VERDICKEN WÄSSRIGER PHASEN

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung einer synergistischen Mischung aus was- serlöslichen, verdickend wirkenden Polymeren und Hydrophobinen zum Verdicken wässriger Phasen sowie den Abbau der verdickenden Wirkung durch Spalten des Proteins. Die Erfindung betrifft weiterhin eine verdickende Zusammensetzung aus wasserlöslichen Polymeren, Hydrophobinen und Wasser.

Wasserlösliche, verdickend wirkende Polymere werden in vielen Bereichen der Technik eingesetzt, beispielsweise im Bereich der Kosmetik, in Lebensmitteln, zur Herstellung von Reinigungsmitteln, Druckfarben, Dispersionsfarben oder bei der Erdölförderung.

Als Polymere mit verdickender Wirkung werden eine Vielzahl chemisch unterschiedlicher Polymere eingesetzt, beispielsweise Biopolymere wie Xanthan, Stärke, Gelatine, modifizierte Biopolymere wie Hydroxyethylcellulose, Hydroxypropylcellulose oder Carboxymethylcellulo- se oder synthetische Polymere wie Polyvinylalkohole, Polyacrylsäuren bzw. teilvernetze Po- lyacrylsäuren oder Polyacrylamide, sowie insbesondere Copolymere von (Meth)acrylsäure mit weiteren Monomeren.

Eine weitere Klasse von verdickend wirkenden Polymeren sind die sogenannten Assoziativ- Verdicker. Hierbei handelt es sich um wasserlösliche Polymere, welche seiten- oder endständig hydrophobe Gruppen aufweisen, wie beispielsweise längere Alkylketten. In wässriger Lösung können derartige hydrophobe Gruppen mit sich selbst oder mit anderen hydrophobe Gruppen aufweisenden Stoffen assoziieren. Hierdurch wird ein assoziatives Netzwerk gebildet, durch das das Medium verdickt wird. Beispiele derartiger Polymere sind in EP 013 836 A1 oder WO 2006/16035 offenbart.

Hydrophobine sind kleine Proteine von etwa 100 bis 150 Aminosäuren, die charakteristisch für filamentöse Pilze, beispielsweise Schizophyllum commune, sind. Sie weisen in aller Regel 8 Cystein-Einheiten auf. Sie bilden in Wasser bei geringen Konzentration von bis zu ca. 3 Gew. % relativ dünnflüssige Lösungen, während stärker konzentrierte Lösungen schließlich gelartig werden.

Im Stand der Technik ist die Verwendung von Hydrophobinen für verschiedene Anwendungen vorgeschlagen worden.

EP 1 252 516 offenbart die Beschichtung verschiedener Substrate mit einer Hydrophobine enthaltenden Lösung bei einer Temperatur von 30 bis 80 ⁰ C. Weiterhin wurde beispielsweise die Verwendung als Demulgator (WO 2006/103251), als Verdunstungsverzögerer (WO 2006/128877) oder Verschmutzungsinhibitor (WO 2006/103215) vorgeschlagen. WO 2006/103253 offenbart Bohrspülungen, welche Hydrophobine enthalten. Die Formulierungen können neben den Hydrophobinen ein Vielzahl unterschiedlichster anderer Komponenten enthalten, darunter auch Polymere oder Copolymere, wie beispielsweise Polyacrylamide.

WO 96/41882 schlägt die Verwendung von Hydrophobinen als Emulgatoren, Verdicker, o- berflächenaktive Substanzen, zum Hydrophilieren hydrophober Oberflächen, zur Verbesserung der Wasserbeständigkeit hydrophiler Substrate, zur Herstellung von Öl-in-Wasser- Emulsionen oder von Wasser-in-ÖI-Emulsionen vor. Weiterhin werden pharmazeutische An- Wendungen wie die Herstellung von Salben oder Cremes sowie kosmetische Anwendungen wie Hautschutz oder die Herstellung von Haarshampoos oder Haarspülungen vorgeschlagen.

Beide Schriften offenbaren aber nicht, dass eine Mischung von Hydrophobinen mit wasser- löslichen, verdickenden Polymeren im Gewichtsverhältnis 5 : 1 bis 1 : 10 synergistische Wirkungen aufweist.

Für manche Anwendungen verdickender Polymere ist es erwünscht, dass die verdickende Wirkung auch wieder rückgängig gemacht werden kann. Ein typisches Beispiel hierzu ist der so genannte „Fracturing" -Prozess im Zuge der Erdölproduktion. Hierbei presst man eine Lösung eines verdickenden Polymers in ein Bohrloch ein. Durch diese Druckbehandlung werden neue Risse in der Erdölformation gebildet, durch welche das Erdöl besser aus der Formation zum Bohrloch strömen soll. Nach Beendigung des „Fracturing" soll die Viskosität der Polymerlösung aber wieder abgebaut werden, damit die Polymerlösung nicht die gebilde- ten Risse verstopft. Zum Abbau der Polymere ist beispielsweise die Verwendung von Oxida- tionsmitteln vorgeschlagen worden. Im Falle von Biopolymeren, wie Polysacchariden ist es weiterhin bekannt zum Abbau Enzyme einzusetzen, die die Polymerkette an bestimmten Stellen aufspalten. Ein derartiges Verfahren ist beispielsweise von US 5,201 ,370 vorgeschlagen worden. Da Enzyme in der Regel relativ selektiv sind, müssen zum Spalten ande- rer Biopolymere auch andere Enzyme bereitgehalten werden, während synthetische Polymere in der Regel gar nicht von Enzymen gespalten werden können.

Aufgabe der Erfindung war es, eine verdickend wirkende Zusammensetzung bereit zu stellen, bei der die verdickende Wirkung auf einfache Art und Weise wieder „abgeschaltet" wer- den kann.

Überraschenderweise wurde gefunden, dass Hydrophobine und wasserlösliche Polymere synergistisch zusammenwirken und bereits in niedrigen Konzentrationen gut verdickende Zusammensetzungen bilden. Die verdickende Wirkung kann -sofern gewünscht- auf einfa- che Art und Weise durch Spalten des Hydrophobins, beispielsweise mit Hilfe von Enzymen beseitigt werden. Eine Spaltung des verdickenden Polymers selbst ist nicht erforderlich. Dem entsprechend wurde die Verwendung einer synergistischen Mischung zur Verdickung wässriger Phasen gefunden, wobei die Mischung

• mindestens ein wasserlösliches, verdickend wirkendes Polymer (A), sowie • mindestens ein Hydrophobin (B),

in einem Gewichtverhältnis (A) / (B) von 5 :1 bis 1 : 10 umfasst.

Weiterhin wurde eine synergistische Zusammensetzung gefunden, welche mindestens

• eine wässrige Phase,

• 0,01 bis 2,5 Gew. % mindestens eines wasserlöslichen, verdickend wirkenden Polymers (A), sowie

• 0,1 bis 2,5 Gew. % mindestens eines Hydrophobins (B),

umfasst, wobei dass das Gewichtverhältnis (A) / (B) 5 :1 bis 1 : 10 beträgt, und wobei die Mengenangaben auf die Summe aller Komponenten der wässrigen Phase bezogen sind.

Zu der Erfindung ist im Einzelnen das Folgende auszuführen:

Verdickendes Polymer (A)

Erfindungsgemäß wird zum Verdicken mindestens ein wasserlösliches, verdickendes PoIy- mer (A) verwendet.

Der Begriff „Polymer" umfasst selbstverständlich auch Copolymere aus zwei oder mehreren Monomeren. Geeignete wasserlösliche, verdickende Polymere (A) weisen im Regelfalle eine zahlenmittlere molare Masse M _n von 1000 bis 10 000 000 g/mol, bevorzugt 10 000 bis 1 000 000 g/mol auf.

Die eingesetzten Polymere (A) können lückenlos mit Wasser mischbar sein, ohne dass dies zur Ausführung der Erfindung zwingend erforderlich ist. Sie müssen sich aber zumindest in einem solchen Maße in Wasser lösen, dass die erfindungsgemäße Verwendung möglich ist. Im Regelfalle sollten die eingesetzten Polymere (A) in Wasser eine Löslichkeit von mindestens 50 g/l, bevorzugt 100 g/l und besonders bevorzugt mindestens 200 g/l aufweisen.

Dem Fachmann auf dem Gebiet verdickender Polymere ist bekannt, dass die Löslichkeit verdickender Polymere in Wasser vom pH-Wert abhängig sein kann. Bezugspunkt für die Beurteilung der Wasserlöslichkeit soll daher jeweils der für den jeweiligen Einsatzzweck der verdickenden Mischung gewünschte pH-Wert sein. Ein Polymer (A), welches bei einem bestimmten pH-Wert eine nicht ausreichende Löslichkeit für den vorgesehenen Einsatzzweck hat, kann bei einem anderen pH-Wert eine ausreichende Löslichkeit aufweisen. Der Begriff „wasserlöslich" bezieht sich also beispielsweise auch auf alkalilösliche Emulsionen (ASE) von Polymeren.

Der Begriff „verdickendes Polymer" wird in dieser Erfindung in prinzipiell bekannter Art und Weise für solche Polymere verwendet, welche bereits in vergleichsweise geringen Konzentrationen die Viskosität wässriger Lösungen signifikant erhöhen.

Geeignete wasserlösliche, verdickende Polymere (A) umfassen neben Kohlenstoff und Wasserstoff hydrophile Gruppen in einer solchen Menge, dass die Polymere (A) zumindest in bestimmten pH-Bereichen wasserlöslich werden. Insbesondere handelt es sich um funktionelle Gruppen, welche O- und/oder N-Atome umfassen. Die O- und/oder N-Atome können Bestandteil der Hauptkette des Polymers sein und/oder seitenständig bzw. endständig angeordnet sein. Beispiele geeigneter funktioneller Gruppen umfassen Carbonylgruppen >C=O, Ethergruppen -O-, insbesondere Polyethylenoxidgruppen -(CH2-CH2-O-) _n -, wobei n bevor- zugt für eine Zahl von 1 bis 200 steht, Hydroxygruppen -OH, Estergruppen -C(O)O-, primäre, sekundäre oder tertiäre Aminogruppen, Amidgruppen -C(O)-NH-, Carboxamidgruppen - C(O)-NH ₂ , Harnstoffgruppen -NH-C(O)-NH- , Urethangruppen -0-C(O)-NH- oder saure Gruppen wie Carboxylgruppen -COOH, Sulfonsäuregruppen -SO3H, Phosphonsäuregrup- pen -PO3H2 oder Phosphorsäuregruppen -0P(0H)3.

Beispiele bevorzugter funktioneller Gruppen umfassen Hydroxygruppen -OH, Carboxylgruppen -COOH, Sulfonsäuregruppen -SO3H, Carboxamidgruppen -C(O)-NH ₂ sowie Polyethylenoxidgruppen -(CH2-CH2-O-)n-, wobei n bevorzugt für eine Zahl von 1 bis 200 steht.

Zur Ausführung der Erfindung geeignete wasserlösliche, verdickende Polymere (A) weisen im Regelfalle ein Zahlenverhältnis von Sauerstoff- und Stickstoffatomen zur Gesamtzahl von Sauerstoff- und Stickstoff- und Kohlenstoffatomen (no+nn) / (nc+no+nn) von 0,2 bis 0,5, bevorzugt 0,3 bis 0,46 auf.

Bei den verdickenden Polymeren kann es sich um natürlich vorkommende Polymere, um modifizierte natürliche Polymere oder um synthetisch hergestellte Polymere handeln.

Natürlich vorkommende verdickende Polymere umfassen beispielsweise Polypeptide wie Gelatine oder Casein.

Weiterhin kann es sich auch um Polysaccharide handeln, wobei der Begriff auch modifizierte Polysaccharide umfassen soll. Beispiele für Polysaccharide umfassen Stärke, Xanthane oder Glucane. Beispiele für modifizierte Polysaccharide umfassen Hydroxyethylcellulose, Hydro- xypropylcellulose, Hydroxypropylmethylcellulose oder Carboxymethylcellulose. Bevorzugt können Xanthane oder Glucane eingesetzt werden.

Beispiele synthetischer Polymere umfassen Poly(meth)acrylsäure bzw. deren Salze, Po- ly(meth)acrylsäure umfassende Copolymere bzw. deren Salze, Polyacrylamide, Polyvinylpyr- rolidon, Polyvinylalkohol oder Polyethylenglykole. Es kann sich auch um vernetzte Po- ly(meth)acrylsäuren bzw. Poly(meth)acrylsäurecopoylmere handeln, vorausgesetzt, die Vernetzung ist nicht so stark, dass sie die Wasserlöslichkeit der Polymere beeinträchtigt.

Bei den Polyacrylsäuren kann es sich um Lösungen von Polyacrylsäure bzw. Copolymeren davon oder auch um Fällungspolymerisate auf Basis von Polyacrylsäure handeln, welche auch leicht vernetzt sein können.

Weitere Beispiele umfassen alkalilösliche Emulsionen von (Meth)acrylsäurecopolymeren. Deartige Copolymere liegen im sauren pH-Bereich als vergleichsweise dünnflüssige Emulsionen in Wasser vor. Im alkalischen Bereich lösen sich die Polymere in der wässrigen Phase und erhöhen deren Viskosität signifikant. Bei alkalilöslichen Emulsionen handelt es sich beispielsweise um Copolymere, welche (Meth)acrylsäure sowie hydrophobe Comonomere, insbesondere (Meth)acrylsäureester, insbesondere d- bis C4-Alkyl-(Meth)acrylate, wie Me- thyl(meth)acrylat, Ethyl(meth)acrylat oder n-Butyl(meth)acrylat umfassen. Die Menge an (Meth)acrylsäure beträgt üblicherweise 10 bis 50 Gew. % und die Menge weiterer Comonomere, insbesondere der besagten (Meth)acrylate 50 bis 90 Gew. %.

Weiterhin kann es sich um hydrophob assoziierende Polymere handeln. Hierunter werden in prinzipiell bekannter Art und Weise wasserlösliche Polymere verstanden, welche seiten- oder endständig hydrophobe Gruppen aufweisen, wie beispielsweise längere Alkylketten. In wäss- riger Lösung können derartige hydrophobe Gruppen mit sich selbst oder mit anderen hydrophobe Gruppen aufweisenden Stoffen assoziieren, wodurch eine stark verdickende Wirkung hervorgerufen wird.

Beispiele bevorzugter hydrophob assoziierender Polymere umfassen Copolymere, welche saure Monomere, bevorzugt (Meth)acrylsäure umfassen, sowie mindestens einen (Meth)acrylsäureester, wobei die Estergruppe einen Kohlenwasserstoffest R ¹ mit mindestens 6 Kohlenstoffatomen, bevorzugt 8 bis 30 Kohlenstoffatomen umfasst. Hierbei kann es um bevorzugt lineare aliphatische Kohlenwasserstoffreste handeln oder auch um aromatische Einheiten umfassende Kohlenwasserstoffreste, insbesondere ω-arylsubstituierte Alkylreste. Bei den (Meth)acrylsäureestern kann es sich um einfache Ester der Formel H ₂ C=C(R ² )- COOR ¹ handeln, wobei R ² für H oder CH3 stehen kann. Bevorzugt ist der Kohlenwasserstoffrest R ¹ über einen hydrophilen Spacer mit dem (Meth)acrylsäurerest verbunden, d.h. es handelt sich um einen (Meth)acrylsäurerester der allgemeinen Formel H2C=C(R ² )-COO-R ³ - R ¹ , wobei R ³ für eine zweiwertige hydrophile Gruppe steht. Bevorzugt handelt es sich bei R ³ um eine Polyalkylenoxidgruppe -(CH2-CH(R ⁴ ) -O-) _n -, wobei n für eine Zahl von 2 bis 100, bevorzugt 5 bis 50 steht und R ⁴ unabhängig voneinander für H oder CH3, mit der Maßgabe, dass es sich bei mindestens 50 mol %, bevorzugt mindestens 80 mol % der Reste R ⁴ um H handelt. Bevorzugt handelt es sich bei R ⁴ ausschließlich um H.

Die Menge der Monomere H ₂ C=C(R ² )-COO-R ³ -R ¹ beträgt üblicherweise 1 bis 20 Gew. % bezüglich der Summe aller Monomere. Bei den weiteren Monomeren kann es sich aus- schließlich um (Meth)acrylsäure handeln. Daneben können auch noch weitere (Meth)acrylsäureester, insbesondere d- bis C4-Alkyl-(Meth)acrylate, wie Me- thyl(meth)acrylat, Ethyl(meth)acrylat oder n-Butyl(meth)acrylat vorhanden sein. Beispielsweise kann es sich um Polymere handeln, welche 1 bis 20 Gew. %., bevorzugt 5 bis 15 Gew. % H ₂ C=C(R ² )-COO-(CH ₂ -CH(R ⁴ ) -O) _n -R ¹ , 10 bis 80 Gew. %, bevorzugt 20 bis 80 Gew. % (Meth)acrylsäure sowie 5 bis 70 Gew. %, bevorzugt 10 bis 65 Gew. % d- bis C ₄ -AIkVl- (Meth)acrylate umfassen, wobei die Mengen jeweils auf die Menge aller Monomere im Polymer bezogen sind. Hierdurch lassen sich alkalilösliche Emulsionen erhalten, welche zusätzlich über hydrophob assoziierende Gruppen verfügen.

Weitere Beispiele hydrophob assoziierender Polymere umfassen hydrophob modifizierte Celluloseether, hydrophob modifizierte Polyacrylamide, hydrophob modifizierte Polyether, beispielsweise mit Cβ- bis C3o-Kohlenwasserstoffgruppen endgruppenverschlossenes PoIy- ethylenglykol oder hydrophob assoziierende Polyurethane, welche Polyethersegmente sowie endständige hydrophobe Gruppen umfassen.

Hydrophobine (B)

Erfindungsgemäß wird zum Verdicken weiterhin mindestens ein Hydrophobin (B) verwendet.

Unter dem Begriff „Hydrophobine" sollen im Folgenden Polypeptide der allgemeinen Strukturformel (I)

X _n -C ¹ -Xi-5θ-C ² -Xo-5-C ³ -Xi-ioo-C ⁴ -Xi-ioo-C ⁵ -Xi-5θ-C ⁶ -Xo-5-C ⁷ -Xi-5θ-C ⁸ -X _m (I)

verstanden werden, wobei X für jede der 20 natürlich vorkommenden Aminosäuren (Phe, Leu, Ser, Tyr, Cys, Trp, Pro, His, GIn, Arg, Ne Met, Thr, Asn, Lys, VaI, AIa, Asp, GIu, GIy) stehen kann. Dabei können die Reste X jeweils gleich oder verschieden sein. Hierbei stellen die bei X stehenden Indizes jeweils die Anzahl der Aminosäuren in der jeweiligen Teilsequenz X dar, C steht für Cystein, Alanin, Serin, Glycin, Methionin oder Threonin, wobei mindestens vier der mit C benannten Reste für Cystein stehen, und die Indizes n und m stehen unabhängig voneinander für natürliche Zahlen zwischen 0 und 500, bevorzugt zwischen 15 und 300.

Die Polypetide gemäß der Formel (I) sind weiterhin durch die Eigenschaft charakterisiert, dass sie bei Raumtemperatur nach Beschichten einer Glasoberfläche eine Vergrößerung des Kontaktwinkels eines Wassertropfens von mindestens 20°, bevorzugt mindestens 25° und besonders bevorzugt 30° bewirken, jeweils verglichen mit dem Kontaktwinkel eines gleich großen Wassertropfens mit der unbeschichteten Glasoberfläche.

Die mit C bis C ⁸ benannten Aminosäuren sind bevorzugt Cysteine; sie können aber auch durch andere Aminosäuren ähnlicher Raumerfüllung, bevorzugt durch Alanin, Serin, Threo- nin, Methionin oder Glycin ersetzt werden. Allerdings sollen mindestens vier, bevorzugt mindestens 5, besonders bevorzugt mindestens 6 und insbesondere mindestens 7 der Positionen C bis C ⁸ aus Cysteinen bestehen. Cysteine können in den erfindungsgemäßen Proteinen entweder reduziert vorliegen oder miteinander Disulfidbrücken ausbilden. Besonders bevorzugt ist die intramolekulare Ausbildung von C-C Brücken, insbesondere die Ausbildung von mindestens einer, bevorzugt 2, besonders bevorzugt 3 und ganz besonders bevorzugt 4 intramolekularen Disulfidbrücken. Bei dem oben beschriebenen Austausch von Cysteinen durch Aminosäuren ähnlicher Raumerfüllung werden vorteilhaft solche C-Positionen paarweise ausgetauscht, die intramolekulare Disulfidbrücken untereinander ausbilden können.

Falls in den mit X bezeichneten Positionen auch Cysteine, Serine, Alanine, Glycine, Methio- nine oder Threonine verwendet werden, kann sich die Nummerierung der einzelnen C- Positionen in den allgemeinen Formeln entsprechend verändern.

Bevorzugt werden Hydrophobine der allgemeinen Formel (II)

Xn-C ¹ -X3-25-C ² -Xθ-2-C ³ -X ₅ - ₅ O-C ⁴ -X2-35-C ⁵ -X2-15-C ⁶ -Xθ-2-C ⁷ -X ₃ -35-C ⁸ -X _m (I I)

zur Ausführung der vorliegenden Erfindung eingesetzt, wobei X, C und die bei X und C ste- henden Indizes die obige Bedeutung haben, die Indizes n und m für Zahlen zwischen 0 und 350, bevorzugt 15 bis 300 stehen, sich die Proteine weiterhin durch die oben erwähnte Kontaktwinkeländerung auszeichnen, und es sich weiterhin bei mindestens 6 der mit C benannten Reste um Cystein handelt. Besonders bevorzugt handelt es sich bei allen Resten C um Cystein.

Besonders bevorzugt werden Hydrophobine der allgemeinen Formel (III)

Xn-C ¹ -X5-9-C ² -C ³ -Xi1-39-C ⁴ -X2-23-C ⁵ -X ₅ -9-C ⁶ -C ⁷ -X6-18-C ⁸ -X _m (I I I)

eingesetzt, wobei X, C und die bei X stehenden Indizes die obige Bedeutung haben, die Indizes n und m für Zahlen zwischen 0 und 200 stehen, sich die Proteine weiterhin durch die oben erwähnte Kontaktwinkeländerung auszeichnen, und es sich bei mindestens 6 der mit C benannten Reste um Cystein handelt. Besonders bevorzugt handelt es sich bei allen Resten C um Cystein.

Bei den Resten X _n und X _m kann es sich um Peptidsequenzen handeln, die natürlicherweise auch mit einem Hydrophobin verknüpft sind. Es kann sich aber auch bei einem oder bei beiden Resten um Peptidsequenzen handeln, die natürlicherweise nicht mit einem Hydrophobin verknüpft sind. Darunter sind auch solche Reste X _n und/oder X _m zu verstehen, bei denen eine natürlicherweise in einem Hydrophobin vorkommende Peptidsequenz durch eine nicht natürlicherweise in einem Hydrophobin vorkommende Peptidsequenz verlängert ist. Falls es sich bei X _n und/oder X _m um natürlicherweise nicht mit Hydrophobinen verknüpfte Peptidsequenzen handelt, sind derartige Sequenzen in der Regel mindestens 20, bevorzugt mindestens 35 Aminosäuren lang. Es kann sich beispielsweise um Sequenzen aus 20 bis 500, bevorzugt 30 bis 400 und besonders bevorzugt 35 bis 100 Aminosäuren handeln. Ein derartiger, natürlicherweise nicht mit einem Hydrophobin verknüpfter Rest soll im Folgenden auch als Fusionspartner bezeichnet werden. Damit soll ausgedrückt werden, dass die Proteine aus mindestens einem Hydrophobinteil und einem Fusionspartnerteil bestehen können, die in der Natur nicht zusammen in dieser Form vorkommen. Fusions-Hydrophobine aus Fusionspartner und Hydrophobinteil sind beispielsweise in WO 2006/082251 , WO 2006/082253 und WO 2006/131564 offenbart worden.

Der Fusionspartnerteil kann aus einer Vielzahl von Proteinen ausgewählt werden. Es kann nur ein einziger Fusionspartner mit dem Hydrophobinteil verknüpft sein, oder es können auch mehrere Fusionspartner mit einem Hydrophobinteil verknüpft werden, beispielsweise am Aminoterminus (X _n ) und am Carboxyterminus (X _m ) des Hydrophobinteils. Es können aber auch beispielsweise zwei Fusionspartner mit einer Position (X _n oder X _m ) des erfindungsgemäßen Proteins verknüpft werden.

Besonders geeignete Fusionspartner sind Proteine, die natürlicherweise in Mikroorganismen, insbesondere in E. coli oder Bacillus subtilis vorkommen. Beispiele für solche Fusionspartner sind die Sequenzen yaad (SEQ ID NO: 16 in WO 2006/082251 ), yaae (SEQ ID NO:18 in WO 2006/082251 ), Ubiquitin und Thioredoxin. Gut geeignet sind auch Fragmente oder Derivate dieser genannten Sequenzen, die nur einen Teil, beispielsweise 70 bis 99 %, bevorzugt 5 bis 50 %, und besonders bevorzugt 10 bis 40 % der genannten Sequenzen umfassen, oder bei denen einzelne Aminosäuren, bzw. Nukleotide gegenüber der genannten Sequenz verändert sind, wobei sich die Prozentangaben jeweils auf die Anzahl der Aminosäuren bezieht.

In einer weiterhin bevorzugten Ausführungsform weist das Fusion-Hydrophobin neben dem genannten Fusionspartner als eine der Gruppen X _n oder X _m oder als terminaler Bestandteil einer solchen Gruppe noch eine sogenannte Affinitätsdomäne (affinity tag / affinity tail) auf. Hierbei handelt es sich in prinzipiell bekannter Art und Weise um Ankergruppen, welche mit bestimmten komplementären Gruppen wechselwirken können und der leichteren Aufarbeitung und Reinigung der Proteine dienen können. Beispiele derartiger Affinitätsdomänen umfassen (His)k- , (Arg)k-, (Asp)k-, (Phe)k- oder (Cys)k-Gruppen, wobei k im allgemeinen für eine natürliche Zahl von 1 bis 10 steht. Bevorzugt kann es sich um eine (His)k-Gruppe handeln, wobei k für 4 bis 6 steht. Hierbei kann die Gruppe X _n und/oder X _m ausschließlich aus einer derartigen Affinitätsdomäne bestehen oder aber ein natürlicherweise oder nicht natürlicherweise mit einem Hydrophobin verknüpfter Rest X _n bzw. X _m wird um eine terminal angeordnete Affinitätsdomäne verlängert.

Die erfindungsgemäß verwendeten Hydrophobine können auch modifiziert sein, beispielsweise durch Glycosilierung, Acetylierung oder auch durch chemische Quervernetzung beispielsweise mit Glutardialdehyd. Eine Eigenschaft der erfindungsgemäß verwendeten Hydrophobine bzw. deren Derivaten ist die Änderung von Oberflächeneigenschaften, wenn die Oberflächen mit den Proteinen beschichtet werden. Die Änderung der Oberflächeneigenschaften lässt sich experimentell bei- spielsweise dadurch bestimmen, dass der Kontaktwinkel eines Wassertropfens vor und nach der Beschichtung der Oberfläche mit dem Hydrophobin gemessen und die Differenz der beiden Messungen ermittelt wird.

Die Durchführung von Kontaktwinkelmessungen ist dem Fachmann prinzipiell bekannt. Die Messungen beziehen sich auf Raumtemperatur sowie Wassertropfen von 5 μl und die Verwendung von Glasplättchen als Substrat. Die genauen experimentellen Bedingungen für eine beispielhaft geeignete Methode zur Messung des Kontaktwinkels sind im experimentellen Teil dargestellt. Unter den dort genannten Bedingungen besitzen die erfindungsgemäß verwendeten Fusionsproteine die Eigenschaft, den Kontaktwinkel um mindestens 20°, be- vorzugt mindestens 25°, besonders bevorzugt mindestens 30° zu vergrößern, jeweils verglichen mit dem Kontaktwinkel eines gleich großen Wassertropfens mit der unbeschichteten Glasoberfläche.

Besonders bevorzugte Hydrophobine zur Ausführung der vorliegenden Erfindung sind die Hydrophobine des Typs dewA, rodA, hypA, hypB, sc3, basfi , basf2. Diese Hydrophobine inklusive ihrer Sequenzen sind beispielsweise in WO 2006/82251 offenbart. Sofern nicht anders angegeben, beziehen sich die nachfolgend angegebenen Sequenzen auf in WO 2006/82251 offenbarten Sequenzen. Eine Übersichtstabelle mit den SEQ-I D-Nummern befindet sich in WO 2006/82251 auf Seite 20. Sofern nicht ausdrücklich anders bezeichnet, beziehen sich alle nachfolgend zitierten SEQ IDs auf die von WO2006/82251 zitierten SEQ IDs.

Erfindungsgemäß insbesondere geeignet sind die Fusionsproteine yaad-Xa-dewA-his (SEQ ID NO: 20), yaad-Xa-rodA-his (SEQ ID NO: 22) oder yaad-Xa-basfl-his (SEQ ID NO: 24) mit den in Klammern angegebenen Polypeptidsequenzen sowie den dafür codierenden Nuklein- säuresequenzen, insbesondere den Sequenzen gemäß SEQ ID NO: 19, 21 , 23. Besonders bevorzugt kann yaad-Xa-dewA-his (SEQ ID NO: 20) eingesetzt werden. Auch Proteine, die sich ausgehend von den in SEQ ID NO. 20, 22 oder 24 dargestellten Polypeptidsequenzen durch Austausch, Insertion oder Deletion von mindestens einer, bis hin zu 10, bevorzugt 5, besonders bevorzugt 5% aller Aminosäuren ergeben, und die die biologische Eigenschaft der Ausgangsproteine noch zu mindestens 50% besitzen, sind besonders bevorzugte Ausführungsformen. Unter biologischer Eigenschaft der Proteine wird hierbei die bereits beschriebene Änderung des Kontaktwinkels um mindestens 20° verstanden.

Besonders zur Ausführung der vorliegenden Erfindung geeignete Derivate sind von yaad-Xa- dewA-his (SEQ ID NO: 20), yaad-Xa-rodA-his (SEQ ID NO: 22) oder yaad-Xa-basf1-his (SEQ ID NO: 24) durch Verkürzung des yaad-Fusionspartners abgeleitete Derivate. Anstelle des vollständigen yaad-Fusionspartners (SEQ ID NO: 16) mit 294 Aminosäuren kann vorteil- haft ein verkürzter yaad-Rest eingesetzt werden. Der verkürzte Rest sollte aber zumindest 20, bevorzugt mindestens 35 Aminosäuren umfassen. Beispielsweise kann ein verkürzter Rest mit 20 bis 293, bevorzugt 25 bis 250, besonders bevorzugt 35 bis 150 und beispielsweise 35 bis 100 Aminosäuren eingesetzt werden. Ein Beispiel für ein derartiges Protein ist yaad40-Xa-dewA-his (SEQ ID NO: 26 in WO 2007/014897), welches einen auf 40 Aminosäuren verkürzten yaad-Rest aufweist.

Eine Spaltstelle zwischen dem Hydrophobin und dem Fusionspartner bzw. den Fusionspartnern kann dazu genutzt werden, den Fusionspartner abzuspalten und das reine Hydrophobin in underivatisierter Form freizusetzen (beispielsweise durch BrCN-Spaltung an Methionin, Faktor Xa-, Enterokinase-, Thrombin-, TEV-Spaltung etc.).

Die erfindungsgemäß verwendeten Hydrophobine lassen sich chemisch durch bekannte Verfahren der Peptidsynthese, wie beispielsweise durch Festphasensynthese nach Merrifield herstellen.

Natürlich vorkommende Hydrophobine lassen sich aus natürlichen Quellen mittels geeigneter Methoden isolieren. Beispielhaft sei auf Wösten et. al., Eur. J Cell Bio. 63, 122-129 (1994) oder WO 96/41882 verwiesen.

Ein gentechnisches Herstellverfahren für Hydrophobine ohne Fusionspartner aus Talaromy- ces thermophilus ist von US 2006/0040349 beschrieben.

Die Herstellung von Fusionsproteinen kann bevorzugt durch gentechnische Verfahren erfol- gen, bei denen eine für den Fusionspartner und eine für den Hydrophobinteil codierende Nukleinsäuresequenz, insbesondere DNA-Sequenz, so kombiniert werden, dass in einem Wirtsorganismus durch Genexpression der kombinierten Nukleinsäuresequenz das gewünschte Protein erzeugt wird. Ein derartiges Herstellverfahren beispielsweise ist von WO 2006/082251 oder WO 2006/082253 offenbart. Die Fusionspartner erleichtern die Herstel- lung der Hydrophobine erheblich. Fusions-Hydrophobine werden bei den genannten gentechnischen Verfahren mit deutlich besseren Ausbeuten produziert als Hydrophobine ohne Fusionspartner.

Die nach dem gentechnischen Verfahren von den Wirtsorganismen produzierten Fusions- Hydrophobine können in prinzipiell bekannter Art und Weise aufgearbeitet und mittels bekannter chromatographischer Methoden gereinigt werden.

In einer bevorzugten Ausführungsform kann das in WO 2006/082253, Seiten 11/12 offenbarte, vereinfachte Aufarbeitungs- und Reinigungsverfahren eingesetzt werden. Hierzu werden die fermentierten Zellen zunächst aus der Fermetationsbrühe abgetrennt, aufgeschlossen und die Zelltrümmer von den Einschlusskörpern (inclusion bodies) getrennt. Letzteres kann vorteilhaft durch Zentrifugieren erfolgen. Schließlich können die Einschlusskörper, beispielsweise durch Säuren, Basen und/oder Detergentien in prinzipiell bekannter Art und Weise aufgeschlossen werden, um die Fusions-Hydrophobine freizusetzen. Die Einschlusskörper mit den erfindungsgemäß verwendeten Fusions-Hydrophobinen können in der Regel schon unter Verwendung von 0,1 m NaOH innerhalb von ca. 1 h vollständig gelöst werden.

Die erhaltenen Lösungen können -ggf. nach Einstellen des gewünschten pH-Wertes- ohne weitere Reinigung zur Ausführung dieser Erfindung eingesetzt werden. Die Fusions- Hydrophobine können aus den Lösungen aber auch als Feststoff isoliert werden. Bevorzugt kann die Isolierung mittels Sprühgranulieren oder Sprühtrocknen erfolgen, wie in WO 2006/082253, Seite 12 beschrieben. Die nach dem vereinfachten Aufarbeitungs- und Reinigungsverfahren erhaltenen Produkte umfassen neben Resten von Zelltrümmern in der Regel ca. 80 bis 90 Gew. % Proteine. Die Menge an Fusions-Hydrophobinen beträgt je nach Fusi- onskonstrukt und Fermentationsbedingungen in der Regel 30 bis 80 Gew. % bezüglich der Menge aller Proteine.

Die isolierten, Fusions-Hydrophobine enthaltenden Produkte können als Feststoffe gelagert werden und zum Einsatz in den jeweils gewünschten Medien gelöst werden.

Die Fusions-Hydrophobine können als solche oder auch nach Abspaltung und Abtrennung des Fusionspartners als „reine" Hydrophobine zur Ausführung dieser Erfindung verwendet werden. Eine Spaltung nimmt man vorteilhaft nach der Isolierung der Einschlusskörper und deren Auflösung vor.

Verwendung einer Mischung aus (A) und (B) zum Verdicken wässriger Phasen

Erfindungsgemäß wird eine Kombination aus mindestens einem wasserlöslichen, verdickend wirkenden Polymer (A) sowie mindestens einem Hydrophobin (B) zum Verdicken wässriger Phasen verwendet. Selbstverständlich können auch Gemische mehrerer verschiedener Polymere (A) und/oder mehrerer verschiedener Hydrophobine eingesetzt werden, vorausge- setzt, es treten keine unerwünschten Effekte auf.

Wässrige Phasen umfassen Wasser oder ein wässriges Lösemittelgemisch. Bei weiteren Lösemittelkomponenten in einem wässrigen Lösemittelgemisch handelt es sich um mit Wasser mischbare Lösemittel handeln, beispielsweise um Alkohole wie Methanol, Ethanol oder Propanol. Der Anteil an Wasser in einem Lösemittelgemisch beträgt in der Regel mindestens 75 Gew. % bezüglich der Summe aller eingesetzten Lösemittel, bevorzugt mindestens 90 Gew. %, besonders bevorzugt mindestens 95 Gew. % und ganz besonders bevorzugt wird ausschließlich Wasser eingesetzt.

Darüber hinaus können die wässrigen Phasen weitere, darin gelöste oder dispergierte anorganische oder organische Komponenten enthalten. Art und Menge weiterer Komponenten richten sich nach der Art der wässrigen Phase. Die Menge aller verdickenden Polymere (A) zusammen wird vom Fachmann je nach der gewünschten Viskosität der Zusammensetzung bestimmt. Sie kann auch von der Art und der molaren Masse des Polymers (A) sowie den sonstigen, in der zu verdickenden wässrigen Phase vorhandenen Komponenten abhängen. Sie beträgt im Regelfalle 0,01 bis 2,5 Gew. % bezüglich der Summe aller Komponenten der Zusammensetzung, bevorzugt 0,1 bis 2 Gew. %, besonders bevorzugt 0,25 bis 1 ,5 Gew. % und beispielsweise 0,5 bis 1 Gew. %.

Die Menge der Hydrophobine (B) wird vom Fachmann je nach der gewünschten Viskosität der Zusammensetzung bestimmt. Sie kann auch von den sonstigen, in der zu verdickenden wässrigen Phase vorhandenen Komponenten abhängen. Die Menge der einzusetzenden Hydrophobin (B) beträgt im Regelfalle 0,1 bis 2,5 Gew. % bezüglich der Summe aller Komponenten der wässrigen Phase, bevorzugt 0,2 bis 2 Gew. % und besonders bevorzugt 0,25 bis 1 Gew. %.

Erfindungsgemäß werden die wasserlöslichen Polymere (A) und die Hydrophobine (B) im Gewichtverhältnis (A) / (B) von 5 :1 bis 1 : 10 eingesetzt. Bevorzugt beträgt das Gewichtsverhältnis (A) / (B) 3 : 1 bis 1 : 2.

Für die erfindungsgemäße Verwendung werden die wasserlöslichen Polymere (A) und die Hydrophobine (B) in den jeweils genannten Mengen und Verhältnissen der zu verdickenden wässrigen Phase zugesetzt. Bevorzugt werden die Komponenten (A) und (B) hierbei jeweils separat in Wasser oder einem wässrigen Lösemittelgemisch gelöst und unter intensivem Mischen jeweils separat der zu verdickenden wässrigen Phase zugesetzt. Die verdickende Wirkung setzt mit dem Vermischen der Komponenten (A) und (B) ein.

Je nach der Art der des Polymers (A) sowie der zu verdickenden wässrigen Phase sind aber auch andere Vorgehensweisen denkbar. Bei Polymeren (A), welche die verdickende Wirkung nur in einem bestimmten pH-Bereich aufweisen, kann man beispielsweise das Polymer (A) und das Hydrophobin (B) miteinander mischen und der wässrigen Phase zugeben, und erst danach den pH-Wert auf den gewünschten Wert einstellen, wodurch sich die gewünschte Viskosität einstellt.

Mittels der Mischung aus wasserlöslichen, verdickend wirkenden Polymeren (A) sowie Hydrophobinen (B) können unterschiedlichste wässrige Phasen verdickt werden. Bei den wässrigen Phasen kann es sich beispielsweise um flüssige Wasch- und Reinigungsmittelformulierungen, wie beispielsweise Waschmittel, Waschhilfsmittel wie bspw. pre-spotter, Weichspüler, kosmetische Formulierungen, pharmazeutische Formulierungen, Nahrungsmittel, Streichmassen, Formulierungen für die Textilherstellung, Textildruckpasten, Druckfarben, Druckpasten für den Textildruck, Anstrichfarben, Pigmentslurries, wässrige Formulierungen zur Schaumerzeugung, Formulierungen für die Bauindustrie, wie beispielsweise Betonmischungen, Formulierungen für die Erdölförderung, wie beispielsweise Bohrspülungen oder Formulierungen zum Acidizing oder Fracturing oder enteisende Mischungen, beispielsweise für Flugzeuge handeln. Bei der erfindungsgemäßen Mischung kann man optional nach dem Verdicken der wässri- gen Phase die verdickende Wirkung wieder abbauen. Hierzu setzt man der wässrigen Phase mindestens ein Agens zu, welches Peptid-Bindungen im Hydrophobin zu spalten vermag. Durch die Spaltung des Hydrophobins wird die verdickende Wirkung je nach der Art der Zusammensetzung zumindest deutlich verringert oder gar aufgehoben.

Die Spaltung kann mittels üblicher chemischer Agentien erfolgen; beispielsweise kann es sich um eine BrCN-Spaltung handeln. In einer bevorzugten Ausführungsform kann man En- zyme zur gezielten Spaltung bestimmter Peptidbindungen einsetzen. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung setzt man Proteasen zum Spalten der Hydrophobine ein.

Diese Ausführungsform kann beispielsweise vorteilhaft im Bereich der Erdölförderung zur Behandlung unterirdischer, erdölführender Formationen einsetzen. Hierzu presst man eine Lösung aus dem wasserlöslichen Polymer (A) und dem Hydrophobin (B) durch ein Bohrloch in die erdölführende Formation ein. Durch diese Druckbehandlung werden neue Risse in der Erdölformation gebildet, durch welche das Erdöl besser aus der Formation zum Bohrloch strömen kann. Eine derartige Behandlung wird auch als „Fracturing" bezeichnet. Nach dem Ende der Behandlung presst man eine Lösung mit dem Agens, welches Peptid-Bindungen spalten kann, bevorzugt eine Protease-Lösung, in die Formation ein. Hierdurch werden die Hydrophobine gespalten, die Viskosität der verdickten wässrigen Phase nimmt wieder ab. Vorteilhaft wird hierdurch vermieden, dass die verdickte wässrige Phase die neu gebildeten Risse verstopft und somit der Erfolg der Fracturing-Behandlung zunichte macht.

In einem weiteren Beispiel kann ein Flugzeug zunächst mit einer erfindungsgemäß verdickten Mischung enteist werden. Nach dem Enteisen kann man die Reste der Mischung mit einem Peptid-Bindungen spaltenden Agens, bevorzugt einer Protease-Lösung behandeln, damit die Reste der enteisenden Mischung nicht das Flugfeld verunreinigen.

Synergistische Verdicker-Zusammensetzung

In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung eine synergistische Zusammensetzung, welche mindestens eine wässrige Phase, 0,01 bis 2,5 Gew. % mindestens eines wasserlösli- chen, verdickend wirkenden Polymers (A), sowie mindestens 0,1 bis 2,5 Gew.% mindestens eines Hydrophobins (B) umfasst, mit der Maßgabe, dass das Gewichtverhältnis (A) / (B) von 5 :1 bis 1 : 10 beträgt, und wobei die Mengenangaben auf die Summe aller Komponenten der wässrigen Phase bezogen sind. Bevorzugte Polymere (A), Hydrophobine (B), Mengen und bevorzugte sonstige Parameter wurden bereits oben erwähnt.

Die erfindungsgemäß verdickten wässrigen Phasen zeigen im Regelfalle ein ausgeprägtes zeitabhängiges Verhalten, d.h. bei Scherung der verdickten wässrigen Phase nimmt deren Viskosität ab. Nach dem Ende der Scherbelastung nimmt die Viskosität der wässrigen Phase wieder zu. Sofern ein verdickend wirkendes Polymer (A) bereits zeitabhängiges Verhalten zeigt, nimmt der zeitabhängige Effekt durch den Zusatz von Hydrophobinen im Regelfalle zu.

Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher illustrieren:

Verwendete verdickende Polymere (A)

Für die Experimente wurden die nachfolgend auggeführten Polymere (A) verwendet. Bei A1 bis A3 handelt es sich um drei verschiedene, handelsübliche alkalilösliche Dispersionen von Acrylaten, bei A4 und A5 um Fällungspolymerisate und bei A6 um ein Biopolymer.

Polymer A1 :

Alkalilösliches Polyacrylat, assoziativ verdickend, wässrige Dispersion, pH ca. 3, Emulsionspolymerisat

Polymer A2:

Alkalilösliches Polyacrylat, wässrige Dispersion, pH ca. 3, Emulsionspolymerisat

Polymer A3:

Alkalilösliches Polyacrylat, wässrige Dispersion, pH ca. 3, Emulsionspolymerisat

Polymer A4:

Handelsüblicher Verdicker auf Basis leicht vernetzer Polyacrylsäure

Polymer A5:

Handelsüblicher Verdicker auf Basis leicht vernetzer Polyacrylsäure

Polymer A6:

Xanthan

Herstellung der verwendeten Hydrophobine (B)

Die Herstellung der verwendeten Hydrophobine erfolgte gemäß der in WO 2006/082253 beschriebenen Prozedur. Es wurde sowohl ein Fusions-Hydrophobin mit dem vollständigen Fusionspartner yaad eingesetzt (yaad-Xa-dewA-his; nachfolgend Hydrophobin A genannt) sowie ein Fusions-Hydrophobin mit einem auf 40 Aminosäuren verkürzten Fusionspartner yaad40-Xa-dewA-his (Hydrophobin B). Die Hydrophobine wurden als wässrige Lösung eingesetzt.

Herstellung der verdickten wässrigen Phasen

Für die Beispiele wurde jeweils eine wässrige Lösung der Hydrophobine (B) vorgelegt und anschließen eine wässrige Lösung des jeweiligen Polymers (A) zugegeben. Die jeweils ver- wendeten Konzentrationen von (A) und (B) in der wässrigen Phase sind in den nachfolgenden Tabellen angegeben. Sofern in der Tabelle angeben, wurde anschließend der pH-Wert der wässrigen Phase auf den angegebenen Wert eingestellt. Die Einzelheiten zu den Versuchen sind in Tabelle 1 zusammengestellt.

Messung der Viskosität

Die Viskosität der wässrigen Lösungen wurde gemäß den Vorschriften DIN 51550, DIN 53018 und DIN 53019 mit einem üblichen Rotationsviskosimeter (Brookfield ^® -Viskosimeter Modell RV-03) bei einer Drehzahl von 20 Umdrehungen pro Minute mit der Spindel Nr. 64 bei 20 ⁰ C gemessen. Die Viskositäten wurden einerseits unmittelbar nach dem Mischen bzw. nach dem Einstellen des pH-Wertes gemessen. Das zeitabhängige Fließverhalten wurde ermittelt, indem -bei laufendem Viskosimeter- die Viskosität in Abhängigkeit der Zeit gemessen wurde.

In Tabelle 1 ist jeweils der anfängliche Wert dargestellt.

Abbildung 1 zeigt die Viskositäten von Lösungen von Polymer A1 bei pH 9 in Abhängigkeit von der Zeit (Kurve 1 : nur 1 ,2 % Polymer; Kurve 2: 1 % Polymer + 0,5 % Hydrophobin Typ A; Kurve 3: 1 % Polymer + 0,5 % Hydrophobin Typ B). Man erkennt eine deutliche Zeitabhän- gigkeit der Viskosität der Mischungen aus Hydrophobin und Polymer A1 , während das Polymer A1 alleine keine Zeitabhängigkeit aufweist.

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Tabelle 1 : Ergebnisse der Versuche und Vergleichsversuche

¹ Bei den Polymeren A1 bis A5 wurde der pH-Wert mithilfe von NaOH auf den Wert eingestellt.

5 ² Visuelle Bewertung des verdickenden Effektes (+ leichte Verdickung, ++ deutliche Verdickung, +++ sehr starke Verdickung)

³ Viskosität unmittelbar nach dem Mischen

Tab. 1 Forts.