implantaires (comblement de perte osseuse, amélioration/accélération de la cicatrisation osseuse, maintien de la crête alvéolaire, etc.).

L'invention concerne également un procédé de traitement thérapeutique d'une alvéole dentaire, pour la cicatrisation et/ou la régénération osseuse de ladite alvéole, utilisant une composition selon l'invention, ou plus généralement utilisant au moins un peptide selon l'invention.

L'invention propose également de greffer des peptides de la kappa-élastine à des composés naturels de la matrice gingivale et osseuse, comme le collagène de type I et la fibrine qui ont des effets favorables sur la différenciation de cellules mésenchymateuses de la moelle osseuse indifférenciée vers un phénotype ostéoblastique. Une telle solution permet la vectorisation et la libération ciblée des peptides de la kappa-élastine au sein des tissus à régénérer. Ainsi libérés, les peptides de la kappa-élastine, associés au collagène de type I ou à la fibrine, peuvent agir favorablement sur la différenciation des cellules du parodonte.

L'invention concerne donc également de tels peptides de la kappa-élastine greffés à des composés naturels, tel que le collagène de type I ou la fibrine. De même, l'invention concerne l'utilisation d'au moins un tel peptide greffé, pour la réalisation d'une composition cosmétique ou pharmaceutique pour la réparation et/ou la régénération d'au moins un tissu du parodonte. De même, l'invention concerne une composition cosmétique ou pharmaceutique pour la réparation et/ou la régénération d'au moins un tissu du parodonte comprenant au moins un tel peptide greffé comme principe actif. L'invention concerne également un procédé de traitement thérapeutique et/ou prophylactique et/ou cosmétique du parodonte utilisant au moins un peptide de la kappa-élastine greffé à un composé naturel, tel que le collagène de type I ou la fibrine.

L'invention va maintenant être illustrée à l'aide des figures et exemples ci- dessous. Ceux-ci sont présentés à titre indicatif et nullement limitatif de l'invention.

Légende des figures

Figure 1 : Mise en évidence du récepteur EBP sur les fibroblastes gingivaux et les cellules osseuses de type ostéoblastique humaines.

Figure 1A : Observation en microscopie confocale (Biorad MRC600 microscope, Zeiss Axiophot) d'EBP sur la surface membranaire de fibroblastes gingivaux.

Figure 1B : Détection d'EBP par western Blot au niveau de fibroblastes gingivaux humains (FGHs). Des fibroblastes dermiques (FDH) sont utilisés comme témoin.

Figure 1C : Détection d'EBP par western Blot au niveau de cellules osseuses de type ostéoblastique (COH). Des fibroblastes de prépuce (FPH) sont utilisés comme témoin.

Figure 2: Mise en évidence de l'implication du récepteur EBP dans la réponse phénotype de cellules du parodonte à la kappa-élastine (kE).

Figure 2A : Analyse par Western blot de l'implication d'EBP dans la synthèse de MMP-3 par les fibroblastes gingivaux humains traités avec 100 μg/mL de kappa-élastine.

Figure 2B : Analyse par Western blot de l'implication d'EBP dans la synthèse de MMP-2 par les cellules osseuses humaines de type ostéoblastique traitées avec 100 μg/mL de kappa-élastine.

Figure 2C : Analyse par RT-PCR de l'implication d'EBP dans l'expression génique de Runx-2 par les cellules osseuses humaines de type ostéoblastique traitées avec 100 μg/mL de kappa-élastine.

Figure 3 : Analyse par RT-PCR de l'influence de la kappa-élastine (kE : 100 μg/mL) sur l'expression génique de protéines matricielles par des fibroblastes gingivaux humains cultivés pendant 1, 4 et 7 jours. Figure 3A: RT-PCR de Troéla, COL1 et de FIB1 réalisées à 1, 4 et 7 jours.

Figures 3B, 3C, 3D: Représentations graphiques des variations d'expression génique de Troéla, COL1 et de FIB1 par les fïbroblastes gingivaux humains traités ou non avec 100 μg/mL à 1, 4 et 7 jours de culture. Témoin : 100%.

Figure 4 : Analyse par RT- PCR de l'effet de la kappa-élastine à concentration croissante sur l'expression génique de Runx-2 et de protéines de la matrice osseuse par les cellules osseuses de type ostéoblastique. Figure 5 : Analyse par RT- PCR de l'effet de la kappa-élastine sur l'expression génique de facteurs de transcription caractéristiques de la différenciation ostéoblastique sur une période de 28 jours.

Figure 5 A: RT-PCR de Runx-2, Dlx5, Msx2, Taz et 18 S réalisées à 1, 7, 14 et 28 jours.

Figures 5B, 5C, 5D, 5E: Représentations graphiques des variations d'expression génique de Runx-2 (B), Dlx5 (C), Msx2 (D) et Taz (E) par les cellules osseuses de type ostéoblastique traitées ou non avec 100 μg/mL de kappa-élastine ou 150μg/mL de (VGVAPG) ₃ (V3) à 14 et 28 jours de culture. Témoin : 100%. Figure 6: Analyse par RT- PCR de l'effet de la kappa-élastine sur l'expression génique de protéines de la matrice osseuse caractéristiques de la différenciation ostéoblastique sur une période de 28 jours.

Figure 6A: RT-PCR de COL1, ON, OP, BSP, OC, Gal3 et 18 S réalisées à 1, 7, 14 et 28 jours

Figures 6B, 6C, 6D, 6E, 6F: Représentations graphiques des variations d'expression génique de COL1 (B), ON (C), Gal3 (D), BSP (E) et OC (F) par les cellules osseuses de type ostéoblastique traitées ou non avec 100 μg/mL de κΕ ou 150 μg/mL de (VGVAPG) ₃ (V3) à 14 et 28 jours de culture. Témoin : 100%. Figure 7 : Variation de l'activité phosphatase alcaline (PAL) exprimée par les cellules ostéoblastiques en présence de kappa-élastine ou de (VGVAPG) ₃ (V3) pendant 28 jours de culture.

Figure 8 : Analyse des effets de la kappa-élastine sur les facteurs modulant l'activation et la différenciation des ostéoclastes, ostéoprotégérine et RANKL. Figures 8 A et 8B: Analyses par RT-PCR de l'effet de la kappa-élastine sur l'expression de l'ostéoprotégérine et de RANKL au cours du temps.

Figure 8C : Rapport OPG/RANKL obtenu à partir des taux d'OPG et de RANKL dosés par kit ELISA.

Figure 9: Observation en microscopie électronique à balayage de cellules osseuses de type ostéoblastique cultivées sur couches de collagène en présence ou en l'absence de kappa-élastine (10(^g/mL) à 1, 7 et 21 jours de culture. Té: témoin; kE: kappa élastine. Flèche blanche : nodule. Col: réseau de fibres de collagène ( ^ ). CO: cellules osseuses.

Figure 10 : Détection et détermination de la composition de nodules par MET/Microanalyse X au sein de couches de collagène ensemencés de cellules osseuses de type ostéoblastique à 21 jours de culture. A : culture témoin ; B : Spectres de microanalyse X de culture témoin ; C : culture cellulaire traitée avec la kappa-élastine (100μg/mL) ; D : Spectres de microanalyse X de culture traitée à la kappa-élastine (intensité en nombre de coups en fonction de l'énergie en keV).

EXEMPLES

Matériel et méthode

Obtention de la kappa-élastine : La kappa-élastine est préparée à partir d'élastine insoluble purifiée d'origine bovine ou chevaline, extraite du ligament issu de la nuque de l'animal et digérée ensuite par de la potasse à 0,1 M repris dans de l'éthanol à 80°, selon le protocole décrit dans Jacob et coll., 1985 (« Isolation and characterization of insoluble and kappa-elastins »). Cette méthode permet d'obtenir des peptides d'élastine solubles, dont les poids moléculaires varient entre 1000 et 100000 Da (vérifiés par chromatographie sur colonne de gel-fïltration G 3000 SW à l'aide d'un appareil HPLC). Environ, 60% des peptides ont une taille située entre 1000 et 60000 Da.

La kappa-élastine contient 4 acides aminés prépondérants : Glycine, Alanine, Proline, Valine et des peptides de séquence X ₁ GX ₂ X ₂ PG, dans lesquelles Xi représente n'importe quel acide aminé et X ₂ représente un acide aminé non polaire et préférentiellement une Glycine, une Alanine, une Proline, ou une Valine. L'existence du pontage de l'élastine est démontrée par la présence d'isodesmosine et desmosine (3,8 résidus pour 1000). La température de coacervation est de 50°C à pH2-5.

La kappa-élastine peut être avantageusement lyophylisée afin d'en assurer une meilleure conservation. Elle est hautement soluble dans l'eau.

Aucune toxicité n'a été constatée sur les cellules utilisées ayant été traitées avec des concentrations de kappa-élastine allant jusqu'à 200 μg/mL, avec une concentration préconisée d'utilisation comprise entre 25 et 100 μg/mL. Obtention de fibroblastes gingivaux : Les fîbroblastes gingivaux humains utilisés sont issus de patients âgés de 40 à 60 ans, exempts de maladies générales et parodontales, non fumeurs.

Les fibroblastes gingivaux humains sont préparés à partir de biopsies gingivales obtenues au cours de chirurgies pré-prothétiques et traitées selon la technique d'explantation.

Les cellules sont cultivées dans un milieu Dulbecco's Modifïed Eagle Médium supplémenté avec 10% de sérum de veau fœtal (SVF) et 1% de Pénicilline/ Streptomycine .

Pour certaines expérimentations, du milieu de culture sans sérum a été utilisé. Les cellules ont été testées entre le 3 ^eme et 6 ^eme passage. Pour chacune des lignées cellulaires, les expériences ont été réalisées en triplicate.

Obtention de cellules osseuses de type ostéoblastique : Les cellules osseuses de type ostéoblastique utilisées sont issues de moelle osseuse humaine de patients âgés de 74 à 77 ans, exempts de maladies générales.

Les cellules osseuses de type ostéoblastique humaines sont préparées à partir de biopsies osseuses obtenues au cours de chirurgies orthopédiques et traitées selon la technique d'explantation. Initialement, les biopsies subissent plusieurs rinçages successifs au PBS, trypsine puis collagénase, avant qu'elles soient cultivées dans un milieu Dulbecco's Modifïed Eagle Médium supplémenté avec 10%> de sérum de veau fœtal (SVF) et 1% de Pénicilline/Streptomycine.

Pour certaines expérimentations, du milieu de culture sans sérum a été utilisé. Les cellules ont été testées entre le 2 ^eme et 4 ^eme passage.

Pour chacune des lignées cellulaires, les expériences ont été réalisées en triplicate. Première expérimentation : Implication du récepteur EBP dans les effets de la kappa-élastine sur les cellules du parodonte

1- Détection du récepteur EBP

Dans un premier temps, les inventeurs ont cherché à montrer la présence de récepteurs EBP sur la membrane plasmique des fïbroblastes gingivaux et des cellules osseuses de type ostéoblastique humains.

Pour cela, ils ont utilisé la technique électrophorétique (Western Blot) et/ou microscopie confocale. Les résultats sont montrés à la figure 1. Les extraits cellulaires ont été récupérés à partir de cellules cultivées à confluence dans un milieu Dulbecco's Modifïed Eagle Médium supplémenté avec 10% de sérum de veau fœtal et 1% de Pénicilline/Streptomycine.

On observe que le récepteur EBP est réparti de façon homogène sur la membrane cellulaire des fïbroblastes gingivaux humains et sa présence est aussi détectée à l'intérieur de la cellule (Figure 1 A).

L'expression du récepteur a été également confirmée par Western blot en utilisant un anticorps primaire polyclonal dirigé contre VI 4, peptide de 14 acides aminés (VVGSPSAQDEASPL) (SEQ ID N°5) correspondant à la séquence de fixation de l'élastine retrouvée dans le récepteur EBP. Seule une bande de protéine possédant une masse moléculaire avoisinant 67 kDa est identifiée comme étant le récepteur EBP (Figure 1B). II en est de même pour les cellules osseuses de type ostéoblastique (Figure

1C).

2- Implication du récepteur EBP dans les effets de la kappa-élastine Pour évaluer l'implication du récepteur EBP dans les effets de la kappa- élastine sur les cellules du parodonte, une étude comparative des effets du peptide de séquence ( VGVAPG) (SEQ ID N°2), du lactose et de V14 (récepteur compétitif d'EBP) a été menée sur ces cellules cultivées pendant 24 heures sans sérum de veau fœtal.

Les effets de (VGVAPG) (200 μΒ/mL), du lactose (50 μΜ), d'un anticorps bloquant V14 (10 μg/mL) et U0126 (10 nM, un inhibiteur d'ERKl/2) ont été comparées à l'effet de la kappa-élastine. Le contrôle correspond à des cellules non traitées avec la kappa-élastine.

Les données présentées aux figures 2A, 2B et 2C sont la moyenne d'expérimentations réalisées en triplicate sur trois lignées de cellules, à savoir des fîbroblastes gingivaux (figure 2A) et des cellules osseuses humaines de type ostéoblastique (figures 2B et 2C).

Dans le cas des fîbroblastes gingivaux humains (Figure 2 A), l'induction de la proMMP-3 est obtenue en utilisant des peptides (VGVAPG), bien qu'à un niveau inférieur à celui obtenu en présence de la kappa-élastine. Le lactose, incubé 1 heure avec les cellules avant que ces dernières ne soient traitées avec la kappa-élastine, réduit pratiquement entièrement la production de MMP-3 induite par la kappa-élastine.

Pour évaluer si l'interaction d'EBP avec la kappa-élastine dépend de l'activation d'ER ½ (Extracellular Signal-Regulated Kinases 1 and 2), un inhibiteur ER ½, U0126, a été utilisé. On constate que cet inhibiteur diminue l'expression de la proMMP-3 d'environ 60% par rapport à l'effet de la kappa-élastine seule.

Dans le cas des cellules osseuses de type ostéoblastique cultivées 24 heures sans sérum (Fig.2B et 2C), l'induction de la proMMP-2 provoquée par la kappa- élastine est réduite d'environ 30%> en présence de V14, utilisée comme récepteur compétitif d'EBP à une concentration de 10 μg/mL (Fig.2B).

L'effet de V14 sur l'expression génique du facteur de transcription Runx-2, caractéristique de l'ostéoblaste, est plus marqué avec un retour d'expression de Runx-2 quasi identique à celle obtenue avec le témoin. La kappa-élastine et (VGVAPG), eux, augmentent son expression par rapport à ce même témoin (Figure 2C).

La régulation des effets de la kappa-élastine passe donc majoritairement par le récepteur EBP présent sur les fîbroblastes gingivaux humains et les cellules osseuses de type ostéoblastique humaines.

Secondes expérimentations : Effets de la kappa-élastine sur la réparation et la régénération des tissus parodontaux

1- Effets de la kappa-élastine sur la production de protéines de la matrice conjonctive gingivale Les effets biologiques de la kappa-élastine (100 μg/mL) ont été testés sur des fîbroblastes gingivaux humains cultivés sur plastique, à confluence, sur une période de 7 jours en présence de 2% de Sérum de Veau Fœtal (Figure 3).

L'expression de protéines de la matrice gingivale, incluant la tropoélastine, le collagène de type I et la fîbrilline-1, a été évaluée par RT-PCR à 1, 4 et 7 jours de culture.

On constate que la kappa-élastine, à 100 μg/mL, induit une augmentation de l'expression de la tropoélastine en comparaison avec le contrôle sans kappa-élastine à 4 et 7 jours (rapport kE/Témoin= 5,5 à J4 et 1,25 à J7) (Figure 3B).

On remarque par ailleurs que l'expression génique de la tropoélastine diminue très rapidement avec le temps dans la culture témoin et est très faiblement détectée à 4 et 7 jours. En présence de la kappa-élastine, son expression est visible à 4 jours et diminue également très fortement à 7 jours tout en restant plus élevée que celle obtenue avec la culture témoin sans kappa-élastine.

La kappa-élastine à 100 μg/mL induit une augmentation de l'expression du collagène de type I par les fîbroblastes gingivaux humains par rapport à la culture témoin, quel que soit le jour de culture mais avec un rapport kE/Témoin le plus élevé au 1 ^er jour de culture (rapport kE/Témoin = 6 à Jl contre 1,5 à J4 et 1,25 à J7) (Figure 3C).

La kappa-élastine à 100 μg/mL, induit une augmentation de l'expression de la fîbrilline-1 par les fîbroblastes gingivaux humains par rapport à la culture témoin aux jours 1 et 7 de culture (Rapport kE/Té = 1 ,5 à 1J et 4 à J7) (Figure 3D).

Au cours du temps, l'expression génique de la fîbrilline-1 par les fîbroblastes gingivaux humains diminue, avec ou sans kappa-élastine. Cependant, de façon signifîcativement moins importante en présence de kappa-élastine qu'en son absence.

Ces résultats suggèrent que la kappa-élastine est apte à favoriser non seulement la cicatrisation et la réparation, mais également la régénération des tissus gingivaux, en prévenant, voire en compensant, la perte tissulaire survenant au cours de maladies parodontales.

2- Effets de la kappa-élastine sur la différenciation de cellules osseuses de type ostéoblastique

2.1. Effet de la kappa-élastine à concentration croissante (0, 25, 50, 100 μ /mL)

Les effets biologiques de la kappa-élastine utilisée à diverses concentrations (25, 50 et 100 μg/mL) ont été testés sur des cellules mésenchymateuses issues de la moelle osseuse et cultivées sur plastique, à confluence, pendant 24 heures, sans sérum de veau fœtal (Figure 4).

Ces cellules ont été cultivées sur plastique pendant 24 heures en présence de 0, 25, 50 ou 100 μg/mL de kappa-élastine, sans sérum de veau foetal. (18S : ARNr 18S).

Ces effets ont été évalués sur l'expression du facteur de transcription Runx-2 et de trois protéines osseuses exprimées précocement au cours de l'état de différenciation des cellules osseuses de type ostéoblastique, le collagène de type I (COL1), l'ostéonectine (ON) et l'ostéopontine (OP). L'analyse en RT-PCR a été réalisée à partir de trois lignées cellulaires différentes. Pour chacune des lignées cellulaires, l'expérimentation a été faite en triplicate (Figure 4).

On observe que l'utilisation croissante de kappa-élastine (25, 50, 100 μg/mL) augmente de façon non significative l'expression de Runx-2, comparativement au témoin cultivé sans peptides, tandis que l'expression du collagène de type I, tout comme les expressions de l'ostéonectine et de l'ostéopontine augmentent de façon significative dès une concentration en peptides d'élastine de 25μg/mL.

Toutefois, quelle que soit la concentration de peptides d'élastine utilisée (25, 50 et 100 μg/mL), l'expression génique pour chacune des 3 protéines osseuses ne varie pas entre elle de façon significative.

Pendant 24 heures de culture, les cellules ostéoblastiques cultivées sur plastique à confluence ont été traitées ou non à des concentrations croissantes de (VGVAPG) ₃ (0 - 50 - 100 - 150 et 200 μg/mL) en l'absence de SVF. L'analyse par RT-PCR indique que le peptide (VGVAPG) ₃ induit de façon dose-dépendante, une augmentation de l'expression des gènes (ON, OP, OPG et MMP-1) par les cellules ostéoblastiques (non montré). Cependant, à une concentration de 200 μg/mL, le peptide (VGVAPG) ₃ entraine une diminution significative de l'expression génique de ΓΟΝ et de ΓΟΡ, voire une inhibition de celle d'OPG et de la MMP-1 par rapport au témoin sans peptide. Cette diminution de l'expression génique de ΓΟΝ, de ΓΟΡ, d'OPG et de la MMP-1 pourrait être dûe à une toxicité du peptide administré à 200μg/mL, ou à une accélération de la différenciation des cellules osseuses. Dans le cas où une toxicité serait confirmée, une concentration maximale de 150 μg/mL du peptide (VGVAPG) ₃ serait préconisée.

2.2. Effet de la kappa-élastine sur la différenciation des cellules osseuses de type ostéoblastique.

Des cellules osseuses de type ostéoblastique issues de moelle osseuse ont été cultivées sur couche de collagène de type I pendant une période de 28 jours en présence de 2% de sérum de veau fœtal, sans ou avec 100 μg/mL de kappa-élastine ou avec 150μg/mL de (VGVAPG) ₃ . (18S : ARNr 18S : contrôle interne; N.D. : Non détecté ; T : témoin ; κΕ : kappa-élastine; V3 : (VGVAPG) ₃ ). Les extraits cellulaires ont été analysés à 1, 7, 14, 21 et 28 jours de culture. Les milieux de culture sont renouvelés tous les 7 jours par moitié. Pour cela, à 1 mL de surnageant de culture cellulaire, 500 sont prélevés et remplacés par 500 de milieu frais avec ou sans kappa-élastine.

Le profil d'expression génique des cellules ostéoblastiques cultivées sur la couche de collagène de type I, a été analysé par RT-PCR afin d'évaluer leur stade de différenciation en fonction de la présence ou de l'absence de la kappa-élastine (Figure 5). Au 1 ^er jour, en présence de kappa-élastine, une faible diminution de l'expression génique des différents facteurs de transcription (Runx2, Dlx5, Msx2 et TAZ) par les ostéoblastes est observée par rapport à celle obtenue avec le témoin sans peptides. II est à noter que Msx2 est peu exprimé par les cellules, quelles que soient les conditions de culture, avec ou sans peptides (Figure 5A).

A 14 jours de culture, l'expression des facteurs de transcription Runx-2, Msx2 et Dlx5 augmente d'environ 40% en présence de kappa-élastine, comparativement au contrôle sans peptides (Figures 5B, 5C et 5D). L'expression de TAZ, elle, augmente de 25% (Figures 5E).

Alors que l'effet des peptides semble se perpétuer au 28 ^eme jour de culture pour l'expression génique de Runx2, il semble s'inverser pour celle de TAZ. A ce stade, Dlx5 et Msx2 ne sont plus détectés, quelles que soient les conditions de culture. Ces résultats étaient attendus et caractérisent un état de différenciation ostéoblastique avancé.

Il est également important de noter que PPARy (Peroxisome proliferator- activated receptor), un facteur de transcription spécifique de l'adipocyte, n'est jamais exprimé, avec ou sans traitement.

Sox9 (Sex determining région Y - box9), un marqueur du chondrocyte, est lui, faiblement exprimé en début de cinétique avant de ne plus être détecté au cours des jours tardifs. Le collagène de type II, un marqueur du chondrocyte plus spécifique que Sox9 et non exprimé par les ostéoblastes, n'est pas détecté en culture, quelles que soient les conditions de culture.

Des résultats comparables sont obtenus avec le peptide de séquence consensus (X ₁ GX ₂ X ₂ PG), plus particulièrement (VGVAPG)3. Ce dernier a des effets sur les facteurs de transcription ostéogéniques plus importants que ceux obtenus avec le témoin sans peptide. Le peptide (VGVAPG) ₃ apparaît plus efficace que la kappa- élastine.

Alors que ces facteurs de transcription sont impliqués dans l'ostéogenèse en favorisant la différenciation ostéoblastique, les inventeurs ont analysé par RT-PCR le profil d'expression de marqueurs protéiques ostéogéniques comme l'ostéocalcine et la sialoprotéine osseuse.

Pour cela, des cellules ostéoblastiques ont été cultivées sur couche de collagène de type I sans ou avec 100 μg/mL de kappa-élastine, ou 150μg/mL de (VGVAPG) ₃ .

18S : ARNr 18S ; N.D. : Non détecté ; T : témoin ; κΕ : kappa-élastine ; V3 :

VGVAPG ₃ . COL1 : Collagène de type I ; ON : ostéonectine ; OP : ostéopontine ; BSP : sialoprotéine osseuse ; Gal3 : Galectine-3 ; OC : ostéocalcine (figure 6).

Au 1 ^er jour de culture, le traitement des cellules avec la kappa-élastine n'a que peu d'effet sur les gènes de protéines exprimées précocement dans les étapes de différenciation des ostéoblastes comme le Collagène de type I , l'ostéonectine, et l'ostéopontine, comparativement au témoin. Dans le cas de la Galectine-3, une diminution est même constatée. II apparaît que la kappa-élastine induit une augmentation de l'expression génique de protéines « tardives » de la différenciation ostéoblastique comme la sialoprotéine osseuse et l'ostéocalcine par rapport au témoin (Figure 6A).

L'expression génique de ces protéines est par ailleurs, détectée dans les cultures témoins sans peptide. Au 7 ^eme puis au 14 ^eme jour de culture, l'expression de ces marqueurs ostéogéniques est augmentée de façon significative avec la kappa-élastine, comparativement au témoin sans peptide (Figures 6B, 6C, 6D, 6E, 6F). II est toutefois intéressant de remarquer que si l'ostéopontine présente un profil d'expression génique semblable aux autres marqueurs ostéoblastiques à 24h de culture, elle n'est plus détectée aux jours suivants (figure 6A).

De même, l'expression de la sialoprotéine osseuse (figure 6E) et de l'ostéocalcine (figure 6F) diminue avec le temps de culture de façon significative entre le 1 ^er et le 28 ^eme jour, quelles que soient les conditions de culture. Cependant, l'expression de l'ostéocalcine reste plus importante en présence de kappa-élastine par rapport au témoin.

Des résultats comparables sont obtenus avec le peptide de séquence consensus (VGVAPG) ₃ . Ce dernier a des effets ostéogéniques plus importants que ceux obtenus avec le témoin sans peptide. Dans le cas de l'expression génique de certaines protéines osseuses comme le Collagène de type I et l'ostéonectine, le peptide apparaît plus efficace que la kappa-élastine. Le dosage de l'activité phosphatase alcaline osseuse (PAL) a été réalisé à partir des extraits cellulaires de cellules ostéoblastiques cultivées sur couche de collagène et traitées ou non avec 100 μg/mL de kappa-élastine, ou 150 μg/mL de (VGVAPG) ₃ (V3) pendant 28 jours (Figure 7).

Le dosage de l'activité PAL est réalisé à partir des extraits cellulaires obtenus de cellules ostéoblastiques cultivées sur un couche de collagène de type I avec ou sans 100 μg/mL de kappa-élastine ou 150 μg/mL de V3.

A 24 heures de culture, une diminution non significative de l'activité PAL est observée en présence de kappa-élastine, comparativement au contrôle sans peptide (34,72 UI/L contre 36,67 UI/L, respectivement).

A 7 jours, puis jusqu'au 28 ^eme jour, l'activité PAL est plus élevée dans des cultures cellulaires traitées avec la kappa-élastine et le peptide (VGVAPG) ₃ , comparativement à la culture témoin sans peptide (à 14 jours : T= 19,45 UI/L ; kE= 22,63 UI/L ; V3= 24,66 UI/L). 2.3. Effets de la kappa-élastine sur la régulation de la différenciation des ostéoblastes

RANKL (Receptor activator for nuclear factor kappa-B ligand) et l'ostéoprotégérine (OPG) sont les clés, respectivement du système agoniste - antagoniste qui régule le devenir des ostéoclastes : différenciation, fusion, activation, survie et apoptose des cellules.

La présente étude a été réalisée en analysant le profil d'expression par RT- PCR des gènes OPG et RANKL par des cellules ostéoblastiques cultivées sur couche de collagène de type I avec ou sans 100 μg/mL de kappa-élastine pendant 1, 7, 14 et 28 jours.

OPG : ostéoprotégérine ; RANKL : RANK ligand; 18S: ARNr 18S ; N.D. :

Non détecté ; T : témoin ; κΕ : kappa-élastine (figure 8).

Au 1 ^er jour de culture, l'expression génique de RANKL et de l'ostéoprotégérine est signifîcativement moins importante dans les cultures d'ostéoblastes traités avec la kappa-élastine, comparativement au témoin sans peptide (Figure 8A).

Dès le 7 ^eme jour, l'expression génique de RANKL n'est plus détectée tandis que celle de l'OPG persiste et semble augmenter au cours du temps (figure 8A).

Au 7 ^eme jour, l'intensité d'expression de l'OPG en présence de la kappa- élastine est plus importante que celle du témoin sans peptide.

A 14 puis 28 jours, l'expression génique d'OPG avec la kappa-élastine est signifîcativement plus importante que celle obtenue avec le contrôle sans peptide (14J : kE = ±30% ; 28J : kE= ±60%) (Figure 8B).

Le rapport OPG/RANKL est positif quel que soit le jour de culture de cellules osseuses de type ostéoblastique, traitées ou non à la kappa-élastine (Figure 8C). Cependant, ce rapport est plus élevé en présence de kappa-élastine, comparativement à celui obtenu avec le témoin sans peptides du 1 ^er au 21 ^eme jours d'étude.

Au 28 ^eme jour, le résultat est inversé.

Ainsi, la kappa élastine à 100 μ§/ι Ι, dirige le phénotype ostéoblastique vers une formation osseuse alors qu'elle permet l'augmentation des expressions génique et protéique de l'ostéoprotégérine et une diminution de celle de RANK-L, favorable à la différenciation et l'activation des ostéoclastes, soit en relation avec la résorption osseuse.

La kappa élastine à 100 μg/mL augmente l'expression génique de facteurs de transcription favorables à la différenciation des ostéoblastes (Runx-2, Dlx5, Msxl, TAZ, etc.) ainsi que celle de protéines constitutives de la matrice osseuse (ostéocalcine, sialoprotéine osseuse, collagène de type I, ostéonectine, etc.) par ces cellules, comparativement à des cultures cellulaires sans traitement, et ceci, que ce soit sur des cultures courtes sur plastique (24 heures de culture) ou sur des cultures longues sur couche de collagène de type I (28 jours de culture). On a ainsi montré que la kappa élastine favorise la différenciation de cellules mésenchymateuses indifférenciées issues de la moelle osseuse en ostéoblastes humains. La kappa élastine favorise également la différenciation des ostéoblastes humains.

Les peptides de séquence consensus (VGVAPG) ₃ possède des propriétés ostéogéniques sensiblement identiques à celles de la kappa élastine.

Troisième expérimentation : Effets de la kappa-élastine sur la minéralisation de la matrice osseuse

Des cellules osseuses de type ostéoblastique issues de moelle osseuse ont été cultivées sur couche de collagène de type I pendant une période de 28 jours en présence de 2% de sérum de veau foetal et plus ou moins en absence de kappa- élastine (100 μg/mL). Les études sur la minéralisation osseuse ont été réalisées à 1, 7, 21 et 28 jours de culture. Les milieux de culture ont été renouvelés tous les 7 jours par moitié. Pour cela, à 1 mL de surnageant de culture cellulaire, 500 ont été prélevés et remplacés par 500 de milieu frais avec ou sans kappa-élastine.

1- Mise en évidence de la minéralisation osseuse à partir d'observation en microscopie électronique à balayage (Figure 9)

Au 1 ^er jour de culture, la morphologie des cellules cultivées en présence de kappa-élastine (κΕ) est sensiblement identique à celle de cellules témoin, cultivées sans peptide. Les cellules sont de forme essentiellement cuboïde ou légèrement allongée.

Elles sont déposées et réparties de façon homogène sur un réseau de fibres collagéniques denses, avec lequel elles entretiennent des interactions cellule-matrice très nombreuses .

Dès le 7 ^eme jour de culture, le réseau collagénique semble moins apparent et identifiable sous les cellules, quelles que soient les conditions de culture (Témoin, kE) bien que ce phénomène soit plus marqué en présence de kappa-élastine par rapport au contrôle sans peptide.

A 21 jours de culture, le réseau de fibres de collagène n'est quasi plus visible sous les cellules témoin, tandis qu'en présence de la kappa- élastine, la matrice extracellulaire apparaît plus dense et contient des petites structures arrondies qui fusionnent les unes aux autres, suggérant la coalescence de nodules de minéralisation. Des résultats similaires sont obtenus en présence de (VGVAPG) ₃ .

2- Mise en évidence de la minéralisation osseuse par microanalyse X (Figure

10)

Les couches de collagène ensemencées de cellules osseuses de type ostéoblastique sont observées en microscopie électronique à transmission (MET), associée à une microanalyse X afin de déterminer si la kappa-élastine favorise la minéralisation osseuse. La composition de nodules de calcification est déterminée par microanalyse

X.

Trois points sont analysés dans les deux types de culture, traités ou non avec la kappa-élastine : deux, à l'intérieur de nodules de taille différente et un, au sein de la matrice.

A 21 jours de culture, l'analyse par MET des cultures témoins montre quelques concressions présentes dans la matrice qui se révèlent être des nodules de calcium à la microanalyse X (Figures 10A et 10B). La matrice extracellulaire, en dehors de ces concressions, ne révèle pas la présence de calcium.

En présence de kappa-élastine, les cultures cellulaires développent des nodules en plus grande quantité comparativement au témoin. Ceux-ci révèlent un pic de calcium à la microanalyse X (Figure 10D). La micro analyse X de la matrice révèle également la présence de calcium dans une moindre mesure par rapport aux nodules (Figure 10D).

3-. Analyse par spectroscopie infrarouge des effets de la kappa-élastine sur la minéralisation osseuse après 28 jours de culture d'ostéoblastes sur couche de collagène

La matrice inorganique de l'os est composée principalement d'hydroxyapatite. La spectroscopie infrarouge a été utilisée comme une approche semi-quantitative de la détection de ce composé dans des cultures de cellules ostéoblastiques ensemencées sur couche de collagène de type I.

Une méthode d'intégration a été utilisée afin de calculer les différences entre les aires de surface présentes sous les spectres et obtenues à partir des cellules traitées ou non à la kappa-élastine.

L'aire définie sous le spectre correspondant aux cultures de cellules traitées avec la kappa-élastine est environ 25% plus importante que celle obtenues avec les cellules témoins, suggérant une augmentation du taux d'hydroxyapatite en présence de kappa-élastine comparativement aux cellules non traitées et ainsi une augmentation du processus de minéralisation avec la kappa-élastine. Dans le cas du peptide (VGVAPG)3, l'aire définie obtenue est 30% supérieure à celle du témoin. La kappa-élastine favorise la minéralisation osseuse par les cellules ostéoblastiques cultivées sur couche de collagène de type I pendant 28 jours de culture, comparativement à des cultures cellulaires ne recevant aucun traitement. Ceci a été démontré par Microscopie Electronique à Balayage, par Microscopie Electronique à Balayage Transmission et microanalyse X et spectroscopie infrarouge qui ont mis en évidence la présence de nodules de calcification plus abondants en présence de kappa-élastine par rapport à des cultures n'ayant pas été traitées.

La kappa-élastine permet donc de favoriser la formation matricielle gingivale et osseuse et tout particulièrement, dans le cas du tissu osseux, favorise la réparation, voire la régénération, osseuse.

Les peptides de séquence (VGVAPG)3 favorisent la formation de la matrice osseuse et sa minéralisation.

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