Einführung Der insulinabhängige Typ-1-Diabetes (IDDM-Insulin-Dependent Diabetes Mellitus) ist eine komplexe Erkrankung, bei der zel- luläre und humorale Immunprozesse ablaufen, die eine Zerstö- rung der körpereigenen Insulin-produzierenden Beta-Zellen zur Folge haben. Man spricht daher beim Typ-1-Diabetes von einer Autoimmunerkrankung. Es besteht heute kein Zweifel mehr, daß der Typ-1-Diabetes genetisch determiniert ist. Gesichert ist, daß bestimmte Klasse-II-Gene des Haupthistokompatibilitätskom- plexes (MHC), der beim Menschen als HLA (Human Leucocyte Anti- gens) bezeichnet wird, an der Entstehung des Typ-l-Diabetes beteiligt, aber allein nicht ausreichend sind. Diese diabetes- suszeptiblen Klasse-II-Gene, die als IDDM1 bezeichnet werden, erklären nur etwa 40% des Risikos, an einem Typ-1-Diabetes zu erkranken. Daher wurde in den letzten Jahren versucht, chromo- somale Regionen mit diabetogenen Nicht-MHC-Genen zu lokali- sieren. Im Ergebnis dieser Studien wurden bis dato mehr als 17 Nicht-MHC-Gene (IDDM2, IDDM3, IDDM4 etc. ), die auf verschiede- nen Chromosomen kartieren, beschrieben. Mit Ausnahme des IDDM2 und IDDM18, bei denen das diabetogene Gen bekannt ist, sind bei den anderen IDDM's die entsprechenden Gene immer noch un- bekannt (1,2).

Bei der Identifikation dieser Nicht-MHC-Gene sind Modelltiere, die ähnlich dem Menschen einen Typ-1-Diabetes entwickeln, sehr hilfreich. Als Modelltier für den Typ-1-Diabetes ist die spon- tan diabetische BB/O (ttawa) K (arlsburg) -Ratte ausgezeichnet ge- eignet, da dieses Modelltier sowohl klinisch, als auch ätiopa- thogenetisch ein hohes Maß an Analogien zum menschlichen Typ- 1-Diabetes aufweist (3-7). Auch bei der BB/OK-Ratte sind die Klasse-II-Gene des MHC essentiell aber nicht ausreichend für die Diabetesentwicklung. Die BB/OK-Ratte ist homozygot für den MHC-Haplotyp RTlu. Analog dem Menschen wird dieses diabetogene Gen als Iddml bezeichnet. Neben diesem Genkomplex ist bei der BB/OK-Ratte allerdings noch ein weiteres Gen, Iddm2, für die Diabetesentwicklung erforderlich. Es handelt sich dabei um ein Gen (l), daß eine Lymphopenie verursacht, rezessiv vererbt und als Iddm2 bezeichnet wird. Daß beide diabetogenen Gene, Iddml und Iddm2, zwar essentiell aber nicht ausreichend sind, wurde durch verschiedene Kreuzungsstudien unter Nutzung diabetischer BB/OK-Ratten und verschiedener diabetesresistenter Rattenstäm- me belegt (8-11). Gleichgültig, ob diabetesresistente LEW. 1A, DA, SHR oder wilde Ratten (12) mit diabetischen BB/OK-Ratten gekreuzt wurden, entwickelte kein Fl-Hybrid und nur etwa 50% der für beide diabetogenen Gene Iddml und Iddm2 bereits homo- zygoten ersten Rückkreuzungshybriden (R1) einen Typ-1- Diabetes. Der Prozentsatz von 50% an diabetischen Tieren bei den für Iddml und Iddm2 bereits homozygoten Rl-Hybriden weist darauf hin, daß mindestens ein weiteres diabetogenes Gen, Iddm3, für die Entwicklung eines Diabetes bei BB/OK-Ratten notwendig ist. Die genomweite Suche nach diesem dritten Gen in zwei Kreuzungspopulationen, [ (BB x DA) Fl x BB] und [ (BB x SHR) F1 x BB], zeigte, daß dieses"dritte Gen"nicht nur ein Gen ist.

Es wurden zwei diabetogene Gene, Iddm3 und Iddm4, auf Chromo- som 18 bzw. 6 und ein Diabetes-protektives Gen, Iddm5r, auf Chromosom 1 kartiert (13,14). Während Iddm3 in beiden Kreu- zungspopulationen nachgewiesen und damit bestätigt wurde (13), waren Iddm4 und Iddm5r nur bei [ (BB x SHR) F1 x BB] R1-Hybriden nachweisbar (14).

Vergleicht man die homologen Bereiche zwischen Ratte und Mensch, zeigt sich, daß beim Menschen die homologen Regionen für Iddm3 auf 18q21-q23, Iddm4 auf 14q24-q32 und Iddm5r auf 11p15 kartieren. Es handelt sich dabei um Bereiche, bei denen auch beim Menschen die diabetogenen Gene IDDM6 auf 18q21-23 (Iddm3), IDDM11 auf 14q24-q32 (Iddm4) und IDDM2 auf 11p15 (Iddm5r) kartiert wurden (15-17).

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher zunächst, die diabetogenen Gene zu identifizieren und therapeutische Ansätze zur Verhinderung der Typ-l-Diabetes zu formulieren.

Im Rahmen der Erfindung wurde überraschenderweise ein Gen identifiziert, das im diabetesprotektiven chromosomalen Be- reich liegt, dessen mutierte Varianten geeignet sind, im Rat- tenmodell Typ-1-Diabetes zu verhindern. Infolge dieser Er- kenntnis steht damit erstmals ein wichtiger therapeutischer Ansatz für Diagnose und Präventivtherapie von Typ-l-Diabetes zur Verfügung. Darüber hinaus ergeben sich durch weitere, er- findungsgemäß gewonnene Erkenntnisse vielfältige zusätzliche Anwendungsmöglichkeiten, die nachfolgend ebenfalls beschrieben werden.

Vorarbeiten Um zu prüfen, welche Bedeutung die kartierten Iddm's der BB/OK-Ratte tatsächlich bei den Entstehung eines Typ-1- Diabetes haben, wurden verschiedene kongene BB/OK-Rattenlinien etabliert.

Neben den bereits beschriebenen köngenen BB. SHR-Linien (BB. 1K, BB. Sa, BB. LL, BB. Bp2, BB. Xs) wurden zwei weitere BB. SHR-Linien etabliert (18-24). Es wurde ein Bereich von Chromosom 6 (D6Ratl84-Iddm4-D6Rat3, ca. 15 cM) und einer von 18 (Olf- Iddm3-D18Rat44, ca. 24 cM) der BB/OK-Ratte durch den der SHR- Ratten ersetzt (24). Die phänotypische Charakterisierung die- ser neu etablierten BB-Linien, kurz als BB. 6S und BB. 18S be- zeichnet, zeigte, daß die Diabetesinzidenz in beiden Kongenen gesenkt werden konnte, besonders allerdings bei der kongenen BB. 6S-Linie (24). Während ca. 86W aller BB/OK-Ratten einen Typ-l-Diabetes bis zur 32. Lebenswoche entwickeln, erkrankten im gleichen Zeitraum in der neu etablierten BB. 6S-Linie nur 140-. und das, obwohl die BB. 6S-Tiere homozygot für Iddml und Iddm2 sind und im Restgenom der BB/OK-Ratte entsprechen, wie durch einen genomweite Analyse bestätigt wurde (24). D. h. die Wirkung beider essentiellen diabetogenen Gene, Iddml und Iddm2, wird durch ein oder mehr Gen/e auf dem transferierten Bereich der diabetes-resistenten SHR-Ratte nahezu vollständig unterdrückt. Ein Ergebnis, welches bis dato einmalig ist.

Selbst bei der N (on) O (besen) D (iabetischen)-Maus, auch ein Mo- dell für den Typ-1-Diabetes, wurden diabetogene Gene kartiert und analog kongene NOD-Linien etabliert, um den in vivo-Effekt dieser Gene zu prüfen. Eine drastische Senkung der Diabetesin- zidenz wurde durch Austausch eines diabetogenen chromosomalen Bereiches wie bei BB. 6S bis dato nicht beschrieben. Eine ähn- lich deutliche Senkung der Diabetesinzidenz wie bei BB. 6S wur- de nur durch Austausch von 2 und mehr chromosomalen Regionen der NOD durch die diabetes-resistenten Stämme erreicht (25-28).

Unterschiede zwischen BB/OK-und BB. 6S-Ratten wurden auch beim Manifestationsalter und bei den Lymphozytenphänotypen nachge- wiesen. BB. 6S-Ratten manifestieren signifikant später (137 14 vs. 103 30 Tage, p<0,001) und haben signifikant weniger aktivierte T-Lymphotzyten als BB/OK-Ratten (36,6 6,9 vs.

65,6 18, 4 %, p<0,0001) (24). Darüber hinaus werden BB. 6S- Ratten signifikant schwerer und haben signifikant höhere Serumcholesterolwerte als BB/OK-Ratten (24).

Da auch bei der SHR-Ratte immunologische Phänomene beschrieben wurden (29-31), wurde die drastische Senkung der Diabetesinzi- denz von 86% bei BB/OK auf 14 bei BB. 6S zunächst in der Weise interpretiert, daß in der transferierten Region ein SHR-Gen oder SHR-Gene lokalisiert ist/sind, dessen/deren Produkt/e die Autoaggression der diabetogenen Genprodukte der BB-Ratte weit- gehend"neutralisieren"kann/können. Diese Annahme wurde durch die Etablierung einer weiteren kongenen BB/OK-Rattenline un- terstrichen.

Neben diabetesresistenten SHR-Ratten wurden auch Wildfangrat- ten zur Erzeugung von kongenen BB. K (arlsburg) W (ild) R (atte)- Ratten verwendet. Analog der BB. 6S-Linie wurde der gleiche chromosomale Bereich der BB/OK von 15 cM durch den von Wild- fangtieren ausgetauscht (BB. 6W). Die Erkrankungshäufigkeit in dieser kongenen BB. 6W-Linie ist mit der der BB/OK-Ratte ver- gleichbar (89% vs. 86%, 32). Daher wird erfindungsgemäß davon ausgegangen, daß die Diabetes-Protektion bei BB. 6S das Ergeb- nis einer"neutralisierenden"Genwirkung der SHR-Ratte und nicht dem Ersatz von Iddm4 der BB/OK-Ratte anzulasten ist.

Die Identifikation der/des Gene/s war somit angezeigt, denn mit der Identifikation des/der Gens/Gene ist die Möglichkeit verbunden, eine genspezifische Behandlung und/oder Prävention des Typ-1-Diabetes bzw. von Autoimmunerkrankungen per se vor- nehmen zu können.

Fortführende Arbeiten zur Identifikation des/der diabetespro- tektiven Gens/Gene Nach der Entschlüsselung des menschlichen Genoms (ca. 40.000 Gene) geht man heute davon aus, daß etwa 15-20 Gene pro cM und nicht wie bisher angenommen 50 Gene lokalisiert sind. Ausge- hend von dieser Annahme sollten in dem transferierten chromo- somalen Bereich der BB. 6S-Ratte von ca. 15 cM etwa 225-300 Ge- ne kartieren. Angesichts dieser Zahl ist die Identifikation von möglichen Kandidatengenen für eine Diabetesprotektion ein aussichtsloses Unterfangen, weshalb subkongene BB. 6S-Ratten erzeugt wurden, um den chromosomalen Bereich mit der diabete- sprotektiven Wirkung weiterhin einzugrenzen.

BB. 6S-Ratten wurden mit diabetischen BB/OK-Ratten gekreuzt.

Die resultierenden FI-Hybriden für den Bereich auf Chromosom 6 wurden untereinander gepaart (intercross) und genetisch analy- siert, wobei das Markerspekrum erweitert wurde, um möglichst Rekombinationen in kleinen Bereiche erkennen zu können : <BR> D6Rat3-D6Ratl-D6wox13-D6Rat101-Ighe/Ckb-D6Mgh2-D6Rat94-<B R> D6Ratl83-D6Ratl0-D6Rat7-D6Rat75-D6Rat9-D6Rat6-D6Ratl60-D6Mgh 9-<BR> D6Ratl84.

Die Zuordnung der Linien mit Diabetesprotektion erfolgte nach der Erkrankungshäufigkeit. Erkrankten bereits mehr als 50% der Nachkommen einer subkongenen Linie vor dem 100. Lebenstag, sprach dieser Phänotyp für den der BB/OK-Ratte und die Linie wurde eliminiert. Erkrankten weniger als 15% bis zum 100. Le- benstag, zeigte diese Linie den Phänotyp von BB. 6S. Diese Li- nien wurden für die Weiterzucht zwecks Minimierung der Diabe- tes-protektiven Region eingesetzt. Durch die Etablierung ver- schiedener subkongener Linien (BB. 6Sa, b, c.. ) mit dem Phänotyp der BB. 6S-Ratte, wurde der in Frage kommende chromosomale Be- reich auf < 2 cM (30-40 Gene) eingegrenzt.

Wie nachfolgend dargestellt, kartiert das diabetesprotektive Gen um den Locus D6Mgh2.

Tabelle 1 : cM BB. 6S BB. 6a BB. 6b BB. 6c BB. 6d BB. 6e BB. 6f D6Mgh4 BB BB BB BB BB BB BB 2. 1 D6Ratl3 BB BB BB BB BB BB BB 4.4 D6Wox5 BB BB BB BB BB BB BB 1.5 D6Rat66 BB BB BB BB BB BB BB 2.0 D6Ratl84/D6M SHR BB BB BB BB BB SHR gh9 0. 8 D6Ratl60 SHR BB BB BB BB BB SHR 1. 3 D6Rat6 SHR BB BB BB BB BB SHR D6Rat9 SHR BB BB BB BB BB SHR 0. 4 D6Rat75 SHR 0. 4 D6Rat7 SHR BB BB BB BB BB SHR 2. 1 D6RatlO SHR BB BB BB BB BB SHR 1.6 D6Ratl83 SHR BB SHR BB BB BB SHR 0. 4 D6Rat94 SHR BB SHR BB BB BB SHR 1.9 D6Mgh2 SHR SHR SHR BB BB BB SHR Ighe SHR SHR BB SHR SHR SHR SHR 1.7 Ckb/D6RatlO1 SHR SHR BB SHR SHR BB SHR 1. 0 D6Ratl SHR SHR BB BB BB SHR BB 1. 9 D6Rat3 SHR SHR BB BB SHR SHR BB Diabetesin-15 10% 22% >50% >50W >50% 14% zidenz Der Locus D6Mgh2 ist ein Mikrosatellit im Efl-Gen. Efl ist ein Pseudogen und kartiert beim Menschen auf Chromosom 14q32 und bei der Maus auf Chromosom 12q14. Nach Angaben der Chromoso- menkarte von Watanabe et al. (33) soll auf Chromosom 6q32 der Ratte auch das Gen Macs kartieren (http ://ratmap. ims. u- tokyo. ac. jp). Dieses Gen ist aber beim Menschen auf Chromosom 6q21-6q22.2 und nicht auf 14q32 lokalisiert worden. Falls dies zutreffen würde, bedeutet es, daß 6q32 der Ratte sowohl homo- log zum humanen Chromosom 14q32, als auch 6q21-6q22.2 sein kann. Zwecks Kandidatengensuche war es notwendig, abzuklären, ob Macs tatsächlich auf dem Rattenchromosom 6q32 kartiert.

Durch einen Polymorphismus im Macs-Gen (zwischen 901 und 1321, KWR hat 1 Aminosäure mehr) zwischen BB/OK und Wildfangtieren (KWR) wurden die Sequenzen zwischen BB/OK, KWR und BB. KWR (Chr. 6 ; BB. 6W) verglichen. Alle BB. 6W-Tiere zeigten den Geno- typ der BB/OK-Ratte. Dadurch konnte ausgeschlossen werden, daß Macs auf Chromosom 6q32 der Ratte lokalisiert ist und damit ein Kartierungsfehler vorliegt. Dadurch konnte die Kandidaten- gensuche durch Homologievergleiche auf 12q13 der Maus und 14q32 des Menschen beschränkt werden.

Da im diabetesprotektivem Bereich auch das Gen Aktl/Pkb kar- tiert, welches essentiell für die ß-Zellfunktion ist (34,35), wurde zunächst versucht, Aktl/Pkb relativ genau in der Region zu positionieren. Da BB/OK und SHR polymorph sind (Intron zwi- schen 1321 und 1561), konnte mit Hilfe der subkongenen BB. 6S- Linien Aktl/PKB zwischen Ighe und Ckb, also außerhalb der dia- betesprotektiven Region, kartiert werden. Damit schied dieses Gen als möglicher Kandidat aus.

Durch die parallel laufende in vivo-Charakterisierung der . BB. 6S-Ratten im Vergleich zum Parentalstamm BB/OK wurden wei- tere Erkenntnisse zur Funktion des möglichen Kandidatengens gewonnen : 1. Morphologische Untersuchungen des Pankreas von normoglykä- mischen BB/OK-und BB. 6S-Ratten zeigten signifikante Unter- schiede auf. Im Alter von 30 Tagen waren bei BB. 6S signifi- kant mehr Langerhanssche Inseln mit Lymphozyten infiltriert (Insulitis) als bei BB/OK. Bei jeweils 12 untersuchten BB. 6S bzw. BB/OK waren 51,2 4, 6% bzw. 7,5 2, 5 (p<0,001) der Inseln infiltriert. Im Alter von 90 Tagen war der Prozentsatz an Inseln mit Insulitis zwischen beiden Stämmen vergleichbar und lag bei etwa 50% (37). Demnach tritt sowohl bei BB/OK als auch bei BB. 6S eine Insulitis auf, die bei BB/OK bei etwa 86% der Tiere und bei BB. 6S nur bei etwa 14% zur Zerstörung der Beta-Zellen und damit zum Typ-1-Diabetes führt, was für die Induktion einer Immunto- leranz bei BB. 6S sprechen könnte.

Signifikante Unterschiede fanden sich auch zwischen frisch- manifestierten, diabetischen BB/OK und BB. 6S im Insulinge- halt und Prozentsatz Insulin-positiver ß-Zellen. Im Ver- gleich zu diabetischen BB/OK war der Insulingehalt (0,15 + 0,03 vs. 0,42 + 0.13 pmol/mg, p<0, 05) und der Prozentsatz Insulin-positiver ß-Zellen (0,07 0,02 vs. 0,19 0, 06%, p<0,05) signifikant niedriger als bei diabetischen BB. 6S, was dafür sprechen könnte, daß die Zerstörung der Insulin- produzierenden ß-Zellen nicht so aggressiv wie bei BB/OK- Ratten abläuft (37).

2. Untersuchungen zur Frakturheilung bei BB/OK-und diabetes- resistenten LEW. lA-Ratten (38) zeigten, daß der Knochen der BB/OK-Ratte deutlich brüchiger als der von LEW. lA-Ratten war, was auf eine mögliche Störung im Calcium-Stoffwechsel der BB/OK hinwies. Verschiedene Untersuchungen zum Calcium- Stoffwechsel ergaben allein signifikante Unterschiede im Serumcalcitoningehalt zwischen BB/OK und BB. 6S-Ratten. Si- gnifikant höhere Calcitonwerte wurden bei BB/OK als bei BB. 6S nachgewiesen (2,4 1,57 vs. 1,0 0,65 pmol/ml ; p=0,0002). Da Calcitonin nicht nur die Calcium-Freisetzung des Knochens hemmt, sondern ebenso über verschiedene Protei- ne und Rezeptoren die Insulinsekretion hemmen kann (39,40), wurde versucht, durch Modulation der Calcium-Zufuhr über die Nahrung von BB/OK und BB. 6S einen weiteren Hinweis zum Zu- sammenspiel von Calcium (Ca) und Diabetesmanifestation zu erhalten.

BB/OK und BB. 6S-Ratten wurden mit Standarddiät (0, 8% Ca), mit Ca-reicher (2-e) und Ca-armer Diät (0, 4W) ernährt und bis zur 30. Lebenswoche auf Diabetesentwicklung beobachtet. Wäh- rend bei BB/OK-Ratten kein Einfluß der Diät auf die Erkran- kungshäufigkeit nachweisbar war (Kontrolle=88% ; Ca-arm=92% ; Ca-reich=90%), erkrankten bei BB. 6S-Ratten signifikant mehr Tiere an einem Diabetes, wenn sie mit Ca-reicher Diät er- nährt wurden (Kontrolle=12% ; Ca-arm=18% ; Ca-reich= 45%, p=0. 02). Darüber hinaus führte die Ca-reiche Ernährung zur Angleichung der Körpermasse und des Serumcholsterolgehaltes bei BB/OK und BB. 6S. Signifikante Unterschiede zwischen bei- den Linien traten bis zur 30. Lebenswoche nicht auf. Weitere in vivo-Manipulationen, wie Verabreichung von Ca-Kanal- Blockern oder verschiedenen Ca-Antagonisten, ergab keinerlei in vivo-Effekte.

3. In vitro Untersuchungen an isolierten Langerhansschen In- seln von BB/OK-und BB. 6S-Ratten zeigten, daß durch Varia- tion der Ca-Konzentration im Kulturmedium weder der Insulin- gehalt, noch die glukosestimulierte Insulinsekretion zwi- schen beiden Linien differierte.

Signifikante Unterschiede fanden sich jedoch bei der Protei- nexpression mittels Westernblottanalyse. Das Ca-bindende Protein, Calbindin-D28k, war in Inseln von BB. 6S-Ratten be- reits unter Basalbedingungen doppelt so hoch wie das von BB/OK-Ratten. Zunehmende Ca-Konzentration im Medium erhöhte deutlich die Proteinexpression von Calbindin-D28k bei BB. 6S- Inseln während die Expression bei BB/OK-Ratten durch Ca fast unbeeinflußt blieb. Calbindin-D28k ist ein cytosolisches Ca- bindendes Protein, welches bevorzugt in der Niere, aber auch im Pankreas und Gehirn exprimiert wird und den apoptotischen (gengesteuerten) Zelltod verhindern kann (41,42). Funktional wird vermutet, daß Calbindin-D28k bei der Regulation der Ca- Reabsorption beteiligt ist.

Da das Kandidatengen 1. die zwei essentiellen diabetogenen Gene, Iddml und Iddm2, nahezu ausschalten kann, 2. bei der Immuntoleranz und beim apoptotischen Zelltod, 3. als auch bei der Regulation von Ca, Ca-bindenden Proteinen (Calbindin-D28k u. a. ) und Hormonen (Calcitonin, u. a.), 4. bei der Entstehung einer Dyslipidämie involviert ist, wurde der Schluß gezogen, daß das Gen ein multifunktioneller Transkriptionsfaktor ist.

Das Kandidatengen Nach Homologievergleichen und Genfunktionsprüfungen wurde der Transkript-ionsfaktor Yin Yang-1 (YY1), der mit hoher Wahr- scheinlichkeit in der diabetesprotektiven Region bei Mensch und Maus kartiert, im Rahmen der vorliegenden Erfindung als Kandidatengen favorisiert, denn er kann die Transkription ei- ner großen Anzahl von zellulären und viralen Genen aktivieren, aber auch hemmen bzw. kann selbst Transkription initiieren und entspricht damit einem multifunktionellem Transkriptionsfak- tor.

YY1 gehört zu der Klasse der regulatorischen Transkriptions- faktoren (RTF), d. h. die Bindung erfolgt sequenzspezifisch an proximale und distale Regulationselemente der DNA. Darüber hinaus besitzt er die Fähigkeit, direkt oder indirekt einen Einfluß auf die Transkriptionmaschinerie zu nehmen. Durch sei- nen vielseitigen molekularen Strukturaufbau (Aktivierungsdomä- ne, Repressionsdomäne, Zinkfingerstrukturen) ist es ihm mög- lich, eine differentielle Genaktivität durchzuführen. Das heißt, er kann als zeitlicher, räumlicher, zellspezifischer, organspezifischer oder signalvermittelnder Parameter fungie- ren. Seine Funktionsmodule erfüllen die Aufgaben der spezifi- schen DNA-Erkennung, der Transkriptionsaktivierung, Transkrip- tionsrepression, aber auch die Interaktion mit anderen Protei- nen.

Genaufbau-Vergleich Das Protein von Yin Yang ist gekennzeichnet durch die lokale Anhäufung von Aspraginsäure (D) und Glutaminsäure (E) zwischen den AS-bereichen 43 bis 53. Der Abschnitt ist homolog zw. Rat- te und Mensch, jedoch unterscheidet sich die Anzahl und die Position von E und D voneinander. Die Ratte besitzt 5 x E und 6 x D, wobei der Mensch über 6 x E und 5 x D verfügt. Daran schließt sich ein Histidin-Cluster bei der Ratte von 54 bis 79 und beim Menschen von 54 bis 82 an. Es fehlen 3 Histidine bei der Ratte gegenüber der humanen Seqeuenz. Es folgt eine GA/GK reiche Domäne von 154 bis 198 beim Menschen. Bei der Ratte ist dieser Positionsbereich um 3 AS-Positionen in Richtung N-ter- minales Ende versetzt. (151-195). Die vier Zinkfinger der hu- manen Sequenz beginnen an Position 298 und enden an Position 407. In der Rattensequenz erstreckt sich dieser Bereich von 295 bis 404. Die gesamte AS-Länge beträgt beim Menschen 414 und bei der Ratte 411 AS (s. Sequenzprotokoll : SEQ ID NO : 2 und 4 ; die Bezeichnung"SEQ ID NO :" entspricht hier und im folgen- den der Sequenzkennzahl"<400>"nach WIPO Standard ST. 25).

Funktionelle Domänen Viele Forschergruppen haben die Struktur und Funktion von YY1 mit Hilfe von Deletionsmutantan, sowie mit Reporterkonstrukten analysiert. Diese Ergebnisse sind in Fig. 1 zusammengefaßt.

Übereinstimmend wurden zwei Aktivierungsdomänen gefunden. Sie sind im Bereich des N-terminalen Endes und in der Region des Zinkfingers lokalisiert. Darüber hinaus konnten von zwei Grup- pen weitere Domänen mit aktivierender Funktion in der Nähe des C-Terminus lokalisiert werden (397-414 und 370-397) (43,44).

Man argumentierte die Maskierung der N-terminalen Aktivie- rungsdomäne durch die C-terminale Domäne, sowie daß bei Dele- tion der C-terminalen Domäne die N-terminale Domäne demaskiert wird, so daß YY1 als konstitutiver Aktivator agieren kann.

Diese Ergebnisse führten zu dem Schluß, daß nur unter bestimm- ten Bedingungen YY1 zum Aktivator wird. Es zeigte sich, daß das E1A in der Lage war, Yin Yang in einen Aktivator umzuwan- deln (43).

Repressionsdomänen konnten für den Zinkfingerbereich lokali- siert werden. Dabei werden dem Zinkfinger 1 und 2 die Repres- sionsaktivität zugesprochen, wobei Zinkfinger 2 und 3 für die DNA-Bindung zuständig sein sollen (45). Bei Betrachtung der Röntgen-Cokristallstruktur von Zinkfinger 2 und 3 stellte man im Gegensatz dazu fest, daß diese in der Lage waren, an den Basen, sowie an das Phosphatrückgrat der DNA anzugreifen (46).

Für den Zinkfinger 1 konnten Kontaktstellen nur für das Phos- phatrückgrat und für Zinkfinger 4 nur für einige wenige Basen gezeigt werden.

Weitere Repressionsdomänen zeigten sich überlappend mit der Aktivierungsdomäne an den Positionen von 1 bis 201, sowie von 170 bis 200 (47,48).

Die Interpretation dieser Ergebnisse von Thomas et al. (49) zeigten zusammenfassend, daß sich nur zwei Repressionsdomänen im YY1 Gen befinden, im Bereich von 170 bis 200 und in der Zinkfingerregion, die vielleicht zusammen interagieren können (vgl. Fig. 1).

Protein/Protein Interaktionen Yin Yang ist imstande, mit Proteinen, wie Transkriptionsfakto- ren und Coaktivatoren/Corepressoren zu interagieren. Zwei Do- mänen, die interagieren sind die Bereiche um 150 bis 170 (zen- trale Domäne), in denen die GA/GK reiche Domäne mit Teilstük- ken des Spacers, sowie die C-terminale Region und die Zinkfin- ger mit Teilen des Spacers lokalisiert sind.

Einige Proteine, wie TBP, CBP/p300, TFIIB, E1A und c-MYC kön- nen an beide Regionen binden (43,45, 47,50, 51). Proteine, die nur mit einer dieser zwei Domänen interagieren können, sind : HDAC2 (zentrale Domäne), SP1 und ATF/CREB (C-terminale Domäne) (45,48, 52-54) (vgl. Fig. 2).

Galvin and Shi demonstrierten (45), daß die Repression von CREB und SP1 durch YY1 aktivator-spezifisch ist. Die Autoren prostulierten, daß YY1 die Target (s) der Aktivatoren interfe- riert, anstelle von direkter Bindung zu diesen zwei Faktoren.

Nur ein Protein, ElA, wurde bisher gefunden, welches direkt mit der Aktivierungsdomäne von YY1 interagiert (43,47, 55).

Seit dieser Entdeckung wird diskutiert, ob YY1 seine Repres- sorfunktion in Richtung Aktivator auch verändern kann, mögli- cherweise durch Maskierung seiner Repressionsdomänen über Mo- difizierung, oder aber über Freilegung seiner Aktivierungsdo- mäne.

Promotorbindung Ausgezeichnet durch vier Cys2-His2-Zinkfinger ist Yin Yang in der Lage, entweder die Transkription zu aktivieren oder zu in- hibieren, was jedoch von der Promotorsequenz der Gene und von der Konzentration des YY abhängig ist. Die Consensus-Sequenz (C/t/a) CATN (T/a) (T/g/c), die in vielen Promotoren von viralen und zellulären Genen zu finden ist, kann über den Zinkfinger gebunden werden (56).

Repressionsmodelle Neben der geregelten Aktivierung der Transkription stellt auch dessen Repression einen wichtigen Kontrollmechanismus der Gen- aktivität dar. Repression durch Umkehrung bzw. Aufhebung gen- aktivierender Prozesse kann durch YY1 bewirkt werden. Im YY1- Genabschnitt wurden mehrere Repressionsbereiche gefunden (sie- he Fig. 3).

Drei Modelle der Repressoraktivität sind bis zum heutigen Stand bekannt. Im ersten Modell deplaziert YY1 den Aktivator.

Störende Eigenschaften weist er im zweiten Modell auf. Er be- hindert den Aktivator, sowie die generellen Transkriptionsfak- toren (GTF) in der Ausübung ihrer Funktion.

Eine indirekte Repression (Drittes Modell) führt YY1 über die Rekrutierung von Corepressoren aus. Er nimmt indirekten Ein- fluß auf die Chromatinstruktur (49). Von besonderem Interesse sind dabei die HDAC 1, 2 und 3, als Corepressoren. HDAC's ste- hen im Zusammenhang mit Auflockerung der Chromatinstruktur.

Alle drei Proteine sind globale Regulatoren der RPD3, d. h. sie sind in der Lage, Histone zu deacetylieren (in vitro). Außer- dem können die HDAC bei Dirigation zum Promotor direkt die Transkription blockieren (48,57-60). Bei Überexpression von HDAC 2 konnte durch die Gruppe Yang et al. (48) gezeigt wer- den, daß die Repressionsfunktion von YY1 verstärkt wird. Durch die Entdeckung, daß HDAC 2 im Komplex mit HDAC 1 arbeitet, muß das gleiche auch für HDAC 1 gelten.

Aktivierungsmodelle Drei Modelle sind bekannt, wie Yin Yang die Transkription ak- tiviert (siehe Fig. 4). Direkte Aktivierung konnte mit Hilfe des Adenovirus Protein E1A von der Gruppe Shi et al (61) ge- zeigt werden. Stimulation der Transkription wird erreicht durch die direkte Interaktion YY1 mit den GTF : TAFII55, TBP und TFIIB (62,63). Der zweite Mechanismus konnte am AAV P5 In- itiator Element aufgeklärt werden (64). Darüber hinaus wird diskutiert, ob YY1 eine strukturelle Veränderung durchmacht, wenn er mit anderen Proteinen interagiert. Im dritten Modell rekrutiert Yin Yang Coaktivatoren, die mit anderen Transkrip- tionsfaktoren interagieren. Dieses Modell beinhaltet viel- leicht auch die Modifikation des Chromatin durch p300. Durch die Auflockerung der Chromatinstruktur mittels p300 (HAT- Aktivität), wäre der Zugang zur DNA erleichtert und eine effi- ziente Bindung möglich (51,55, 65).

Regulation von YY1 durch Acetylierung und Deacetylierung : Die Regulation des Transkriptionsfaktors erfolgt auf der post- translationalen Ebene durch die Interaktion mit anderen Pro- teinen.

Die Transkriptionsaktivatoraktivität von YY1 ist direkt abhän- gig von der Assoziation zu den Coaktivatoren p300, CBP, sowie PCAF. Diese Coaktivatoren besitzen Histon-Acetyltransferase (HAT) und sind somit befähigt, Acetylgruppen zu transferieren.

Im Gegensatz dazu ist die Repressionsaktivität von YY1 assozi- iert mit der Histon-Deacetylase2 (HDAC2) im Bereich 170-200 der Repressionsdomäne.

Die selektive Assoziation von YY1 mit HAT oder HDAC entschei- det darüber, ob er als Aktivator oder Repressor fungiert.

Acetylierung und Deacetylierung durch p300, PCAF und DHAC : Yin Yang verfügt über 2 Acetylierungsdomänen. Die erste liegt im Bereich zwischen 170 bis 200, die Zweite überlappt den Zinkfingerbereich am C-terminalen Ende zwischen 261-414.

Die Acetylierungen im Bereich 170 bis 200 werden durch p300 und PCAF an den Lysin-Resten durchgeführt. Sechs Paare an Lysinen befinden sich in der ersten Domäne, wobei aber nur 3 verschiedene Lysine durch p300 und PCAF acetyliert werden. Um eine maximale Repressionsaktivität zu erhalten, muß YY1 an al- len drei Stellen acetyliert werden. Würde nur ein Lysin durch ein Arginin ersetzt werden, wäre keine maximale Repressionsak- tivität mehr gewährleistet, aufgrund der eintretenden Konfor- mationsveränderung.

Ein weiterer, entscheidender Punkt der Acetylierung zwischen 170 bis 200 ist, daß sich die Bindungswahrscheinlichkeit von DHAC signifikant erhöht und somit in diesem Bereich auch eine Deacetylierung durch HDAC 1,2 erfolgen kann.

Erstaunlicherweise ist es HDAC auch möglich, in dem zweiten Acetylierungsbereich (261-333) zu binden. Im Gegensatz zur er- sten Acetylierungsdomäne findet hier jedoch keine Deacetylie- rung statt.

Weiterhin konnte gezeigt werden, daß sich durch die Acetylie- rung von PCAF im überlappenden Bereich des Zinkfingers (261- 333) die DNA-Bindungsaktivität von YY1 erniedrigt (66).

Feinkartierung von YY1 Da die Sequenz der Ratte bis Dezember 2002 noch nicht in der Genbank vorhanden war, wurde erfindungsgemäß die Gensequenz der Maus benutzt, um Primer zu rekrutieren, denn die erste Aufgabe bestand in der Feinkartierung von'YY1. Es mußte si- chergestellt werden, daß das Gen tatsächlich im diabetespro- tektiven Bereich liegt.

Da die Chance, im Intron einen Polymorphismus zu finden, recht groß ist, wurden Primer zur Amplifikation der Introns verwen- det (-vgl. Fig. 11 ; Intron 1 : K828-F/K829-R ; Intron 2 : K830- F/K832-R ; Intron 3 : K831-F/K833-R ; Intron 4 : K815-F/K817-R ; K815-F/K875 ; K821-F/K817-R ; K821-F/K870-R ; K874-F/K870-R). Es wurde nur ein sequenzierbares Genprodukt mit genomischer DNA vom Intron 4 erhalten. Das Intron hat 633 Basenpaare (bp) und unterscheidet sich zwischen BB-und SHR-Ratten an den Positio- nen 323 (t-a), 502 (g-c) und 528 (a-c). Zur genauen Positio- nierung von YY1 auf Chromosom 6q32 wurde dieser Polymorphismus unter Verwendung der subkongenen BB. 6S-Linien benutzt. YY1 wurde zwischen D6Mgh2 und Ighe kartiert und befindet sich so- mit im diabetesprotektiven Bereich.

Um zu prüfen, ob der Polymorphismus im Intron 4 auch bei an- deren Stämmen vorkommt oder weitere Unterschiede auftreten können, wurde das Intron 4 von folgenden Ratten sequenziert und verglichen : 2 Wildfangtiere (Wildtyp, M+W), jeweils 1 Tier von diabetes-resistenten, ingezüchteten DA/K, BN/Mol, LEW/K und WOKW-Ratten.

WOKW-Ratten entwickeln keine Hyperglykämie (=Diabetes), aber ein komplettes metabolisches Syndrom (Fettsucht, Hyperinsu- linämie, Dyslipidämie, gestörte Glukosetoleranz, Hypertonie) und stammen wie BB/OK-Ratten aus der gleichen Wistarratten- Auszuchtpopulation der BioBreeding Laboratories, Ottawa, Cana- da (67,68).

Im Ergebnis zeigte sich, daß die Intronsequenz zwischen BB/OK und Wildfangtieren, sowie zwischen SHR und DA, BN, LEW. 1W, als auch WOKW identisch ist.

Sequenzierung von YY1 Sowohl genomische als auch cDNA wurde mittels PCR unter Ver- wendung verschiedener Primer so amplifiziert, daß überlappende Genprodukte zur Sequenzierung zur Verfügung standen (vgl. Fig.

11 ; Promotor : K823-F/K825-R* ; Promotor und Exon 1 : K884- F/K806-R ; Exon 1 : K801-F/K804-R ; K814-F/K832-R* ; Exon 2 und 3 : K828-F/K833-R ; K831-F/K817-R ; Exon 4 : K815-F/K870-R ; K815- F/K818-R ; K816-F/K819-R ; K834-F/K836-R). Die PCR und Sequen- zierung wurden wie im Material & Methoden-Teil (M&M) beschrie- ben durchgeführt.

Das YY1-Gen der Ratte umfaßt 1236 Basenpaare (bp) und besteht aus 411 Aminosäuren (AS), was von Nishiyama et al. 2003 bestä- tigt wurde (69). Sequenzunterschiede zwischen BB/OK und SHR bzw. BB. 6S wurden an Position 603 (c-t), 980 (t-g) und 1004 (g-a) nachgewiesen (vgl. SEQ ID NO : 1 und 3). Dieser Basenaus- tausch führt zur Änderung der Aminosäuren an Position 303 und 311 im Zinkfingerbereich (vgl. SEQ ID NO : 2 und 4). Bei BB/OK- Ratten kodieren die AS Methionin (Nukleotide 907-910 ab Start- codon) und Arginin (Nukleotide 931-933 ab Startcodon) und bei SHR-Ratten die AS Arginin und Lysin.

Der Promotorbereich wurde nur teilweise vom Transkriptions- start (-72) sequenziert, wobei noch ein Bereich von 470 bp mit der GC-Box vorliegt. Unterschiede zwischen BB/OK und SHR waren nicht nachweisbar.

Nach Sequenzvergleichen mit der Maus sollte der Promotorbe- reich ca. 891 bp vom Transkriptionsstart entfernt sein (Acc : L13969,1-464, 86% Homologie). Beim Vergleich mit der Humanse- quenz (Acc : AF047455 Promotor in dieser Sequenz nur-42bp) wa- ren Übereinstimmungen zwischen-636 bis-585 (216-269 ; 47/54 ; 87W Übereinstimmung) und-464 bis-392 (392-464 ; 64/73 ; 87%) Basen vom Transkriptionsstart zu finden.

Sequenzvergleich der Nukleinsäure und des Proteins zwischen Ratte und Mensch Der Sequenzvergleich zwischen BB/OK-, SHR-Ratte und Mensch, wie in Fig. 9 und 10 zusammengestellt, zeigten eine bp- Übereinstimmung von 95, 6% bzw. 95, 3% und die AS von 96,9 bzw.

96, 4%. Berücksichtigt man die Tatsache, daß der Ratte 3 AS fehlen (3 Histidine, 1 x zwischen Aktivierungs-und erster Re- presssionsdomäne, Position 66 beim Menschen und 2 in der er- sten Repressionsdomäne, statt 12 Histidinen hat die Ratte nur 10), erhöht sich die Übereinstimmung im codierenden Bereich zwischen Ratte und Mensch bei den bp auf 97,0 (1206/1239) bzw.

96, 8W (1200/1239) und bei den AS auf 97, 6% (401/411) bzw.

97, 1% (399/411). Im Zinkfinger, der 330 bp und 110 AS umfaßt, stimmen bei der BB/OK-Ratte 99% der bp (327/330) und AS (109/110) und bei SHR-Ratten 98% der bp (325/330) und 97, 3% (107/110) der AS überein.

Genexpressionsstudien Um zu prüfen, inwieweit die Sequenzunterschiede eine Auswir- kung auf die Genexpression von YY1 haben, wurden Genexpressi- onsstudien durchgeführt.

Es wurde mRNA aus isolierten Langerhannschen Inseln, Pankreas, Leber, Gehirn, Thymus und Milz von 8 Tage alten Ratten der In- zuchtstämme BB/OK, SHR, BB. 6S und LEW ("unbelastete"Kontrol- le) gewonnen, in ssDNA umgeschrieben und für die Genexpressi- onsstudien eingesetzt (vgl. Material&Methoden-Teil).

Es wurde wiederholt gezeigt, daß der YY1-Zinkfingerbereich un- ter Verwendung der Primer K831-F/K818-R und K831-F/K870-R in isolierten Langerhansschen Inseln der BB/OK-Ratte bzw. LEW- Ratte stark- (YYl-Zinkfinger/GPDH-Intensität = 0. 19 0.04) und signifikant erniedrigt in den von SHR-und BB. 6S-Ratten expri- miert ist (YY1-Zinkfinger/GPDH-Intensität = 0. 03 0.02 ; p<0.001). Im Pankreas zeigte sich ein ähnlicher Expressionsun- terschied, jedoch etwas abgeschwächt. Die Untersuchung der Ex- pression unter Verwendung der Primer K831-F und K870-R zeigte, daß im Pankreas, der Leber und im Gehirn bei BB. 6S-Ratten eine zweite, um ca. 150 bp kürzere Bande auftrat, die weder bei BB/OK noch bei SHR und LEW zu beobachten war. Interessant war auch die Tatsache, daß Geschlechtsunterschiede in der Genex- pression auftraten. Die Expression bei männlichen Tieren war stets stärker als bei Weibchen. In allen anderen untersuchten Organen wird YY1 exprimiert. Augenfällige Unterschiede zwi- schen den Stämmen, außer zwischen männlichen und weiblichen Tieren, wurden nicht beobachtet.

Sequenzierung der zweiten Bande bei BB. 6S Da eine zweite Bande nur bei BB. 6S-Ratten im Pankreas, in der Leber und im Gehirn auftrat, wurde diese zweite Bande eluiert, amplifiziert und sequenziert (vgl. M&M). Im Ergebnis zeigte sich, daß diese Bande eine verkürzte Zinkfingersequenz ist (vgl. Fig. 12 und SEQ ID NO : 7). Danach fehlt ein Teil vom Zinkfinger 1, und Zinkfinger 2 fehlt vollständig (967 bis 1125 ; vgl. SEQ ID NO : 8).

Schlußfolgerungen Da gezeigt werden konnte, daß l. YY1 als multifunktioneller Transkriptionsfaktor im diabete- sprotektivem Bereich kartiert, 2. Sequenzunterschiede mit Änderung der AS zwischen BB/OK und SHR im Zinkfingerbereich (AS an Position 303-Methio- nin/Aginin und 311 Arginin/Lysin sind different) und im Intron 4, das im Zinkfinger liegt, nachweisbar sind, 3. bei BB/OK-Ratten YY1 in isolierten Langerhansschen Inseln und Pankreas deutlich und bei SHR-und BB. 6S-Ratten kaum, in den anderen untersuchten Organen jedoch vergleichbar, aber mit 2 Banden bei BB. 6S nach Amplifizierung des Zinkfingerbe- reiches exprimiert ist, wurde der Schluß gezogen, daß YY1 bei BB. 6S in Langerhansschen Inseln unterexprimiert ist und damit diabetesprotektiv wirkt, wobei die zweite Bande im Pankreas und anderen Geweben eben- falls für die Diabetesprotektion von Bedeutung ist, zumal dem Zinkfinger 2 eine besondere Rolle bei der Transkription zuge- sprochen wird. Eine Beobachtung, die durch die AS-Änderung im Zinkfingerbereich und/oder im Intron (unterschiedliches Spleißverhalten bei BB/OK und BB. 6S) verursacht ist.

Da die Änderung im Zinkfingerbereich eine diabetesprotektive Wirkung hat, sind mehrere Gene in ihrer Regulation/Aktivität beeinträchtigt/verändert. Für eine Beteiligung des Introns an der Diabetesprotektion spricht die Tatsache, daß die Sequen- zunterschiede zwischen BB/OK und SHR nachweisbar waren, nicht aber zwischen BB/OK und Wildfangtieren. Die Sequenz zwischen BB/OK und Wildfangtieren war gleich. Dies wiederum erklärt, warum BB. 6S-, nicht aber BB. 6W-Ratten vor der Entwicklung ei- nes Diabetes geschützt sind.

Infolge der erfindungsgemäß gewonnenen Erkenntnisse eröffnet die Modulation des multifunktionellen Transkriptionsfaktors YY1 auf Expressions-und Regulationsebene zum einen erstmals einen-Weg-, um Typ-1-Diabetes zu verhindern, zum anderen lassen sich durch diese Modulation auch Autoimmunerkrankungen als solche verhindern. Ferner lassen sich auch weitere Erkrankun- gen wie Krebs, AIDS, Fettstoffwechselstörungen und Hypertonie positiv beeinflussen.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein Protein, das die in SEQ ID NO : 4 dargestellte Aminosäuresequenz auf- weist. Ferner eingeschlossen sind Homologe des Proteins, die Arginin und an Position 311 Lysin aufweist. Der Homologiegrad beträgt mindestens 95%, vorzugsweise mindestens 97%, und be- sonders bevorzugt mindestens 99%.

Die Erfindung betrifft auch Peptide, die Fragmente eines vor- genannten Proteins sind und eine Aminosäuresequenz aufweisen, die den die Aminosäurepositionen 303 und 311 in SEQ ID NO : 4 (bzw. 306 und 314 in SEQ ID NO : 6) umfassenden Sequenzbereich enthält. Die Länge der erfindungsgemäßen Peptide beträgt bei- spielsweise 53 bis 315 Aminosäuren, vorzugsweise z. B. 315,117 oder 53 Aminosäuren, wobei die Peptide vorzugsweise die Se- quenzbereiche von Position 1 bis 315, von 295 bis 411 bzw. von 299 bis 351 umfassen.

Erfindungsgemäß sind ferner folgende Fragmente wichtig : Ami- nosäuren 165-214 ; 255-333 ; 255-411. Die Numerierung bezieht sich auf die Numerierung gemäß SEQ ID NO : 4.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung sind auch Peptide von Bedeutung, die nur einen Bereich von z. B. Po- sition 295-310 oder 305-320 (Numerierung bezogen auf SEQ ID NO : 4) abdecken und somit nur eine der beiden mutierten Ami- nosäuren einschließen.

Die Erfindung betrifft ferner eine Nukleinsäure, die für ein vorgenanntes Protein oder Peptid kodiert. Die für das Protein mit der in SEQ ID NO : 4 kodierende Nukleinsäure weist vorzugs- weise die in SEQ ID NO : 3 dargestellte Nukleinsäuresequenz auf.

Eine für die vorgenannten Homologen kodierende Nukleinsäure weist eine Nukleinsäuresequenz auf, die den die Nukleinsäure- positionen 979-981 und 1003-1005 in SEQ ID NO : 3 umfassenden Sequenzbereich enthält. Die Codons an den genannten Positionen können selbstverständlich infolge der Degeneration des geneti- schen Codes variieren, solange sie für die Aminosäuren Arginin bzw. Lysin kodieren.

Erfindungsgemäß ist ferner die Intronsequenz wichtig : 1126- 1758. (Die Lage der Exons in SEQ ID NO : 3 ist : Exon 1 : 73 bis 729 ; Exon 2 : 730 bis 825 ; Exon 3 : 826 bis 978 ; Exon 4 : 979 bis 1125 ; Exon 5 : 1759 bis 1938 ; siehe Sequenprotokoll.) Die Nume- rierung bezieht sich auf die Numerierung gemäß SEQ ID NO : 3.

Diabetes Mellitus Typ 1 und Autoimmunerkrankungen an sich Wie bereits erwähnt, resultiert Typ-l-Diabetes aus der selek- tiven Zerstörung der Insulin-produzierenden ß-Zellen im Pankre- as. Der Untergang der ß-Zellen wird durch autoreaktive T- Zellen, die gegen ß-Zell-spezifische Antigene (Autoantigene) gerichtet sind, gesteuert. Mit der Diabetesmanifestation ver- bunden ist eine Insulitis (69). Dieser Prozess ist gekenn- zeichnet durch die lymphozytäre Infiltration der ß-Zelle. Da eine Insulitis nicht immer die Antwort auf eine ß- Zelldestruktion sein muß, unterscheidet man zwischen einer be- nignen und destruktiven Insulitis (70). Dieser Prozeß korre- liert mit der Cytokinproduktion, wie für Modelltiere (BB- Ratte) und für den Menschen gezeigt werden konnte (71-78). Da- bei spielen die Cytokine IFNy und IFNa während der destruktiver Insulitis eine Hauptrolle. Für die benigne Insulitis werden IL10 und TGFß als Hauptfaktoren angesehen. Darüber hinaus konn- te in nicht-diabetischen Mäusen Insulitis durch TNFa, TNFß, so- wie IL6 induziert werden, was jedoch nicht zu einer ß- Zellzerstörung führte. Bei transgener Expression von IFNa, IFNy und IL2 konnte gezeigt werden, daß nicht-diabetische Mäuse ei- ne Insulitis und einen autoimmunen Typ-1-Diabetes entwickeln.

Demnach sind IFNy, IFNa, IL2 und IL10 bei der Entstehung, TNFa, IL4, IL6, sowie TGFß bei der Verhinderung des Typ-1-Diabetes involviert (71-81).

Da alle BB. 6S-Ratten eine Insulitis entwickeln, Diabetes aber nur bei etwa 15% der Tiere auftritt (82), muß YY1 auch beim Insulitisprozeß eine Rolle spielen. Entweder schaltet YY1 die protektiven Cytokine an, unterdrückt die pathogenen Cytokine oder er balanciert beide Cytokingruppen so, daß zum einen die ß-zelldestruktive Insulitis auftritt oder aber die benigne In- sulitis, die nicht zum autoimmunen Diabetes führt, zum Tragen kommt. Da er auch in der Lage ist, IL4 zu aktivieren (83) und IFNy zu inhibieren (84), wird erfindungsgemäß davon ausgegan- gen, daß er auch die Relation der T-Helferzellpopulationen, TH1 und TH2, zugunsten von TH2 verschiebt.

Ist durch eine Mutation die AS-Sequenz von YY1 bei Typ-1- Diabetikern verändert, kann er nicht mehr an bestimmte Sequen- zen in der DNA binden, oder aber seine Affinität zur Bindungs- stelle ist reduziert. D. h., er kann nicht mehr an den IFNy- Promotor binden, oder mit zu niedriger Affinität, und die IFNy- Synthese auch nicht mehr hemmen. Eine Überproduktion von IFNy wäre die Folge. Diese Überproduktion könnte dann zu einer In- sulitis führen. Da IFNy die TH1 Antwort aktiviert, indem er die MHC-Klasse-I-Proteine auf der Oberfläche von ß-Zellen hochregu- liert (85,86) und sogleich die T-Zelldifferenzierung in Rich- tung TH1 beeinflußt und dadurch die TH2-Antwort reduziert, wä- re eine Verschiebung zwischen TH1 und TH2 gegeben, wie es beim autoimmünen Diabetes postuliert wird. Darüber hinaus ist be- kannt, daß Makrophagen zuerst in der ß-Zelle nachweisbar sind.

Da IFNy ein Stimulator für Makrophagen ist, kann die frühe Ein- wanderung in die ß-Zelle dadurch erklärt werden, daß IFNy nicht mehr durch YY1 gehemmt wird. Zusätzlich ist YY1 auch prädesti- niert, die IL4 Synthese einzuleiten (83). Ist dieser Fakt durch Sequenzveränderung oder Unterproduktion von YY1 auch nicht gegeben, kann die TH1-Antwort nicht mehr durch IL4 als protektives Cytokin unterdrückt werden. Aufgrund einer erhöh- ten Aktivität von TH1 können cytotoxische T-Zellen (CTL oder CD8+) und NK-Zellen ihre Funktion in der ß-Zelle als"Killer Zellen"wahrnehmen. Der apoptotische ß-Zelltod, induziert durch FAS-Rezeptoren unter Interaktion mit dem FAS-Liganden, kann durch YY1 auch zusätzlich noch induziert werden (87). Ist der Transkriptionsfaktor bei Typ-l-Diabetikern mutiert, kann er nicht mehr in vollem Maße die FAS-Expression hemmen. Somit er- scheint FAS auf der Oberfläche von ß-Zellen, und die apoptoti- sche Signalkaskade ist aktiviert. Das Resultat ist der ß- Zelltod und damit Typ-l-Diabetes.

Da neonatale Thymektomie bei Modelltieren (BB-Ratte und NOD- Maus) die Entstehung eines Typ-1-Diabetes verhindert (88), wird u. a. auch vermutet, daß beim Typ-1-Diabetes autoreaktive T-Zellen schon während der T-Zelldifferenzierung entstehen.

D. h., YY1 müßte schon in einem frühen Stadium der T- Zellentwicklung eingreifen, was man sich wie folgt vorstellen könnte : Um ein funktionales Lymphozytenrepertoire zu entwickeln, müs- sen die Vorläuferzellen, sogenannte Präthymozyten, verschie- denste Entwicklungsstadien im Thymus durchlaufen. Da nur etwa 2% reifer T-Zellen den Thymus verlassen können, liegt eine strenge Selektion während der T-Zellreifung vor, welche über Tod oder Überleben entscheidet. Ein Regulationspunkt ist im frühen Thymozytenstadium, dem"Doppelt Negativen" (DN), veran- kert. Hier entscheidet der auf der Oberfläche befindliche prä- T-Zell-Rezeptor (preTCR), bestehend aus CD44 (ß-Kette) und der invarianten Kette pTa, ob ein Eintreten in den Zellzyklus mög- lich ist. Dieser Kontrollpunkt wird auch als"Beta-Checkpoint" bezeichnet. Die unreifen T-Zellen verweilen solange in diesem Stadium, bis das richtige a-Ketten-Gen umgeordnet ist und der T-Zell-Rezeptor (TCR), bestehend aus a-und ß-Kette, auf der Oberfläche exprimiert werden kann. Erscheinen beide T-Zell- Rezeptoren CD4 plus CD8 zusammen mit CD3 auf der Oberfläche, werden diese T-Zellen nun als"Doppelt Positiv" (DP) bezeich- net. Etwa 95 erreichen dieses Stadium nicht. Dies unter- streicht die Bedeutung des Kontrollpunktes beim Übergang vom DN-zum DP-Stadium (89).

Als kritischer Gesichtspunkt wird dabei die Regulation der Ex- pression der pTa-Kette betrachtet. Die pTa-Gentranskription scheint bisher vorallem durch den upstream Bereich, dem Enhan- cer, entscheidend reguliert zu werden. Mehrere Proteine, unter ihnen befindet sich auch YY1, die in der Lage sind, an diesen Bereich zu binden, wurden identifiziert (90). Als weitere Bin- dungsproteine des Enhancer sind zu nennen : SP1/3, ZBP-89 und c-MYC. Betrachtet man diese Proteine im Zusammenhang mit YY1, kann man schlußfolgern, daß alle, ausgenommen ZBP-89, mit YY1 interagieren, so daß als weiterer Regulationspunkt von YY1 auch die T-Zellreifung angesehen wird. Unterstützt wird diese Annahme durch Befunde von Iritani et. al. (91). Sie konnten zeigen, daß c-MYC allein nicht in der Lage ist, die pTa- Expression zu regulieren. Nur verschiedenste c-MYC Konzentra- tionen schienen zum Teil einen Einfluß auf den Zellwachstum- sarrest im späten DP-Stadium zu haben. Ist YY1 im Thymus überexprimiert, schaltet er die Transkription pTa an. In umge- kehrter Weise, bei Unterexpression, verhindert er die pTa- Transkription. Bei Überexpression oder Unterexpression, sowie Sequenzveränderungen von YY1 können T-Zellen während ihrer Entwicklung in den Arrest geschickt oder aber in ein weiteres T-Zellstadium überführt werden.

Da die T-Zellreifung und deren Selektion bei allen Autoim- munerkrankungen, wie Rheumatoide Arthritis, Multiple Sklerose, Autoimmune Encephalomyelitis, Zöliakie u. a., entscheidend ist, können neben dem Typ-l-Diabetes auch Autoimmunerkrankungen per se durch YY1 beeinflußt werden, was durch Auf-oder Abre- gulation von YY1 erreicht wird.

Es wird davon ausgegangen, daß sich die YYl-Sequenz zwischen Typ-l-Diabetiker und gesunden Probanden unterscheidet. Mehrere Sequenzvarianten werden für Typ-l-Diabetiker erwartet, da es neben dem klassischen Typ-l-Diabetiker auch noch weitere For- men für Typ-l-Diabetes existieren, wie zum Beispiel der LADA (Latent Autoimmune Diabetes in Adults). Diese Sequenzvarian- ten sollen als genetischer Marker für die Prädiabetiker ge- nutzt werden. Der Nachweis der Änderung basiert auf der DNA- Sequenzierung, wobei Vollblut gewonnen, DNA bzw. RNA, die um- geschrieben wird in ssDNA, isoliert und dann sequenziert wird.

Parallel dazu wird das Expressionsprofil für Typ-l-Diabetiker erstellt. In Anbetracht der Tatsache, daß die Krankheit eines jeden Typ-1-Diabetikers individuell verläuft, wird erwartet, daß das Expressionsprofil von Proband zu Proband unterschied- lich ist. In Abhängigkeit vom Alter des Probanden, vom Ge- schlecht, vom Autoantikörperstatus [GAD (Glutamatdecarboxyla- se), IA-2 (Proteintyrosinphosphatase), ICA (zytoplasmatische Inselzellautoantikörper)] vom BMI, sowie vom HLA-Genotyp (HLA- DQB1) werden unterschiedliche Expressionsprofile erwartet.

Demnach soll eine entsprechende Prophylaxe/Therapie auch indi- viduell zugeschnitten werden. Durch die genetische Heterogeni- tät interagiert YY1 bei jedem Individuum mit einem differenten genetischen Hintergrund, so daß die YY1-Expression zwischen den Individuen großen Schwankungen unterliegen wird.

Eine Abregulation kann über Applikation von Antisense und durch Herstellung spezifischer Antikörper für den jeweiligen Probanden erreicht werden. Die Struktur der Antisense und der Antikörper ergibt sich aus der Sequenzfolge des Probanden. Die zu applizierende Menge der Antisense sowie Antikörper ergibt sich aus dem Expressionsprofil des Probanden (Auf-und Abregu- lation vgl. M&M).

Daß YY1 selbst als Autoantigen fungiert, liegt nahe, weil bis dato das auslösende Autoantigen für die Zerstörung der Insu- lin-produzierenden Beta-Zelle immer noch nicht bekannt ist.

Liegt eine Bestätigung vor, daß YY1 als Autoantigen fungiert, soll über orale Verabreichung von YY1 Toleranz induziert wer- den, wie es bei Allergikern durch Hypersensibilisierung be- reits erfolgt. Dabei soll für den jeweiligen Probanden oder Probandengruppen die Sequenzvarianten erfaßt und anschließend die mutierte Form synthetisch hergestellt werden, um es oral verabreichen zu können. Damit soll eine Verschiebung des TH1/TH2 Profils erreicht werden, um der autoimmunen Zerstörung entgegenzuwirken.

Daß durch Applikation-von nackter cDNA oder DNA die Entstehung eines Typ-l-Diabetes bei BB/OK-Ratten verringert werden kann, zeigten jüngste Ergebnisse einer Pilotstudie. 174 Nachkommen nicht-diabetischer Muttertiere wurde mit 2,8, 12,16, 20,25 und 30 Tagen nackte DNA der Primer K815 und K817, K831 und K818 (Figur 11) sowie gereinigte PCR-Produkte unter Verwendung der Primer K815 und K817 (Amplifikation genomischer BB/OK-DNA, Intron von YY1, Sequenz 1069 bis 1804) sowie K831 und K870 (Amplifikation von BB/OK-cDNA, Exon 3,4 und 5, Zinkfinger, Sequenz 911 bis 1125 und 1758-bis 2078) dosisabhängig (100, 200 und 400 ng in 50 yl) einmal an den o. g. Tagen s. c. appli- ziert. Darüber hinaus wurden nicht-diabetische BB/OK-Weibchen gezielt ängepaart, die bei Spermanachweis and dann am 4., 8., 12., 16. und 18 Schwangerschaftstag mit 100 oder 400 ng nack- ter DNA (Primer K815/K817) behandelt wurden. Die 24 Nachkom- men dieser Mütter und die 174 post-partuum behandelten Nach- kommen wurden bis zur 30. Lebenswoche auf Diabetesvorkommen beobachtet. Als Kontrolle dienten unbehandelte sowie behandel- te BB/OK-Ratten, denen 50 gl Wasser s. c. im gleichen Alter appliziert wurde. Nach 30 Wochen waren 93% der behandelten (13/14) und 86% der unbehandelten Kontrolltiere (19/22) er- krankt. Eine recht deutliche Senkung der Diabeteshäufigkeit wurde in 2 Versuchsgruppen beobachtet. Die Häufigkeit sank auf 62% (8/13) bei Applikation des Zinkfinger-PCR-Produktes (400 ng) und auf 50 (6/12) bei den Nachkommen, die von dem mit 400ng behandelten Muttertier geboren wurden ; Alle übrigen Ver- suchsgruppen erkrankten mit den der Kontrollgruppen vergleich- baren Häufigkeit (74 bis 100%), wobei eine Dosisabhängigkeit zu beobachten war. Eine weitere Studie zeigte, dass die Appli- kation von 400ng/50y1 PCR-Produkt, amplifiziert mit den Pri- mern K831/K870 die Diabetesinzidenz weiter senken konnte. Im Vergleich zur"Wasserkontrolle" (16/19=84%) erkrankten signi- fikant weniger BB/OK-Ratten (16/19 vs. 13/27 ; p=0.013) der be- handelten-Gruppe.-Angesichts dieser ersten Ergebnisse wird da- von ausgegangen, daß durch eine häufigere und/oder längere Ap- plikation nackter DNA und/oder PCR-Produkten eine Senkung der Diabeteshäufigkeit bei BB/OK-Ratten gegen 0% erreicht werden kann.

Protoonkogene und Krebs Das c-MYC Gen wurde ursprünglich als zelluläres Homolog des retroviralen v-myc Onkogens in den 70er Jahren entdeckt. Em- bryonale Lethalität ist das Ergebnis einer Deletion dieses Gens. Das Produkt eines c-MYC Protoonkogens ist das c-MYC Protein, welches-ebenso wie YY1-einen multifunktioneller Transkriptionsfaktor darstellt. Eine entscheidende Rolle spielt c-MYC in der Differenzierung, dem Zellwachstum, Pro- liferation, Transformation und Apoptosis von Zellen. Die Dysregulationen der c-MYC Expression stehen im Zusammenhang mit abnormen malignen Zellwachstum und somit der Tumorentste- hung von Lungenkrebs, Brustkrebs und Darmkrebs. Dies zeigt, daß c-MYC als starker Regulator des Zellwachstums, der Zell- differenzierung und Zellproliferation ebenso stark kontrol- liert wie balanciert werden muß, um die Carzinomentstehung zu verhindern (102-104).

Da YY1 als vielseitiger Regulator in Abwesenheit von dem es- sentiellen Partnerprotein (MAX) direkt an den C-terminalen Teil des basischen Helix-Loop-Helix (bHLH) Zinkfingers von c- MYC binden kann, spielt YY1 auch bei der Krebsentstehung eine bedeutende Rolle. Hierbei ist YY1 in der Lage, jeden seiner vier Zinkfinger dazu zu benutzen, um an das c-MYC Protein zu binden. Nicht möglich ist es YY1 jedoch, die Verbindung zwi- schen dem Komplex von c-MYC/MAX zu unterbrechen. Da aber trotz Komplexbildung zwischen YY1 und c-MYC die sequenzspezifische DNA-Bindung von YY1 nicht blockiert wird, ist die Regulation auf DNA-Ebene durch YY1 immer noch möglich.

Das humane c-MYC Gen kodiert zwei Polypeptide (439 und 453 Aminosäuren) mit einem Molekulargewicht von 64 und 67 kDa und ist im Zellkern lokalisiert. Der Translationsstart des größe- ren Proteins liegt am Ende des ersten Exons, während die klei- nere und meist vorherrschende Form des Proteins durch Transla- tion im zweiten Exon initiiert wird.

C-MYC ist ein Transkriptionsfaktor, der basische Helix-Loop- Helix/Leuzin-Zipper Domäne (bHLH-LZ) aufweist, wobei diese konservierten Domänen Bestandteil vieler Transkriptionsfakto- ren sind und Protein/Protein, sowie Protein/DNA-Interaktionen vermitteln.

C-MYC ist Teil einer Genfamilie, die noch weitere Mitglieder wie N-, L-, S-und B-myc beinhaltet (105-108).

Die Bindung von c-MYC an die DNA erfolgt über die sogenannte E-Box, eine spezifische regulatorische Sequenz der Basen 5'- CACGTG-3'. Zur Aktivierung der Transkription muß das c-MYC Protein mit dem Partnerprotein MAX heterodimere Komplexe aus- bilden (109). MAX gehört ebenfalls zu den bHLH-LZ Proteinen, besitzt aber keine transaktivierende Domäne wie c-MYC (110).

Die Heterodimerisierung mit MAX ist essentiell für die Funk- tionen von c-MYC, wie Regulation des Zellzyklus, Einleiten von Apoptose oder Transformation von Zellen. MAX bildet weiterhin mit den bHLH-LZ Proteinen der MAD-Familie Komplexe. Diese He- terodimere binden ebenfalls spezifisch an E-Boxen und wirken transkriptionsreprimierend über Sin3-vermittelte Rekrutierung von Histondeacetylasen (111).

Demnach sollte durch Ab-oder auch Aufregulation von YY1, be- dingt durch seine-vielfältigen Interaktionen mit anderen Ge- nen, auch über C-MYC, eine Beeinflussung der Krebsentstehung möglich sein, was durch folgende Beobachtungen unterstrichen wird.

BB/OK-Ratten entwickeln nicht nur einen Typ-1-Diabetes sonder auch Tumore wie eine Langzeitstudie zeigte. 202 BB/OK-Ratten wurden bis zu ihrem natürlichen Tod beobachtet. 87 von den 202 wurden diabetisch. Die verbleibenden 115 Tiere überlebten im Mittel 576 79 Tage. Nur 37% (42/115) wurden älter als 400 Ta- ge. Die Mehrzahl der Tiere (73/115) starb zwischen dem 200. und 400. Lebenstag vornhemlich an Tumoren (50/115). Betroffen waren Leber, Lyphknoten, Lunge, Darm, Pankreas und Milz (112).

Analog wurde eine Studie mit BB. 6S-Ratten durchgeführt. 47 Tiere wurden bis zum 600. Lebenstag beobachtet. 6 von 47 Rat- ten (12, 8%) wurden bis zur 30. Lebenswoche diabetisch, 2 wei- tere Tiere manifestierten im Alter von 437 und 560 Tag. 62% der Tiere (24 von 39 nichtdiabetischen Tieren) überlebten den Beobachtungszeitraum von 600 Tagen. 6 Tiere starben, ohne ma- kroskopisch eine Todesursache feststellen zu können. 9 Tiere mußten auf Grund ihres schlechten Allgemeinzustandes getötet werden, wobei als Todesursache in 7 Fällen Darmverschluß und bei 2 Tieren Tumore in der Leber diagnostiziert wurden. Dem- nach überleben die kongenen BB. 6S-Ratten signifikant länger als BB/OK-Ratten und die Tumorrate ist signifikant niedriger bei BB. 6S als bei BB/OK (50/115 vs. 2/39, p<0.0001). Ange- sichts dieser Befunde, scheint die ausgetauschte Region und damit YY1 bei BB. 6S-Ratten die Tumorentstehung deutlich zu senken und die Lebenserwartung zu erhöhen. Demnach sollte durch Abregulation von YY1 die Tumorentstehung verhindert und die Lebenserwartung gesteigert werden können.

Lipidstöffwechsel Steroidhormonsynthese Steroide werden in spezialisierten Zellen der Nebennieren, Ei- zellen, Hoden, PlAcenta und im Gehirn synthetisiert. Sie sind essentiell für die Aufrechterhaltung der normalen Körper- homöostase. Die Synthese aller Steroidhormone beginnt mit der Umwandlung von Cholesterol in Pregnenolon. Dies ist der erste enzymatische Schritt, der an der Matrix der innermitochondria- len Membran erfolgt.

Das Steroidogenic Acute Regulatory Protein (StAR) spielt eine Schlüsselrolle im Transport von Cholesterol von der äußeren zur innermitochondrialen Membran. Dieser Transport ist der ra- tenlimitierende Schritt in der Steroidogenese. Mutationen im StAR-Gen verursachen die potentiell lethalen Bedingungen, die als congenital lipoid adrenale Hyperplasie bekannt sind. Glei- che Beobachtungen konnten an StAR-Knock-out Mäusen gemacht werden (131).

StAR-Expression kann durch Agenzien positiv und negativ regu- liert werden, die vorwiegend am Promotor wirken. Die hormon- stimulierte Steroidsynthese ist begleitet von einem schnellen Anstieg der StAR-mRNA-Spiegel. cAMP hat einen positiven und schnellen Effekt auf den Anstieg der StAR-mRNA, scheint aber nicht direkt an der Promotorsequenz zu wirken.

Der erste Transkriptionsfaktor als potentieller Regulator des StAR-Gens war der Steroidogenic factor 1 (SF 1), auch Orphan Nuclear Rezeptor Transkriptionsfaktor genannt.

Der StAR-Promotor besitzt verschiedene Consensus- Bindungssequenzen für SF 1. Zwei von diesen an Position-97 und-42 sind hoch konserviert. Eine weitere an Position-132 wurde nur in Mäusen und Ratten gefunden.

Ein weiterer Kandidat ist das CCAAT/enhancer Bindungsproteine (C/EBPs), das zur Familie der bRegion/leucine zipper Tran- skriptionsfaktoren gehört. Zwei Mitglieder dieser Familie wer- den in steroidogenen Zellen exprimiert (C/EMPa und C/EMPß).

Der StAR-Promotor hat zwei mögliche Bindungssstellen für C/EMP. SF 1 und C/EMP bilden einen Komplex am StAR-Promotor.

Sowohl der humane als auch der Ratten-StAR-Promotor besitzt weiterhin Bindungsstellen für SREBP-la (Sterol regulatory ele- ment binding protein-la). SREBP-la ist ein bedeutender Aktiva- tor für den StAR-Promotor.

Weitere Transkriptionsfaktoren wie SF 1, NF-Y, YY1, und SP1 sind in die Wirkung von SREBP am StAR-Promotor involviert.

SREBP-la reguliert koordinierend zusammen mit den anderen Fak- toren den StAR-Promotor.

CREB kann ebenfalls binden und auf schnelle Weise die Tran- skription aktivieren (cAMP Bindung).

DAX-1 bindet direkt an der Hairpin-Struktur des StAR-Promotors sowie direkt an SF-1 und inhibiert in beiden Fällen deren Ex- pression (131).

Wenn SREBP-la eine koordinierende Rolle in der Bereitstellung von Cholesterol in der Steroidhormonsynthese übernimmt, kommt ihm eine essentielle Bedeutung in der Cholesterolhomöostase zu. Der StAR-Promotor der Ratte besitzt 5 sogenannte SRE- Bindungsstellen (Sterol Regulatory Element), an die die akti- vierte Form von SREBP-la binden und die Transkription aktivie- ren kann- Eine weitere SRE-Bindungsstelle wurde im huma- nen StAR-Promotor gefunden, an die sowohl SREBP-la als auch YY1 binden kann und bedingungsabhängig bei hohen Konzentratio- nen von SREBP-la aktiv ist (133).

SREBPs gehören zur Familie der basic helix-loop-helix leucine zipper (bHLH-Zip) Transkriptionsfaktoren, die als 125 kDa mem- brangebundene Precursor-Proteine im endoplasmatischen Retiku- lum synthetisiert werden und bei Sterolmangel in der Zelle durch enzymatische Abspaltung der 68 kDa N-terminalen, die bHLH-Zip Domäne enthaltenden Region des Proteins aktiviert werden und in den Nucleus einwandern. Dort binden sie spezi- fisch an die DNA-Sequenz von SRE (sterol regulatory element) und aktivieren die Transkription ihrer Zielgene (134,135).

Es wurden bisher drei SREBPs beschrieben, die SREBP-la, SREBP- lc und SREBP-2 genannt werden. SREBP-la und-lc werden vom gleichen Gen unter Nutzung alternativer Promotoren exprimiert.

SREBP-2 wird von einem separaten Gen exprimiert (135,136).

Cholestolgene, die klassische SRE-Bindungsstellen in ihren Promotoren besitzen, werden stark und effektiv von SREBP-la und SREBP-2 aktiviert. SREBP-lc ist inaktiv für diese Bin- dungsstellen.

SREBP-lc, auch ADD 1 genannt, weist eine Besonderheit auf. Es bindet an E-Boxen (universelle cis-Elemente für bHLH- Proteine). Damit weist es eine duale Bindungsspezifität zu beiden, den klassischen palindromen E-Boxen und den nonpa- lindromen SREs, auf. Diese einmalige Bindungsspezifität ist auf den Thyrosinrest in der basischen Region zurückzuführen, der einmalig für die SREBP-Familie ist, denn alle bekannten bHLH-Proteine besitzen an dieser Position Arginin (136). Die- ser Austausch zerstört die Transaktivität aller SREBPs für SRE-Bindungsstellen, erhöht aber markant die Aktivität von SREBP-1 für Bindung an E-Boxen (siehe SREBP-lc) aber auch von SREBP-2. Dieses ist jedoch inaktiv und aktiviert das Zielgen nicht (136).

Die SREBPs sind unterschiedlich starke Transkriptionsfaktoren und benötigen meist Cofaktoren. Solche sind NF-Y, SP1, CBP (CREB-Bindungsprotein).

SREBP-Zielgene werden in 2 Gruppen eingeteilt (136) : Cholesterol-Biosynthese-Gene * HMG-CoA-synthase und-reduktase <BR> <BR> <BR> <BR> Farnesyl-diphosphatsynthase<BR> <BR> <BR> <BR> <BR> Squalensynthase SREBP-2 LDL-Rezeptor' HDL-Rezeptor (137) Alle enthalten die klassische SRE-Sequenz (ATCACCCCAC) oder das SRE 3 Motif (CTCACACGAG) und angrenzende Cofak- tor-Bindungsstellen für NF-Y oder SP1 in ihren Promotoren.

* Lipogene Enzym-Gene Sind nahrungsreguliert auf der Transkriptionsebene (z. B. Glukose, Insulin) Acetyl-CoA-Carboxylase Fettsäuresynthase (FAS, erhöht TG) Steryl-CoAdesaturase 1 und 2 Glycerol-3-phosphat-Acyltransferase Diacepam-binding Inhibitor (Acyl-CoA-Bindungsprotein) -Spot 14 (Leberenzym S 14) Die SREBP-Bindungs-und-Aktivierungsstellen in den Pro- motoren dieser Gene scheinen sich von den klassischen SRE-Consensus-Sequenzen zu unterscheiden und werden als SRE-like-Sequenzen bezeichnet.

Einige weitere Enzyme wie Liver-Type-Pyruvatkinase (PK) und Glukokinase (GK) enthalten E-Box oder E-Box-like Sequenzen im Promotor, was bedeuten kann, daß sie Kohlenhydrat, Glukose- und Insulin-sensitiv sind und potentiell SREBP-Targets sein können.

Alle aktiv wachsenden Zellkulturen produzierten prädominant SREBP-la und SREBP-2, wogegen die meisten Organe einschließ- lich Leber von adulten Tieren SREBP-lc und SREBP-2 produzie- ren. Alle SREBPs sind in der Lage, jedes der bekannten Zielge- ne zu aktivieren, jedoch mit unterschiedlicher Effizienz.

SREBP-lc ist schwächer (kürzere Transaktivierungsdomäne) als SREBP-la und SREBP-2.

Die spezifische Rolle der SREBP-Isoformen in vivo wurde in transgenen Mäusen untersucht Die differente Überexpression er- gab, daß die SREBP-1-Isoformen selektiv die Fettsäurebiosyn- thesegene aktivieren und SERBP-2 spezifisch die Cholesterol- biosynthese kontrolliert.

SREBP-la und-lc spielen eine große Rolle in der nahrungsab- hängigen Induktion hepatisch lipogener Enzyme und der Chole- sterogenese. SREBP-2 dagegen bestimmt die Sterolregulation durch Abbau des membrangebundenen Precursor-Proteins, um die aktive Form für die Einwanderung in den Nukleus bereitzustel- len. SREBP-1 kontrolliert lipogene Enzyme durch Selbstregula- tion seines eigenen Transkriptionslevels.

Der Fakt, daß die SREBPs relativ schwache Transkriptionsfakto- ren sind und Cofaktoren benötigen, wurde bereits erwähnt. Ben- nett et. al. (138) zeigten beispielsweise, daß die Aktivierung der SREBPs durch Sterolmangel in vivo in einer erhöhten Bin- dung von SP1 an einer, an die SREBP-Bindungsstelle angrenzen- den Sequenz im Promotor für das LDL-Rezeptorgen bindet. Ähn- lich werden die zwei coregulierenden Faktoren NF-Y und CREB (cAMP Responsive Element Binding Protein) verstärkt an den Promotor von HMG CoA-Reduktase gebunden. SREBP-Aktivierung er- höht die Histonacetylierung von H 3, nicht aber von H 4 im Chromatin beider Promotoren (HMG-CoA-Synthase und-Reduktase).

Die Resultate zeigen, daß feine Differenzen im Muster der Kern-Histon-Acetylierung eine Rolle in der selektiven Genakti- vierung spielen. Das zeigt, daß die Bindung der Transkripti- onsfaktoren an die DNA eine notwendige, aber nicht ausreichen- de Bedingung für die Transaktivierung ist (138).

SREBP-1 kann einige andere E-Box oder E-Box-like-Sequenzen im FAS-Promotor und im S14-Promotor aktivieren, ist aber völlig inaktiv für degenerierte E-Box-Sequenzen z. B. im PK Promotor.

Promotoren mit SRE-Bindungsstellen benötigen unbedingt NF-Y oder SP1 als Cofaktoren für die SREBP-Aktivierung. SREBP-1 hat eine wesentlich höhere Affinität und ist effizienter in der Aktivierung von SRE enthaltenden Promotoren als von E-Box ent- haltenden Promotoren.

In lipogenen Enzymen, die Promotoren mit SRE-like-Sequenzen enthalten, aktivieren alle Isoformen von SREBP die Transkrip- tion (SREBP-la stärker als SREBP-lc, SREBP-la bevorzugt gegen- über SREBP-2). Die Bindung der SREBP-Isomeren an die verschie- denen Bindungsdomänen der Genpromotoren (136) ist in Fig. 6 dargestellt.

-Einfluß von YY1 auf die Regulation der lipogenen Gene YY1 ist bekannt als Transkriptionsmodulator, der sowohl als Enhancer und Repressor aber auch als Initiator-Bindungsprotein wirken kann, was von der Herkunft der Zelle und den Bindungs- stellen des Promotors abhängig ist. YY1 ist auch in der Lage, den gleichen Promotor zu aktivieren und zu hemmen, wenn das intrazelluläre Milieu verändert ist, das Bindungselement im Promotor mutiert (verändert) ist, oder die Bindungsstelle um- gebende DNA-Sequenz alteriert ist.

In Hinblick auf die betrachteten Gene lassen sich folgende Einflüsse von YY1 folgern.

YY1 besitzt eine hohe Affinität zu SREBP-la. Im StAR-Promotor befindet sich eine YYl-Bindungsstelle, die mit der proximalen Bindungsstelle für SREBP-la überlappt. Die gleichzeitige Bin- dung von SREBP-la und YY1 am StAR-Promotor reprimiert dessen Transkription. Dieser Fakt beeinflußt wiederum den Chole- steroltransport und somit die Steroidhormonsynthese.

YY1 wirkt als Aktivator spezifischer Repressor, konkurriert mit den Bindungsstellen der SREBPs und deren Cofaktoren bzw. behindert sterisch die Bindung der SREBPs z. B. an SREs der lipogenen Gene. Er wirkt sowohl als Typ-I-Repressor (Bindung an Cofaktoren, Komplexbildung) als auch als Typ-II-Repressor (direkte Bindung an die DNA, sterische Blockierung von Bin- dungsstellen). Durch Mutation der Bindungsstelle in YY1 konnte nachgewiesen werden, daß die SREBP-la Aktivierung des StAR- Promotors um ein Vielfaches anstieg. Untersuchungen an trans- fizierten HepG2 Zellen ergaben, daß YY1 Mutanten (YY A 296- 331, YY A 399-414, YY A 334-414 oder YY A 154-199) z. B. die sterolaktivierte Expression des LDL-Rezeptor und FPPS- Rezeptors nicht reprimierte. Die Mutationen YY A 334-414 oder YY A 154-199 verhindern die nukleare Lokalisation, die DNA- Bindung und die Interaktion mit CBP. YY A 296-331, YY A 399- 414 waren inaktiv bei der Repression der SREBP-la abhängigen Induktion der Expression des HMG-CoA Synthase-Promotors (134).

Zahlreiche weitere Promotoren der sterolregulierten Gene ent- halten potentielle Bindungsstellen für YY1 (CCAT oder ACAT) überlappend oder angrenzend an Bindungsstellen der Coaktivato- ren bzw. Transkriptionsaktivatoren. Diese können durch YY1 verdrängt oder blockiert und damit die Genexpression repri- miert werden (vgl. Fig. 7).

Nach dem gleichen Prinzip werden auch die anderen Promotoren durch YY1 reprimiert. HDL-Rezeptor o positiv reguliert durch SREBP-la plus SP1 eYY1 (Repr.) LDL-Rezeptor p positiv reguliert durch SREBP-la plus SP1 eYY1 (Repr.) Fettsäuresynthase Farnesyl Synthase > positiv reguliert durch SREBP-la plus NF-Y X YYl (Repr.) HGM-Co A Synthase HGM-CoA-Reduktasegenexpression wird durch YY1 nicht re- primiert.

Der Synergismus der Bindung von SREBP und NF-Y bzw. SP1 an Promotoren der SREBP-responsiven Gene, einschließlich SREBP-2, führt zur Aktivierung der Transkription, die die Cholesterol- homöostase (LDL-Rezeptor, HDL-Rezeptor, HMG-CoA-Synthase und- Reduktase, FPP (Farnesylphosphat) -Synthase, Squalensynthase) die Fettsäuresynthese (Fettsäuresynthase und AcetylCoA- Acetylase), den Fettsäureabbau (Stearyl-CoA-Desaturase) und die Triglyceridsynthese (Glycerol-3-phosphat- Acetyltransferase) kontrolliert (134).

YY1 kann über die o. g. Mechanismen in diese Prozesse eingrei- fen. YY1 kann auch durch Interaktion mit SREBP-la die Erken- nung der Domäne auf SREBP-la für die RNA-Polymerase-II behin- dern und damit die Transkription reprimieren, was einen weite- ren regulatorischen Mechanismus der Transkriptionsregulation darstellt (134).

Beeinflussung der SREBP Aktivierung bei verschiedenen Erkran- kungen In hepatischen Zellen wird vorwiegend SREBP-lc exprimiert, das in diesen Zellen auch durch Glukose und Insulin sowohl auf mRNA als auch auf Proteinebene stimuliert wird (139).

Bei experimentellem Streptozotozin-Diabetes von Ratten wurde eine massive Erhöhung der Expression von SREBP-la und Fettsäu- resynthase gefunden. Daraus resultierte eine starke Triglyce- ridakkumulation (TG). Behandlung mit Insulin konnte beides senken. In Nierenzellen war bei hoher Glukose die Expression von SREBP-la und-lc mRNA und Proteinsynthese erhöht ebenfalls die Fettsäuresynthese und damit die TG-Akkumulation. SREBP-1- Expression ist bei Diabetes mellitus erhöht. SREBP-1 spielt eine bedeutende Rolle in der Erhöhung der Lipidsynthese, TG- Akkumukation, mesangialen Expansion, Glomerulosklerose und Proteinurie, indem es die Expression von TNFß und des vaskulä- ren Endothelwachstumsfaktors erhöht (140).

Bei Typ-2-Diabetikern wurde eine signifikante Verminderung der SREBP-1-Expression im subkutanen Fettgewebe und im Skelettmus- kel gefunden. Ex vivo konnte dieser Effekt durch TNFa behoben werden (141).

Daher kann durch Auf-bzw. Abregulation von YY1 der Li- pidstoffwechsel entsprechend beeinflußt werden wie nachfolgen- de Ergebnisse bestätigen.

Wie eingangs bereits erwähnt, unterscheiden sich BB/OK-und BB. 6S-Ratten nicht nur signifikant in der Diabeteshäufigkeit und Manifestationsalter. Im Alter von 12 Wochen sind BB. 6S- Ratten im Vergleich zu BB/OK auch schwerer und das Serumge- samtcholesterol ist bei männlichen und weiblichen Tieren und die Serumtriglyzeride sind bei Weibchen signifikant erhöht (24). Nach der 24. Lebenswoche sind auch die Serumtriglyzeride. bei den männlichen BB. 6S-Ratten signifikant gegenüber BB/OK erhöht. Auf Grund dieser Befunde lag der Schluß nahe, daß YY1 auch im Fettstoffwechsel involviert ist. Daher wurde in einer Pilotstudie geprüft, inwieweit die Applikation von YY1- Antisense der 4 Zinkfinger die Lipide beeinflussen kann. 10-12 männlichen Ratten der Stämme BB/OK, LEW. 1A, LEW. 1W, WOKW und SHR wurden 600ng/100y1 Antisense für 2 Wochen, beginnend in der 9. Lebenswoche, appliziert. Die Serumtriglyzeride (TG),- gesamtcholesterol (Chol) und-HDL-Choelesterol (HDL) wurden vor (8. Woche) und nach Applikation (10. Woche) bestimmt. Die genetisch und phänotypisch differenten Stämme reagierten er- wartungsgemäß unterschiedlich wie nachfolgend zusammengestellt ist. Stamm TG Chol HDL HDL/Chol- Ratio# BB/OK BB. LL T* LEW. LA LEW. 1W ** ** SHR WOKW signifikänt erhöht bzw. erniedrigt. * p<0. 05 ** p<0. 01 # HDL/Cholesterol-Ratio interessanterweise erkrankten von den 12 BB/OK-Ratten bis zur 30. Lebenswo- che nur 7 Tiere (58%), was den diabetesprotektiven Effekt von Yyl-PCR- Produkten erneut unterstreicht (s. S. 32).

Wie für den Typ 1 Diabetes beschrieben sollte es in Abhängig- keit vom Expressionsprofil der Probanden möglich sein, auch die Blutfette zu beeinflussen (vgl. Material & Methoden-Teil).

Vitamin D, Calciuiristoffwechsel und Entwicklungsprozesse Vitamin D gehört neben dem Parathormon (PTH), Calcitonin (CT) und dem PTH related Peptide (PTHrP) zu den Hauptregulatoren des Calciumstoffwechsels. Seit 1966 ist bekannt, daß Vitamin-D in einer aktiven Form vorliegen muß, um seine funktionelle Aufgaben wahrnehmen zu können (143). Die aktive Form entsteht durch die Hydroxylierung am C25 sowie am Cl Atom. Bezeichnet wird diese Form als 1,25-Dihydroxycholecaliferol oder als Vit- amin-D3. Eine Aufgabe des Calciferols besteht darin, der Absen- kung des Pläsmacaiciumspiegels entgegen zu wirken. Erreicht wird dies über eine vermehrt intestinale Calciumresorption, durch gesteigerte renale Calciumresorption und durch gestei- gerte Calciummobilistion aus dem Skelettsystems (144). Die in- testinale Resorption benötigt ein aktives Transportsystem (Calcium bindende Proteine, Cälbindin), das nur in Anwesenheit von Vitamin-D3 zu finden ist. Darüber hinaus ist Vitamin-D3 auch für die Erhaltung der Funktionsfähigkeit der intestinalen Mucosazellen verantwortlich. Calbindine, Osteocalcin, Matrix- Gla-Protein, Osteopontin, Kollagen Typ I etc. werden durch Calciferol induziert. Einfluß auf die Proliferation, Diffe- renzierung, Hormonsekretion und Apoptose werden auch durch Calciferol ausgeübt. Die Bedeutung des Vitamin-D3 wird an Man- gelerscheinungen, sogenannten Hypovitaminosen (Rachitis, Osteomalazie) deutlich (144).

Mit der Entdeckung des Vitamin-D-Rezeptors (VDR ; 145,146) konnte der Wirkmechanismus untersucht werden. Mit Hilfe des VDR konnte gezeigt werden, daß Vitamin-D im Kern von Keratino- zyten der Haut, Langerhansschen Inseln des Pankreas, Lympho- zyten, Promyelozyten etc. lokalisiert ist. Die aktive Form des Vitamin-D ist lipophil, so daß es über Diffusion durch die Zellmembran in die Zelle und weiter in den Zellkern gelangt und dort mit hoher Affinität an seinen Rezeptor bindet. Der VDR gehört zu der Familie der ligandengesteuerten Transkripti- onsfaktoren. Nach Aktivierung durch seinen Liganden, moduliert VDR die Transkription solcher Genabschnitte, die ein dem Re- zeptor zugeordnetes DNA-Element tragen, die sogenannten Hormo- ne-Response-Elemente (HRE). Für den VDR werden diese Genab- schnitte Vitamin-D-Response Elemente (VDREs) genannt. Gene, die VDRE enthalten, sind u. a. Osteocalcin (OC), Calbindin D9k (CALB3) und D28k (CALB1), Vitamin-D 24-Hydroxylase (CYP24), Osteopontin (OPN), atriale natriuretische Peptid (ANP), Para- thormon (PTH), Carbonanhydrase II (CA-II), Integrin, beta-3 (ITGB3), Fibronektin (FN1), c-fos, Parathormon-related Peptid (PTHrP),"slow myosin heavy chain 3" (slowMyHC3), gewebespezi- fischer Plasminogenaktivator (t-PA), Wachstumsfaktor 1 (PIT1 ; POU1F) und Involucrin (IVL).

Die Studie von DeLuca et al. (147) zeigte, daß sich die aktive Form des Vitamins auch in Lymphozyten (CD4 und CD8), insbeson- dere in aktivierten T-Lypmphozyten befindet. Immunsupression von Autoimmunkrankheiten konnte auf die aktive Form von Vit- amin-D3 und Ca2+ zurückgeführt werden. Da im Rahmen der vorlie- genden Erfindung gezeigt werden konnte, daß bei Ca2+-reicher Diät die Diabetesinsidenz von BB. 6S-Ratten von 15 auf 45% er- höht werden kann, muß hier ein weiterer Regelmechanismus von YY1 existieren.

Guo et al. (148) konnte erstmals die Rolle von YY1 im Calcium- stöffwechsel für das Osteocalcingen zeigen. YY1 reprimiert die 1,25-Dihydroxcholecalciferol vermittelte Transaktivierung des knochenspezifischen Osteocalcingens. Aufgrund der Interaktion von YY1 mit beiden Komponenten, VDR und Transkritionsfaktor IIB (TFIIB), ist er in der Lage, die von Vitamin-D abhängigen Transkriptionen zu regulieren. Darüber hinaus konkurriert das VDR/RXR (Retinoid X Receptor) -Heterodimer mit YY1 um die Bin- dungsstellen der VDR-Elemente im Osteocalcingen. Da VDREs in vielen Genen vorhanden sind, übernimmt YY1 dort weitere regu- latorische Rollen.

Zusätzlich ist es YY1 möglich, bereits in die Synthese von Calciferol einzugreifen. Durch die Repression der Transkripti- on des Enzyms, 25-Hydroxyvitamin-D3-24-hydroxylase [24 (OH) ase ; CYP24], ist der Katabolismus gestört. Eine erhöhte Repression konnte in Anwesenheit von TFIIB oder CBP (CREB-Binding- Protein) festgestellt werden (149). Darüber hinaus konnte bei transgenen Ratten, bei denen CYP24 überexprimiert wurde, ge- zeigt werden, daß diese Tiere eine Albuminurie und Hyperlipi- dämie entwickelten. Eine Beobachtung, die in diesem Zusammen- hang an die erhöhten. Blutfette der BB. 6S-Ratten im Vergleich zum Parentalstamm, der BB/OK-Ratte, erinnert. Auch entwickel- ten diese transgenen Ratten atherosklerotische Läsionen an der Aorta (150).

Daß der VDR im Zusammenhang mit dem Typl-Diabetes steht, konn- te von der Gruppe Chang et al. (151) gezeigt werden. Als di- rekter negativer Faktor fungiert die aktive Form von Vitamin-D auch im Renin-Angiotensin-System. Dieses System spielt eine wichtige Rolle in der Regulation des Flüssigkeits-und Elek- trolythäüshalts und somit auch in der Blutdruckkontrolle. Bei Abweichung des Vitamin-D-Levels kommt es zur direkten Inhibie- rung der Renin-Gen-Expression. Somit spielt Vitamin-D nicht nur als Regulator bei der Aufrechterhaltung der Calcium- Hömostase eine Rolle sondern auch im Hömostase-Prozess der Elektrolyte, dem Blutvolumen und Blutdruck (152). Unterstüt- zend dazu kann die Studie von Bhalla et al. (153) herangezogen werden. Man konnte zeigen, daß YY1 synergistisch mit GATA-4 als transkriptioneller Komplex über CBP/p300 die brain natri- uretic"Peptid (BNP)-Gen-Transkription aktiviert. BNP gehört zur Familie der natriuretischen Peptide, die aus 3 Peptiden (atriale natriuretische Peptid, ANP ; BNP ; natriuretische Pep- tid Typ C, CNP) besteht. Ihre Hauptwirkung liegt in einer Zu- nahme der Natriumausscheidung, in einer Gefäßerweiterung (Vasodilatation) und in einer Abnahme der Aldosteronsekretion (wichtigstes Mineralocorticoid, beeinflußt den Natrium-, Kali- um-und Wasserhaushalt-in sämtlichen Geweben), womit sie den eigentlichen Gegenspieler des Renin-Angiotensin-Aldosteron- Systems darstellen. GÄTA-4 gehört zu der Familie der GATA- Zink-Finger-Transkriptionsfaktoren und ist im adulten Gewebe des Herzens, im Darmepithel und Gonaden exprimiert. Während der Fetalentwicklung ist GATA-4 bei der Herzformation betei- ligt. Daher fungieren GATA-4 als auch YY1 gleichermaßen als Schlüsselelement bei der myocardialen Differenzierung und Funktion. Beide beeinflussen zahlreiche Herz-Gene (154-158).

Unter Anderem konnte gezeigt werden, daß YY1 in Verbindung mit der Hypertrophy in Herzmyocyten (über ILlß vermittelt) steht (159).

In Anbetracht der bisher vorliegenden Arbeiten, sowie eigener Ergebnisse (s. o. ), kann der Schluß gezogen werden, daß YY1 in den Calciumstoffwechsel selbst eingreift oder aber durch Cal- cium (und deren Komponenten) beeinflußt wird. Außerdem kann davon ausgegangen werden, daß YY1 eine wesentliche Rolle bei der Blutdruckregulation und Muskelkontraktion zukommt. Daher soll je nach betroffenem Gewebe und in Abhängigkeit vom Ge- schlecht YY1 ab-oder aufreguliert werden.

Mit Hilfe von Maus-Embryonen konnte dargestellt werden, daß YY1 in dem Entwicklungsprozess von Knochen eine bedeutende Rolle hat. Er ist in der Lage das MSX2 Gen zu aktivieren (160). MSX2 gehört zu der Klasse der Homöobox-Genen und wird in zahlreichen Geweben von Embryonen exprimiert. Als Schlüs- selmediator ist MSX2 während verschiedenster Entwicklungspro- zesse, wie zum Beispiel bei der Formation von Schädel, Zähnen, Augen, sowie in der cranio-facialen Morphogenese beteiligt. Er ist involviert in der epithelialen-mesenchymalen Interaktion und Apoptose (161-165). Bei Dysregulation des Expressionslevel von Mxs2 konnte abnormes Wachstum festgestellt werden. Zwei Faktoren, BMP4 (Bone Mòrphogenetic Protein Typ 4) und YY1 re- gulieren die Expression von MSX2 in embryonalen Geweben (166).

Unabhängig von BNP4 ist YY1 im Stande an drei Stellen des Pro- motors von MSX2 zu binden und somit zu aktivieren (160). Die Involvation von YY1 in die Prozesse der Embryogenese, Neuro- nal-, Skelettmuskel-und Knochenentwicklung läßt den Schluß zu, daß YY1 mit Sicherheit bei Mutation oder Fehlregulation an Erkrankungen der Muskeln, Knochen und dem Gehirn entscheidend beteiligt sein wird (167). Daher kann auch hierbei je nach be- troffenem Gewebe und in Abhängigkeit vom Geschlecht, YY1 ab- oder aufreguliert werden.

Nutzung der Erkenntnisse 1. Diagnostik DNA-sequénz und Genexpression Ausgehend von der vorliegenden YY1 Sequenz werden unter Ver- wendung der in Fig. 11 aufgeführten Primer Sequenzänderungen in YY1 zur Diagnose von möglichen Fehlleistungen genutzt. Dazu wird genomische DNA und ssDNA aus mononukleären Blutzellen mit den Primern amplifiziert und sequenziert bzw. Punktmutations- analysen (SNPs) durchgeführt (vgl. Kwok P. Y. SNP genotyping with fluorescence polarisation detection. Hum. Mutat. 19, 2002,315-323).

Darüber hinaus wird RNA aus mononukleären Blutzellen und Gewe- be durch Biopsie (Muskel, Fettgewebe, Haut) bzw. durch Punkti- on von Niere und Leber gewonnen, umgeschrieben in ssDNA und sequenziert (Umschreibung in ssDNA) sowie zur Genexpressions- änalyse eingesetzt, wie oben beschrieben (vgl. S. 22/23, "Genexpressionsstudien"). Es wird davon ausgegangen, daß in den Geweben unterschiedliche Expressionsmuster und auch Spleißvariähten (s. verkürzter Zinkfinger bei BB. 6S in Leber, Pankreas und Hirn) auftreten können und wichtige Hinweise zur Regulation von YY1 in den Geweben und zur Erkrankung geben.

Diese Gewebe kommen in Betracht, da beim Typ-1-Diabetes diabe- tische Folgeerkrankungen auftreten können, die sich in ver- schiedenen Geweben manifestieren (diabetische Nephropathie, Retinopathie, Neuropathie etc. ). Folgeerkrankungen sind u. a.

Fettstoffwechselstörungen (Fettgewebe, Leber), Bluthochdruck (Niere), Herz-Kreislauferkrankungen (Muskelgewebe) aber auch dermatologische Erkrankungen (Haut). Da nicht alle Diabetiker gleichermaßen an allen Folgeerkrankungen leiden, wird erwar- tet, daß das Expressionsprofil von Proband zu Proband unter- schiedlich ist.

ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) Um serologische Tests zur Diagnostik durchführen zu können, kann die Sequenz genutzt werden, um verschiedene ELISA- Verfahren zu etablieren. Dafür werden monoklonale und polyklo- nale Antikörper erzeugt.

Herstellung von polyklonalen und monoklonalen Antikörpern (s. Ref. 89) Es werden erfindungsgemäß polyklonale Antikörper gegen YY1 hergestellt. Zur Erzeugung können Kaninchen genutzt werden.

Das Protein YY1, synthetisch hergestellt und individuell für den Probanden, wird mit einem sogenannten vollständigen Freundschen Adjuvans versetzt. Das Adjuvans schützt das Prote- in YY1 vor der Degradierung. Das Freundsche Adjuvans besteht aus einer Mischung von Paräffinöl und Manidmonooleat, der in- aktivierte und getrocknete Tuberkulosebakterien (Mycobacterium tübercülosis) zugesetzt wurden. Dies bewirkt im Tier eine all- gemeine Immunreäktivität, die primäre Immunantwort. Das Ge- misch wird intradermäl, subkutan oder intramuskulär ins Kanin- chen injiziert. Nach ungefähr vier bis sechs Wochen wird das gleiche Protein mit inkompletten Adjuvans (Bakterien fehlen) erneut injiziert, um eine sekundäre Immunantwort auszulösen.

In Abhängigkeit vom Antikörpertiter wird das Tier entblutet und das Antiserum gewonnen.

Für die Herstellung monoklonaler Antikörper (mAK) wird die von Köhler und Milstein entwickelte Hybridoma-Technik angewandt.

Mäuse werden mit dem YY1-Protein, daß in Abhängigkeit von der DNA-Sequenz des Probanden synthetisch hergestellt wird, immu- nisiert. Die antikörperproduzierenden Milz-Lymphozyten werden anschließend in Kultur mit Myelomzellen (Krebszellen) fusio- niert in Anwesenheit von Polyethylenglykol. Nach Fusionierung werden die sogenannten Hybridome in Mikrotitertestplatten (0,2 ml Volumen) verteilt und mit dem HAT (Hypoxanthin-Aminopterin- Thymidin)-Selektionsmediüm kultiviert. Das Medium gewährlei- stet, daß nur Hybridome wachsen. Nach 10 Tagen Kultur werden die Hybridome vereinzelt und in Kultur weitervermehrt. Die mAK werden aus den Zellkulturüberstanden isoliert.

Reinigung der Antikörper (Affinitätschromatographie) (s. Ref.

89) Da Antiseren neben den spezifischen Immunglobulinen, die gegen YY1 gerichtet sind, noch weitere Antikörper enthalten, soll mittels einer Affinitätschromatographie die Aufreinigung er- folgen. YY1 wird dabei an eine feste Matrix gebunden. Nur An- tikörper, die spezifisch gegen YY1 gerichtet sind, binden. Al- le anderen Antikörper passieren die Säule. Die spezifischen Antikörper werden durch pH-Wert Veränderung (auf 2,5 oder über 11) von YY1 eluiert. Diese spezifisch aufgereinigten Antikörper gegen YY1 können dann in weiteren Schritten im ELISA-Verfahren oder Western blot genutzt werden.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind daher auch Antikör- per, die gegen ein vorgenanntes Protein oder Peptid der Erfin- dung gerichtet sind. Vorzugsweise handelt es sich bei den An- tikörpern um monoklonale Antikörper.

In diesem Zusammenhang dienen auch Sandwich-ELISA zum Antigen- nachweis, und geeignet ist auch der Nachweis spezifischer An- tikörper gegen ein Antigen mittels enzymmarkierten Sekundäran- tikörpern.

Etablierung der ELISA-Verfahren (s. Ref. 89) Nachweis spezifischer Antikörper gegen YY1 mittels enzymmar- kierten Sekundärantikörpern Synthetisch hergestellte YYl-Proteine werden an einen festen Träger (Kunststoffoberflächen, Mikrotiterplatte) gekoppelt.

Anschließend wird das zu untersuchende Probandenmaterial (Se- rum) überschichtet. Spezifisch gegen YY1 gerichtete Antikörper im Serum befindlich, binden. Ungebundene Komponenten werden heruntergewaschen. Mittels eines Sekundärantikörpers, chemisch mit einem Enzym markiert, wird in der Farbreaktion das Sub- strat umgewandelt. Anhand eines mitgeführten Standars kann dann, nach Erstellung der Eichkurve, direkt mit der Antikör- perkonzentration-korreliert werden.

Sandwich-ELISA (Antigennachweis) (s. Ref. 89) Die Antikörper, spezifisch gegen YY1 gerichtet, werden an ei- nen festen Träger (Kunststoffoberflächen, Mikrotiterplatte) gebunden. Im Anschluß daran wird das Probandenmaterial über- schichtet. Die YY1-Proteine binden spezifisch an den Antikör- per. Ungebundene Komponente werden heruntergewaschen. Mittels monoklonaler Antikörper und eines Anti-Antikörpers (Enzym-mar- kiert) wird die Menge an YY1-Proteinen ermittelt.

Westernblot (s. Ref. 144) Es wird davon ausgegangen, daß zwischen den Probanden, bedingt durch alternatives Spleißen oder bereits genetisch bedingt, sich die YYl-Proteine in ihrer Größe (Molekulargewicht) unter- scheiden.

Daher kann mit Hilfe einer SDS-Polyacrylamid-Gelelekrophorese (SDS-Page) YYl-Proteine nach ihrer Größe aufgetrennt werden.

Durch das SDS erhalten die Proteine negative Ladungen (SDS- Bindung). Nach dem gelelektrophoretischen Lauf wird das Trenn- gel auf eine immobilisierte Membran (Nitrozellulose) transfe- riert. Mittels spezifischer Antikörper gegen YY1 gerichtet und Alkalischer Phoshatase werden die Proteine angefärbt.

Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Bestim- mung der Neigung, an Typ-1-Diabetes, Autoimmunerkrankungen im allgemeinen (insbesondere, Arthritis, Multiple Sklerose, Au- toimmune Encephalomyelitis, Zöliakie), Typ-2-Diabetes, Krebs (insbesondere Lungenkrebs, Brustkrebs, Darmkrebs, u. a. ) oder Mineral-und Lipidstoffwechselstörungen zu erkranken, bei dem man gehomische DNÄ aus isolierten mononukleären Blutzellen am- plifiziert, sequenziert und man Änderungen oder Abweichungen der Nukleinsäuresequenz, die für ein Protein mit der in SEQ ID N0 : 6 dargestellten Aminosäuresequenz kodiert, bestimmt, wobei Abweichungen von Codons (nicht-stille Mutationen) eine erhöhte Neigung anzeigen, an einer der vorgenannten Krankheiten zu er- kranken.

Weitere Mutationen, die auf höhere Diabetesneigung hindeuten können, liegen in folgenden Sequenzbereichen und lassen sich unter Verwendung folgender Primer nachweisen : Intron 4 : Pri- mer : K815-F/K817-R ; K815-F/K875 ; K821-F/K817-R ; K821-F/K870- R ; K874-F/K870-R. Zur Amplifikation verwendet man vorzugsweise die Primer K823-F/K825-R ; K884-F/K806-R ; K801-F/K804-R ; K814- F/KK832-R ; K828-F/K833-R ; K831-F/K817-R ; K815-F/K870-R ; K815- F/K818-R ; K816-F/K819-R ; K834-F/K836-R, F15/R12 ; F15/R14 ; F15/R13 ; F57/R16 ; F57/R20 ; F57/R21 ; F59/RR25 ; F59/RR30 ; F59/R33 ; F95/R34 ; F96/R39 ; F95/R48 ; F95/R50 ; F60/R7 ; F60/R8 ; F60/R66 ; F60/R67 ; F96/R76 ; F96/R77 ; F96/R81 F96/R83 ; F33/R1 ; F33/R4 ; F33/R15 ; F39/R28 ; F40/R3 ; F41/R5 ; oder andere Kombina- tiönen.

Ferner eingeschlossen ist ein Verfahren zur Bestimmung der Neigung, an Typ-1-Diabetes, Autoimmunerkrankungen im allgemei- nen (insbesondere Arthritis, Multiple Sklerose, Autoimmune En- cephalomyelitis, Zöliakie), Typ-2-Diabetes oder Krebs (insbe- sondere Lungenkrebs, Brustkrebs, Darmkrebs, u. a. ) oder Mine- ral-und Lipidstoffwechselstörungen zu erkranken, bei dem man RNA aus isolierten mononukleären Blutzellen oder Gewebsbiopsi- en (Fettgewebe, Muskelgewebe, Haut) -bzw. Gewebspunktionen (Leber, Niere) isoliert, amplifiziert und quantifiziert, wobei eine erhöhte/verminderte Expression eine erhöhte/verminderte Neigung anzeigt, an Diabetes, Autoimmunerkrankungen im allgemeinen (insbesondere Arthritis, Multiple Sklerose, Au- toimmune Encephalömyelitis, Zöliakie), Typ-2-Diabetes, Krebs (insbesondere Lungenkrebs, Brustkrebs, Darmkrebs, u. a. ) oder Mineral-und Lipidstoffwechselstörungen zu erkranken. (vgl. oben zu'Genexpression').

2. Behandlung 2.1 Nutzung von DNA oder Antisense Zur Abregulation von YY1 soll DNA oder Antisense von der vor- liegenden Sequenz mittels PCR erzeugt und appliziert werden.

Sowohl DNA als auch Antisense-Oligonukleotide werden modifi- ziert, um ihre Stabilität gegenüber den meisten Exo-und Endo- nukleasen zu erhöhen (168). Die Applikation der stabilisierten DNA oder Antisense erfolgt subkutan (s. c. ) oder intramuskulär (i. m. ). Die Dosis richtet sich nach der individuellen Expres- sion von YY1, die in bestimmten Abständen geprüft werden soll, um eine ausgewogene Balance von YY1 im Hinblick auf andere Ge- ne zu erreichen.

Antisehse Öligonukleotide Da die Antisense Oligonukleotide eine hohe Spezifität besit- zen, können sie spezifisch binden, die RNA blockieren und so- mit die Expression verhindern. Die Antisense Oligonukleotide sollen im Abstand von 2 bis 20 Basen über die Sequenz verteilt werden. Dabei wird vorzugsweise bei Position 73 begonnen. wichtige Fragmente, bei denen mehrere Antisense- Oligonukleotide hergestellt wurden (immer um eine Position verschoben), sind : 73 bis 564,565 bis 717,718 bis 834,835 bis 1071 ; 955 bis 999, 955 bis 1041,1000 bis 1041,1042-1125, 1759 bis 1848, 1849 bis 1938, 967 bis 1125,1071 bis 1938 so- wie die Intronsequenz 1126-1758. Die PCR-Amplifikation erfolgt wie beschrieben (12).

Oligonukleotid-Modifikationen Zur Verbesserung der Effizienz/Stabilität mit Hilfe von : 1.) Methylphosphonaten 2. ) Phosphorothioaten - Nuclease-resistent, wasserlöslich, starke Hybrydisierung mit m-RNA - steigert RNase H Aktivität, die verantwortlich ist für den Abbau von m-RNA im Doppelstrang 3. ) Phosphodithionate 4. ) Polyamid-Rückgrat (PNA-DNA-Chimäre) statt Pentose- Phosphat (Uhlmann E., Peyman A., Breipohl G., Angew. Chem.

1998,110, 2954-2983. ) - Chimäre besser für die Zellaufnahme Verbesserung der Transporteigenschaften mit Hilfe von : 1.) Alkylierung (Hydrophobie erhöht) 2. ) Kopplung an Zucker Ribozyme Ribozyme sind katalytische RNA, mit enzymatischen Eigenschaf- ten (Phosphatester-Hydrolyse ; Nobelpreis Chech/Altmann). Ribo- zyme erkennen bestimmte Basensequenzen in der mRNA und zer- schneiden das Molekül an diesen Stellen. Sie haben demnach ei- ne Doppelfunktiön, das Erkennen einer bestimmten Struktur, dann. hydrolytische Spaltung einer Phosphordiesterbindung an einer bestimmten Stelle. Zwei Klassen von Ribozymen haben be- sondere Bedeutung. Solche mit einer hammerförmigen ("hammer- head") -Struktur und andere, die eine Haarnadel ("hairpin")- Struktur aufweisen. Die von den Ribozymen entwickelte Endonu- kleaseaktivität kann praktisch gegen alle RNA-Strukturen wirk- sam werden.

Triple-Helix-Bindung Darüber hinaus soll ein dritter Nukleotidstrang an eine DNA- Doppelhelix über zusätzliche (Hoogsteen-) Basenpaarung gekop- pelt werden. Damit entsteht ein Stück eines Dreifachstranges, das nicht mehr transkribiert werden kann. Die Positionen in der DNA sind abhängig von der Sequenzstruktur des Probanden.

Nachteil : Erkennung nur in Purin-reichen Regionen Gegenstand der Erfindung ist daher auch die Verwendung einer vorgenannten Nukleinsäure oder eines Antisense-Oligonukleotids zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung. Die pharmazeutische Zusammensetzung dient insbesondere zur Behand- lung von Typ-1-Diabetes, Autoimmunerkrankungen im allgemeinen (insbesondere Arthritis, Multiple Sklerose, Autoimmune Ence- phalomyelitis, Zöliakie), Typ-2-Diabetes oder Krebs (insbeson- dere Lungenkrebs, Brustkrebs, Darmkrebs, u. a. ) oder Mineral- und Lipidstoffwechselstörungen.

Ferner betrifft die Erfindung eine pharmazeutische Zusammen- setzung, die eine vorgenannte Nukleinsäure oder ein Antisense- Oligonukleotid sowie gegebenenfalls zusätzliche, pharmazeu- -tisch verträgliche Hilfs-und/oder Trägerstoffe enthält. Die Zusammensetzungen sind vorzugsweise in einer zur intravenösen (i. v.), subcutanen (s. c. ) oder intramuskulären (i. m. ) Applika- tion geeigneten Form formuliert.

2.2 Nutzung des Proteins Das Protein YY1 oder Peptide desselben werden synthetisiert, um appliziert werden zu können. Bevorzugte AS-Fragmente sind : 1 bis 165,166 bis 215,216 bis 254,255 bis 323,255 bis 302, 255 bis 309 (mit und ohne Mutation), 310 bis 323 (mit und ohne Mutation), 324 bis 351,352 bis 381,382 bis 411. Darüber hin- aus wird der verkürzte BB. 6S- Bereich von 299 bis 351 bevor- zugt. In diesem Zusammenhang kann die für ein Protein mit der in SEQ ID NO : 6 kodierende Nukleinsäuresequenz, insbesondere die Sequenz gemäß SEQ ID NO : 5, oder Fragmente derselben in ei- nen Expressionsvektor eingebracht und unter Bedingungen expri- miert werden, die für das gewählte Vektorsystem geeignet oder vorteilhaft sind. Entsprechende Verfahren sind dem Fachmann wohlbekannt.

Dabei stehen Modifikationen des Proteines oder der Peptide durch : a) Acetylierungen b) Deacetylierungen c) Methylierungen d) Phosphorylierungen e) 0-und N-Glykösylierungen im Vordergrund, um Stabilität und Aktivität zu erhöhen bzw. zu verändern.

Die Erfindung betrifft somit auch die Verwendung eines oder mehrerer der oben genannten Proteine und/oder Peptide zur Her- stellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung. Die pharma- zeutische Zusammensetzung dient insbesondere zur Behandlung von Typ-1-Diabetes, Autoimmunerkrankungen im allgemeinen (ins- besondere Arthritis, Multiple Sklerose, Autoimmune Encepha- lomyelitis, Zöliakie), Typ-2-Diabetes oder Krebs (insbesondere Lungenkrebs, Brustkrebs, Darmkrebs, u. a. ) oder Mineral-und Li- pidstoffwechselstörungen.

Eingeschlossen sind ferner pharmazeutische Zusammensetzungen, die ein oder mehrere der oben genannten Proteine und/oder Pep- tide enthalten, wobei die Proteine und Peptide gegebenenfalls wie oben beschrieben modifiziert sind. Die Zusammensetzungen enthalten gegebenenfalls zusätzliche, pharmazeutisch verträg- liche Hilfs-und/oder Trägerstoffe und sind vorzugsweise in einer zur intravenösen (i. v. ), subcutanen (s. c. ) oder intra- muskulären (i. m. ) Applikation geeigneten Form formuliert.

Spleißvarianten Darüber hinaus können alle möglichen Spleißvarianten (s. un- ten) mit Hilfe der im Rahmen der Erfindung untersuchten Se- quenz erfaßt werden, um verschiedenste Proteine erzeugen zu können. Die Spleißvarianten unterschiedlicher Größe sind nach- folgend aufgezeigt. Diese Proteine werden vorzugsweise wieder- um modifiziert (s. oben), um einen spezifischen Einsatz zu er- möglichen. Sie können entweder einzeln auch in Kombination eingesetzt werden.

Potentielle Spleißvarianten (http ://www. itba. mi. cnr. it) DONOR SITES : POSITION EXON INTRON SCORE ---157 GAG GTGGAG 78. 379 GAG GTGATT 85. 406. GAG GTAGTG 81. 409 GTA GTGGGT 81. 475 CCG GTACCC 75. 668. CGG GTAATA 80. 694. CAG GTGCAG 78. 1129 CAG GTAGAG 79. 1172 CTG GTCAGG 83. 1214 GGG GTATTT 73. 1273 CAG GTGTTA 77. 1363 GTA GTGAGT 80. 1370 GTA GTGTGT 72. 1423 CAG GTGACA 84. 1453 CTC GTGAGT 79. 1605 CCA GTGTGT 78. 1671 ATA GTAGGT 80. 1675 TAG GTGGTT 77. 1693 GCA GTGAGC 79. 2172 AAG GTGTTT 78. . ACCEPTOR SITES : POSITIONINTRON EXON SCORE 31 CTCCCGCAG CCCA 87. 36 GCAGCCCAG GAGC 85. 335 GCGCTGCAG CCGC 78. 747 GGTCTTCAG ATGA 80. 882 ACCTCTCAG ACCC 80. 1036 CGGTCCCAG AGTC 78. 1053 TCTGTGCAG AATG 77. 1274 GGACTGCAG GTGT 80. 1333 TTCTAGCAG GTTT 79. 1365 GTTTTGTAG TGAG 80. 1418 TGGCTACAG CTCC 77. 1424 CAGCTCCAG GTGA 81. . 1447 TGCTTATAG AAGA 80. 1510 ACTTCCTAG AGTG 81. 1572 TTTCTCAAG AACT 84. 1713 GATCCCCAG GTTC 80. 1734 TTTGCCAAG AGGG 78. 1763 CCTTGACAG TGCA 85. 1989 CCTCTTCAG GAGT 79. 2037 TATTTCTAG GAAG 83.

Die Spleißvarianten werden durch entsprechende Restriktionsen- zyme erhalten. Die Verwendung der Spleißvarianten hängt von der individuellen Situation der Probanden ab.

Antikörper Darüber hinaus werden monoklonale Antikörper für Bereiche des YYl-Proteins erzeugt und zur Abregulation verwendet. Auch hierbei sind die Antikörper der individuelle Situation anzu- passen.

2.3 Erhöhung der YY1-Expression Die gesamte DNA-Sequenz oder Teilsequenzen von YY1 (Positionen 73 bis 564,565 bis 717,718 bis 834,835 bis 1071 ; 955 bis 999,955 bis 1041,1000 bis 1041,1042-1125, 1759 bis 1848, 1849 bis 1938,967 bis 1125, 1071 bis 1938 sowie die Intronse- quenz 1126-1758), die sich nach der individuellen Situation der Probanden richtet, werden in Plasmiden unter Kontrolle eu- karyotischer, gewebsspezifischer Promotoren kloniert und zur Langzeitexpression von YY1 an sich oder seiner Teilsequenzen appliziert, um eine gewebsspezifische Erhöhung der Expression von YY1 oder seiner Teilsequenzen zu erreichen. Die Vektorsy- steme werden entsprechend dem Stand der Technik einge- setzt (169).

2.4. Regulation anderer Gene durch YY1-Antisense Angesicht der Multifunktiohalität von YY1 wurde Antisense-DNA von YY1 mit den in der Genbank vorhandenen Sequenzen auf Über- seinstimmung mit anderen Genen geprüft (siehe Figur 13 ; die angegebenen Positionen (Numerierungen) beziehen sich auf den kodierenden Bereich und nicht auf die Nukleotidnumerierung des Sequenzprotokolls). Diese entsprechenden Sequenzen sollen un- ter Nutzung von Kern-Lokalisationssignalen (NLS) mit Domänen von YY1 gezielt zur Beeinflussung dieser Gene (funktionelle Domäne) eingesetzt werden (vgl. Fig. 8).

Die Aktivierühgsdomänen, Repressionsdomänen und Zinkfinger von YY1 sollen allein und in allen Kombinationsmöglichkeiten mit- einander, mit der Antisense-DNA kreiert werden. Die Kombinati- on ist abhängig vom Krankheitsbild, den betroffenen Organen und vom Geschlecht.

Kongene und tränsgene Tiere Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurden ferner kongene nicht-menschliche Säuger, vorzugsweise Ratten, erzeugt, die eine für (das mutierte) YY1 gemäß SEQ ID NO : 4 kodierende Nu- kleinsäuresequenz enthalten. Bei dem Säuger handelt es sich vorzugsweise um eine Ratte. Die Säuger sind durch eine ernied- rigte Typ-1-Diabetesinzidenz charakterisiert. In gleicher Weise ist es möglich, transgene Säuger, vorzugsweise Ratten, zu erzeugen, die sich dadurch auszeichnen, dass sie ebenfalls eine für (das mutierte) YY1 kodierende Nukleinsäuresequenz (s. o. ) enthalten.

Die Erfindung stellt ferner erstmals ein Verfahren zum Identi- fieren diabetesprotektiver Wirkstoffe bereit, bei dem den vor- genannten Säugern potentielle Wirksubstanzen verabreicht wer- den und man überprüft, in wieweit die Neigung, Typ-l-Diabetes zu entwickeln, reduziert wird. Gegenstand der Erfindung ist somit auch die Verwendung eines transgenen oder kongenen nicht-menschlicher Säugers, dessen Keim-und somatische Zellen eine Nukleinsäure oder einen Nukleinsäureabschnitt enthalten, die/der für ein Protein mit der in SEQ ID NO : 4 (SHR) gezeigten Aminosäuresequenz oder einer dazu homologen Aminosäuresequenz (s. o. ) kodiert, wobei die homologe Aminosäuresequenz an Posi- tion 303 Methionin und an Position 311 Arginin aufweist, zum Identifizieren Diabetes-protektiver Substanzen.

Die Erfindung betrifft ferner transgene nicht-menschliche Säu- ger, insbesondere Ratten, deren Keim-und somatische Zellen ei- ne Nukleinsäure oder einen Nukleinsäureabschnitt enthalten, die/der für ein Protein mit der in SEQ ID NO : 2 gezeigten Ami- nosäuresequenz oder einer dazu homologen Aminosäuresequenz (s. o. ) kodiert, wobei die homologe Aminosäuresequenz an Posi- tion 303 Arginin und an Position 311 Lysin aufweist.

Weitere Erfinduncrsgegenstände Die Erfindung betrifft ferner weitere Gegenstände und Ausfüh- rungsformen, die sich für den Fachmann vor dem Hintergrund der vorliegenden Offenbarung mühelos erschließen.

In diesem Zusammenhang sind auch Vorrichtungen (Kits) zur Durchführung eines der vorgenannten (Screening-) Verfahren zu nennen.

Methoden 1. Tierhaltung 2. Erzeugung der kongenen BB. 6S 2.1. Erzeugung weiterer kongener Linien 3. Phänotypische Charakterisierung 3.1. Diabetesinzidenz und Blutglukosebestimmung 3.2. Lymphozyten-Phänotypen 3.3 Blutdruck 4. Statistische Analyse 5. Molekularbiologische Methoden 5.1. Isolierung Langerhansscher Inseln des Pankreas 5. 2. DNA-Isolierung 5.3. RNA-Isolierung aus Geweben 5.4. RT-PCR 5.5. Sequenzierung von YY1 5.6. Eluierung der zweiten Bande bei BB. 6S 5.7. Genexpressionsstudien 5.8. RNA-Isolierung aus EDTA-Blut 6. Feinkartierung von YY1 (Sicherstellung, dass YY1 in dem diabetesprotektiven Bereich liegt) 7. Prüfung des Polymorphismus im Intron 3 unter Nutzung weite- rer Ratten-Stämme 8. Weitere Untersuchungen in vitro 9. Weitere Untersuchungen in vivo 10. Primerbedinguhgen bei der Sequenzierung 11. Mikrosatellitehmärker 1. Tierhaltung Die Tiere wurden unter Semibarrierebedingungen gehalten und hatten freien Zugang zu Pelletfutter (Ssniff R-Zucht, Spezia- litäten GmbH, Soest) sowie Wasser (pH 2,5-3).

Die Tiere wurden unter einem 12 Stunden Rhythmus gehalten (12h Licht, 12h Dunkelheit). In einem Käfig befanden sich maximal 3 Tiere.

Alle tierexperimentellen Arbeiten erfolgten unter Einhaltung der gültigen Tierschutzbestimmungen.

2. Erzeugung der kongenen BB. 6S Käuflich erworbene, männliche SHR/Mol-Ratten (Mollegaard Bree- ding Ltd, Dänemark) wurden mit diabetischen BB/OK-Weibchen ge- kreuzt. Die resultierenden Fl-Hybriden wurden auf diabetische BB/OK-Ratten insgesamt 7 mal rückgekreuzt. Die Nachkommen jeder Rückkreuzungsgeneration wurden auf Heterozygotie in dem interessierenden chromosomalen mittels PCR-analysierter Mikro- satellitenmarker, die die interessierenden Bereiche flankie- ren, genetischen analysiert. Die für diesen Bereich heterozy- göten Tiere wurden dann für die Erzeugung der nächsten Rück- kreuzungsgeneration angepaart. Für den chromosomalen Bereich heterozygoten Tiere der 7 Rückkreuzungsgeneration wurden dann untereinander (intercross) gekreuzt und erneut genetisch ana- lysiert. Zunächst wurden alle Tiere, die für den interessie- renden chromosomalen Bereich homozygot für Allele der SHR- Ratten waren, selektiert. Diese Tiere wurden dann erneut mit- tels 139 PCR-analysierter Mikrösatellitenmarker, die etwa 96W des Genoms der Ratte abdecken, genetisch charakterisiert. Tie- re, die dann für diese 139 Marker homozygot für Allele der BB/OK-Ratte waren, wurden für die Etablierung (Founder) der kongenen Linien BB. SHR eingesetzt und phänotypisch charakteri- siert.

Das Markerspekrum wurde erweitert, um einerseits den geneti- schen BB/OK-Background abzusichern (s. Material&Methoden-Teil) und um andererseits möglichst Rekombinationen in kleinen Be- reiche erkennen zu können : D6Rat3-D6Ratl-D6woxl3-D6Ratl01- Ighe/Ckb-D6Mgh2-D6Rat94-D6Ratl83-D6RatlO-D6Rat7-D6Rat75- D6Rat9-D6Rat6-D6Ratl60-D6Mgh9-D6Ratl84.

Diese Linien wurden für die Weiterzucht zwecks Minimierung der Diabetes-protektiven Region eingesetzt. Durch die Etablierung verschiedener subkongener Linien (BB. 6Sa-f) mit dem Phänotyp der BB. 6S-Ratte, wurde der in Frage kommende chromosomale Be- reich auf < 2 cM (30-40 Gene) eingegrenzt.

Kartierung des diabetesprotektiven Gens um den Locus D6Mgh2.

Tabelle 2 : cM BB. 6S BB. 6a BB. 6b BB. 6c BB. 6d BB. 6e BB. 6f D6Mgh4 BB BB BB BB BB BB BB 2. 1 D6Ratl3 BB BB BB BB BB BB BB 4.4 D6Wox5 BB BB BB BB BB BB BB 1.5 D6Rat66 BB BB BB BB BB BB BB 2.0 D6Ratl84/SHR BB BB BB BB BB SHR D6Mgh9 0. 8 D6Ratl60 SHR BB BB BB BB BB SHR 1. 3 D6Rat6 SHR BB BB BB BB BB SHR D6Rat9 SHR BB BB BB BB BB SHR 0. 4 D6Rat75 SHR BB BB BB BB BB 0.4 D6Rat7 SHR BB BB BB BB BB SHR 2. 1 D6RatlO SHR BB BB BB BB BB SHR 1.6 D6Ratl83 SHR BB SHR BB BB BB SHR 0. 4 D6Rat94 SHR BB SHR BB BB BB SHR 1.9 D6Mgh2 SHR SHR SHR BB BB BB SHR Ighe SHR SHR BB SHR SHR SHR SHR 1.7 Ckb/SHR SHR BB SHR SHR BB SHR D6Ratl01 1. 0 D6Ratl SHR SHR BB BB BB SHR BB 1. 9 D6Rat3 SHR SHR BB BB SHR SHR BB Diabete-15% 10% 22% >50% >50% >50% 14% sinzidenz 2.1. Erzeugung weiterer kongener Linien BB. K (arlsburg) W (ild) R (atte) -Ratten Neben diabetesresistenten SHR-Ratten wurden auch Wildfangrat- ten zur Erzeugung von kongenen BB. K (arlsburg) W (ild) R (atte) - Ratten verwendet. Analog der BB. 6S-Linie wurde der gleiche chromosomale Bereich der BB/OK von 15 cM durch den von Wild- fangtieren ausgetauscht (BB. 6W). siehe Herstellung kongener Ratten-Linien unter Punkt 2.

3. Phänotypische Charakterisierung Die Körpermasse wurde von nichtdiabetischen Ratten in der zwölften Woche bestimmt. (Waage NAGEMA, VEB Wägetechnik Rapido, Wägebereich 1-lOOOg, e=O, lg).

Zusätzlich wurden zu diesem Zeitpunkt die Blutglucose, das Se- rum Insulin, Plasma-Cholesterol und die Triglyzeride bestimmt.

Blutproben würde durch Punktion des Augenplexsuses nach An- ästesie mit Isoflurane (Abbott, Wiesbaden, Deutschland) durch- geführt.

Die Blutfette wurden über eine automatische Analyse (Roche Cobas Mira Plus, Roche, Schweiz) durchgeführt.

Das ELISA-Verfahren (Rat Insulin ELISA, Mercodida AB, Uppsala, Schweden) diente zur Bestimmung der Serum-Insulin-Konzentrati- on.

3.1. Diabetesinzidenz und Blutglukosebestimmung Die Diabetesinzidenz der Stämme wurde longitudinal in einer Inzuchtgeneration ermittelt. Dazu wurde vom 50. -200. Le- benstag zweimal wöchentlich mittels Teststreifen (Diaabur-Test 5000, Bbehringer, Mannheim, Deutschland) auf Glukosurie gete- stet und im positiven Fall der Blutzucker bestimmt (Analyzer ESAT 6660-2, Prüfgerätewerk Medingen GmbH). Wenn innerhalb von 2 Tagen zweimal eine Hyperglykämie (Blutglukose >15 mmol/1 entspricht > 300mg/dl) nachgewiesen wurde, galten die Ratten als diabetisch.

3.2. Lymphozyten-Phänotyp Die Lymphozytenisolation von nichtdiabetischen Ratten erfolgte über Dichtgradientenzentrifugation unter Nutzung von Histpaque-1083 (Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Deutschland).

Die Messumg erfolgte über eine Zwei-Farben Immunfluoreszenz- Technik. (EPICS Profile II Flow Cytometer (Coulter, Hialeah, USA). Für die Phänotypisierung wurde eine Mindestanzahl von 0,5 x 106 Zellen festgelegt. Folgende monoklonale Antikörper wurden benutzt : Zellen mAK Firma T-Zellen R73-FITC Medizinische Hochschule, Hannover, Deutschland T-Zellen 3G2-FITC Medizinische Hochschule, Hannover, Deutschland B-Zellen OX33-FITC Pharmlgen, Heidelberg, Deutschland NK - Zellen 10/78 - FITC Pharmigen, Heidelberg, Deutschland TH-Zellen W3/25-FITC Serotec, Eching, Deutschland Ts/c-Zellen 341-FITC Pharmigen, Heidelberg, Deutschland akt. T-Zellen OX39-PE Pharmigen, Heidelberg, Deutschland TH1/TH2-like OX-22-PE Pharmigen, Heidelberg, Deutschland Zellen W3/25-FITC Serotec, Eching, Deutschland 3.3. Blutdruck Der systolische Blutdruck wurde im Alter von 12 bis 14 Wochen zwischen 9.00 bis 11.00 Uhr über die Schwanz-Methode gemessen (Kent Scientific Corporation, Kent, England). Drei separate Punkte wurden benutzt, um einen Endwert zu erhalten.

4. Statistische Analyse Die Berechnung der Mittelwerte und der Standardfehler (SD) er- folgte mit dem Statistikprogramm SPSS. Die Signifikanzen wur- den mittels ANOVA Analyse berechnet.

5. Molekularbiologische Methoden 5.1. Isolierung Langerhansscher Inseln des Pankreas Die Isolierung der Langerhanschen Inseln erfolgte mittels Kollagenaseverdau (Biochrom) und Dextran- Dichtegradientenzentrifugation (Dextran, Fluka, Schweiz). Es wurden mindestents 3 und maximal 15 Pankreata pro Kollagenase- verdau eingesetzt.

Nach Entnahme der Pankreata wurden diese in die Kollagenaselö- sung (30 mg Kollagenase (Biochrom) gelöst in 40 ml Hank's Salzlösung (Sigma) bei 37°C für 10 min) überführt und mittels Handschütteln verdaut. Anschließend wurde mit Hanks'Salzlösung das Inselsediment dreimal gewaschen. Nach Abzentrifugation der Inseln (1900 U/min) wurde der Überstand dekantiert und mit Dextranlösung (11 g Dextran/39 ml Hank's Salzlösung) aufgewir- belt. Die Inselemulsion wurde anschließend mit 3 weiteren Dichtegradienten von jeweils 4 ml überschichtet. Nach 20- minütiger Zentrifugation (1900 U/min) erfolgte die Handlesung der Inseln unter dem Mikroskop. Zur Genexpressionsanalyse wur- den jeweils 500 Langerhanssche Inseln eingesetzt.

5.2. DNA-Isolierung Die Isolierung der genomische DNA aus Lebergewebe wurde nach Vorschrift des Herstellers (Wizard 0, Genomic DNA Purification Kit, Promega) durchgeführt.

5.3. RNA-Isolierung aus Geweben Die RNA-Isolierung erfolgte nach den Angaben des Herstellers (RnEasy Mini Kit, Qiagen).

5.4. RT-PCR Die Umschreibung der RNA in ssDNA (cDNA) erfolgte mit dem Re- versen Transcription System der Firma Promega.

Für die Umschreibung wurde die RNA-Konzentration (Photometer, Eppendorf) auf 1,5 yg eingestellt.

Die 1, 5yg RNA wurden mit 1µl Random-Hexamerprimer (Promega) versetzt und anschließend auf 13, 5y1 Endvolumen mit Rnase freiem Wasser (Promega) aufgefüllt. Anschließend wurde dieser RNA-Mix für 5 min bei 65°C erhitzt und danach auf Eis für eine Minute abgekühlt. Nach Zugabe des RT (Reverse Transkriptase)- Mixes (6, 5 yl) erfolgte die Umschreibung im Cycler (Thermocy- cler, Techne, Cambridge) nach folgendem Programm : 50 min 42°C 10 min 70°C RT-Mix enthält : Volumen Komponenten Firma + 4µl 5x MMLV-Puffer Promega + 1y1 lOmM dNTP's Promega + 0, 5y1 rRNasin Promega + ljul MMLV-Reverse Transkritase Promega 6, 5µl Endvolumen Nach Beendigung des Cycler-Programmes wurde die ssDNA mit 50y1 bidest-Wasser versetzt.

Die ssDNA wurde für die Expressionsstudien sowie für die Se- quenzierung genutzt.

5.5. Sequenzierung von YY1 Zur Sequenzierung des Gens wurde genomische DNA aus Lebergewe- be (Wizard 0, Genomic DNA Purification Kit, Promega) und RNA aus isolierten Langerhansschen Inseln, Pankreas, Leber und Ge- hirn der BB/OK-, SHR-und BB. 6S-Ratte gewonnen (Rneasy Mini Kit, Qiagen). RNA wurde dann in ssDNA bzw. cDNA (siehe Pkt.

5.4) nach Angaben des Herstellers umgeschrieben (Reverse Tran- scription System, Promega). Sowohl genomische als auch cDNA wurde mittels PCR (Einsatz von GeneAmp High Fidelity PCR Sy- stem, Applied BioBiosystems) unter Verwendung verschiedener Primer so amplifiziert, daß überlappende Genprodukte zur Se- quenzierung zur Verfügung standen (vgl. Fig. 11 ; Promotor : K823-F/K825-R* ; Promotor und Exon 1 : K884-F/K806-R ; Exon 1 : K801-F/K804-R ; K814-F/KK832-R* ; Exon 2 und 3 : K828-F/K833-R ; K831-F/K817-R ; Exon 4 : K815-F/K870-R ; K815-F/K818-R ; K816- F/K819-R ; K834-F/K836-R). Die PCR wurde wie folgt durchge- führt : 3min 94 °C, gefolgt von 35 Zyklen a 30sec 94 °C, 1 min 55 oder 60 °C (*), 45 sec 72 °C mit anschließender Elongation von 3min bei 72 °C.

Die amplifizierten Genprodukte wurden nach Reinigung mit Ami- conMicrocon-PCR-Zentrifälfiltern (Millipore, USA) für die Se- quenzier-PCR verwandt. Die gereinigten PCR-Produkte (250 ng) wurden unter Verwendung von ABIPRISMs BigDye Terminators v3.0 -Cycle Sequenzing-Kit nach Vorschrift des Herstellers (Applied Biosystems) amplifiziert (25 Zyklen : 10 sec. 96 °C, 4 min 60°C). Die amplifizierten Genprödükte wurden anschließend mit Alkohol gefällt, getrocknet, in Formamid (4 yl) und Loading Buffer (1y1) aufgenommen, 2 min bei 90 °C denaturiert und da- nach mit dem ABI PRISM 377 (Applied Biosystems) sequenziert.

Die Sequenzauswertung, einschließlich der Erstellung der Pro- teinsequenz erfolgte mit der Sequenzanalysesystemsoftware v3.4. 1 (Applied Biosystems, USA). Die Genprödukte wurden wie- derholt sequenziert und analysiert, um Artefakte ausschließen zu können.

Die Prüfung der Sequenz mit der Genbank erfolgte online (www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST).

5.6. Eluierung der zweiten Bande bei BB. 6S Es wurde nach der gelelektrophoretischen Auftrennung die zwei- te Bande (Pankreas, Leber, Gehirn) herausgeschnitten und mit dem WizardPCR Preps DNA Purification System der Firma Promega eluiert. Nach Amplifizierung mit den Primern K831-F/K870-R er- folgte die Sequenzierung am ABI PRISM 377 (Applied BioBiosy- stems (vgl. Fig. 12 und SEQ ID NO : 7).

5.7. Genexpressionsstudien Aus gewonnener RNA von isolierten Langerhansschen Inseln, Pan- kreas, Leber, Gehirn, Thymus und Milz von 8 Tage alten Ratten der Inzuchtstämme BB/OK, SHR, BB. 6S und LEW ("unbelastete" Kontrolle) erfolgte die Umschreibung in ssDNA (siehe Punkt 5. 4). Die optimalen PCR-Bedingungen wurden für jedes Primer- päar unter Verwendung von ssDNA diabetes-resistenter LEW- Ratten erarbeitet. Als Kontrollsituation (housekeeping gene) wurde die Genexpression von GAPDH zugrunde gelegt. Gewebsspe- zifische cDNA wurde mit den Primern für GAPDH (F : S'TCCCTCAÄGATTGTCAGCAAT ; R : 5AGATCCACALACGGATACATT3, Pro- duktgröße = 308bp) ünd dèn YYl-Primern K801-F/KK804-R (Exon 1) und K831-F/K8818-R bzw. K831-F/K870-R (Zinkfinger) amplifi- ziert. Die Genprodukte wurden gelelektrophoretisch aufgetrennt und die Expressionsstärke zwischen den Stämmen unter Berück- sichtigung von GAPDH und Nutzung des Typhoon 8600 Variable Mo- de Imager (Amersham-Pharmacia Biotech, U. K. ) quantifiziert.

5.8 RNA-Isolierung aus EDTA-Blut Produkt Firma QIAampR RNA Blood Mini Kit QIAGEN zusätzliche Nutzung von : Produkt Firma QIAshredder QIAGEN RQl-RNase free DNase Promega -ausführliche Anleitung im mitgelieferten QIAGEN Mini Handbook 6. Feinkartierung von YY1 (Sicherstellung, dass YY1 in dem diabetesprotektiven Bereich liegt) Die Feinkartierung erfolgte mit Hilfe der Maus-Gensequenz.

Anhand dieser Gensequenz könnten Primer hergestellt werden.

7. Prüfung des Polymorphismus im Intron 3 unter Nutzung wei- terer Ratten-Stämme Dazu wurden folgende Stämme, die unter gleichen Bedingungen wie BB. 6S gehalten werden, benutzt : 2 Wildfangtiere (Wildtyp, M+W), jeweils i Tier von diabetes-resistenten, ingezüchteten DA/K, BN/Mol, LEW/K und WOKW-Ratten.

8. Weitere Untersuchungen in vitro Morphologische Untersuchungen des Pankreas von normo- glykämischen BB/OK-und BB. 6S-Ratten (Lucke, S., Klöting, I., Pusch, A., Heinrich, H. W. and H. J. Hahn. Endocrine pancreas histology of congenic BB-rat strains with reduced diabetes in- cidence after genetic manipulation on chromosomes 4,6 and X.

Autoimmunity 36,2003, 143-149).

Untersuchungen an isolierten Langerhansschen Inseln von BB/OK- und BB. 6S- Ratten durch Variation der Ca-Konzentration im Kul- turmedium.

Calbindin-D28k Proteinexpression mittels Westernblotanalyse unter Basalbedingungen und mit zunehmender Ca-Konzentration im Medium.

9. Weitere Untersuchungen in vivo Untersuchungen zur Frakturheilung bei BB/OK-und diabetes- resistenten LEW. lA-Ratten (38).

BB/OK und BB. 6S-Ratten wurden mit Standarddiät (0, 8% Ca), mit Ca-reicher (2%) und Ca-armer Diät (0, 4-6) ernährt (hergestellt von Ssniff R-Zucht, Spezialitäten GmbH, Soest) und bis zur 30.

Lebenswoche auf Diabetesentwicklung beobachtet (nicht publi- ziert).

Verabreichung von Ca-Kanal-Blockern oder verschiedenen Ca- Antagonisten (Quercitin). (nicht publiziert) 10. Primerbedingungen bei der Sequenzierung Für alle Primer gelten folgende Bedingungen : Denaturierung : 3 min 94 °C Annealing : 35 Zyklen a 30sec 94°C 1 min 55 oder 60 °C (*) 45 sec 72 °C Elongation : 3 min bei 72 °C.

11. Mikrosatellitenmarker Chr. Intern Marker Gesamt 1 R152 Igf2 1 K6 D1Mgh10 1 K7 DlMghl2 1 K57 DlMgh7 1 K58 DlMit3 1 K109 DlMgh6 1 K136 DlMgh4 1 K220 DlMghl8 1 K228 DlMghl4 1 K524 DlRat249 1 K526 D1Rat167 1 K533 DlRat60 <BR> <BR> <BR> 12<BR> <BR> <BR> <BR> <BR> 2 K110 D2Mit8 2 Kill D2Mgh9 2 K138 D2Mitl 2 K139 D2Mit4 2 K140 D2Mit15 2 K230 D2Mgh14 2 K238 D2Mit7 2 (5) K280 D5Mghi 2 K374 D2Wox8 2 K376 D2Wox34 2 K384 D2Woxl 11 3 R142 Svs2p . 3 K63 D3Mitl 3 K66 D3Mghll 3 K68 D3MitlO 3 K386 D3Woxl 3 K393 D3Wox16 3 K395 D3Wox25 7 4 R88 Il-6 4 K147 Eno 4 K215 Nos 4 K253 D4Mit9 4 K262 D4Mitl6 4 K264 D4Mgh9 4 K267 D4Mghll 4 K547 D4Rat9 <BR> <BR> <BR> 8<BR> <BR> <BR> 5 R44 A2ug 5 Cjun Cjun 5 K72 D5Mghl5 5 K151 D5Mgh5 5 K270 D5Mghl 5 K404 D5Wox26 5 K412 D5Woxl7 7 6 R99 Ckb 6 K73 D6Mgh4 6 K74 D6Mit5 6 K154 D6Mitl 6 K155 D6Mgh5 6 K156 D6Mit4 6 K158 D6Mit9 6 K159 D6Pasl 6 K284 D6Mgh2 6 K288 D6Mit8 6 K289 D6Mit2 6 K290 D6Mit3 6 K416 D6Wox2 6 K417 D6Woxl7 6 K420 D6Wox10 6 K506 D6Kyo4 6 K549 D6Ratl84 6 K554 D6Ratl60 6 K556 D6RatlO1 6 K557 D6Rat31 6 K625 D6Rat66 21 7K26D7Mit9 7 K77 D7Mit7 7 K162 D7Mgh7 7 K163 D7Mgh9 7 K300 D7Mitl6 7 K427 D7Wox28 7 K428 D7Woxl5 7 K435 D7Wox2 8 8 R102 Apöc3 8 K84 D8Mit4 8 K116 D8Mit2 8 K117 D8Mghll 8 K166 D8Mgh4 8 K437 D8Wox23 8 K444 D8Woxl2 8 K560 D8Rat51 8 9 R27 Cryg 9 Inhb Inhb 9 K87 D9Mitl 9 K88 D9Mgh2 9 K171 Aep2 9 K451 D9Wox20 9 K453 D9Mgh5 7 10 R126 Aep 10 Il-4 Il-4 10 K30 D10Mgh2 10 K32 DlOMitIO 10 K119 D10Mgh6 10 K644 D10Rat4 10 K646 DlORat8 <BR> <BR> <BR> 7<BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> 11 R22 Smst 11 K39 DllMgh5 11 K91 DllMit2 11 K120 DllMgh3 11 K459 DllWox4 11 K516 DllRat22 6 12 K42 D12Mit5 12 K179 D12Mit2 12 K182 D12Mgh4 12 K183 D12Mit4 12 K468 D12Woxl5 5 13 Atpa Atpa 13 K11 D13UW 13 K93 D13Mitl 13 K122 D13Mgh8 13 K189 D13Mgh7 5 14 R40 Alb 14 R130 Gck 14 K99 D14Mgh2 14 K100 D14Mghl 14 K128 Csna 14 K130 D14Mgh3 14 K337 D14Mgh4 14 K584 D14Rat65 14 K588 D14Rat37 <BR> <BR> <BR> 9<BR> <BR> <BR> <BR> <BR> 15 K45 D15Mgh3 15 K102 D15Mgh6 15 K123 D15Mgh5 15 K482 D15Wox5 15 K483 D15Wox3 <BR> <BR> <BR> 5 16 K48 D16Mgh4 16 K49 D16Mit2 16 K170 D9Mghl 16 K486 D16Wox7 4 17 K35 D17Mgh3 17 K36 D17Mgh5 17 K104 D17Mit7 17 K105 D17Mit5 17 K491 D17Wox8 5 18 R66 Olf 18 R98 Gjai 18 Mit9 D18Mit9 18 K12 D18Mgh3 18 K202 D18Mit4 18 K511 D18Kyol 18 K559 D18Rat44 <BR> <BR> <BR> 7 19 K206 D19Mit7 19 K569 D19Ratl2 19 K572 D19Rat3 19 K575 D19Rat34 <BR> <BR> <BR> 4<BR> <BR> <BR> <BR> <BR> 20 R145 Tnf 20 K108 D20Mghl 20 K127 Prkacn <BR> <BR> <BR> 3 X Mgh3 DXMgh3 X K15 DXMghl X R87 Pfkfb X R47 Ar X K657 DXRatl7 X K654 DXRatl9 X K661 DXRat103 X K661 DXRat103 X K364 DXWox29 X K352 DXWoxl7 X K359 DXWox24 11 Gesamt 160 Referenzen 1 She, J-X. and M. P. Marron. Genetic susceptibility factors in typl diabetes : linkage, disequilibrium and functional analyses, Cur. Opin. Immunol., 10,1998, 682-689 2 Morahan, G., Huang, D., Ymer, S. I. et al. Linkage disequi- librium of a type 1 diabetes susceptibility locus with a regulatory IL12B allele. Nature Genet. 27,2001, 218-221 3 Klöting, I. and L. Vogt. BB/O (ttawa) K (arlsburg) rats : Fea- tures of a subline of diabetes-prone BB rats. Diabetes Res., 1991,18, 79-87 4 Lühder, F., Woltanski, K. P., Hamann, J. et al. Detection of antibodies against both isoforms of glutamate decarboxylase in BB/OK rats by western blotting and immuno trapping en- zyme activity assay. Diabetes Res. 20,1992, 97-107 5 Ziegler, B., Witt, S., Kohnert, K. D. et al. Characteriza- tion of monoclonal islet cell reactive autoantibodies from the diabetic Biobreeding (BB/OK) rat. Acta Diabetol. 30, 1993,201-206 6 Schröder, D., Schmidt, S., Klöting, I. and B. Hehmke. Ef- fect of syngeneic islet antigen administration on comple- ment-dependent antibody-mediated cytotoxicity to islet cells and diabetes onset in diabetes-prone BB/OK rats.

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