Beschreibung

Die Erfindung liegt auf dem technischen Gebiet des Nachweises von Nukleinsäuren einer zumindest teilweise bekannten Nukleotidsequenz. Ferner liegt die Erfindung auf dem technischen Gebiet des Nachweises bzw. der Bestimmung von einer Abweichung einer Nukleotidsequenz einer Nukleinsäure von einer vorbestimmten Nukleotidsequenz und/oder auf dem Gebiet der Bestimmung einer Konzentration einer' bestimmten Nukleinsäure in einer Lösung.

Insbesondere liegt die Erfindung in einem Aspekt auf dem technischen Gebiet, die Existenz und/oder die Konzentration von Nukleinsäuren wie z.B. Desoxyribonukleinsäure (DNA) oder Ribonukleinsäure (RNA) nachzuweisen. Die nachgewiesene Nukleinsäure kann dann beispielsweise darüber Informationen geben, ob z.B. ein Krankheitskeim in einer zu untersuchenden Probe vorhanden war und/oder ob z.B. ein Lebewesen/Organismus eine gewisse genetische Veranlagung trägt oder nicht. Bei einem derartigen Nukleinsäure-Nachweis, kann beispielsweise die nachzuweisende Nukleinsäure-Sequenz vorher ganz oder zumindest teilweise bekannt sein. Alternativ kann beispielsweise eine Zielsetzung sein, lediglich die Anwesenheit einer nachzuweisenden Nukleinsäure-Sequenz in einer Probe nachzuweisen und/oder evtl. Variationen bzw. Abweichungen der Sequenz von einer vorbestimmten Sequenz zu bestimmen.

Ferner kann die Erfindung auf einem technischen Gebiet liegen, bei welchem ein Nachweis einer Nukleinsäuren direkt erfolgen soll, also bei ausreichender Menge der nachzuweisenden Nukleinsäure beispielsweise ohne eine vorherige z.B. enzymatische Vervielfältigung durchzuführen. Ohne vorherige enzymatische Vervielfältigung kann dabei beispielsweise ohne eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und/oder isothermale Amplifikation und/oder vorherige Transkription wie z.B. Reverser Transkription (RT), bei der z.B. durch eine enzymatische Reaktion ein Typ von Nukleinsäure wie hier z.B. RNA in einen anderen Typ von Nukleinsäure wie hier z.B. DNA umgeschrieben wird, bedeuten.

Die Erfindung kann zudem auch auf einem technischen Gebiet liegen, bei welchem die Zielsetzung ein indirekter Nachweis der Nukleinsäuren ist, also z.B. nach und/oder während einer z.B. enzymatischen Vervielfältigungsreaktion wie z.B. PCR und/oder isothermaler Amplifikation. Dies kann dann wünschenswert sein, wenn die nachzuweisende Nukleinsäure beispielsweise nur in geringen Mengen in einer zu untersuchenden Probe vorhanden ist und somit beispielsweise erst vervielfältigt werden muss, um dann für eine Nachweisreaktion in ausreichender Menge zur Verfügung zu stehen. Hierbei kann es z.B. vorteilhaft sein, wenn die nachzuweisende Reaktion erst ab einer gewissen Mindestmenge von nachzuweisender oder vervielfältigter Nukleinsäure stattfindet und/oder ein detektierbares Signal liefert und somit z.B. während einer Vervielfältigungsreaktion der Zeitpunkt des Stattfindens der Nachweisreaktion oder der erstmaligen Signaldetektion als Maß für die Menge des ursprünglich vorhandenen Nukleinsäure genutzt werden kann (Beispiel Real-Time PCR oder qPCR). Ein indirekter Nachweis von Nukleinsäuren kann auch bedeuten, dass vor dem eigentlichen Nachweis ein weiterer Schritt wie z.B. eine vorherige Transkription wie z.B. RT erfolgt, also ein Umschreiben von RNA in DNA.

Im Stand der Technik sind verschiedene Verfahren zur Detektion bzw. zum Nachweis von Nukleinsäuren bekannt. Gemäß dieser herkömmlichen Verfahren erfolgt der Nachweis von Nukleotiden dabei meist mittels Farbstoffen. Beispiele für solche herkömmliche Verfahren werden im Folgenden genannt.

Beispielsweise werden in herkömmlichen Verfahren interkalierende Farbstoffe wie z.B. Sybr-Green verwendet, die eine geringe Grundfluoreszenz aufweisen wenn sie nicht in Kontakt mit doppelsträngiger DNA sind, deren Fluoreszenz jedoch sehr stark zunimmt wenn sie in doppelsträngige DNA eingelagert werden. Ein derartiges Verfahren ist beispielsweise in dem Dokument US 5 436 134 A offenbart. Interkalierende Farbstoffe wie z.B. Sybr-Green können herkömmlicherweise in einer Real-Time PCR oder qPCR auch dazu genutzt werden, die Menge der ursprünglich eingesetzten Nukleinsäure zu bestimmen, indem der Zeitpunkt bzw. die zu diesem Zeitpunkt erreichte Anzahl der von durchlaufenen Zyklen bestimmt wird, in welchem das Fluoreszenzsignal des interkalierenden Farbstoffes über ein bestimmtes Rauschlimit steigt. Ein derartiges Verfahren ist in der Patentschrift US 6 569 627 B2 beschrieben. Derartige Verfahren sind jedoch oft mit dem Nachteil behaftet, dass das detektierbare Limit bzw. die Schwelle der Detektierbarkeit teilweise erst bei relativ hohen Konzentrationen, z.B. von 10 nM des Amplifikats in typischen Reaktionsvolumina erreicht werden kann, wodurch die Zeitdauer der Amplifikationsreaktion bis zum frühesten Detektionszeitpunkt sehr lange werden kann.

In anderen herkömmlichen Farbstoff-basierten Nachweisverfahren für Nukleinsäuren wird beispielsweise ausgenutzt, dass Farbstoffe unterschiedliche Emissionsverhalten zeigen, je nachdem wie nah sie sich bei einem anderen Farbstoff oder Quencher befinden. Ein Quencher kann beispielsweise das Emissionsverhalten eines nahegelegenen Farbstoffs durch Förster- Resonanzenergietransfer (FRET) stark beeinflussen. Basierend auf diesem Prinzip gibt es ebenfalls herkömmliche Real-Time PCR- oder qPCR-Verfahren wie z.B. TaqMan (Hydrolyse-Sonden) oder Hybridisierungssonden (auch "Light-Cycler- Sonden" genannt), die je nach Konzentration des Amplifikates FRET-Partner in unterschiedlichem Abstand zueinander halten (TaqMan) oder bringen (Hybridisierungssonden) und somit unterschiedlich starke Fluoreszenz-Signale erzeugen. Ein derartiges Verfahren ist beispielsweise in der Patentschrift US 5 804 375 A beschrieben.

Andere herkömmliche Farbstoff-basierte Nachweisverfahren für Nukleinsäuren nutzten die räumliche Lokalisierung von Nukleinsäuren und machen sie dort mit Farbstoffen sichtbar, so z.B. in der Gelelektrophorese oder Array- Hybridisierungsverfahren. Ferner sind im Stand der Technik Methoden bekannt, die Nukleinsäuren ohne den Einsatz von Farbstoffen oder anderen Markern detektieren. Beispielsweise erlauben Extinktionsmessungen im Ultravioletten (z.B. bei einer Wellenlänge von 260 nm) die Bestimmung der Konzentration von Nukleinsäuren, wie etwa von DNA und RNA.

Darüber hinaus sind im Stand der Technik weitere Methoden bekannt, welche Nanopartikel zur Detektion von Nukleinsäuren verwenden. Beispielsweise offenbart die Patentschrift US 6 812 334 B1 ein solches Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren. Gemäß dieses Verfahrens werden Nanopartikel, an denen Oligonukleotide angebracht sind, und eine oder mehrere Arten von Verbindungs- Oligonukleotiden bereitgestellt. Jedes Verbindungs-Oligonukleotid hat dabei zwei Abschnitte. Die Sequenz eines Abschnitts ist komplementär zu der Sequenz eines der Abschnitte der Nukleinsäure und die Sequenz des anderen Abschnitts ist komplementär zu der Sequenz der Oligonukleotide auf den Nanopartikeln. Die Nanopartikel-Oligonukleotid-Konjugate, die Verbindungs-Oligonukleotide und die Nukleinsäure werden unter Hybridisierungsbedingungen zusammengebracht, wodurch eine messbare Veränderung entsteht. Die genannte Patentschrift offenbart ferner ein Kit zur Durchführung dieses Verfahrens.

Aus der Patentanmeldung US 2010/0075335 A1 ist ein kolorimetrisches Verfahren zum Nachweis von spezifischen Nukleinsäuresequenzen, einschließlich von Mutationen und Einzelnukleotid-Polymorphismen (SNPs) in Nukleotidsequenzen durch Aggregation von Nanopartikeln bekannt. In diesem Verfahren werden identische Nanosonden mit Oligonukleotiden verwendet, die direkt an Gold- Nanopartikel angebracht sind, welche sich in einer Lösung rot darstellen. Die Aggregation dieser Nanosonden durch eine Erhöhung der lonenstärke führt zu einem Farbumschlag von Rot zu Blau. Die Anwesenheit der nachzuweisenden Ziel- DNA mit einer Sequenz, die vollständig komplementär zu der Sequenz der Nanosonde ist, verhindert diese Aggregation, woraufhin die Lösung rot bleibt. Diese Methode kann beispielsweise verwendet werden, um vollständig komplementäre Sequenzen von Sequenzen mit einem SNP zu unterscheiden. Ferner offenbart diese Patentanmeldung auch ein Kit zur Anwendung des genannten Verfahrens. Die europäische Patentanmeldung EP 1 870 478 A1 offenbart einen Biosensor, der aus Metallpartikeln besteht, die auf einer Oberfläche eines Trägermaterials befestigt sind. Auf diesen Metallpartikeln ist ein Sondenmolekül befestigt, das insbesondere eine Nukleinsäure sein kann, die eine Hairpin-Struktur bildet. Das Sondenmolekül weist ein Fluoreszenzmolekül auf. Vor der Reaktion der Sondenmoleküle mit den Zielmolekülen ist die Entfernung zwischen dem Metallpartikel und dem Fluoreszenzmolekül gleich oder weniger als 5 nm, so dass Anregungsenergie vom Fluoreszenzmolekül zum Metallpartikel übertragen wird. Dadurch wird die Fluoreszenz gelöscht (engl.: quenched). Der Abstand zwischen Fluoreszenzmolekül und Metallpartikel ist nach der Reaktion größer, so dass das Fluoreszenzmolekül fluoreszieren kann, womit sodann die Reaktion bzw. die Nukleinsäure nachgewiesen werden kann. Darüber hinaus zeigt die Publikation von R. Gill et al., "Fast, single-step, and surfactant-free oligonucleotide modification of gold nanoparticles using DNA with a positively charged tail", Chem. Commun., 2013, 49, 1400- 1402 wie Nanopartikel durch ZNA mit DNA funktionalisiert und stabilisiert werden können. Die so funktionalisierten Nanopartikel können dann gezielt mit anderen Nanopartikeln durch Hybridisierung verbunden werden und erzeugen somit eine messbare optische Veränderung. In anderen Worten fördert die Verwendung von ZNA gemäß dieses herkömmlichen Verfahrens das„Anhaften" der DNA an einem Nanopartikel. Die Verbindung mehrerer Nanopartikel erfolgt dabei herkömmlicherweise durch eine Hybridisierung von DNA, welche auf den verschiedenen Nanopartikeln angebracht ist.

Hier werden somit Nukleinsäuren und Nanopartikel durch ZNA verbunden, d.h. DNA mittels ZNA an Nanopartikel hybridisiert.

Den aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren zum Nachweis einer Nukleinsäure haften dabei insbesondere die Nachteile an, dass diese eine relativ geringe Sensitivität aufweisen und dass die Durchführung dieser Verfahren oftmals sehr viel Zeit in Anspruch nimmt, bis die Anwesenheit oder Abwesenheit bzw. die Konzentration einer bestimmten Nukleinsäure zuverlässig beurteilt werden kann. In herkömmlichen Verfahren erfolgt der Nachweis von Nukleotiden dabei meist mittels Farbstoffen. Farbstoff-basierte Methoden können allerdings Probleme aufweisen, z.B. hinsichtlich eines Ausbleichens und/oder der Stabilität der Farbstoffe, Quenching-Effekte durch Wechselwirkung mit störenden Stoffen in der Probe, störende Hintergrund-Fluoreszenz von anderen Stoffen. Ferner weisen herkömmliche Verfahren oftmals die Notwendigkeit von oftmals sehr aufwändigen Detektionsmethoden. Eine Vermeidung von Farbstoffen bei Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren ist daher wünschenswert. Es ist die objektive technische Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren und ein Kit bereitzustellen, welche nicht die Nachteile der herkömmlichen Verfahren aufweisen.

Diese Aufgabe wird durch eine erfindungsgemäße Verwendung von Nanopartikeln gemäß Anspruch 1 , eine erfindungsgemäße Verwendung von kationisch modifizierter Nukleinsäure gemäß Anspruch 2, einem erfindungsgemäßen Verfahren mit den Schritten aus Anspruch 3, sowie durch ein Kit mit den Merkmalen aus Anspruch 15 gelöst. Bevorzugte Ausführungsformen sind Gegenstände der abhängigen Ansprüche.

In einem ersten Aspekt betrifft die Erfindung eine Verwendung von zumindest zwei Nanopartikeln in Kombination mit einer kationisch modifizierten Nukleinsäure zum Nachweis einer nachzuweisenden Nukleinsäure in einer Lösung. Die erfindungsgemäße Verwendung der Nanopartikel hat dabei den Vorteil, dass das Nachweisverfahren von Nukleinsäuren besonders effizient erfolgen kann. Insbesondere kann durch eine erfindungsgemäße Verwendung die Zeitdauer, welche zur Erzielung eines aussagekräftigen Ergebnisses nötig sein kann, deutlich reduziert werden. Ferner bietet eine erfindungsgemäße Verwendung den Vorteil, dass vorzugsweise eine Implementierung in herkömmliche Verfahren und/oder die Verwendung von herkömmlichen Detektionsvorrichtungen und/oder herkömmlichen Messapparaturen möglich ist und dadurch gegebenenfalls keine wesentlichen bzw. keine hohen Anschaffungskosten für geeignete Vorrichtungen zu einer erfindungsgemäßen Verwendung erforderlich sind. Ferner bietet eine erfindungsgemäße Verwendung den technischen Vorteil, dass insbesondere während bzw. im Rahmen eines Nachweisverfahrens in einer Lösung die Möglichkeit eines lokalen Heizens zumindest eines Teils der Lösung mit einem besonders effizienten Nachweisverfahren kombiniert werden kann.

Nanopartikel sind dabei bevorzugt solche Partikel, welche aufgrund ihrer Größe besondere optische Eigenschaften aufweisen. Vorzugsweise sind deren optische Eigenschaften hauptsächlich durch die Größe der Nanopartikel gegeben, weniger jedoch durch deren Materialeigenschaften. Die besonderen optischen Eigenschaften können dabei beispielsweise charakteristische Extinktionsspektren und/oder Streuspektren sein, welche maßgeblich durch die Partikelgröße beeinflusst werden und nicht notwendigerweise im Volumenmaterial bzw. makroskopischen Material ausgeprägt sind. Besonders bevorzugt sind die Nanopartikel solche Nanopartikel, deren optische Eigenschaften zumindest teilweise durch die plasmonischen Eigenschaften der Nanopartikel hervorgerufen werden. Vorzugsweise haben die Nanopartikel dabei einen Durchmesser zwischen 2 und 500 nm, besonders bevorzugt zwischen 3 und 300 nm, weiter bevorzugt zwischen 5 und 200 nm, noch weiter bevorzugt zwischen 7 und 150 nm, am meisten bevorzugt zwischen 10 und 100 nm. Die Nanopartikel können von kugelförmiger bzw. sphärischer Form sein, sind jedoch in ihrer Form nicht darauf limitiert. Beispielsweise sind auch andere Formen der Nanopartikel denkbar, wie etwa elongierte bzw. stäbchenförmige Nanopartikel („Nanorods") oder auch andere geometrische Formen.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfasst zumindest ein Teil der Nanopartikel zumindest ein Metall und/oder einen Halbleiter. Das Metall ist dabei vorzugsweise ein Edelmetall, wie etwa Gold, Silber, Platin oder Kupfer. Der Halbleiter kann beispielsweise Silizium und/oder Germanium umfassen, sowie auch zusammengesetzte Halbleitermaterialien, wie etwa Cadmiumtellurid oder Bleisulfid. Des Weiteren kann zumindest ein Teil der Nanopartikel auch aus verschiedenen Materialien zusammengesetzt sein. Beispielsweise kann dabei zumindest ein Teil der Nanopartikel als Schale-Kern-Nanopartikel („core Shell nanoparticle") ausgebildet sein, wobei beispielsweise der Kern ein Metall und die Hülle ein Halbleitermaterial umfasst, oder der Kern ein Halbleitermaterial und die Hülle ein Metall umfasst. In einer bevorzugten Ausführungsform sind alle verwendeten Nanopartikel gleichartig ausgebildet, insbesondere vom gleichen Material gefertigt. In einer bevorzugten Ausführungsform kann ein Nanopartikel an seiner Oberfläche Poren aufweisen, welche von Atomen oder Molekülen mit einer für die Poren geeigneten Größe und Ladung besetzt werden können, wenn sich beispielsweise derartige Atome und/oder Moleküle zusammen mit den Nanopartikeln in einer Lösung befinden. Ein Nanopartikel soll dabei auch die an seiner Oberfläche angelagerten Atome und/oder Moleküle umfassen.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform eignen sich die Nanopartikel aufgrund ihrer besonderen optischen Eigenschaften dazu, Licht bei bestimmten Wellenlängen besonders effektiv zu absorbieren und/oder zu streuen. Insbesondere absorbieren bzw. streuen die Nanopartikel dabei in besonders effizienter Weise Licht, dessen Wellenlängen mit einer Plasmonenresonanz der Nanopartikel übereinstimmt, wobei die Wellenlänge der Plasmonenresonanz bzw. die Anregungsenergie der Plasmonenresonanz maßgeblich durch die Größe und/oder die Form und/oder das Material der Nanopartikel bestimmt wird. Eine Anregung der Nanopartikel mit Licht, dessen Photonenenergie in etwa mit der Plasmonenresonanzenergie übereinstimmt, eignet sich in besonders effizienter Weise dazu, Lichtenergie auf die Nanopartikel zu übertragen, bzw. Lichtenergie von den Nanopartikeln absorbieren zu lassen. Die Begriffe Nukleinsäure und Oligonukleotid umfassen dabei im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung nicht nur Desoxyribonukleinsäuren bzw. Desoxyoligoribonukleotide, sondern auch Nukleinsäuren und Oligonukleotide mit ein oder mehreren Nukleotidanaloga mit Modifikationen an ihrem Backbone (z.B. Methylphosphonate, Phosphothioate oder peptide nucleic acids (PNAs), insbesondere an einem Zucker des Backbone). Ferner können diese auch Basenanaloga enthalten, die etwa 7-Deazapurine oder Universalbasen wie Nitroindol oder modifizierte natürliche Basen wie N4-Ethyl-Cytosin. ln einer weiteren Ausführungsform sind die Nukleinsäuren oder Oligonukleotide Konjugate oder Chimären mit nicht-nukleosidischen Analoga, wie etwa PNA. Die Nukleinsäuren oder Oligonukleotide können an einer oder mehreren Positionen nicht-nukleosidische Einheiten wie Spacer, z.B. Hexaethylenglycol oder Cn-Spacer, wobei n vorzugsweise eine natürliche Zahl zwischen 3 und 6 ist, aufweisen. Cn- Spacer sind dabei vorzugsweise Spacer, welche n Kohlenstoffatome umfassen. Beispielsweise können Cn-Spacer als Abstandshalter, insbesondere zwischen einem Bindungselement wie etwa einer Thiol-Bindung und der Nukleinsäure im eigentlichen Sinne dienen. Beispielsweise können Cn-Spacer für eine Synthese von Thiol-Oligomeren erforderlich sein bzw. an Thiol-Modifikationen ausgebildet sein Sofern die Nukleinsäuren oder Oligonukleotide Modifikationen aufweisen, sind diese vorzugsweise so gewählt, dass auch mit der Modifikation eine Hybridisierung mit natürlicher DNA bzw. RNA möglich ist. In weiteren bevorzugten Ausführungsformen können die Nukleinsäuren und/oder Nukleotide Modifikationen aufweisen, welche das Schmelzverhalten, insbesondere die Schmelztemperatur, beeinflussen. Dies kann beispielsweise vorteilhaft sein, um Hybride mit unterschiedlichen Graden der Komplementarität ihrer Basen unterscheiden zu können (mismatch-Diskriminierung). Weitere bevorzugte Modifikationen umfassen LNA, 8-Aza-7-Deazapurine, 5-Propinyl-Uracil und -Cytosin und/oder abasische Unterbrechungen oder Modifikationen in der Nukleinsäure oder in dem Oligonukleotid. Weitere Modifikationen im Sinne der Erfindung sind z. B. Modifikationen mit Biotin, Thiol bzw. Thiolen und Fluoreszenzdonor- und Fluoreszenzakzeptormolekülen. Die kationisch modifizierte Nukleinsäure ist dabei vorzugsweise eine Nukleinsäure, welche einen kationischen Block bzw. einen kationischen Abschnitt aufweist. Dabei kann es sich beispielsweise um eine Nukleinsäure handeln, welche an zumindest einem Ende einen kationischen Fortsatz aufweist. Der kationische Fortsatz weist dabei vorzugsweise eine mittlere Ladungsdichte auf, welche weniger anionisch ist, als die mittlere Ladungsdichte einer Nukleinsäure, insbesondere dann, wenn sowohl die Nukleinsäure als auch der kationische Fortsatz in einer für die Nukleinsäure typischen Umgebung vorliegen. In anderen Worten ist der kationische Fortsatz vorzugsweise positiver elektrisch geladen als eine Nukleinsäure. Die Nukleinsäure mit kationischer Modifikation bzw. die kationisch modifizierte Nukleinsäure umfasst ferner vorzugsweise einen Abschnitt bzw. einen Hybridisierungsbereich, welcher hauptsächlich eine Nukleinsäure umfasst, und daran konjugiert einen kationischen Fortsatz.

In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst der kationische Fortsatz der kationisch modifizierten Nukleinsäure kationische Spermine. Der kationische Fortsatz umfasst dabei zwischen 1 und 20 Spermine, vorzugsweise zwischen 2 und 15 Spermine, besonders bevorzugt zwischen 2 und 10 Spermine, am meisten bevorzugt zwischen 2 und 5 Spermine. Die mittlere elektrische Ladungsdichte einer kationisch modifizierten Nukleinsäure ist dabei weniger anionisch als die mittlere elektrische Ladungsdichte einer nicht-kationisch modifizierten Nukleinsäure. Auf diese Weise ist beispielsweise die elektrostatische Abstoßung zwischen einer kationisch modifizierten Nukleinsäure und einer nicht-kationisch modifizierten Nukleinsäure geringer als die elektrostatische Abstoßung zwischen zwei nicht- kationisch modifizierten Nukleinsäuren. Besonders bevorzugt ziehen sich eine kationisch modifizierten Nukleinsäure und eine nicht-kationisch modifizierte Nukleinsäure elektrostatisch an. Beispielsweise umfasst eine kationisch modifizierte Nukleinsäure eine Nukleinsäure vom Typ einer ZIP NUCLEIC ACID (ZNA) des Herstellers METABION (METABION INTERNATIONAL AG, Planegg, Germany), welche beispielsweise in den Druckschriften WO 2007 069 092 B1 oder WO 2009 083 763 A1 beschrieben ist. Alternativ oder zusätzlich kann eine kationisch modifizierte Nukleinsäure beispielsweise zumindest einen kationisch geladenen Farbstoff und/oder andere kationische Einheiten umfassen. Das Hinzufügen zumindest einer kationischen Einheit zu einer Nukleinsäure erfolgt dabei vorzugsweise am 5'-Ende und/oder am 3'- Ende der Nukleinsäure. Der Nachweis der nachzuweisenden Nukleinsäure kann dabei beispielsweise dadurch geschehen, dass ein detektierbarer bzw. messbarer Effekt detektiert wird, welcher eintritt, wenn die zumindest zwei Nanopartikel sich in der räumlichen Nähe zu zumindest einer kationisch modifizierten Nukleinsäure befinden, insbesondere wenn die zumindest zwei Nanopartikel zumindest teilweise an eine kationisch modifizierte Nukleinsäure gebunden sind.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist ein Nanopartikel insbesondere dann in der . räumlichen Nähe zu einer kationisch modifizierten Nukleinsäure, wenn deren elektrostatische Wechselwirkung untereinander, d.h. deren elektrostatische Abstoßungs- und/oder Anziehungskräfte, beeinflusst wird bzw. wenn die elektrostatische Wechselwirkung zwischen einem Nanopoartikel und einer kationisch modifizierten Nukleinsäure die Wechselwirkung des Nanopartikels zu anderen, vorzugsweise benachbarten, Nanopartikeln signifikant beeinflusst. Die effektive Entfernung, bis zu welcher elektrostatische Kräfte zwischen dem Nanopartikel und der kationischen modifizierten Nukleinsäure einen signifikanten Einfluss auf die Wechselwirkung zwischen dem Nanopartikel und der kationisch modifizierten Nukleinsäure haben, kann dabei durch deren Umgebung beeinflusst sein. Beispielsweise kann die Salzkonzentration und/oder der pH-Wert der Lösung, in welcher sich die Nanopartikel und die kationisch modifizierten Nukleinsäuren befinden, einen Einfluss auf deren elektrostatische Wechselwirkung haben. Vorzugsweise ist der Einfluss der elektrostatischen Wechselwirkung zwischen einer kationischen modifizierten Nukleinsäure und einem Nanopartikel für die bevorzugte Erzielung eines erfindungsgemäß beabsichtigten Effekts vorzugsweise dann besonders ausgeprägt, wenn die Entfernung zwischen der kationischen modifizierten Nukleinsäure und der Oberfläche des Nanopartikels kleiner als 150 nm, weiter bevorzugt kleiner als 100 nm, noch weiter bevorzugt kleiner als 50 nm, mehr bevorzugt kleiner als 30 nm, am meisten bevorzugt kleiner als 10 nm ist.

Bevorzugt weisen die zumindest zwei Nanopartikel an deren Oberfläche funktionalisierte Moleküle auf, an welche eine kationisch modifizierte Nukleinsäure zumindest teilweise binden kann.

Bevorzugt weist die Lösung, in welcher sich die Nanopartikel und/oder die kationisch modifizierten Nukleinsäuren befinden, geeignete Pufferbedingungen auf. Die Pufferbedingungen können beispielsweise dann geeignet sein, wenn sie einen Ablauf einer Amplifikationsreaktion zur Amplifikation einer Nukleinsäure ermöglichen.

In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung eine Verwendung einer kationisch modifizierten Nukleinsäure in Kombination mit zumindest zwei Nanopartikeln zum Nachweis einer einer nachzuweisenden Nukleinsäure in einer Lösung.

Die Verwendung einer Kombination der Nanopartikel und der kationisch modifizierten Nukleinsäure kann in einer bevorzugten Ausführungsform dem Nachweis einer Nukleinsäure, insbesondere einer weiteren Nukleinsäure, dienen. Dabei kann beispielsweise sowohl die kationisch modifizierte Nukleinsäure als auch die Nanopartikel in eine Lösung gegeben werden, in welcher die Anwesenheit und/oder Konzentration einer weiteren Nukleinsäure nachgewiesen werden soll, wobei die Nukleotidsequenz der nachzuweisenden Nukleinsäure vorzugsweise zumindest teilweise bekannt ist. In einer bevorzugten Ausführungsform können dabei aus dem Auftreten oder Nichtauftreten einer Wechselwirkung zwischen der kationisch modifizierten Nukleinsäure und den Nanopartikeln bzw. aus dem sich daraus ergebenden messbaren Effekt Rückschlüsse auf die Anwesenheit und/oder die Abwesenheit und/oder die Konzentration der nachzuweisenden Nukleinsäure in der Lösung gezogen werden.

Ferner betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Nachweis einer nachzuweisenden Nukleinsäure in einer Lösung, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:

Bereitstellen von zumindest zwei Nanopartikeln in der Lösung;

- Bereitstellen einer kationisch modifizierten Nukleinsäure in der Lösung;

Ermitteln einer Änderung zumindest einer physikalischen Eigenschaft der Lösung wobei, die physikalische Eigenschaft der Lösung durch das zumindest teilweise Binden der zumindest zwei Nanopartikel an die kationisch modifizierte Nukleinsäure zumindest teilweise geändert wird und wobei die nachzuweisende Nukleinsäure in der Lösung das zumindest teilweise Binden der zumindest zwei Nanopartikel an die kationisch modifizierte Nukleinsäure zumindest teilweise fördert oder zumindest teilweise hemmt. Vorzugsweise wird durch eine größere Konzentration der nachzuweisenden Nukleinsäure in der Lösung das zumindest teilweise Binden der zumindest zwei Nanopartikel an die kationisch modifizierte Nukleinsäure stärker gehemmt oder stärker gefördert als durch eine geringere Konzentration der nachzuweisenden Nukleinsäure in der Lösung. In anderen Worten steigt vorzugsweise mit der Konzentration der nachzuweisenden Nukleinsäure in der Lösung die Förderung oder die Hemmung des zumindest teilweisen Bindens der zumindest zwei Nanopartikel an die kationisch modifizierte Nukleinsäure. Bevorzugt ändert sich eine Wechselwirkung der zumindest zwei Nanopartikel untereinander zumindest teilweise, wenn die zumindest zwei Nanopartikel zumindest teilweise an die kationisch modifizierte Nukleinsäure gebunden sind. Besonders bevorzugt hängt die Änderung der physikalischen Eigenschaft von der Änderung der Wechselwirkung der zumindest zwei Nanopartikel untereinander ab,

Besonders bevorzugt erfolgt die Änderung der physikalischen Eigenschaft der Lösung durch eine Änderung der Wechselwirkung der zumindest zwei Nanopartikel, wobei die Änderung der Wechselwirkung der zumindest zwei Nanopartikel durch ein zumindest teilweises Binden der zumindest zwei Nanopartikel an die kationisch modifizierte Nukleinsäure beeinflusst, insbesondere bedingt, ist.

Vorzugsweise hängt ein Binden der zumindest zwei Nanopartikel an die kationisch modifizierte Nukleinsäure zumindest teilweise von einer Konzentration der nachzuweisenden Nukleinsäure in der Lösung ab.

Insbesondere kann die Anwesenheit der nachzuweisenden Nukleinsäure in der Lösung bzw. das Vorhandensein einer Mindestkonzentration der nachzuweisenden Nukleinsäure in der Lösung dazu führen, dass die zwei Nanopartikel zumindest teilweise an eine kationisch modifizierte Nukleinsäure binden bzw. zumindest teilweise daran binden können, während eine Abwesenheit der nachzuweisenden Nukleinsäure in der Lösung bzw. das Vorhandensein einer geringeren Konzentration als eine Mindestkonzentration der nachzuweisenden Nukleinsäure in der Lösung nicht dazu führt, dass die zumindest zwei Nanopartikel zumindest teilweise an eine kationisch modifizierte Nukleinsäure binden bzw. zumindest teilweise daran binden können.

Alternativ kann die Anwesenheit der nachzuweisenden Nukleinsäure in der Lösung bzw. das Vorhandensein einer Mindestkonzentration der nachzuweisenden Nukleinsäure in der Lösung dazu führen, dass die zumindest zwei Nanopartikel nicht zumindest teilweise an eine kationisch modifizierte Nukleinsäure binden bzw. zumindest teilweise nicht daran binden können, während eine Abwesenheit der nachzuweisenden Nukleinsäure in der Lösung bzw. das Vorhandensein einer geringeren Konzentration als eine Mindestkonzentration der nachzuweisenden Nukleinsäure in der Lösung dazu führt, dass die zumindest zwei Nanopartikel zumindest teilweise an eine kationisch modifizierte Nukleinsäure binden, bzw. zumindest teilweise nicht daran binden können. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die physikalische Eigenschaft der Lösung eine Eigenschaft, welche gemessen werden kann. Vorzugsweise handelt es sich bei der physikalischen Eigenschaft der Lösung um eine makroskopische Eigenschaft der Lösung. Besonders bevorzugt handelt es sich bei der physikalischen Eigenschaft der Lösung um eine homogene Eigenschaft der Lösung, d.h. dass die physikalische Eigenschaft der Lösung in beliebigen Teilvolumina und/oder an beliebigen Punkten der Lösung gemessen werden kann und die Messung sodann repräsentativ für die entsprechende physikalische Eigenschaft der gesamten Lösung ist. Dabei sind die Teilvolumina vorzugsweise mindestens so groß bemessen, dass mindestens zwei Nanopartikel und mindestens eine kationisch modifizierte Nukleinsäure in jedem Teilvolumen enthalten sind. In der Praxis sind die Teilvolumina daher vorzugsweise größer als 1 Attoiiter, weiter bevorzugt größer als 1 Femtoliter, besonders bevorzugt größer als 1 Pikoliter und am meisten bevorzugt größer als 1 Nanoliter. Beispielsweise kann die physikalische Eigenschaft der Lösung eine optischen Eigenschaft der Lösung sein und/oder eine Eigenschaft der Zusammensetzung der Lösung, wie etwa eine Eigenschaft des Gemischs und/oder ein Auftreten eines Ausfallprodukts und/oder einer Sedimentation. ln einer bevorzugten Ausführungsform ist zumindest eine Nukleinsäure an zumindest einen der Nanopartikel gebunden.

In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens ist die zumindest eine an den zumindest einen Nanopartikel gebundene Nukleinsäure eine Nukleinsäure, welche charakterisiert werden soll. Insbesondere kann die Nukleinsäure eine Nukleinsäure sein, deren Nukleotidsequenz zumindest teilweise bestimmt werden soll und/oder von welcher die Komplementarität mit einer anderen Nukleinsäure bestimmt werden soll. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird die Komplementarität der Nukleotidsequenz der an dem Nanopartikel gebundenen Nukleinsäure mit zumindest einem Teil der Nukleotidsequenz der kationisch modifizierten Nukleinsäure bestimmt.

In weiteren bevorzugten Ausführungsformen können verschiedene Nukleinsäuren mit verschiedenen Nukleotidsequenzen an jeweils einem Nanopartikel angebracht sein und/oder verschiedene Nukleinsäuren mit verschiedenen Nukleotidsequenzen an unterschiedlichen Nanopartikeln angebracht sein. In anderen Worten kann eine Mehrzahl von Nanopartikeln vorliegen, an welche jeweils eine Nukleinsäure der gleichen Nukleotidsequenz gebunden ist und/oder es kann eine Mehrzahl von Nanopartikeln vorliegen, an welche jeweils Nukleinsäuren mit unterschiedlichen Nukleotidsequenzen gebunden sind. Ferner können sich auch die Nanopartikel selbst voneinander unterscheiden, insbesondere in ihrer Größe und/oder in ihrer Form und/oder in ihrem Material. Die an einen Nanopartikel gebundene Nukleinsäure kann dabei auf unterschiedliche Weise an dem Nanopartikel befestigt sein. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Nukleinsäure mit einer Thiol-Bindung und/oder mit einer Streptavidin-Biotin-Bindung und/oder mit einer kationisch modifizierten Nukleinsäure an den Nanopartikel gebunden. Dabei können sich zwischen einer aktiven Erkennungssequenz bzw. Erkennungsnukleotidsequenz der Nukleinsäure und der Oberfläche des Nanopartikels noch weitere passive Nukleotidsequenzen befinden. Derartige passive Nukleotidsequenzen können beispielsweise Abstandshalter und/oder abasische Modifikationen sein, wie etwa Spacer9, dSpacer, Polyethylenglycole und/oder Ähnliches. Insbesondere können passive Nukleotidsequenzen aus einem gleichen und/oder einem ähnlichen Material ausgebildet sein, wie eine Erkennungssequenz bzw. ein Hybridisierungsbereich der Nukleinsäure. Beispielsweise können derartige Abstandshalter als DNA- Abstandshalter und/oder Multi-Adenin-Sequenzen ausgebildet sein. Ein Spacer9 ist dabei eine Modifikation, welche auf einer Triethylenglycol-Kette mit einer Länge von 9 Atomen basiert, wie dies im Stand der Technik hinreichend bekannt ist.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst die an den zumindest einen Nanopartikel gebundene Nukleinsäure zumindest ein Oligonukleotid.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform sind lediglich eines oder eine Mehrzahl von Oligonukleotiden an den Nanopartikel gebunden. Sofern eine Mehrzahl von Oligonukleotiden an einen Nanopartikel gebunden ist, können dies gleichartige und/oder verschiedenartige Oligonukleotide sein. Beispielweise können jeweils eine Mehrzahl von verschiedenartigen Oligonukleotiden an einem Nanopartikel angebracht sein. Die Oligonukleotide können sich dabei beispielsweise in ihrer Länge und/oder ihrer Bindung und/oder ihrer Nukleotidsequenz unterscheiden. Vorzugsweise sind zwischen 1 und 5.000 Oligonukleotide an einem Nanopartikel befestigt. Besonders bevorzugt sind zwischen 2 und 4.000 Oligonukleotide an einem Nanopartikel befestigt. Weiter bevorzugt sind zwischen 10 und 3.000 Oligonukleotide an einem Nanopartikel befestigt. Noch weiter bevorzugt sind zwischen 20 und 2.000 Oligonukleotide an einem Nanopartikel befestigt. Besonders bevorzugt sind zwischen 50 und 1.000 Oligonukleotide an einem Nanopartikel befestigt.

Je größer die Anzahl von Oligonukleotiden ist, welche an einem Nanopartikel befestigt sind und/oder je größer die Länge bzw. die Anzahl der Nukleotide pro Oligonukleotid ist, welche an einem Nanopartikel befestigt sind, desto größer ist die Beladungsdichte des Nanopartikels. Eine größere Beladungsdichte kann den vorteilhaften Effekt bewirken, dass die Nanopartikel in der Lösung stabiler sind. Die Nanopartikel sind in einer Lösung insbesondere dann stabil, wenn sie insbesondere bei Raumtemperatur und ohne Fremdeinwirkung nicht miteinander aggregieren bzw. verklumpen und/oder aus der Lösung ausfallen. Eine derartige Fremdeinwirkung kann beispielsweise die Verbindung mit einer kationisch modifizierten Nukleinsäure sein. In anderen Worten verhindert oder verringert eine große Beladungsdichte das Risiko, dass Nanopartikel miteinander aggregieren. In einer bevorzugten Ausführungsform haben alle in einer Lösung befindlichen stabilen Nanopartikel zumindest ein Molekül an deren Oberfläche gebunden. Vorzugsweise weisen die verwendeten Nanopartikel eine Beladungsdichte zwischen 0,001 und 1 , weiter bevorzugt zwischen 0,001 und 0,5, noch weiter bevorzugt zwischen 0,001 und 0,2, mehr bevorzugt zwischen 0,001 und 0,1 , am meisten bevorzugt zwischen 0,01 und 0,1 Oligonukleotide pro nm ² Nanopartikeloberfläche auf.

Ein Oligonukleotid umfasst dabei vorzugsweise nicht mehr als 1.000 Nukleotide, weiter bevorzugt nicht mehr als 500 Nukleotide, besonders bevorzugt nicht mehr als 200 Nukleotide, noch weiter bevorzugt nicht mehr als 100 Nukleotide, ganz besonders bevorzugt nicht mehr als 80 Nukleotide, am meisten bevorzugt nicht mehr als 50 Nukleotide.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die kationisch modifizierte Nukleinsäure zumindest teilweise komplementär zu einer in der Lösung nachzuweisenden Nukleinsäure und/oder ist das zumindest eine Oligonukleotid, welches an den zumindest einen Nanopartikel gebunden ist, vorzugsweise zumindest teilweise komplementär zu der in der Lösung nachzuweisenden Nukleinsäure. Wenn eine erste Nukleinsäure teilweise komplementär zu einer zweiten Nukleinsäure ist, bedeutet dies, dass zumindest ein Teil der ersten Nukleinsäure zu zumindest einem Teil der zweiten Nukleinsäure komplementär ist. Insbesondere bedeutet dies, dass bei einer Komplementarität zweier Nukleinsäuren deren Nukleotidsequenzen derart ausgestaltet sind, so dass diese Nukleinsäuren miteinander hybridisieren können. Wenn die kationisch modifizierte Nukleinsäure zumindest teilweise komplementär zu der in der Lösung nachzuweisenden Nukleinsäure ist, kann demnach ein Einzelstrang der kationisch modifizierten Nukleinsäure mit einem Einzelstrang der in der Lösung nachzuweisenden Nukleinsäure hybridisieren. Wenn das auf dem Nanopartikel angebrachte Oligonukleotid zumindest teilweise komplementär zu der in der Lösung nachzuweisenden Nukleinsäure ist, kann ein Einzelstrang des auf dem Nanopartikel angebrachten Oligonukleotids mit einem Einzelstrang der in der Lösung nachzuweisenden Nukleinsäure hybridisieren. Wenn das auf dem Nanopartikel angebrachte Oligonukleotid mit der in der Lösung nachzuweisenden Nukleinsäure hybridisiert, ist die in der Lösung nachzuweisende Nukleinsäure mit dem Nanopartikel verbunden. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das zumindest eine Oligonukleotid zumindest teilweise komplementär zu einem ersten Nukleotidsequenzabschnitt einer in der Lösung nachzuweisenden Nukleinsäure und ist die kationisch modifizierte Nukleinsäure zumindest teilweise komplementär zu einem zweiten Nukleotidsequenzabschnitt der in der Lösung nachzuweisende Nukleinsäure.

Beispielsweise können der erste Nukleotidsequenzabschnitt und der zweite Nukleotidsequenzabschnitt an dem gleichen Strang der in der Lösung nachzuweisenden Nukleinsäure ausgebildet sein. Wenn sich in diesem Fall das Oligonukleotid und die kationisch modifizierte Nukleinsäure mit dem ersten Nukleotidsequenzabschnitt bzw. mit dem zweiten Nukleotidsequenzabschnitt verbinden, sind sowohl das Oligonukleotid als auch die kationisch modifizierte Nukleinsäure am gleichen Strang der nachzuweisenden Nukleinsäure hybridisiert.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist der erste Nukleotidsequenzabschnitt an einem ersten Strang der nachzuweisenden Nukleinsäure ausgebildet und ist der zweite Nukleotidsequenzabschnitt an einem von dem ersten Strang verschiedenen zweiten Strang der nachzuweisenden Nukleinsäure ausgebildet. In einer bevorzugten Ausführungsform ist zumindest ein Teil des zumindest einen Oligonukleotids und/oder zumindest ein Teil der kationisch modifizierten Nukleinsäure ein Primer, wie etwa ein Forward-Primer und/oder ein Reverse-Primer. Beispielsweise kann das an dem Nanopartikel befestigte Oligonukleotid ein Forward-Primer oder Reverse-Primer für den ersten Strang der nachzuweisenden Nukleinsäure sein. Zudem kann die kationisch modifizierte Nukleinsäure ein Forward-Primer oder Reverse-Primer für den zweiten Strang der nachzuweisenden Nukleinsäure sein. Gemäß dieser bevorzugten Ausführungsform wird während einer Amplifikationsreaktion vorzugsweise das Oligonukleotid, welches an dem Nanopartikel befestigt ist, elongiert und/oder die kationisch modifizierte Nukleinsäure während eines Ampiifikationsvorgangs elongiert. Die dabei auftretenden Amplifikate können sodann vorzugsweise miteinander hybridisieren, wobei vorzugsweise die Hybridisierung eines an einen Nanopartikel gebundenen elongierten Oligonukleotids mit einer elongierten Nukleinsäure mit kationischer Modifikation auftreten kann.

Vorzugsweise können während eines Annealing-Vorgangs einer PCR die Primer mit dem ersten Strang und/oder dem zweiten Strang der nachzuweisenden Nukleinsäure hybridisieren. Das an den Nanopartikel gebundene Oligonukleotid und/oder die kationisch modifizierte Nukleinsäure können dabei weitere Teile bzw. Blöcke bzw. Abschnitte umfassen, welche im Wesentlichen nicht zu der Funktion als Primer beitragen. Beispielsweise können dies bei dem Oligonukleotid ein oder mehrere Abschnitte sein, mit welchem das Oligonukleotid an den Nanopartikel gebunden ist. Ferner kann das Oligonukleotid einen oder mehrere Spacer aufweisen, welche im Wesentlichen nicht zu der Funktionalität als Primer beitragen. Ferner kann auch die kationisch modifizierte Nukleinsäure Spacer aufweisen, welche nicht zu der Funktion als Primer beitragen. In einer bevorzugten Ausführungsform trägt insbesondere der Fortsatz mit der kationischen Modifikation nicht zu der Funktionalität als Primer als solcher bei. Beispielsweise kann ein kationischer Fortsatz einen Schmelzpunkt erhöhen, wenn die kationisch modifizierte Nukleinsäure mit einer Nukleinsäure hybridisiert und/oder eine Affinität zu einer Nukleinsäure beeinflussen, insbesondere erhöhen.

In einer bevorzugten Ausführungsform trägt zumindest ein Teil des zumindest einen Oligonukleotids und/oder zumindest ein Teil der kationisch modifizierten Nukleinsäure am 3' Ende eine oder mehrere terminierende Modifikationen wie z.B. Dideoxycytidin (ddC) oder Phosphat oder Biotin. Diese Modifizierungen können dabei die 3'-Extension des zumindest einen Teils des zumindest einen Oligonukleotids und/oder des zumindest einen Teils der kationisch modifizierten Nukleinsäure durch die Polymerase verhindern, so dass der zumindest eine Teil des zumindest einen Oligonukleotids und/oder der zumindest eine Teil der kationisch modifizierten Nukleinsäure nicht als Primer dienen kann. Dies kann vorteilhaft sein, um den Amplifikationsvorgang möglichst wenig durch die Anwesenheit des Oligonukleotids und/oder der kationisch modifizierten Nukleinsäure zu beeinflussen und/oder zu stören und/oder das Oligonukleotid und/oder die kationisch modifizierte Nukleinsäure als Hybridisierungs-Sonde einzusetzen. Eine Hybridisierungssonde bezeichnet dabei insbesondere eine Nukleinsäure und/oder einen Teil einer Nukleinsäure und/oder einen Nukleotidsequenzabschnitt einer Nukleinsäure, durch dessen Hybridisierung mit zumindest einem Teil der nachzuweisenden Nukleinsäure die Anwesenheit der jeweiligen nachzuweisende Nukleinsäure überprüft bzw. nachgewiesen werden kann, wobei die Hybdridisierungssonde vorzugsweise hybridisieren kann aber nicht elongiert werden kann.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist zumindest ein Teil der mit dem Nanopartikel verbundenen Nukleinsäure ein Primer, wie etwa ein Forward-Primer und/oder ein Reverse-Primer, wobei die kationisch modifizierte Nukleinsäure kein Primer ist bzw. keinen Primer umfasst. Gemäß dieser bevorzugten Ausführungsform umfasst die kationisch modifizierte Nukleinsäure eine spezifische Nukleotidsequenz, welche als spezifische Hybridisierungs-Sonde dient. In anderen Worten ist zumindest ein Teil der kationisch modifizierte Nukleinsäure im Wesentlichen zumindest teilweise identisch mit oder komplementär zu der Nukleotidsequenz der nachzuweisenden Nukleinsäure.

Alternativ ist gemäß einer bevorzugten Ausführungsform zumindest ein Teil der kationisch modifizierten Nukleinsäure ein Primer bzw. umfasst einen Primer, wobei die mit dem Nanopartikel verbundene Nukleinsäure kein Primer ist bzw. keinen Primer umfasst. Gemäß dieser bevorzugten Ausführungsform umfasst die mit dem Nanopartikel verbundene Nukleinsäure eine spezifische Nukleotidsequenz, welche als spezifische Hybridisierungs-Sonde dient. In anderen Worten ist zumindest ein Teil der mit dem Nanopartikel verbundenen Nukleinsäure im Wesentlichen zumindest teilweise identisch mit oder komplementär zu der Nukleotidsequenz der nachzuweisenden Nukleinsäure.

Gemäß einer besonders bevorzugter Ausführungsform kann eine in der Lösung nachzuweisende Nukleinsäure als Target dienen, um etwa im Laufe einer Amplifikationsreaktion den bzw. die Primer zu elongieren, d.h. die mit dem Nanopartikel verbundene Nukleinsäure oder die kationisch modifizierte Nukleinsäure zu elongieren. Der Primer kann dabei bspw. ein Forwardprimer sein. Zusätzlich kann die Lösung eine weitere Nukleinsäure beinhalten, welche ebenfalls als Primer, bspw. als Reverse-Primer, dient und welche ebenfalls während der Amplifikationsreaktion elongiert wird. Die weitere Nukleinsäure kann dabei eine kationische Modifikation oder auch keine kationische Modifikation aufweisen.

Vorzugsweise führt gemäß dieser bevorzugten Ausführungsform die Amplifikationsreaktion alleine, beispielsweise bei Abwesenheit einer Hybridisierungs-Sonde und/oder bei Abwesenheit einer nachzuweisenden Nukleinsäure, nicht zu einer ausreichenden, messbaren Änderung der physikalischen Eigenschaft der Lösung. Wenn beispielsweise das entsprechende komplementäre Gegenstück zur Nanopartikel-gebundenen Nukleinsäure bzw. zur Hybridisierungs-Sonde während der Amplifikationsreaktion im elongierten Teil am Forward-Primer mit kationischer Modifikation entstanden ist, kann beispielsweise die Nanopartikel-gebundene Hybridisierungs-Sonde an den während der Amplifikationsreaktion elongierten Teil am Forward-Primer mit kationischer Modifikation hybridisieren und zu einer Verbindung vön Nanopartikel-gebundener Hybridisierungs-Sonde mit dem Forward-Primer mit kationischer Modifikation führen. Ab einer ausreichenden Menge von Amplikon bzw. von elongierter Nukleinsäure mit kationischer Modifikation kommt es zu einer messbaren Veränderung der physiklischen Eigfenschaft der Lösung. Dieses Verfahren kann beispielsweise entweder als Endpunkt-Detektion nach Abschluss des Amplifikationsverfahrens verwendet werden oder als Real-Time Verfahren während der Amplifikationsreaktion, das dann vorzugsweise eine Quantifizierung der ursprünglich vorhandenen Nukleinsäure-Konzentration in der Probe erlaubt. Evtl. kann es dabei vorteilhaft sein, die Menge des Reverse-Primers (welcher mit oder ohne kationischer Modifikation ausgebildet sein kann) geringer zu wählen, als die Menge des Forward-Primers mit kationischer Modifikation. Dies kann beispielsweise vorteilhaft sein, um während der Amplifikationsreaktion einen Überschuss des Nukleinsäurestrangs zu erzeugen, der durch Elongation des Forward-Primers mit kationischer Modifikation entsteht (einzelsträngiger Teil des Amplikons), an welchen die Nanopartikel-gebundene Hybridisierungs-Sonde hybridisieren kann, ohne dass es beispielsweise zu einer Konkurrenz mit dem Gegenstrang (einzelsträngiger Teil des Amplikons durch Elongation des Reverse- Primers entstanden) kommt.

Bevorzugt überschneiden sich die Erkennungssequenz bzw. Hybridisierungs- Sonden-Sequenz bzw. Hybridisierungs-Sonden-Nukleotidsequenz und die Primer- Sequenzen bzw. Nukleotidsequenzen nicht, welche als Primer dienen. Bevorzugt ist kein zusammenhängender Teilbereich der Erkennungssequenz bzw. Hybridisierungs-Sonden-Sequenz bzw. Hybridisierungs-Sonden-Nukleotidsequenz von mehr als 7 Nukleotidbasen, weiter bevorzugt von mehr als 5 Nukleotidbasen, nocht weiter bevorzugt von mehr als 3 und am meisten bevorzugt von mehr als 2 Nukleotidbasen komplementär oder identisch zu den Primer-Sequenzen bzw. den Nukleotidsequenzen, welche als Primer dienen. Vorzugsweise ist die Nukleotidsequenz der Hybridisierungs-Sonde, d.h. die Hybridisierungs-Sonden- Sequenz, mindestens am 3'-Ende terminiert (z.B. durch Biotin, Phosphat, ddC oder andere Modifikationen, die ein elongieren durch die Polymerase verhindert) oder trägt ein abstehendes 3'-Ende (dangling end), das mit mindestens einer Base nicht komplementär mit der Zielbinde-Sequenz ist. Somit kann beispielsweise verhindert werden, dass die Hybridisierungs-Sonden-Sequenz an der exponentiellen Amplifikation beteiligt ist, vergleichbar z.B. zu einer TaqMan-Sonde (siehe Beispiel 6). Diese bevorzugte Ausführungsform kann beispielsweise den Vorteil haben, dass die Bildung von Primer-Dimeren verringert und/oder verhindert werden kann. Insbesondere kann verhindert oder zumindest teilweise vermieden werden, dass die Bildung von Primer-Dimeren zu einer Verbindung von Nanopartikeln mit kationisch modifizierter Nukleinsäure führt. Dies kann vorteilhafterweise dazu beitragen, dass es fälschlicherweise zu einer Signalbildung kommt, obwohl eine nachzuweisende Nukleinsäure nicht in der Lösung vorhanden ist. Insbesondere kann zur Vermeidung eines fälschlicherweise auftretenden Signals beitragen, dass die Hybridisierungs-Sonde, d.h. die Nukleinsäure welche zur nachzuweisenden Nukleinsäure zumindest teilweise komplementär ist oder mit der nachzuweisenden Nukleinsäure zumindest teilweise identisch ist, d.h. die an den Nanopartikel gebundene Nukleinsäure oder die Nukleinsäure mit kationischer Modifikation, gemäß dieser bevorzugten Ausführungsform im Wesentlichen nicht amplifiziert wird. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist zumindest ein Teil der kationisch modifizierten Nukleinsäure kein Primer bzw. umfasst keinen Primer, und auch die mit dem Nanopartikel verbundene Nukleinsäure ist kein Primer bzw. umfasst keinen Primer. Gemäß dieser bevorzugten Ausführungsform umfasst die mit dem Nanopartikel verbundene Nukleinsäure eine spezifische Nukleotidsequenz, welche als spezifische Hybridisierungs-Sonde dient. In anderen Worten ist zumindest ein Teil der mit dem Nanopartikel verbundenen Nukleinsäure im Wesentlichen zumindest teilweise identisch mit oder komplementär zu der Nukleotidsequenz der nachzuweisenden Nukleinsäure. Zusätzlich umfasst gemäß dieser bevorzugten Ausführungsform die kationisch modifizierte Nukleinsäure eine spezifische Nukleotidsequenz, welche als spezifische Hybridisierungs-Sonde dient. In anderen Worten ist zumindest ein Teil der kationisch modifizierte Nukleinsäure im Wesentlichen zumindest teilweise identisch mit oder komplementär zu der Nukleotidsequenz der nachzuweisenden Nukleinsäure.

In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Verfahren zu einer Bestimmung der Konzentration der in der Lösung nachzuweisenden Nukleinsäure verwendet, wobei das Verfahren vorzugsweise eine Vervielfältigung der nachzuweisenden Nukleinsäure umfasst.

Insbesondere kann der Nachweis einer in der Lösung nachzuweisenden Nukleinsäure dadurch erfolgen, dass nicht bzw. nicht nur die ursprüngliche bzw. originale bzw. anfänglich vorhandene Nukleinsäure selbst nachgewiesen wird, sondern alternativ oder zusätzlich die bei einer Vervielfältigungsreaktion bzw. Amplifikationsreaktion erzeugten Amplifikate bzw. Duplikate der ursprünglichen Nukleinsäure. Dies kann beispielsweise ermöglichen, dass in der Lösung eine Nukleinsäure nachgewiesen werden kann, deren anfängliche Konzentration zu gering ist, um ohne vorherige Vervielfältigung einen messbaren Effekt bzw. eine messbare Änderung der physikalischen Eigenschaft der Lösung hervorrufen zu können. Insbesondere kann eine Amplifikationsreaktion dann vorteilhaft sein, wenn die durch die anfänglich vorhandene nachzuweisende Nukleinsäure entstehende Änderung der physikalischen Eigenschaft der Lösung nicht ausreicht, um diese Änderung zuverlässig zu detektieren bzw. zu messen.

In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt der Nachweis der in der Lösung nachzuweisenden Nukleinsäure während und/oder nach einer Amplifikation der in der Lösung nachzuweisenden Nukleinsäure mittels einer Polymerase- Kettenreaktion (PCR).

Insbesondere kann das Auftreten einer messbaren Änderung der physikalischen Eigenschaft der Lösung in einer Realtime-PCR dazu verwendet werden, aus der laufenden Nummer des Zyklus, bei welchem diese messbare Änderung der physikalischen Eigenschaft der Lösung auftritt, die anfängliche Konzentration der nachzuweisenden Nukleinsäure zu bestimmen.

Gegenüber herkömmlichen Realtime-PCR Verfahren kann die erfindungsgemäße Verwendung von Nanopartikeln und kationisch modifizierter Nukleinsäure zu einer früheren Detektierbarkeit, d.h. bei einer geringeren Anzahl von Zyklen, der gegebenenfalls amplifizierten, nachzuweisenden Nukleinsäure führen und/oder zu einem deutlicher ausgeprägten, insbesondere steileren Signalanstieg. Dies kann beispielsweise einen schnelleren, verbesserten und/oder zuverlässigeren Nachweis der Nukleinsäure ermöglichen. Ein weiterer Vorteil der erfindungsgemäßen Verwendung von Nanopartikeln und kationisch modifizierter Nukleinsäure kann darin bestehen, dass Polymerasenkonzentrationen ausreichend sein können, welche vorzugsweise nicht mehr als 20%, besonders bevorzugt nicht mehr als 5% der vom Hersteller der Polymerase typischerweise empfohlenen Menge bzw. Konzentration von Polymerasen entsprechen.

In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Vervielfältigung der in der Lösung nachzuweisenden Nukleinsäure mittels einer PCR, wobei bei der PCR ein Zyklus vorzugsweise die Schritte Denaturierung, Annealing und Elongation umfasst. Vorzugsweise werden während einer PCR der Zyklus bzw. die von dem Zyklus umfassten Schritte mehrfach durchlaufen. Besonders bevorzugt umfasst jeder Zyklus die Schritte Denaturierung, Annealing und Elongation jeweils einmal. Diese Schritte können dabei vorzugsweise bei unterschiedlichen Temperaturen der Lösung stattfinden. Ferner kann ein Zyklus ausschließlich aus den Schritten Denaturierung, Annealing und Elongation bestehen. Alternativ ist es möglich, dass ein Zyklus die Schritte Denaturierung bei einer ersten Temperatur und Annealing und Elongation gemeinsam bei einer zweiten Temperatur umfasst. Ein Zyklus kann weitere Schritte, wie etwa eine Bestimmung der physikalischen Eigenschaft der Lösung und/oder eine Detektion einer Fluoreszenz und/oder eine Bestimmung einer Menge von erzeugten und/oder vorhandenen Amplifikaten umfassen. Vorzugsweise ist der Ablauf eines jeden Zyklus identisch zu den anderen Zyklen. Alternativ können sich die Zyklen auch voneinander unterscheiden, Z.B. kann die Annealingtemperatur in mindestens einem Zyklus niedriger oder höher sein, als in den vorhergehenden Zyklus.

Bei der Denaturierung wird in der Lösung vorhandene doppelsträngige Nukleinsäure dehybridisiert, bzw. geschmolzen, bzw. voneinander getrennt. Nach der Denaturierung, bzw. dem Schmelzen, bzw. der Dehybridisierung liegt die in der Lösung vorhandene Nukleinsäure zumindest teilweise einsträngig vor. Insbesondere kann die Denaturierung durch ein globales und/oder lokales Erhitzen der Lösung erfolgen. Eine derartige lokale Erhitzung ist beispielsweise in der Druckschrift DE 10 2013 215 166 B3 beschrieben.

Ein globales Erhitzen der Lösung kann beispielsweise durch ein Erhitzen der gesamten Lösung bzw. zumindest eines Teils des Reaktionsgefäßes erfolgen, in welchem sich die Lösung befindet.

Während des Schritts des Annealings lagern sich in der Lösung vorhandene Primer an eine einzelsträngige Nukleinsäure an, sofern die Nukleotidsequenz des jeweiligen Primers ausreichend komplementär zu zumindest einem Teil der Nukleinsäure ist.

Während der Elongation wird zumindest ein Teil der Stränge einer Nukleinsäure in der Lösung, an welchen jeweils zumindest ein Primer anliegt, zumindest teilweise mittels einer Polymerase mit freien Nukleotiden aufgefüllt.

Vorzugsweise werden während einer Realtime-PCR nicht mehr als 200 Zyklen, weiter bevorzugt nicht mehr als 150 Zyklen, noch weiter bevorzugt nicht mehr als 100 Zyklen, mehr bevorzugt nicht mehr als 60 Zyklen, noch mehr bevorzugt nicht mehr als 40 Zyklen, besonders bevorzugt nicht mehr als 30 Zyklen, am meisten bevorzugt nicht mehr als 25 Zyklen durchlaufen.

In einer bevorzugten Ausführungsform wird durch eine Anregung zumindest eines Teils der Nanopartikel eine Umgebung der angeregten Nanopartikel lokal erhitzt. Nanopartikel, welche zur lokalen Erhitzung der Lösung angeregt werden, müssen dabei nicht notwendigerweise die gleichen bzw. die selben Partikel sein, wie die zur Detektion der physikalischen Eigenschaft bzw. einer Änderung der physikalischen Eigenschaft der Lösung verwendeten Nanopartikel. Beispielsweise können sich die Nanopartikel hinsichtlich der daran gebundenen Oligonukleotide und/oder des Materials und/oder der Form und/oder der Größe unterscheiden.

Vorzugsweise erfolgt die Anregung eines Nanopartikels dabei durch eine optische Anregung. Die optische Anregung eines Nanopartikels kann beispielsweise durch die Absorption von Photonen durch den Nanopartikel geschehen. Die Absorption eines Photons durch einen Nanopartikel geschieht insbesondere dann besonders effizient, wenn die Photonenenergie in etwa der Anregungsenergie eines Plasmons in dem Nanopartikel bzw. der Plasmonenresonanz des Nanopartikels entspricht. Die Photonenenergie entspricht insbesondere dann im Wesentlichen der Plasmonenanregungsenergie, wenn zwischen der Plasmonenabsorptionsbande und dem Wellenlängenspektrum des Photons bzw. des einfallenden Lichts ein zumindest teilweiser Überlapp besteht. Je größer der spektrale Überlapp des einfallenden Lichts mit dem Plasmonenabsorptionsspektrum des Nanopartikels ist, desto größer kann auch die Effizienz der optischen Anregung der Nanopartikel durch das einfallende Licht sein.

Wenn durch Anregung eines Nanopartikels Wärme an die Umgebung des Nanopartikels übertragen wird, bedeutet dies, dass Energie auf den Nanopartikel übertragen wird und der Nanopartikel durch die Übertragung der Energie seine JJmgebung erhitzt, Dabei wird vorzugsweise durch die Anregung des Nanopartikels die unmittelbare Umgebung des Nanopartikels stärker erhitzt als die weitere Umgebung des Nanopartikels. Typischerweise wird der Nanopartikel zunächst durch Anregung, insbesondere durch optische Anregung, erhitzt und überträgt dann die Wärme an seine Umgebung. Bevorzugt ist die Umgebung des Nanopartikels ein sphärisches Volumen, das in etwa den einhundertfachen (100-fachen) Durchmesser des Nanopartikels aufweist, der sich in der Mitte bzw. im Mittelpunkt dieses Volumens befindet. Besonders bevorzugt hat das Volumen in etwa den zehnfachen Durchmesser, weiter bevorzugt in etwa den vierfachen Durchmesser, am meisten bevorzugt weniger als den doppelten Durchmesser des Nanopartikels.

Bevorzugt wird durch die Anregung einer Mehrzahl von Nanopartikeln die Umgebung der Mehrzahl von Nanopartikeln lokal erhitzt. Besonders schnelle Temperaturänderungen sind insbesondere dann möglich, wenn das erhitzte Volumen nur einen kleinen Bruchteil des Gesamtvolumens der Lösung ausmacht, in welcher sich die Nanopartikel befinden. Einerseits kann in diesem Fall schon mit einem kleinen Energieeintrag durch die Strahlung bzw. durch das Licht eine hohe Temperaturdifferenz erzeugt werden. Andererseits ist eine sehr schnelle Abkühlung des erwärmten Volumens möglich, wenn ein ausreichend großes, kaltes Temperaturreservoir im bestrahlten Volumen bzw. um das bestrahlte Volumen herum vorhanden ist, um nach der Bestrahlung die Nanopartikel und ihre Umgebung wieder abzukühlen. Dies kann beispielsweise dadurch erreicht werden, dass die Nanopartikel hinreichend stark (um den gewünschten Temperaturhub zu erreichen) und hinreichend kurz (damit die Wärme lokalisiert bleibt) bestrahlt werden. Vorteilhafterweise ist es durch eine lokale Erhitzung möglich, die Polymerasen, welche sich ebenfalls in der Lösung befinden können, einer geringeren Hitze auszusetzen, so dass auch PCR-Verfahren mit einer Zyklenzahl von mehr als 80 realisiert werden können.

Beispielsweise kann eine derartige optische Anregung mittels Laserstrahlung erfolgen, wobei die Photonenenergie vorzugsweise im Wesentlichen der Anregungsenergie einer Plasmonenresonanz des zumindest einen Teils der Nanopartikel entspricht. Die Anregung erfolgt vorzugsweise durch Absorption von Licht bzw. Laserstrahlung durch zumindest einen Teil der Nanopartikel. Eine lokale Erhitzung liegt insbesondere dann vor, wenn die Dauer der optischen Anregung im jeweils bestrahlten Volumen (z. B. im Laserfokus) t kürzer oder gleich einer kritischen Anregungsdauer t1 gewählt wird. Hierbei ist t1 durch eine Zeit bestimmt, die die Wärme benötigt, um bei mittlerem Nanopartikelabstand von einem Nanopartikel zum nächsten Nanopartikel zu diffundieren, multipliziert mit einem Skalierungsfaktor s1 . Bei einem mittleren Nanopartikelabstand |x| und einer Temperaturleitfähigkeit D des Mediums zwischen den Nanopartikeln ist die kritische Anregungsdauer t1 geben durch t1 = (s1 - |x|) ² /D, wobei die Temperaturleitfähigkeit D typischerweise in wässriger Lösung einen Wert von D = 10 ^"7 m ² /s hat. Der Skalierungsfaktor s1 ist dabei vorzugsweise s1 100, besonders vorzugsweise s1 >10, besonders vorzugsweise s1 >1 und weiter vorzugsweise s1 >0, 1 . Für die Definition des lokalen Heizens berechnet sich der mittlere Nanopartikelabstand in Metern als \x\ = (C _NP ^■ 1000 · ΝΑ ^~1/3 , wobei CNP die molare Konzentration der Nanopartikel ist und NA die Avogadro-Konstante bezeichnet.

In einer bevorzugten Ausführungsform ändert sich die zumindest eine physikalische Eigenschaft der Lösung, wenn zumindest ein Teil der Nanopartikel mit der zumindest einen kationisch modifizierten Nukleinsäure verbunden ist, wobei die zumindest eine Eigenschaft der Lösung vorzugsweise eine optische Eigenschaft umfasst, und wobei die optische Eigenschaft insbesondere eine Extinktion und/oder eine Streuung und/oder eine Absorption ist. In einer bevorzugten Ausführungsform ist ein Nanopartikel insbesondere dann mit der kationisch modifizierten Nukleinsäure verbunden, wenn die kationisch modifizierte Nukleinsäure zumindest teilweise mit einem an dem Nanopartikel angebrachten Oligonukleotid hybridisiert ist. Alternativ kann die kationisch modifizierte Nukleinsäure mit einem Nanopartikel verbunden sein, indem die kationisch modifizierte Nukleinsäure direkt an den Nanopartikel gebunden ist (z.B. über eine Thiol-Bindung). Darüber hinaus kann in einer bevorzugten Ausführungsform eine kationisch modifizierte Nukleinsäure mit einem Nanopartikel dadurch verbunden sein, dass ein an dem Nanopartikel angebrachtes Oligonukleotid über eine Verbindungsnukleinsäure mit der kationisch modifizierten Nukleinsäure verbunden ist. Dies kann insbesondere dann der Fall sein, wenn das am Nanopartikel angebrachte Oligonukleotid mit einem ersten Abschnitt der Verbindungsnukleinsäure hybridisiert und die kationisch modifizierte Nukleinsäure mit einem zweiten Abschnitt der Verbindungsnukleinsäure hybridisiert. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform können mehrere Oligonukleotide an einen Nanopartikel gebunden sein. Insbesondere kann sich dabei an zumindest einen Teil der an den Nanopartikel gebundenen Oligonukleotide jeweils zumindest eine kationisch modifizierte Nukleinsäure direkt und/oder indirekt binden. Eine Direktbindung kann beispielsweise dann vorliegen, wenn die kationisch modifizierte Nukleinsäure direkt mit dem am Nanopartikel befestigten Oligonukleotid hybridisiert. Eine indirekte Bindung bzw. Verbindung kann insbesondere dann vorliegen, wenn die kationisch modifizierte Nukleinsäure mit dem am Nanopartikel angebrachten Oligonukleotid über eine Verbindungsnukleinsäure verbindet. In einer weiteren Ausführungsform können beispielsweise an einem Nanopartikel verschiedenartige Oligonukleotide angebracht sein, an denen jeweils eine oder mehrere kationisch modifizierte Nukleinsäuren anbringbar sind. Beispielsweise können an den an dem Nanopartikel angebrachten ersten Oligonukleotiden erste kationisch modifizierte Nukleinsäuren verbunden sein und mit an dem Nanopartikel angebrachten zweiten Oligonukleotiden zweite kationisch modifizierte Nukleinsäuren verbunden sein, wobei die ersten Oligonukleotide und die zweiten Oligonukleotide bzw. die erste modifizierte Nukleinsäure und die zweite modifizierte Nukleinsäure unterschiedlich voneinander sind. Ferner ist es möglich, dass sich die erste kationisch modifizierte Nukleinsäure direkt mit einem der ersten Oligonukleotide verbindet und/oder die zweite kationisch modifizierte Nukleinsäure sich indirekt mit einem der zweiten Oligonukleotide verbindet. Die physikalische Eigenschaft der Lösung kann sich beispielsweise dadurch ändern, dass sich die mittlere elektrische Ladungsdichte in der unmittelbaren Umgebung der Nanopartikel und der damit verbundenen Nukleinsäuren ändert, wenn zumindest eine kationisch modifizierte Nukleinsäure mit zumindest einem Teil der Nanopartikel verbunden ist. Die unmittelbare Umgebung umfasst dabei vorzugsweise das sphärische Volumen, das vom Mittelpunkt des Nanopartikels bis zu einem Abstand von der Nanopartikeloberfläche von vorzugsweise 100 nm, weiter bevorzugt 50 nm, besonders bevorzugt 30 nm und am meisten bevorzugt 15 nm reicht. Wenn im Folgenden die Rede von der mittleren elektrischen Ladungsdichte der Nanopartikel ist, ist dabei vorzugsweise stets die Ladungsdichte in der unmittelbaren Umgebung der Nanopartikel gemeint.

In einer bevorzugten Ausführungsform weisen Nanopartikel, welche jeweils mit zumindest einer kationisch modifizierten Nukleinsäure verbunden sind, untereinander eine andere elektrostatische Wechselwirkung auf, als Nanopartikel untereinander aufweisen, welche jeweils nicht mit einer kationisch modifizierten Nukleinsäure verbunden sind. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform weist auch ein Nanopartikel, der mit zumindest einer kationisch modifizierten Nukleinsäure verbunden ist, eine andere Wechselwirkung zu einem Nanopartikel auf, der nicht mit einer kationisch modifizierten Nukleinsäure verbunden ist, als die Wechselwirkung zwischen zwei Nanopartikeln, welche jeweils nicht mit einer kationisch modifizierten Nukleinsäure verbunden sind. Insbesondere ist die elektrostatische Abstoßung zweier Nanopartikel, von denen zumindest ein Nanopartikel mit zumindest einer kationisch modifizierten Nukleinsäure verbunden ist, geringer, als die elektrostatische Abstoßung zweier Nanopartikel, die jeweils nicht mit einer kationisch modifizierten Nukleinsäure verbunden sind.

Vorzugsweise werden die Nanopartikel und/oder die daran gebundenen Nukleinsäuren derart gewählt, dass diese in ihrer normalen Umgebung bzw. in der dafür vorgesehenen Lösung stabil sind, d.h. dass diese im Wesentlichen nicht miteinander aggregieren bzw. im Wesentlichen nicht verklumpen. Ist ein Teil der Nanopartikel mit zumindest einer kationisch modifizierten Nukleinsäure verbunden, so führt dies besonders bevorzugt dazu, dass zumindest der Teil der Nanopartikel, der mit der zumindest einen kationisch modifizierten Nukleinsäure verbunden ist, mit zumindest einem anderen Nanopartikel aggregiert. Ein derartiges Aggregieren führt dabei vorzugsweise zu einer Änderung der physikalischen Eigenschaft der Lösung. Ist die physikalische Eigenschaft der Lösung zumindest eine optische Eigenschaft, _kann diese Änderung der physikalischen Eigenschaft der Lösung beispielsweise eine Änderung der Amplitude und/oder der spektralen Eigenschaften der zumindest einen optischen Eigenschaft sein. Beispielsweise kann sich die Stärke einer Extinktion und/oder einer Streuung und/oder einer Absorption ändern. Ferner kann sich vorzugsweise eine spektrale Eigenschaft der Extinktion und/oder der Streuung und/oder der Absorption ändern. Beispielsweise kann die von der Plasmonenresonanz der Nanopartikel herrührende spektrale Absorptionsbande einer spektralen Verbreiterung und/oder einer spektralen Rotverschiebung unterzogen werden. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird die Konzentration der Nanopartikel und/oder der kationisch modifizierten Nukleinsäure derart gewählt, däss bei einer Verbindung zumindest eines Teils der Nanopartikel mit zumindest einem Teil der kationisch modifizierten Nukleinsäure eine derart große Änderung der physikalischen Eigenschaft hervorgerufen werden kann, dass eine Messung bzw. Detektion der Änderung der physikalischen Eigenschaft der Lösung möglich ist. Besonders bevorzugt wird die Konzentration der Nanopartikel und/oder der kationisch modifizierten Nukleinsäure derart gewählt, dass bei einer Verbindung zumindest eines Teils der Nanopartikel mit zumindest einem Teil der kationisch modifizierten Nukleinsäure eine derart große Änderung der physikalischen Eigenschaft hervorgerufen werden kann, dass die Änderung mit bloßem Auge erkennbar ist.

Besonders bevorzugt erfolgt die Messung und/oder Bestimmung der Änderung der physikalischen Eigenschaft der Lösung beispielsweise durch die Messung einer Änderung der Extinktion bei einer längeren Wellenlänge als das Extinktionsmaximum der Plasmonenresonanz der Nanopartikel in der Lösung. Vorzugsweise wird dazu eine Wellenlänge gewählt, welche erst durch eine Rotverschiebung der Plasmonenresonanz aufgrund eines verringerten mittleren Abstands von zumindest zwei Nanopartikeln eine zunehmende, insbesondere möglichst stark zunehmende, bzw. zuverlässig messbare Extinktion aufweist.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird die physikalische Eigenschaft der Lösung bei unterschiedlichen Temperaturen der Lösung gemessen. Beispielsweise kann das Messen der physikalischen Eigenschaft der Lösung bei unterschiedlichen Temperaturen dazu dienen, die Komplementarität zweier in der Lösung vorhandener Nukleinsäuren zu bestimmen. Je größer die Komplementarität zweier in der Lösung vorhandenen Nukleinsäuren ist, desto höher ist typischerweise deren Schmelztemperatur, wenn diese zu einem Doppelstrang hybridisiert sind. Auf diese Weise kann beispielsweise durch gezielte, sukzessive Temperaturerhöhungen festgestellt werden, bei welcher Temperatur der Schmelzpunkt zweier komplementärer bzw. zumindest teilweiser komplementärer Nukleinsäuren in der Lösung liegt und/oder bei welcher Temperatur der Schmelzpunkt überschritten wird. Auch kann das Messen der physikalischen Eigenschaft der Lösung bei unterschiedlichen Temperaturen beispielsweise dazu dienen, eine Sequenz-Zusammensetzung und/oder Länge zweier in der Lösung vorhandener Nukleinsäuren zumindest teilweise zu bestimmen. Für DNA ist typischerweise anzunehmen, dass je größer die Länge und der GC-Gehalt, d.h. der Anteil von Guanin-Cytosin Basenpaaren, zweier in der Lösung vorhandener Nukleinsäuren ist, desto höher typischerweise deren Schmelztemperatur ist, wenn diese zu einem Doppelstrang hybridisiert sind. Vorzugsweise ist die Schmelzkurve bei der erfindungsgemäßen Verwendung von Nanopartikeln und kationisch modifizierten Nukleinsäuren schärfer bzw. eindeutiger erkennbar bzw. rauschärmer als eine Schmelzkurve, die ohne die Verwendung von Nanopartikeln und kationisch modifizierten Nukleinsäuren aufgenommen wurde. Mit anderen Worten ist bei der erfindungsgemäßen Verwendung von Nanopartikeln und kationisch modifizierten Nukleinsäuren gemäß einer bevorzugten Ausführungsform die Halbwertsbreite der ersten Ableitung der Schmelzkurve vorzugsweise geringer. Vorzugsweise ist die Halbwertsbreite der ersten Ableitung der Schmelzkurve geringer als 7°C, weiter bevorzugt geringer als 5°C, noch weiter bevorzugt geringer als 3°C und am meisten bevorzugt geringer als 2°C. Eine steile Schmelzkurve oder in anderen Worten eine geringe Halbwertsbreite der ersten Ableitung der Schmelzkurve kann vorteilhaft sein, um Schmelzpunkte oder Schmelztemperaturen von unterschiedlichen Nukleinsäuren besser unterscheiden zu können, wenn diese nah beieinander liegen oder sich die Schmelzpunkte oder Schmelztemperaturen wenig unterscheiden. Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein Kit zum Nachweis einer nachzuweisenden Nukleinsäure in einer Lösung, umfassend:

zumindest eine kationisch modifizierte Nukleinsäure; und

zumindest zwei Nanopartikel, wobei die zumindest zwei Nanopartikel ausgelegt sind, durch ein zumindest teilweises Binden der zumindest zwei Nanopartikel an die kationisch modifizierte Nukleinsäure die physikalische Eigenschaft der Lösung zumindest teilweise zu ändern und wobei die nachzuweisende Nukleinsäure in der Lösung das zumindest teilweise Binden der zumindest zwei Nanopartikel an die kationisch modifizierte Nukleinsäure zumindest teilweise fördert oder zumindest teilweise hemmt.

Die Nanopartikel einerseits und die kätiönisch modifizierte Nukleinsäure andererseits können dabei im Kit separat voneinander vorliegen, bzw. separat abgepackt sein. In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Nanopartikel in einer ersten Lösung und die kationisch modifizierte Nukleinsäure in einer von der ersten Lösung verschiedenen zweiten Lösung vorliegend. Beispielsweise werden die erste und die zweite Lösung erst dann vom Benutzer zusammengeführt, wenn ein erfindungsgemäßes Verfahren durchgeführt werden soll. Alternativ können die Nanopartikel und die kationisch modifizierte Nukleinsäure auch in einer einzigen Lösung zusammen vorliegen.

Im Folgenden werden einzelne, bevorzugte Ausführungsformen zur Lösung der Aufgabe anhand der Figuren beispielhaft beschrieben. Dabei weisen die einzelnen beschriebenen Ausführungsformen zum Teil Merkmale auf, die nicht zwingend erforderlich sind, um den beanspruchten Gegenstand bzw. das beanspruchte Verfahren auszuführen, die aber in bestimmten Anwendungsfälien gewünschte Eigenschaften bereitstellen. So sollen auch Ausführungsformen als unter die beschriebene technische Lehre fallend offenbart angesehen werden, die nicht alle Merkmale der im Folgenden beschriebenen Ausführungsformen aufweisen. Ferner werden, um unnötige Wiederholungen zu vermeiden, bestimmte Merkmaie nur in Bezug auf einzelne der im Folgenden beschriebenen Ausführungsformen erwähnt. Es wird darauf hingewiesen, dass die einzelnen Ausführungsformen daher nicht nur für sich genommen sondern auch in einer Zusammenschau betrachtet werden sollen. Anhand dieser Zusammenschau wird der Fachmann erkennen, dass einzelne Ausführungsformen auch durch Einbeziehung von einzelnen oder mehreren Merkmalen anderer Ausführungsformen modifiziert werden können. Es wird darauf hingewiesen, dass eine systematische Kombination der einzelnen Ausführungsformen mit einzelnen oder mehreren Merkmalen, die in Bezug auf andere Ausführungsformen beschrieben werden, wünschenswert und sinnvoll sein kann, und daher in Erwägung gezogen und auch als von der Beschreibung umfasst angesehen werden soll.

Es zeigt:

Fig. 1A bis 1G-2: schematische Darstellungen einer ersten bevorzugten Ausführungsform sowie eines Effektes des Verfahrens gemäß der ersten bevorzugten Ausführungsform;

Fig. 2: eine fotografische Darstellung von Reaktionsgefäßen bei der Durchführung eines Verfahrens gemäß der ersten bevorzugten Ausführungsform; Fig. 3A bis 3D: eine graphische Darstellung von Extinktionsspektren von Lösungen bei der Durchführung eines Verfahrens gemäß einer bevorzugten Ausführungsform; Fig. 4: eine schematische Darstellung einer zweiten bevorzugten Ausführungsform;

Fig. 5: eine fotografische Darstellung von Reaktionsgefäßen bei der Durchführung eines Verfahrens gemäß der zweiten bevorzugten Ausführungsform;

Fig. 6: eine schematische Darstellung einer dritten bevorzugten Ausführungsform;

Fig. 7: eine fotografische Darstellung von Reaktionsgefäßen bei der Durchführung eines Verfahrens gemäß der dritten bevorzugten Ausführungsform;

Fig. 8: eine graphische. Darstellung von Real-Time PCR Kurven, welche mittels eines herkömmlichen, aus dem Stand der Technik bekannten Verfahrens aufgenommen wurden; Fig. 9A und 9B: eine graphische Darstellung von Real-Time PCR Kurven, welche mittels eines Verfahrens gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung aufgenommen wurden;

Fig. 10: eine graphische Darstellung von Real-Time PCR Kurven, welche mittels eines Verfahrens gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung aufgenommen wurden;

Fig. 11 : eine graphische Darstellung von Real-Time PCR Kurven, welche mittels eines Verfahrens gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung zum Nachweis einer genomischen DNA aufgenommen wurden; Fig. 12: eine graphische Darstellung von Real-Time PCR Kurven, welche mittels eines Verfahrens gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung bei einer anderen MgC Konzentration der Lösung aufgenommen wurden; Fig. 13: eine graphische Darstellung der ersten Ableitung von Schmelzkurven, welche mittels eines Verfahrens gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung von falsch-positiven und echt-positiven Proben während einer kontinuierlichen Temperaturerhöhung aufgenommen wurden; Fig. 14A und 14B: schematische Darstellungen einer Messvorrichtung, welche zur Durchführung einer Laser-PCR geeignet ist;

Fig. 15A: eine graphische Darstellung von Real-Time Laser-PCR Kurven welche mittels eines erfindungsgemäßen Verfahrens in einer bevorzugten Ausführungsform gemessen wurden;

Fig. 15B: Erste Ableitungen der Kurven aus Fig. 15A;

Fig. 16A: eine graphische Darstellung von Real-Time Laser-PCR Kurven welche mittels eines Verfahrens ohne eine kationisch modifizierte Nukleinsäure gemessen wurden;

Fig. 16B: eine graphische Darstellung von weiteren Real-Time Laser-PCR Kurven welche mittels eines Verfahrens ohne eine kationisch modifizierte Nukleinsäure gemessen wurden;

Fig. 17: eine graphische Darstellung von Real-Time PCR Kurven welche mittels eines erfindungsgemäßen Verfahrens in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform gemessen wurden.

In einer ersten Ausführungsform werden Nanopartikel verwendet, wobei zumindest ein Teil der Nanopartikel zumindest eine Nukleinsäure trägt, d.h. an jeden Nanopartikel des zumindest einen Teils der Nanopartikel ist jeweils zumindest eine Nukleinsäure gebunden. Vorzugsweise ist an jeden Nanopartikel zumindest eine Nukleinsäure gebunden. Die Nanopartikel werden vorzugsweise in eine Lösung gebracht. Gemäß der ersten Ausführungsform werden ferner kationisch modifizierte Oligonukieotide verwendet, deren Nukleotidsequenz zumindest teilweise bekannt ist. Die kationisch modifizierten Oligonukieotide werden in die Lösung gebracht, in welcher sich die Nanopartikel befinden. Bei einer hohen Komplementarität zwischen den Nukleotidsequenzen der an den Nanopartikeln befestigten Nukleinsäuren und den Oligonukleotiden mit kationischer Modifikation hybridisiert vorzugsweise zumindest eines der Oligonukieotide mit kationischer Modifikation auf zumindest eine der auf den Nanopartikeln befestigten Nukleinsäuren. Es liegt beispielsweise dann eine hohe Komplementarität vor, wenn die Nukleotidsequenz der Oligonukieotide über einen ganzen Hybridisierungsbereich eine mit der Nukleinsäure komplementäre Sequenz aufweist, welche bei weniger als 10% der Basen eine nicht-komplementäre Basenpaarung aufweist, bevorzugt bei weniger als 5% der Basen eine nichtkomplementäre Basenpaarung aufweist, weiter bevorzugt bei weniger als 3% der Basen eine nicht-komplementäre Basenpaarung aufweist, noch weiter bevorzugt bei weniger als 1 % der Basen eine nicht-komplementäre Basenpaarung aufweist, am meisten bevorzugt keine nicht-komplementäre Basenpaarung aufweist.

Erfolgt eine Hybridisierung, tritt gemäß der ersten bevorzugten Ausführungsform eine Veränderung zumindest einer physikalischen Eigenschaft der Lösung auf. Vorzugsweise ist die Veränderung der physikalischen Eigenschaft der Lösung messbar. Wird die messbare Veränderung der physikalischen Eigenschaft der Lösung gemessen, können daraus bevorzugt Informationen über die Komplementarität zwischen den Nukleotidsequenzen der kationisch modifizierten Oligonukieotide und den Nukleotidsequenzen der an den Nanopartikeln befestigten Nukleinsäuren bestimmt werden. Ein Verfahren gemäß der ersten Ausführungsform kann beispielsweise dazu verwendet werden, den Grad einer Komplementarität zwischen der an den Nanopartikeln befestigten Nukleinsäuren und den Oligonukleotiden mit kationischer Modifikation zu bestimmen. Alternativ oder zusätzlich kann ein Verfahren gemäß der ersten Ausführungsform dazu verwendet werden, die Fähigkeit zur Hybridisierung zwischen den auf den Nanopartikeln befestigten Nukleinsäuren mit den Oligonukleotiden mit kationischer Modifikation zu bestimmen. Möglicherweise ist dabei die Sequenz der auf den Nanopartikeln befestigten Nukleinsäuren zumindest teilweise unbekannt.

Fig. 1A bis 1E zeigen eine Schematische Darstellung der Nanopartikel 2 mit daran gebundenen Nukleinsäuren 4, der kationisch modifizierten Oligonukleotide 6 sowie eine schematische Darstellung eines Grundprinzips eines erfindungsgemäßen Verfahrens gemäß der ersten bevorzugten Ausführungsform.

Die schematische Darstellung in Fig. 1A zeigt einen Nanopartikel 2 an welchen eine Mehrzahl von Nukleinsäuren 4 befestigt bzw. gebunden bzw. funktionalisiert bzw. konjugiert ist. Die Nukleinsäuren 4 können dabei gleichartig oder unterschiedlich sein und in gleicher oder unterschiedlicher Orientierung an dem Nanopartikel 2 befestigt sein. Fig. 1A veranschaulicht den Nanopartikel 2 dabei lediglich in einer zweidimensionalen Projektion bzw. in einem zweidimensionalen Querschnitt. Die Nukleinsäuren 4 sind dabei vorzugsweise über die gesamte Oberfläche des dreidimensionalen, vorzugsweise sphärischen, Nanopartikels 2 verteilt. Besonders bevorzugt sind die an den Nanopartikel 2 angebrachten Nukleinsäuren 4 einzelsträngige Nukleinsäuren 4 und derart gewählt, dass diese nicht mit anderen an den Nanopartikel 2 oder an anderen Nanopartikeln 2 gebundenen Nukleinsäuren 4 hybridisieren. Besonders bevorzugt handelt es sich bei allen an den Nanopartikeln 2 gebundenen Nukleinsäuren 4 um gleichartige Nukleinsäuren 4. Fig. 1 B zeigt eine schematische Detail-Darstellung eines kationisch modifizierten Oligonukleotids 6. Die Größenverhältnisse in den Figuren bzw. zwischen verschiedenen Figuren müssen dabei nicht notwendiger Weise den tatsächlichen Größenverhältnissen entsprechen. Das kationisch modifizierte Oligonukleotid 6 umfasst in der gezeigten Ausführungsform einen Hybridisierungsbereich 6a und einen kationischen Abschnitt 6b. Der Hybridisierungsbereich 6a umfasst dabei vorzugsweise eine Nukleotidsequenz. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform kann der Hybridisierungsbereich 6a ein Oligonukleotid umfassen und/oder insbesondere aus einem Oligonukleotid bestehen. Der kationische Abschnitt 6b ist dabei vorzugsweise an einem Ende, insbesondere am 3'-Ende und/oder am 5'-Ende, des Hybridisierungsbereichs 6a ausgebildet. Der kationische Abschnitt 6b umfasst dabei zumindest eine kationische Einheit 6c. In der gezeigten Ausführungsform umfasst der kationische Abschnitt 6b drei kationische Einheiten 6c. Die kationischen Einheiten 6c umfassen vorzugsweise Spermine bzw. Spermin- Einheiten.

Fig. 1C zeigt den Nanopartikel 2 aus Fig. 1A, wobei an den an dem Nanopartikel 2 befestigten Nukleinsäuren 4 eine Mehrzahl von kationisch modifizierten Oligonukleotiden 6 hybridisiert ist. An dem gezeigten Nanopartikel 2 sind dabei alle konjugierten Nukleinsäuren mit kationisch modifizierten Oligonukleotiden 6 besetzt. Jedoch ist dies nicht zwingend erforderlich, da auch lediglich ein Teil der Nukleinsäuren 4 mit kationisch modifizierten Oligonukleotiden 6 besetzt sein kann. Insbesondere kann es für die Erzielung einer messbaren Änderung der physikalischen Eigenschaft der Lösung ausreichend sein, wenn lediglich ein Teil der am Nanopartikel 2 befestigten Oligonukleotide 4 besetzt ist. Vorzugsweise hybridisieren die kationisch modifizierten Oligonukleotiden 6 an die an dem Nanopartikel 2 befestigten Nukleinsäuren, indem die jeweiligen Hybridisierungsbereiche 6a der kationisch modifizierten Oligonukleotide 6 zumindest teilweise an die Nukleinsäuren 4 hybridisieren. Eine derartige Hybridisierung findet vorzugsweise dann statt, wenn die kationisch modifizierten Oligonukleotide 6 und die Nukleinsäuren 4 eine ausreichende Komplementarität aufweisen. Ob bzw. wann eine Komplementarität ausreichend ist, hängt dabei von verschiedenen Parametern ab, wie etwa von der Temperatur der gesamten Lösung und/oder der lokalen Umgebung. Bei einer sehr hohen Temperatur, von mindestens 40°C, bevorzugt mindestens 50°C, weiter bevorzugt mindestens 60°C, noch mehr bevorzugt mindestens 70°C, am meisten bevorzugt mindestens 80°C, kann es erforderlich sein, dass die Nukleotidsequenzen der Hybridisierungsbereiche 6a der kationisch modifizierten Oligonukleotide 6 vollständig komplementär zu zumindest einem Teil der Nukleotidsequenzen der Nukleinsäuren 4 sind, d.h. dass keine nichtkomplementären Basenpaarungen vorhanden sind, während bei geringeren Temperaturen eine Hybridisierung bei Vorliegen einzelner nicht-komplementärer Basenpaarungen erfolgen kann.

Fig. 1 D zeigt eine schematische Darstellung einer Wechselwirkung von zwei Nanopartikeln 2 in einer Lösung, wobei an jedem der zwei Nanopartikeln 2 bzw. an den daran befestigten Nukleinsäuren 4 eine Mehrzahl von kationisch modifizierten Oligonukleotide 6 hybridisiert sind, welche zumindest teilweise komplementär zu den Nukleinsäuren 4 sind. Wenn ein kationisch modifiziertes Oligonukleotid 6 an ^' einen Nanopartikel 2 hybridisiert ist, soll dies im Folgenden bedeuten, dass das kationisch modifizierte Oligonukleotid 6 an eine an dem Nanopartikel 2 befestigte Nukleinsäure 4 hybridisiert ist.

Vorzugsweise ändert sich durch eine Hybridisierung von zumindest einem kationisch modifizierten Oligonukleotid 6 an einen Nanopartikel 2 eine mittlere elektrische Ladungsdichte des Komplexes aus dem Nanopartikel 2 und den daran befestigten bzw. hybridisierten Nukleinsäuren 4 bzw. kationisch modifizierten Oligonukleotiden 6. Beispielsweise sind die an einem Nanopartikel befestigten Nukleinsäuren 4 vorzugsweise elektrisch negativ geladen, d.h. anionisch. Entsprechend stoßen sich vorzugsweise mehrere in der Lösung befindliche Nanopartikel 2 bzw. mehrere Komplexe der Nanopartikel 2 aufgrund einer repulsiven elektrostatischen Wechselwirkung voneinander ab. In anderen Worten sind die Nanopartikel vorzugsweise im Wesentlichen in der Lösung stabil, d.h. sie verklumpen nicht und/oder aggregieren nicht oder aggregieren nur in einem derart geringen Umfang, dass sich die physikalische Eigenschaft der Lösung dadurch vorzugsweise nicht oder nicht messbar ändert bzw. die Aggregierung und De- Aggregierung im Gleichgewicht stehen.

Findet bei zumindest einem Teil der Nanopartikel 2 eine Hybridisierung mit jeweils zumindest einem kationisch modifizierten Oligonukleotid 6 statt, kann dies vorzugsweise eine Veränderung der mittleren elektrischen Ladungsdichte der Nanopartikel 2 bzw. der Komplexe der Nanopartikel 2 verursachen. Insbesondere kann dabei die mittlere elektrische Ladungsdichte der Nanopartikel 2 bzw. der Komplexe der Nanopartikel 2 mit hybridisierten kationisch modifizierten Oligonukleotiden 6 weniger anionisch bzw. weniger elektrisch negativ sein als die mittlere elektrische Ladungsdichte der Nanopartikel 2 bzw. der Komplexe der Nanopartikel 2 ohne hybridisierte kationisch modifizierte Oligonukleotide 6. In anderen Worten kann eine Hybridisierung mit kationisch modifizierten Oligonukleotiden 6 zu einer positiveren oder kationischeren mittleren elektrischen Ladungsdichte der Nanopartikel 2 bzw. der Komplexe der Nanopartikel 2 führen. Dies kann vorzugsweise dazu führen, dass die repulsive, elektrostatische Wechselwirkung von den mit kationisch modifizierten Oligonukleotiden 6 hybridisierten Nanopartikeln 2 in der Lösung geringer wird. Dies kann zur Folge haben, dass sich der mittlere Abstand zweier Nanopartikel 2 der Mehrzahl von Nanopartikeln 2 in der Lösung verringert und/oder die Nanopartikel 2 zumindest teilweise aggregieren und/oder die Nanopartikel 2 zumindest teilweise aggregieren bzw. verklumpen. Vorzugsweise verringert sich der mittlere Abstand zweier vorzugsweise benachbarter Nanopartikel 2 der Mehrzahl von Nanopartikeln 2 in der Lösung auf weniger als das Dreifache des durchschnittlichen Partikeldurchmessers der Nanopartikel 2, weiter bevorzugt auf weniger als das Doppelte des durchschnittlichen Partikeldurchmessers, weiter bevorzugt auf weniger als die Länge des durchschnittlichen Partikeldurchmessers, noch weiter bevorzugt auf weniger als die halbe Länge des durchschnittlichen Partikeldurchmessers, besonders bevorzugt auf weniger als 20% des durchschnittlichen Partikeldurchmessers. Als Abstand zwischen zwei Nanopartikeln wird dabei der Abstand der jeweiligen Punkte auf den Oberflächen der jeweiligen Nanopartikel 2 angenommen, welche dem jeweils anderen Nanopartikel 2 am nächsten sind.

Insbesondere kann ein mittlerer Abstand zweier Nanopartikel 2 der Mehrzahl von Nanopartikeln 2 in der Lösung derart gering sein, dass sich die zumindest eine optische Eigenschaft der Lösung ändert, insbesondere messbar ändert. Beispielsweise kann eine derartige Eigenschaft bzw. Änderung der physikalischen Eigenschaft eine Änderung einer optischen bzw. spektralen Eigenschaft sein. Beispielsweise kann eine derartige Änderung eine Änderung einer optischen Absorption und/oder Extinktion und/oder Streuung sein. Beispielswiese kann eine derartige Änderung eine Rotverschiebung und/oder spektrale Verbreiterung einer solchen optischen Eigenschaft sein. Beispielsweise kann eine derartige Änderung auch eine messbare Reduktion und/oder eine messabre Erhöhung der messbaren Fluoreszenz eines Farbstoffs sein, der sich ebenfalls in der Lösung befinden kann. Eine Reduktion oder eine Erhöhung der Fluoreszenz eines Farbstoffs kann beispielsweise dann besonders ausgeprägt sein, wenn das Fluoreszenzspektrum des Farbstoffs und das Absorptionsspektrum der Plasmonenresonanz von Nanopartikeln 2 in der Lösung zumindest teilweise überlappen.

Beispielsweise kann eine Änderung einer Absorptionsbande der Lösung von einer Änderung einer Plasmonenresonanz der Nanopartikel 2 in der Lösung herrühren. Beispielsweise kann sich durch einen geringeren mittleren Abstand zweier vorzugsweise benachbarter Nanopartikel 2 der Mehrzahl von Nanopartikeln 2 in der Lösung eine Absorptionsbande hin zu geringeren Energien verschieben und/oder verbreitern. In anderen Worten kann dadurch eine spektrale Rotverschiebung und/oder spektrale Verbreiterung der Plasmonenresonanz der Nanopartikel 2 auftreten. Beispielsweise kann dies durch eine Wechselwirkung von Plasmonen bzw. Oberflächenplasmonen der wechselwirkenden Nanopartikel 2 geschehen. Insbesondere kann dies durch eine Dipol/Dipol-Wechselwirkung zwischen den wechselwirkenden Nanopartikeln 2 geschehen. Derartige Wechselwirkungen von Nanopartikeln 2 sind beispielsweise in M. Quinten and U. Kreibig, Optical properties of aggregates of small metal particles, Surface Science, Volume 172, Issue 3, 2 July 1986, Pages 557-577 beschrieben.

Flg. 1E zeigt eine schematische Darstellung einer Kombination, bei welcher die an den Nanopartikeln 2 befestigten Nukleinsäuren 4 nicht und/oder nicht ausreichend komplementär mit den kationisch modifizierten Oligonukleotiden 6 sind. Aufgrund der mangelnden Komplementarität der an den Nanopartikeln 2 befestigten Nukleinsäuren 4 mit den kationisch modifizierten Oligonukleotiden 6 können die kationisch modifizierten Oligonukleotide 6 nicht mit den an den Nanopartikeln 2 befestigten Nukleinsäuren 4 hybridisieren. In diesem Fall kommt es vorzugsweise nicht zu einer Verringerung der mittleren elektrischen Ladungsdichte der Nanopartikel 2 und/oder nicht zu einer Verringerung des mittleren Abstands zweier Nanopartikel 2 der Mehrzahl von Nanopartikeln 2 in der Lösung. Demnach findet vorzugsweise keine oder keine messbare Änderung der physikalischen Eigenschaft der Lösung statt.

Auf diese Weise kann eine Messung der physikalischen Eigenschaft der Lösung bzw. die Messung einer Änderung der physikalischen Eigenschaft der Lösung dazu dienen, eine Information über eine Hybridisierung der kationisch modifizierten Oligonukleotiden 6 mit den an den Nanopartikeln 2 befestigten Nukleinsäuren 4 und/oder über eine Komplementarität der kationisch modifizierten Oligonukleotiden 6 mit den an den Nanopartikeln 2 befestigten Nukleinsäuren 4 zu ermitteln.

Fig. 1F-1 und 1 F-2 zeigen eine schematische Darstellung eines erfindungsgemäßen Verfahrens in einer bevorzugten Ausführungsform, bei welcher eine optische Transmission einer Lösung, welche Nanopartikel 2 beinhaltet, gemessen wird. Bevorzugt weist dabei das einfallende Licht eine Intensität 11 auf und das optische Spektrum des einfallenden Lichts überlappt vorzugsweise zumindest teilweise mit einem Absorptions- und/oder Extinktionsspektrum zumindest eines Teils der Nanopartikel 2, wie etwa der Plasmonenresonanz der Nanopartikel 2. Bevorzugt handelt es sich bei dem einfallenden Licht um spektral schmalbandiges Licht, welches etwa von einer Leuchtdiode (LED) oder einem LASER emittiert wird. Besonders bevorzugt ist die Zentralwellenlänge des einfallenden Lichts in etwa gleich der Wellenlänge der Plasmonenresonanz der Nanopartikel 2, wenn diese im Wesentlichen nicht miteinander wechselwirken und/oder insbesondere nicht miteinander aggregieren. Im Wesentlichen nicht miteinander wechselwirken bedeutet dabei insbesondere, dass der mittlere Abstand zwischen jeweils zwei Nanopartikeln 2 nicht so gering ist, dass es zu einer messbaren Verschiebung einer Plasmonenresonanz von benachbarten Nanopartikeln 2 kommt.

Fig. 1F-1 zeigt dabei illustrativ den Fall, in dem keine derartige Wechselwirkung zwischen Nanopartikeln 2 stattfindet, da die Abstände zwischen den Nanopartikeln groß genug sind, um eine derartige Wechselwirkung auf effiziente Weise nicht ermöglichen. Die Darstellung ist dabei nicht notwendiger maßstabsgetreu. Umfasst das einfallende Licht mit der Intensität 11 eine Wellenlänge, welche von den Nanopartikeln aufgrund der Plasmonenresonanz effizient absorbiert werden kann, kommt es innerhalb des Reaktionsgefäßes R in der Lösung zu einer messbaren Abschwächung der Lichtintensität, so dass das austretende, transmittierte Licht eine Intensität T1 aufweist, welche geringer, insbesondere um einen messbaren Faktor geringer ist, als die Intensität 11 des einfallenden Lichts. Auf diese Weise kann beispielsweise nachgewiesen werden, dass die Nanopartikel nicht bzw. zumindest nicht vollständig bzw. nicht zu einem gewissen Anteil miteinander wechselwirken und/oder aggregieren und/oder verklumpen und/oder ausgefallen sind. Vorzugsweise ist das Verhältnis aus der Intensität des einfallenden Lichts 11 und der Intensität des transmittierten Lichts T1 ein Maß für eine Verschiebung der Plasmonenresonanz der Nanopartikel 2 und/oder für den mittleren Abstand zwischen den Nanopartikeln 2 und/oder für deren Aggregation.

Fig. 1 F-2 zeigt eine schematische Darstellung des Falls, in welchem in der Lösung aus Fig. 1 F-1 zusätzlich zumindest eine Nukleinsäure mit kationischer Modifikation 6 vorhanden ist, welche sich mit den Nanopartikeln 2 verbinden kann. Hybridisiert die Nukleinsäure mit kationischer Modifikation 6 zumindest teilweise mit den Nanopartikeln 2 bzw. mit einer an den Nanopartikeln 2 funktionalisierte Nukleinsäure bzw. einem Oligonkleotid 4, so kann sich der mittlere Abstand zwischen den Nanopartikeln zumindest teilweise verringern. Dies kann zumindest teilweise zu einer Aggregierung und/oder einem Ausfallen und/oder einem Sedimentieren der Nanopartikel 2 führen. Besonders bevorzugt kommt es dabei zu einer Verschiebung und/oder Verbreiterung der Plasmonenresonanz der Nanopartikel 2, weshalb sich diö Absorption und/oder die Extinktion der Lösung bzw. der Nanopartikel bei der Wellenlänge zumindest teilweise ändert. Dies kann zur Folge haben, dass die Abschwächung des einfallenden Lichts geringer ist, als in dem in Fig. 1 F-1 gezeigten Fall. Besonders bevorzugt kann dabei die Intensität des transmittierten Lichts T2 größer sein, als die Intensität des transmittierten Lichts T1 im in Fig. 1 F-1 gezeigten Fall, selbst wenn die Intensität 11 des einfallenden Lichts in beiden Fällen gleich groß ist. Vorzugsweise ist das Verhältnis aus der Intensität des einfallenden Lichts 11 und der Intensität des transmittierten Lichts T2 ein Maß für eine Verschiebung der Plasmonenresonanz der Nanopartikel 2 und/oder für den mittleren Abstand zwischen den Nanopartikeln 2 und/oder für deren Aggregation. Besonders bevorzugt lässt sich ein Maß für eine Verschiebung der Plasmonenresonanz der Nanopartikel 2 und/oder für den mittleren Abstand zwischen den Nanopartikeln 2 und/oder für deren Aggregation besonders effizient und besonders genau aus einem Vergleich und/oder einer Differenz und/oder einem Quotienten der ausfallenden Lichtintensitäten der in Fig. 1 F-1 und 1 F-2 gezeigten Fälle bestimmen. Fig. 1G-1 und 1G-2 zeigen eine schematische Darstellung eines erfindungsgemäßen Verfahrens in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform, bei welcher in der Lösung zusätzlich Farbstoffe 8 vorhanden sind und eine Intensität einer optischen Emission F1 bzw. F2 zumindest eines Teils der Farbstoffe 8 gemessen wird. Hinsichtlich der weiteren Eigenschaften, insbesondere hinsichtlich der Nanopartikel und des einfallenden Lichts, entsprechen die in Fig. 1G-1 und 1 G- 2 gezeigten Fälle den in Fig. 1 F-1 bzw. 1 F-2 gezeigten Fällen. Vorzugsweise überlappen die Absorptions- bzw. Anregungsspektren und/oder die Emissionsspektren der Farbstoffe 8 zumindest teilweise mit dem Spektrum des einfallenden Lichts und/oder mit dem Absorptionsspektrum der Nanopartikel 2, insbesondere mit dem Spektrum der Plasmonenresonanz.

Sind, wie in Fig. 1G-1 gezeigt, die Nanopartikel 2 nicht aggregiert, absorbieren die Nanopartikel auf effiziente Weise das einfallende Licht. Vorzugsweise schirmen auf diese Weise die Nanopartikel 2 auf besonders effiziente Weise die Farbstoffe 8 von dem einfallenden Licht ab. Alternativ oder zusätzlich schirmen bevorzugt die Nanopartikel 2 die durch die Farbstoffe 8 auftretende Emission von Licht, welche beispielsweise durch Fluoreszenz der Farbstoffe 8 verursacht wird, auf besonders effiziente Weise ab. Dadurch kann die mit der Intensität F1 aus der Lösung austretende Emission, zumindest teilweise abgeschwächt sein oder ganz unterbleiben. Vorzugsweise ist das Verhältnis aus der Intensität des einfallenden Lichts 11 und der Intensität des von den Farbstoffen 8 emittierten Lichts F1 ein Maß für eine Verschiebung der Plasmonenresonanz der Nanopartikel 2 und/oder für den mittleren Abstand zwischen den Nanopartikeln 2 und/oder für deren Aggregation. Fig. 1G-2 zeigt eine schematische Darstellung des Falls, in welchem in der Lösung aus Fig. 1 G-1 zusätzlich zumindest eine Nukleinsäure mit kationischer Modifikation 6 vorhanden ist, welche sich mit den Nanopartikeln 2 verbinden kann. Hybridisiert die Nukleinsäure mit kationischer Modifikation 6 zumindest teilweise mit den Nanopartikeln 2 bzw. mit an den Nanopartikeln 2 funktionalisierte Nukleinsäure bzw. Oligonukleotide 4, so kann sich der mittlere Abstand zwischen den Nanopartikeln 2 zumindest teilweise verringern. Dies kann zumindest teilweise zu einer Aggregierung und/oder einem Ausfallen /und/oder einem Sedimentieren der Nanopartikel 2 führen. Besonders bevorzugt kommt es dabei zu einer Verschiebung und/oder Verbreiterung der Plasmonenresonanz der Nanopartikel 2, weshalb sich die Absorption und/oder Extinktion der Lösung bzw. der Nanopartikel bei der Wellenlänge des einfallenden Lichts und/oder der Absorption der Farbstoffe 8 und/oder der Emission der Farbstoffe 8 zumindest teilweise ändert. Dies führt vorzugsweise zu einer geringeren Abschirmung der Farbstoffe 8 von dem einfallenden Licht und/oder zu einer geringeren Abschwächung des von den Farbstoffen 8 emittierten Lichts. Besonders bevorzugt kann dabei die Intensität des von den Farbstoffen emittierten Lichts F2, welches aus dem Reaktionsgefäß R austritt, größer sein, als die Intensität des emittierten Lichts F1 im in Fig. 1 G-1 gezeigten Fall, selbst wenn die Intensität 11 des einfallenden Lichts in beiden Fällen gleich groß ist. Vorzugsweise ist das Verhältnis aus der Intensität des einfallenden Lichts 11 und der Intensität des emittierten Lichts F2 ein Maß für eine Verschiebung der Plasmonenresonanz der Nanopartikel 2 und/oder für den mittleren Abstand zwischen den Nanopartikeln 2 und/oder für deren Aggregation. Besonders bevorzugt lässt sich ein Maß für eine Verschiebung der Plasmonenresonanz der Nanopartikel 2 und/oder für den mittleren Abstand zwischen den Nanopartikeln 2 und/oder für deren Aggregation besonders effizient und besonders genau aus einem Vergleich und/oder einer Differenz und/oder einem Quotienten der emittierten Lichtintensitäten F1 und F2 der in Fig. 1 G-1 und 1 G-2 gezeigten Fälle bestimmen.

Fig. 2 zeigt eine beispielhafte fotografische Darstellung von Reaktionsgefäßen R1 bis R8, in welchen ein Verfahren gemäß der zweiten bevorzugten Ausführungsform durchgeführt wird, wobei die Durchführung weiter unten in Beispiel 1 genauer beschrieben ist. Messungen bzw. Messdaten von optischen Eigenschaften der Lösung sind dabei in den in Fig. 3A bis 3C gezeigten Extinktionsspektren gezeigt.

Mit Bezug auf Fig. 4 wird im Folgenden eine zweite bevorzugte Ausführungsform der Erfindung erläutert. Gemäß einer zweiten bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfassen die an zumindest einem Teil der Nanopartikel befestigten Nukleinsäuren 4 jeweils ein Oligonukleotid. Bevorzugt bestehen die Nukleinsäuren 4, welche an dem Nanopartikel 2 befestigt sind, im Wesentlichen aus einem Oligonukleotid 4 und einer daran anschließenden Bindung, mit welcher das Oligonukleotid an eine Oberfläche eines Nanopartikels 2 binden kann. Vorzugweise werden dabei Oligonukleotide 4 mit bekannter Nukleotidsequenz bzw. mit bekannten Nukleotidsequenzen an den bzw. die Nanopartikel 2 gebunden. Dabei können sämtliche an die Nanopartikel 2 gebundenen Oligonukleotide 4 die gleiche oder unterschiedliche Nukleotidsequenzen aufweisen.

Fig. 4 zeigt dabei eine schematische Darstellung der zweiten bevorzugten Ausführungsform. In der zweiten bevorzugten Ausführungsform sind die Nanopartikel 2 mit Oligonukleotiden 4 beladen, wobei die Oligonukleotide 4 zumindest teilweise komplementär zu der nachzuweisenden Nukleinsäure 10 sind. Ferner werden vorzugsweise in der zweiten bevorzugten Ausführungsform Oligonukleotide 6 mit kationischer Modifikation verwendet, deren Nukleotidsequenz bzw. Nukleotidsequenzen zu der Nukleotidsequenz bzw. den Nukleotidsequenzen der an den Nanopartikeln 2 befestigten Oligonukleotide 4 zumindest teilweise komplementär ist bzw. sind. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird für jede Art von an den Nanopartikeln 2 befestigten Oligonukleotiden 4 zumindest eine Art von komplementären Oligonukleotiden 6 mit kationischer Modifikation bereitgestellt.

Ist in der Lösung, in welcher sich die Nanopartikel 2 und die Oligonukleotide 6 mit kationischer Modifikation befinden, keine nachzuweisenden Nukleinsäuren 10 oder nur eine sehr geringe Konzentration der nachzuweisenden Nukleinsäure 10 vorhanden, können die Oligonukleotide 6 mit kationischer Modifikation und die Oligonukleotide 4 auf den Nanopartikeln 2 miteinander hybridisieren. Wie bereits mit Bezug auf die Figuren 1A bis 1 E diskutiert, kann die Hybridisierung der Nanopartikel 2 bzw. der Oiigonukleotide 4 auf den Nanopartikeln 2 mit den Oligonukleotiden 6 mit kationischer Modifikation eine messbare Veränderung der physikalischen Eigenschaften der Lösung hervorrufen. Ist die nachzuweisende Nukleinsäure 10 in einer zumindest ausreichend hohen Konzentration in der Lösung vorhanden, wird die Hybridisierung der Oiigonukleotide 4 auf den Nanopartikeln 2 mit den Oligonukleotiden 6 mit kationischer Modifikation zumindest teilweise unterbunden bzw. verhindert. Dadurch wird ferner die messbare Veränderung der physikalischen Eigenschaft der Lösung zumindest teilweise unterbunden bzw. zumindest teilweise verhindert. Dies hat seine Ursache darin, dass die nachzuweisende Nukleinsäure 10 gemäß der zweiten bevorzugten Ausführungsform der Erfindung mit den Oligonukleotiden 6 mit kationischer Modifikation und/oder mit den Oligonukleotiden 4 auf den Nanopartikeln 2 hybridisieren kann. Die Oiigonukleotide 6 mit kationischer Modifikation und/oder die Olignukleotide 4 auf den Nanopartikeln können somit zumindest teilweise durch die nachzuweisende Nukleinsäure 10 besetzt sein. Vorzugsweise wird somit durch die nachzuweisende Nukleinsäure 10 ein derart großer Teil der Oiigonukleotide 4 auf den Nanopartikeln 2 und/oder der Oiigonukleotide 6 mit kationischer Modifikation besetzt, dass der Anteil an freien bzw. nicht durch die nachzuweisende Nukleinsäure 10 besetzten Oiigonukleotide 4 auf den Nanopartikeln bzw. Oiigonukleotide 6 mit kationischer Modifikation keine messbare Veränderung der physikalischen Eigenschaft der Lösung hervorrufen kann.

Vorzugsweise tritt dabei die nachzuweisende Nukleinsäure in Konkurrenz zu den Oligonukleotiden 6 mit kationischer Modifikation. In anderen Worten kann ein an dem Nanopartikel 2 angebrachtes Oligonukleotid 4 entweder mit der nachzuweisenden Nukleinsäure 10 oder mit einem Oligonukleotid 6 mit kationischer Modifikation hybridisieren, nicht aber mit beiden gleichzeitig. Obwohl auch das Oligonukleotid 6 mit kationischer Modifikation komplementär zu dem Oligonukleotid 4 an dem Nanopartikel 2 ist, kann das Oligonukleotid 6 mit kationischer Modifikation unter Umständen nicht mehr an das Oligonukleotid 4 an den Nanopartikel 2 binden, da dieses möglicherweise bereits durch eine nachzuweisende Nukleinsäure 10 besetzt ist. Vorzugsweise führt auch eine ausreichende Konzentration von Oligonukleotiden 6 mit kationischer Modifikation in der Lösung nicht zu einer ausreichenden Anzahl von Bindungen zwischen Oligonukleotiden 6 mit kationischer Modifikation und Oligonukleotiden 4 auf den Nanopartikeln 2 bzw. mit den Nanopartikeln 2, so dass keine messbare Veränderung der physikalischen Eigenschaft der Lösung erfolgt.

Die nachzuweisende Nukleinsäure 10 bzw. eine Lösung mit der nachzuweisenden Nukleinsäure 10 kann dabei entweder zeitlich vor oder gleichzeitig mit den Oligonukleotiden 6 mit kationischer Modifikation zur Lösung mit den Nanopartikeln hinzugegeben werden. Besonders bevorzugt wird die nachzuweisende Nukleinsäure 10 zeitlich vor den Oligonukleotiden 6 mit kationischer Modifikation hinzu gegeben. Auch ist es möglich, die nachzuweisende Nukleinsäure 10 zeitlich nach den Oligonukleotiden 6 mit kationischer Modifikation hinzuzugeben. Gegebenenfalls kann ein Heizschritt vor einer Messung der Veränderung der physikalischen Eigenschaft der Lösung eingefügt werden, ^, um eventuell bereits bestehende Bindungen bzw. Hybridisierungen zu lösen und für eine neue Konkurrenzsituation während des Abkühlens der Lösung nach dem Heizschritt zu sorgen. Insbesondere, wenn die nachzuweisenden Nukleinsäuren 10 erst nach dem Oligonukleotid 6 mit kationischer Modifikation zur Lösung hinzugegeben werden, kann ein derartiger Heizschritt sinnvoll und/oder erforderlich sein. Ferner kann ein derartiger Heizschritt insbesondere dann sinnvoll sein, wenn die nachzuweisende Nukleinsäure 10 zunächst in sehr geringer Konzentration vorliegt und während einer Amplifikationsreaktion vervielfältigt wird, so dass sie erst während und/oder nach der Amplifikationsreaktion zuverlässig nachgewiesen werden kann. Beispielsweise wären in solch einem Fall Zwischen-Heizschritte sinnvoll.

Ist die nachzuweisende Nukleinsäure 10 nicht oder nicht in ausreichender Konzentration in der Lösung vorhanden und/oder ist die nachzuweisende Nukleinsäure nicht ausreichend kompatibel zu den Oligonukleotiden 4 auf den Nanopartikeln 2 und/oder den Oligonukleotiden 6 mit kationischer Modifikation, können vorzugsweise eine ausreichende Anzahl von Oligonukleotiden 6 mit kationischer Modifikation an die Nanopartikel 2 bzw. die Oligonukleotide 4 auf den Nanopartikeln 2 binden, um eine messbare Veränderung der physikalischen Eigenschaft der Lösung hervorzurufen.

Ein Verfahren gemäß der zweiten bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist vorzugsweise dazu geeignet, eine nachzuweisende Nukleinsäure 10 in der Lösung bzw. Reaktionslösung nachzuweisen. Zu diesem Zweck werden vorzugweise die Nanopartikel 2 mit den daran befestigten Oligonukleotiden 4 sowie die Oligonukleotide 6 mit kationischer Modifikation in die Lösung gebracht, in welcher die nachzuweisende Nukleinsäure 10 nachgewiesen werden soll. Die Nanopartikel 2 und die Oligonukleotide 6 mit kationischer Modifikation müssen dabei nicht notwendigerweise gleichzeitig zu der Lösung zugegeben werden. Vorzugsweise befindet sich die nachzuweisende Nukleinsäure 10 zunächst frei in der Lösung. Gemäß der zweiten bevorzugten Ausführungsform ist zumindest ein Teil der Nukleotidsequenz der nachzuweisenden Nukleinsäure 10 zumindest teilweise komplementär zu der Nukleotidsequenz der Oligonukleotide 4 auf den Nanopartikeln 2 und/oder zu der Nukleotidsequenz der Oligonukleotide 6 mit kationischer Modifikation.

Fig. 5 zeigt eine beispielhafte fotografische Darstellung von Reaktionsgefäßen R1 bis R4, in welchen ein Verfahren gemäß der zweiten bevorzugten Ausführungsform durchgeführt wird, wobei die Durchführung weiter unten in Beispiel 2 beschrieben ist.

Im Folgenden wird eine dritte bevorzugte Ausführungsform mit Bezug auf Fig. 6 beschrieben. Im Detail zeigt Fig. 6 einen zweidimensionalen Querschnitt bzw. eine zweidimensionale Projektion eines Nanopartikels 2, welcher mit Oligonukleotiden 4 mit einer bekannten Nukleotidsequenz funktionalisiert ist.

Gemäß der dritten bevorzugten Ausführungsform weist jedes an den Nanopartikel gebundene Oligonukleotid 4 eine bekannte Nukleotidsequenz auf. Jedes Oligonukleotid 6 mit kationischer Modifikation weist dabei ebenfalls eine bekannte Nukleotidsequenz auf. Vorzugsweise ist die Nukleotidsequenz der Oligonukleotide 4, welche an dem Nanopartikel 2 befestigt sind, verschieden von der bekannten Nukleotidsequenz der Oligonukleotide 6 mit kationischer Modifikation. Die bekannten Nukleotidsequenzen der Oligonukleotide 4, welche am Nanopartikel 2 befestigt sind, sowie die Nukleotidsequenz der Oligonukleotide 6 mit kationischer Modifikation sind dabei derart gewählt, dass die Nukleotidsequenz des am Nanopartikel 2 befestigten Oligonukleotids 4 zumindest teilweise komplementär zu einer Nukleotidsequenz eines ersten Teilbereichs einer in der Lösung nachzuweisenden Nukleinsäure 10 ist. Die Nukleotidsequenz der Oligonukleotide 6 mit kationischer Modifikation ist dabei vorzugsweise derart gewählt, dass sie komplementär zu einer Nukleotidsequenz eines vorzugsweise benachbarten zweiten Teilbereichs der in der Lösung nachzuweisenden Nukleinsäure 10 ist. Vorzugsweise überlappen der erste Teilbereich und der zweite Teilbereich der nachzuweisenden Nukleinsäure 10 nicht.

Die dritte bevorzugte Ausführungsform kann beispielsweise dazu dienen, die Komplementarität der Nukleotidsequenz der nachzuweisenden Nukleinsäure 10 zu den bekannten Nukleotidsequenzen der auf den Nanopartikeln 2 angebrachten Oligonukleotide 4 und der Oligonukleotide 6 mit kationischer Modifikation zu ermitteln. Bei einer hohen Komplementarität des ersten Teilbereichs der nachzuweisenden Nukleinsäure 10 mit den am Nanopartikel 2 befestigten Oligonukleotiden 4 sowie einer hohen Komplementarität des zweiten Teilbereichs der nachzuweisenden Nukleinsäure 10 mit den Oligonukleotiden 6 mit kationischer Modifikation können vorzugsweise sowohl ein Oligonukleotid 4, welches an einem Nanopartikel befestigt ist, als auch ein Oligonukleotid 6 mit kationischer Modifikation an ein und denselben Strang der nachzuweisenden Nukleinsäure 10 hybridisieren. In anderen Worten kann bei hoher Komplementarität die nachzuweisende Nukleinsäure 10 als eine Verbindungsnukleinsäure dienen, um jeweils zumindest ein Oligonukleotid 4, welches an einem Nanopartikel befestigt ist, und ein Oligonukleotid 6 mit kationischer Modifikation miteinander zu verbinden. In anderen Worten wird ein an dem Nanopartikel befestigtes Oligonukleotid 4 über die nachzuweisende Nukleinsäure 10 mit einem Oligonukleotid 6 mit kationischer Modifikation verbunden. In anderen Worten dient die nachzuweisende Nukleinsäure 10 als Verbindungsnukleinsäure, um zumindest ein Oligonukleotid 4, welches an dem Nanopartikel befestigt ist, mit einem Oligonukleotid 6 mit kationischer Modifikation zu verbinden.

Besonders bevorzugt kommt es zu einer messbaren Veränderung der zumindest einen physikalischen Eigenschaft der Lösung, wenn zumindest ein Nanopartikel 2 bzw. ein daran befestigtes Oligonukleotid 4 über die nachzuweisende Nukleinsäure 10 mit zumindest einem Oligonukleotid 6 mit kationischer Modifikation verbunden ist. Bei Abwesenheit oder bei einer zu geringen Konzentration der nachzuweisenden Nukleinsäure 10 können trotz einer ausreichenden Konzentration von Oligonukleotiden 6 mit kationischer Modifikation vorzugsweise nicht genügend Bindungen zwischen Nanopartikein 2 und Oligonukleotiden 6 mit kationischer Modifikation erzeugt werden, um eine messbare Veränderung der physikalischen Eigenschaft der Lösung bewirken zu können. Der Effekt entspricht dabei im Wesentlichen den Effekten, die bereits mit Bezug auf die erste bevorzugte Ausführungsform und die zweite bevorzugte Ausführungsform beschrieben wurden.

Fig. 7 zeigt eine beispielhafte fotografische Darstellung von Reaktionsgefäßen R3 bis R4, in welchen ein Verfahren gemäß der zweiten bevorzugten Ausführungsform durchgeführt wird, wobei die Durchführung weiter unten in Beispiel 3 beschrieben ist.

Die vorliegende Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele näher erläutert, ohne jedoch auf die folgenden Beispiele beschränkt zu sein.

Beispiel 1

In Beispiel 1 wurde ein Verfahren gemäß der ersten bevorzugten Ausführungsform der Erfindung angewandt. Dabei sind Nukleinsäuren auf den Nanopartikein befestigt, wobei sich die Nanopartikel in einer Lösung befinden. Ferner befinden sich Oligonukleotide mit kationischer Modifikation in der Lösung, welche eine bekannte Nukleotidsequenz aufweisen. Das Verfahren gemäß dieses Beispiels dient beispielsweise dafür, den Grad der Komplementarität oder die Fähigkeit zur Hybridisierung zwischen der Nukleinsäure auf den Nanopartikeln mit den Oligonukleotiden mit kationischer Modifikation zu messen bzw. zu bestimmen. Die Sequenz der Nukleinsäure kann dabei zumindest teilweise unbekannt sein. Bei hoher Komplementarität hybridisieren die Oligonukleotid mit kationischer Modifikation auf die Nukleinsäure auf dem Nanopartikel und es wird eine messbare Veränderung hervorgerufen. Fig. 2 zeigt eine Fotografie von 8 Reaktionsgefäßen R1 bis R8 in einer Multiwellplatte, mit einem Gesamtvolumen bzw. Fassungsvermögen von 20 μΙ je Reaktionsgefäß. In jedem Gefäß befinden sich 40 pM (Pikomol pro Liter) Goldnanopartikel mit 60 nm Durchmesser (geliefert von BBI). Jeder Nanopartikel trägt ca. 1.000 Nukleinsäuren mit Sequenz 1 (siehe Anhang), die über eine Thiol- Bindung an die Nanopartikeloberfläche funktionalisiert wurden (nach J. Hurst et al., Anal. Chem., 78(24), 8313-8318, 2006, dessen diesbezüglicher Inhalt durch Verweis Teil der vorliegenden Offenbarung ist). Nach der Funktionaiisierung erfolgen 6 Waschschritte. Die Nanopartikel sind gelöst in einem Phosphatpuffer (3,75 mM Phosphat, pH 7) mit 0,1 % Tween 20, 5 mM MgC , 7,5 mM NaCI. Unter diesen Bedingungen sind die Nanopartikel ohne Zugabe von Oligonukleotiden mit kationischer Modifikation stabil und zeigen eine rote Farbe (siehe R1 und R2). In der oberen Reihe (R1 , R3, R5 und R7) wurde als Oligonukleotid mit kationischer Modifikation eine ZNA (geliefert von Metabion GmbH, Planegg, Germany) mit der Sequenz 2 (siehe Anhang) in unterschiedlichen Endkonzentrationen zugegeben. Die Konzentrationen sind dabei 100 nM in R7, 10 nM in R5, 1 nM in R3). Da die Sequenzen 1 und 2 zueinander eine hohe Komplementarität aufweisen, kann die ZNA gut auf die Nanopartikel-gebundenen Nukleinsäuren hybridisieren. Ab einer Endkonzentration der ZNA von 10 nM (R5 und R7) ist eine deutliche Entfärbung der Nanopartikel-Lösung beobachtbar. In der unteren Reihe wurde als Oligonukleotid mit kationischer Modifikation eine ZNA (geliefert von Metabion GmbH, Planegg, Germany) mit der Sequenz 3 (siehe Anhang) in unterschiedlichen Endkonzentrationen zugegeben (100 nM in R8, 10 nM in R6, 1 nM in R4). Da die Sequenzen 1 und 3 zueinander eine sehr geringe Komplementarität aufweisen, kann die ZNA nicht oder nur schlecht auf die Nanopartikel-gebundenen Nukleinsäuren hybridisieren. Keine dieser Nanopartikel-Lösungen in der unteren Reihe (R2, R4, R6, R8) zeigt eine signifikante Entfärbung. Beide eingesetzten ZNA- Sequenzen tragen zwei kationische Einheiten in der ZNA-Modifikation. Die Aufnahme wurde 15 Minuten nach Zusammenmischen der Reagenzien, d.h. der Nanopartikel und der ZNA aufgenommen.

Die Fig. 3A bis 3D zeigen Extinktionsspektren von Nanopartikellösungen. Fig. 3A zeigt eine Lösung mit Goldnanopartikeln mit 60 nm Durchmesser und 40 pM Nanopartikel-Konzentration (geliefert von BBI). Die gezeigten Extinkionsspektren sind dabei in willkürlicher Einheit (engl.: arbitrary units), d.h. lediglich qualitativ gegen die Wellenlänge aufgetragen. Jedes Nanopartikel trägt ca. 1.000 Nukleinsäuren mit Sequenz 4 (siehe Anhang), die über eine Thiol-Bindung an die Nanopartikeloberfläche funktionalisiert wurden. Die Nanopartikel sind gelöst in Phosphatpuffer (3,9 mM Phosphat, pH 7) mit 0,1 % Tween 20, 5 mM MgC , 7,85 mM NaCI. Das Extinktionsspektrum (aufgenommen mit einem Varian Cary 50 Spektrometer in einer Quarzküvette mit 3 mm optischem Pfad) einer Partikellösung ohne Zugabe von Oligonukleotiden mit kationischer Modifikation (durchgezogene Linie) zeigt eine Plasmonenresonanz mit Resonanzmaximum bei einer Wellenlänge von ca. 530 nm. Die Zugabe eines Oligonukleotids mit kationischer Modifikation (ZNA mit Sequenz 5, siehe Anhang, Endkonzentration 150 nM) zeigt 5 Minuten nach Zugabe keine signifikante Veränderung des Extinktionsspektrums (gepunktete Linie), da die Sequenzen 4 und 5 zueinander eine sehr geringe Komplementarität aufweisen und die ZNA daher nicht oder nur schlecht auf die Nanopartikel- gebundenen Nukleinsäuren hybridisieren kann.

In Fig. 3B wurde anstatt der ZNA mit Sequenz 5 eine ZNA mit Sequenz 6 (siehe Anhang) als Oligonukleotid mit kationischer Modifikation hinzugegeben (Endkonzentration ebenfalls 150 nM, gleiches Puffersystem wie in Fig. 3A). Dabei zeigt sich bereits nach 1 Minute eine relativ starke Veränderung des Extinktionsspektrums (gestrichelte Linie) im Vergleich zur Kurve vor Zugabe der Oligonukleotide mit kationischer Modifikation (durchgezogene Kurve). Nach 5 Minuten ist die Änderung noch stärker ausgebildet (gepunktete Kurve). Da die Sequenzen 4 und 6 zueinander eine hohe Komplementarität aufweisen kann die ZNA gut bzw. effektiv auf die Nanopartikel-gebundenen Nukleinsäuren hybridisieren. Die beobachtbare bzw. messbare Veränderung des Extinktionsspektrums ist typisch für eine Verschiebung der Plasmonenresonanz der Nanopartikel, die ein Hinweis sein könnte auf einen geringeren, mittleren Abstand der Nanopartikel zueinander, der durch die Bindung der Oligonukleotide mit kationischer Modifikation auf die Nanopartikel hervorgerufen wird.

In Fig. 3C wurde die Temperatur der Probe aus Fig. 3B zunächst auf 60°C erhöht (Extinktionsspektrum als gestrichelte Linie dargestellt). Dabei bleibt die Veränderung der optischen Eigenschaften zunächst bestehen (stark verbreiterte und rotverschobenen Plasmonenresonanz im Vergleich zum Extinktionsspektrum einer Probe ohne Oligonukleotiden mit kationischer Modifikation). Bei einer weiteren Erhöhung der Probentemperatur auf 70°C verändert sich das Extinktionsspektrum jedoch im Wesentlichen wieder zurück zum ursprünglichen Zustand mit Plasmonenresonanzmaximum bei einer Wellenlänge von ca. 530 nm (Extinktionsspektrum als durchgezogene Linie dargestellt). Dies ist dadurch zu erklären, dass die Denaturierungstemperatur des DNA-Doppelstranges aus Sequenz 4 und 6 erreicht ist und dieser Doppelstrang getrennt wird. Hierdurch können sich die Oligonukleotiden mit kationischer Modifikation wieder von den Nanopartikeln entfernen. Demnach können sich auch die lokalen Ladungsverhältnisse an den Nanopartikeln und damit die Ursache für die Bindung zwischen den Nanopartikeln wieder verändern. Hierdurch werden die Partikel wieder freigesetzt, wobei sich beispielsweise durch Diffussion und Coulomb- Abstoßung der Nanopartikel der Abstand zwischen den Nanopartikeln wieder vergrößert. Dies zeigt, dass die messbare Veränderung auch reversibel sein kann, wenn die Bindung zwischen Oligonukleotiden mit kationischer Modifikation und den Nanopartikeln wieder aufgelöst wird. In Fig. 3D wurden Oligonukleotide mit kationischer Modifikation mit Sequenz 6 (das in Kombination mit Nanopartikeln, die mit Sequenz 4 funktionalisiert waren eine starke messbare Veränderung erzeugten) nun zu anderen Nanopartikeln, die mit Sequenz 11 (siehe Anhang) funktionalisiert sind (Endkonzentration des Oligonukleotids mit kationischer Modifikation ebenfalls 150 nM, Nanopartikel- Konzentration ebenfalls 40 pM, gleiches Puffersystem wie in Fig. 3A und Fig. 3B), so ist keine signifikante Veränderung zu beobachten, da Sequenz 6 und 11 zueinander wieder eine sehr geringe Komplementarität aufweisen.

Beispiel 2

In Beispiel 2 wurde ein Verfahren gemäß der zweiten bevorzugten Ausführungsform angewandt. Dabei tragen die Nanopartikel in der Lösung jeweils zumindest ein Oligonukleotid mit bekannter Nukleotidsequenz. Ferner werden der Lösung Oligonukleotide mit kationischer Modifikation mit einer bekannten Nukleotidsequenz hinzugegeben, wobei die Nukleotidsequenz zumindest teilweise Komplementär zu den an den Nanopartikeln befestigten Oligonukleotiden ist. Ferner enthält die Lösung eventuell eine nachzuweisende Nukleinsäure, welche zunächst frei in Lösung ist und welche zumindest teilweise komplementär zu den Oligonukleotiden auf den Nanopartikeln und/oder zu den Oligonukleotiden mit kationischer Modifikation ist. Ohne Nukleinsäure oder bei nur geringer Konzentration der Nukleinsäure können Oligonukleotide mit kationischer Modifikation und die Oligonukleotide auf den Nanopartikeln hybridisieren und eine messbare Veränderung hervorrufen. Die Anwesenheit der Nukleinsäure oder eine ausreichend hohe Konzentration der Nukleinsäure verhindert diese Hybridisierung und somit die messbare Veränderung, da die Nukleinsäure mit den Oligonukleotiden mit kationischer Modifikation und/oder den Oligonukleotiden auf den Nanopartikeln hybridisieren kann. Die Oligonukleotide mit kationischer Modifikation und / oder die Oligonukleotide auf den Nanopartikeln sind somit zumindest teilweise besetzt und können nicht mehr (ausreichend) miteinander hybridisieren und somit auch keine messbare Veränderung hervorrufen.

Fig. 5 zeigt eine Fotografie von 4 Reaktionsgefäßen R1 , R2, R3 und R4 in einer Multiwellplatte mit einem Gesamtvolumen bzw. Fassungsvermögen von 20μΙ je Reaktionsgefäß. In jedem Reaktionsgefäß befinden sich 40 pM Goldnanopartikel mit 60 nm Durchmesser (geliefert von BBI), jedes Nanopartikel trägt ca. 1.000 Oligonukleotide mit Sequenz 4, die über eine Thiol-Bindung an die Nanopartikeloberfläche funktionalisiert wurden. Die Nanopartikel sind gelöst in Phosphatpuffer (3,9 mM Phosphat, pH 7) mit 0,1 % Tween 20, 5 mM MgC , 7,7 mM NaCI. Unter diesen Bedingungen sind die Nanopartikel ohne Zugabe von Oligonukleotiden mit kationischer Modifikation stabil und zeigen eine rote Farbe. Zu einem Reaktionsvolumen von 17,7 μΙ wurden in der oberen Reihe, R1 und R3, als Nukleinsäure DNA mit der Sequenz 7 zugegeben (2 μΙ einer DNA-Konzentration von 1 μΜ), in der unteren Reihe R2 und R4 wurde stattdessen 2 μΙ Wasser als Negativkontrolle zugesetzt. Da die Sequenzen 4 und 7 zueinander eine hohe Komplementarität aufweisen, kann die zugegebene DNA auf die Oligonukleotide auf der Nanopartikeloberfläche hybridisieren und diese somit für weitere Hybridisierungen blockieren. Nach einer Inkubationszeit von 10 Minuten wurden jedem Reaktionsgefäß ZNA mit der Sequenz 6 als Oligonukleotid mit kationischer Modifikation hinzugegeben (jeweils 0,3 μΙ einer 10 μΜ ZNA-Lösung, Endkonzentration somit 150 nM ZNA), die eine hohe Komplementarität mit der Sequenz 4 der Nanopartikel-gebundenen Oligonukleotide besitzt. In der oberen Reihe, R1 und R3, mit Nukleinsäure kann die ZNA nicht mehr auf die Nanopartikel- gebundenen Oligonukleotide hybridisieren, da diese von der Nukleinsäure besetzt sind. Es findet somit keine Entfärbung oder messbare Veränderung statt. In der unteren Reihe, R2 und R4, ist jedoch eine deutliche Entfärbung der Nanopartikel- Lösung und somit eine messbare Veränderung der optischen Eigenschaft der Lösung beobachtbar, da die Oligonukleotide mit kationischer Modifikation gut auf die Nanopartikel-gebundenen Oligonukleotide hybridisieren. Die Aufnahme wurde 10 Minuten nach dem Zusammenmischen der Reagenzien, d.h. der Nanopartikel und der ZNA aufgenommen.

Beispiel 3 In Beispiel 3 wurde ein Verfahren gemäß der dritten bevorzugten Ausführungsform angewandt. Dabei tragen die Nanopartikel in der Lösung jeweils zumindest ein Oligonukleotid mit bekannter Nukleotidsequenz. Ferner werden der Lösung Oligonukleotide mit kationischer Modifikation mit einer bekannten Nukleotidsequenz hinzugegeben. Femer befindet sich eventuell eine nachzuweisende Nukleinsäure zunächst frei in Lösung. Die Nukleotidsequenz der nachzuweisenden Nukleinsäure umfasst dabei einen ersten Teilbereich, welcher zumindest teilweise komplementär zu den Oligonukleotiden auf den Nanopartikeln ist und einen vorzugsweise benachbarten zweiten Teilbereich, welcher zumindest teilweise komplementär zu den Oligonukleotiden mit kationischer Modifikation ist.

Mit diesem Beispiel kann festgestellt werden, wie gut die Nukleinsäure zur bekannten Sequenz auf dem Nanopartikel und der bekannten Sequenz des Oligonukleotids mit kationischer Modifikation komplementär ist. Bei hoher Komplementarität hybridisieren sowohl das Oligonukleotid mit kationischer Modifikation sowie das Oligonukleotid auf dem Nanopartikel mit der Nukleinsäure und es wird eine messbare Veränderung hervorgerufen. Fig. 7 zeigt eine fotografische Darstellung von Reaktionsgefäßen R1 bis R3 in einer Multiwellplatte, Gesamtvolume je Reaktionsgefäß 20 μΙ. In jedem Gefäß R1 bis R3 befinden sich 40 pM Goldnanopartikel 2 mit 60 nm Durchmesser (geliefert von BBI), jedes Nanopartikel trägt ca. 1000 Oligonukleotide mit Sequenz 12, die über eine Thiol-Bindung an die Nanopartikeloberfläche funktionalisiert wurden. Die Nanopartikel 2 sind gelöst in Phosphatpuffer (3,9 mM Phosphat, pH 7) mit 0,1 % Tween 20, 12 mM MgCte, 7,7 mM NaCI. Unter diesen Bedingungen sind die Nanopartikel 2 stabil und zeigen eine rote Farbe. Zu einem Reaktionsvolumen von 19,4 μΙ wurden in die Reaktionsgefäße R2 und R3 jeweils als Nukleinsäure DNA mit der Sequenz 13 zugegeben (0,3 μΙ einer DNA-Konzentration von 1 μΜ), in das Reaktionsgefäß R1 wurde stattdessen 0,3μΙ Wasser als Negativkontrolle zugesetzt. Nach einer Inkubationszeit von 5 Minuten wurden den Reaktionsgefäßen R1 und R3 ZNA mit der Sequenz 6 als Oligonukleotid mit kationischer Modifikation hinzugegeben (jeweils 0,3μΙ einer 10 μΜ ZNA-Lösung, Endkonzentration somit 150 nM ZNA), die eine hohe Komplementarität mit einem Teilabschnitt der Sequenz 13 der nachzuweisenden Nukleinsäure aufweist, aber eine geringe Komplementarität mit Sequenz 12 der Nanopartikel-gebundenen Oligonukleotide besitzt. In das Reaktionsgefäß R2 wurde statt der ZNA 0,3 μΙ Wasser hinzugegeben. Nach weiteren 10 Minuten Inkubationszeit wurde das Photo in Fig. 7 aufgenommen. Nur im ersten Reaktionsgefäß von links zeigt sich eine Entfärbung der Nanopartikel- Lösung und somit eine messbare Veränderung, da nur dort über die Sequenz 13 der nachzuweisenden Nukleinsäure die Oligonukleotide mit kationischer Modifikation mit Sequenz 6 mit den Nanopartikeln bzw. den darauf befestigten Oligonukjeotiden mit Sequenz 12 verbunden werden können.

Beispiel 4: Real-Time PCR

Im Folgenden werden die Beispiele 4.1 bis 4.3 für bevorzugte Verwendungen der Nanopartikel und/oder der kationisch modifizierten Nukleinsäuren bzw. Anwendung von bevorzugten, erfindungsgemäßen Verfahren im Rahmen einer Real-Time PCR beschrieben. Alle Real-Time PCR Reaktionen in den folgenden Beispielen wurden dabei in einem Roche Light Cycler 1.5 mit Software-Version 4.1.1.21 in Plastik- Kapillaren von Genaxxon durchgeführt. Zur besonderen Verdeutlichung der technischen Vorteile der Erfindung wird die Erfindung dabei in einem Vergleich mit herkömmlichen Verfahren gemäß dem Stand der Technik dargestellt.

Beispiel 4.1 : Stand der Technik: Real-Time PCR mit interkalierendem Farbstoff Für einen indirekten Nachweis einer Nukleinsäure wurde eine Polymerase- Kettenreaktion (PCR) durchgeführt. Zunächst wurde die Funktionalität des Primer- Systems nach dem Stand der Technik überprüft: hier wird die Nukleinsäure mit Sequenz 7 durch die Primer-Oligonukleotide mit Sequenz 8 und 9 amplifiziert und das PCR-Amplikon durch einen interkalierenden Farbstoff (Sybr-Green I Nucleic Acid Gel Stain, 0.000x Konzentrat, Roche) nachgewiesen, der mit zunehmender Menge von doppelsträngiger DNA in der Probe zunehmende Fluoreszenz zeigt. Der Forward-Primer mit Sequenz 8 trägt keine kationische Modifikation, der Reverse- Primer mit Sequenz 9 hingegen trägt am 5'-Ende eine kationische Modifikation mit drei kationischen Einheiten (ZNA3). Die kationische Modifikation ist in diesem Fall am 5'-Ende des Primers und nicht am 3'-Ende, um nicht die Elongation durch die Polymerase zu verhindern, die am 3'-Ende des Primers ansetzt. Jede Reaktion besteht aus 9 μΙ Mastermix und 1 μΙ Nukleinsäurelösung bzw. Wasser. 9 μΙ Mastermix für eine Reaktion werden, wie folgt in Tabelle 1 aufgelistet, zusammengestellt:

Tabelle 1

Das PCR-Protokoll besteht aus 40 Zyklen ä 5 Sekunden 90°C, 15 Sekunden 60°C und 15 Sekunden 72°C. Die Fluoreszenz-Detektion findet nach jedem 72°C-Schritt statt. Fig. 8 zeigt Real-Time PCR Kurven des 530 nm Fluoreszenz-Kanals von drei verschiedenen Ausgangskonzentrationen der Nukleinsäure mit Sequenz 7 (als Oligonukleotid vorliegend) und einer Negativkontrolle ohne Nukleinsäure als Zielsequenz. Die Kurven zeigen den für derartige Real-Time PCR typischen Verlauf: Zunächst bleibt die detektierte Fluoreszenz in den erste PCR-Zyklen im Wesentlichen unverändert. Dabei werden zwar (je nachdem ob Nukleinsäure als Ausgangsmaterial in der Probe enthalten ist oder nicht) auch in jedem Zyklus neue DNA-Doppelstränge als Amplikon erzeugt, die Menge reicht hier jedoch noch nicht aus, um die hierdurch hervorgerufene Fluoreszenz über das messbare Grundlimit zu heben und zu detektieren. Für die Probe, in welche 1 μΙ einer 1 pM Konzentration der Nukleinsäure mit Sequenz 7 als Ausgangsmaterial eingesetzt wurde (durchgezogene Linie) steigt die Fluoreszenz ca. ab dem 20. Zyklus stark an, um dann (ab ca. Zyklus 27) in eine Sättigung überzugehen. Dieser Anstiegspunkt ist von großer Aussagekraft für die Ausgangskonzentration der Nukleinsäure mit Sequenz 7, denn eine Probe mit 10fach geringerer Ausgangskonzentration steigt erst ca. ab dem 24. Zyklus an (gestrichelte Linie), für eine 100fach geringere Ausgangskonzentration steigt sie ca. ab dem 28. Zyklus an (gepunktete Linie). Ohne Nukleinsäure mit Sequenz 7 als Ausgangsmaterial ist bis zum 30. Zyklus kein Anstieg zu erkennen (gestrichelt-gepunktete Linie). Die Software des Instrumentes bestimmt den sog. Ct- Wert (engl. Cycle Threshold für Schwellenwert-Zyklus) bzw. Cp-Wert (engl. Crossing Point), der den Zyklus beschreibt, an dem die Fluoreszenz erstmals signifikant über die Hintergrund-Fluoreszenz ansteigt. Dieser kann dann bei einer Probe mit unbekannter Ausgangskonzentration der Nukleinsäure typischerweise durch Vergleich mit einer bekannten Standard-Konzentrationsreihe zur Quantifizierung des Ausgangskonzentration der Nukleinsäure in der Probe herangezogen werden.

Die Cp-Werte für die Messung aus Fig. 8 sind in der folgenden Tabelle 2 dargestellt:

Tabelle 2

Gibt man der Instrumenten-Software die Proben mit Nukleinsäure als bekannte Standard-Konzentrationsreihe vor, so kann diese aus den Konzentrationen und den Abständen der Cp-Werte zueinander die Effizienz der Amplifikationsreaktion errechnen. Man kommt mit den Werten aus obiger Tabelle auf eine Vervielfältigung pro Zyklus im Konzentrationsbereich von 1 -100 fM von 1 ,858 (+-0,00584). Mit dieser Vervielfältigung pro Zyklus und den Cp-Werten kann man aus den ursprünglich eingesetzten Nukleinsäure-Konzentrationen (Co) abschätzen, welche Amplikon- Konzentration bei Erreichen des Cp-Wertes in der Probe herrscht (man nimmt hierbei vereinfacht an, dass die Vervielfältigung pro Zyklus im Mittel über alle Zyklen gleich hoch ist. Gemäß der Gleichung (1 )

C(Cp) = C ₀ ^■ 1,858 ^Cp (1) ergibt sich somit eine Amplikon-Konzentration bei Erreichen des Cp-Wertes in der Probe von C(Cp) = 41 nM für Co = 100 fM, C(Cp) = 40 nM für Co = 10 fM, C(Cp) = 41 nM für Co = 1 fM. Für das Instrument ist somit in diesem System mit interkalierendem Farbstoff als Signalgeber bei ca. 40 nM Amplikon-Konzentration eine signifikant messbare Veränderung der Fluoreszenz über der Hintergrund- Fluoreszenz erreicht.

Anzumerken ist hier noch, dass auch die Probe ohne Nukleinsäure mit Sequenz 7 als Ausgangsmaterial (gestrichelt-gepunktete Linie) in den letzten Zyklen deutlich ansteigt. Dies ist ein nicht selten auftretender Effekt in herkömmlichen Realtime- PCR-Verfahren, vor allem wenn wie hier interkalierende Farbstoffe zur Detektion eingesetzt werden. Die Ursache hierfür sind meist sog. Primer-Dimere, also ungewollte Bildung von DNA-Doppelsträngen, die aus unspezifischen, ungewollten Bindungen zwischen Primern (gleichartigen oder unterschiedlichen) hervorgerufen werden können und ebenfalls hochamplifiziert werden.

Beispiel 4.2: Real-Time PCR mit Nanopartikeln und ZNA - ohne Farbstoff

Für einen indirekten Nachweis einer Nukleinsäure wurde eine Polymerase- Kettenreaktion durchgeführt. Das verwendete Primer-System bleibt im Grundsatz gleich zu dem in Beispiel 4.1 , jedoch wird nun der bisher ungebundene Forward- Primer mit Sequenz 8 durch modifizierte Primer-Oligonukleotide mit Sequenz 4 ersetzt, welche auf einen Gold-Nanopartikel funktionalisiert wurde. Das modifizierte Primer-Oligonukleotid mit Sequenz 4 umfasst als Teilsequenz Sequenz 8 (diese Sequenz dient nach wie vor als eigentliche Primer-Sequenz), zusätzlich eine Teilsequenz aus 35 Adenin -Basen, die als Abstandshalter zwischen Partikel- Oberfläche und Primer-Teilsequenz dient und zusätzlich zwei abasische Modifikationen Spacer9 zwischen Abstandsteilsequenz und Primerteilsequenz die das Überschreiben der Abstandsteilsequenz durch die Polymerase verhindert (siehe z.B. Patentanmeldung DE 10 2013 215 168.3). Weiter enthält das modifizierte Primer-Oligonukleotid mit Sequenz 4 am 5'-Ende eine Thiol- Modifikation, mit deren Hilfe das Oligonukleotid auf die Oberfläche von Gold- Nanopartikeln gebunden wird. Es werden die gleichen Nanopartikel-Oligonukleotid- Konjugate verwendet wie in Fig. 5 bzw. Beispiel 2, d.h. Goldnanopartikel mit 60 nm Durchmesser (geliefert von BBI), wobei jedes Nanopartikel ca. 1.000 Oligonukleotide mit Sequenz 4 trägt. Der Reverse-Primer ist dabei das Oligonukleotid mit kationischer Modifikation mit drei kationischen Einheiten am 5'- Ende mit Sequenz 9 (ZNA3). Amplifiziert wird die Nukleinsäure mit Sequenz 7. Das PCR-Amplikon wird nun nicht durch einen Farbstoff nachgewiesen, sondern durch eine messbare Veränderung, die dadurch hervorgerufen wird, dass durch das PCR- Amplikon das Oligonukleotid mit kationischer Modifikation (hier der Reverse-Primer) mit den Nanopartikeln verbunden wird. Jede Reaktion besteht aus 9 μΙ Mastermix und 1 pl Nukleinsäurelösung bzw. Wasser. 9 μΙ Mastermix für eine Reaktion werden wie folgt in Tabelle 3 zusammengestellt:

Tabelle 3

Endkonzen¬

Stock- μΙ für 1

tration in 10

Konzentration Reaktion

Ml

Wasser 2

5x Apta Taq Genotyping

5 1 2

Master (Roche) [x-fach]

Nanopartikel-Oligonukleotid-

200 40 2

Konjugate [pM]*

Reverse-Primer Sequenz 9

3.000 300 1

[nM]

MgCI ₂ [mM] 50 5 1

Tween 20 (%) 1 0,1 1 * die Nanopartikel-Oligonukleotid-Konjugate sind funktionalisiert (nach J. Hurst et al., Anal. Chem., 78(24), 8313-8318, 2006, dessen diesbezüglicher Inhalt durch Verweis Teil der vorliegenden Offenbarung ist). Nach Funktionalisierung und 6 Waschschritten liegen die Nanopartikel-Oligonukleotid-Konjugate in einer Konzentration von 200 pM in Phosphatpuffer (5 mM Phosphat, pH 7) mit 0,1 % Tween 20, 10 mM NaCI vor.

Das PCR-Protokoll besteht aus 40 Zyklen ä 5 Sekunden 90°C, 15 Sekunden 60°C und 15 Sekunden 72°C. Die Signal-Detektion findet nach jedem 72°C-Schritt statt. Es wird in diesem Experiment kein Farbstoff verwendet, dennoch wird die gleiche, unmodifizierte Detektionseinheit- und Software des Light Cycler Instruments verwendet, wie in den Beispielen 4.1 und 4.2 unter Verwendung von Farbstoffen.

Da weder Instrument noch Software hierfür ausgelegt sind, kann es ohne Farbstoff- Einsatz dazu kommen, dass die Proben zu Beginn der Real-Time PCR mit der Fehlermeldung„The following samples were not found during the seek process: ..." nicht erkannt werden und anschließend mit dem weiteren Vermerk„Empty Position" bei der folgenden Signal-Detektion übergangen werden. In diesen Fällen ist keine Detektion der Messbaren Veränderung möglich. Dies könnte z.B. durch eine Änderung von Instrumentensoftware und /oder -hardware vermieden werden oder bei unveränderter Instrumentensoftware und /oder -hardware durch den Einsatz von Fluoreszenzfarbstoffen im Hintergrund umgangen werden (siehe Beispiel 4.3). Fig. 9A zeigt Real-Time PCR Kurven des 530 nm Fluoreszenz-Kanals des LIGHT CYCLER Instruments, obwohl in diesem Fall keine Fluoreszenz gemessen wird, von drei verschiedenen Ausgangskonzentrationen der Nukleinsäure mit Sequenz 7 (als Oligonukleotid vorliegend) und einer Negativkontrolle ohne Nukleinsäure als Zielsequenz. Die Kurven. zeigen im Wesentlichen wieder einen für Real-Time PCR typischen Verlauf, obwohl aufgrund der sehr geringen absoluten Signalveränderung (ca. 300 mal kleiner als im Beispiel 4.1 beim Einsatz eines Fluoreszenzfarbstoffes) die Abweichungen im Grundniveau der Messung die verschiedenen Kurven visuell sehr stark voneinander abhebt. Die Abweichungen im Grundniveau sind bei genauer Betrachtung auch in Fig. 8 bzw. Beispiel 4.1 in der gleichen absoluten Größenordnung zu erkennen, dort jedoch aufgrund der anderen Skalierung der vertikalen Achse des Graphen visuell nicht auffällig. Fig. 9B zeigt eine leicht veränderte Darstellung des Graphen aus Fig. 9A, wobei in der Light Cycler Software mittels der Funktion„Analysis - Amplification Analysis - Absolute Quantification" eine veränderte Darstellung gewählt wurde, in der das Grundniveau stärker zusammengezogen erscheint, um die visuelle Auswertung zu erleichtern. In dieser Darstellung in Fig. 9B, wie auch in der Grunddarstellung in Fig. 9A bleibt das detektierte Signal in den ersten PCR-Zyklen zunächst im Wesentlichen unverändert. Für die Probe bzw. die Lösung, in welche 1 μΙ einer 1 pM Konzentration der Nukleinsäure mit Sequenz 7 als Ausgangsmaterial eingesetzt wurde (durchgezogene Linien) steigt das Signal ca. ab dem 20. Zyklus stark an, um dann in eine Sättigung überzugehen. Die Probe mit 10fach geringerer Ausgangskonzentration steigt erst ca. ab dem 24. Zyklus an (gestrichelte Linie), für eine 100fach geringere Ausgangskonzentration steigt sie ca. ab dem 29. Zyklus an (gepunktete Linie). Ohne Nukleinsäure mit Sequenz 7 als Ausgangsmaterial ist bis zum 40. Zyklus kein Anstieg zu erkennen (gestrichelt-gepunktete Linie). Diese Anstiegspunkte sind sehr gut vergleichbar mit den Anstiegspunkten in Fig. 8 des Farbstoff-basierten Beispiels 4.1 . Auch sind die Kurven zueinander ähnlich äquidistant, was die gute Quantifizierbarkeit der Messmethode belegt. Die messbare Veränderung, die ab einer bestimmten Mindestkonzentration von Amplikon nachweisbar wird, entsteht hier nicht wie im Stand der Technik durch Fluoreszenz eines Fluoreszenzfarbstoffes, sondern durch die veränderten optischen Eigenschaften der Lösung, welche durch die Verbindung der Gold- Nanopartikel in der Lösung mit ausreichend vielen Oligonukleotiden mit kationischer Modifikation (hier Reverse Primer als ZNA) hervorgerufen wird. Die Nanopartikel haben im gelösten Zustand ohne Bindung zu Oligonukleotiden mit kationischer Modifikation (also z.B. in den ersten Zyklen der Real-Time PCR vor der Signalveränderung) ihr Extinktionsmaximum bei einer Wellenlänge von ca. 530 nm (siehe z.B. auch Extinktionsspektren in Fig. 3A bis 3D), bei dieser Wellenlänge wird im gewählten Modus auch im Light Cycler das Signal aufgenommen. Durch Bindung an Oligonukleotide mit kationischer Modifikation nimmt die Extinktion bei 530 nm ab (siehe auch Extinktionsspektren in Fig. 3B). Dass das Signal im Light Cycler ab einem gewissen Zyklus zunimmt (und nicht abnimmt) ist ein Hinweis darauf, dass durch die abnehmende Nanopartikel-Extinktion in der Probe bzw. Lösung bei 530 nm mehr Hintergrundsignal (wie z.B. Reflexion von den Kapillarwänden oder der Flüssigkeitsoberfläche oder Streuung aus Kapillaren oder Reaktionsflüssigkeit oder Eigenfluoreszenz der Lösung) die Probe durchdringen kann, den Detektor erreicht und somit detektierbar wird. Das verringerte Hintergrundsignal in Gegenwart von ungebundenen Nanopartikeln in der Lösung kann auch der Grund dafür sein, dass derartige Proben ohne Farbstoffe von Instrument und Software zu Beginn der Real-Time PCR im sog.„seek process" nicht erkannt werden.

Beispiel 4.3: Real-Time PCR mit Nanopartikeln und ZNA - mit Hintergrundfarbstoff In Beispiel 4.3 wurde für einen indirekten Nachweis einer Nukleinsäure eine Polymerase-Kettenreaktion vergleichbar zu Beispiel 4.2 durchgeführt, nun jedoch zusätzlich mit Farbstoff in der Reaktionslösung. Das verwendete Primer-System aus Nanopartikel-Oligonukleotid-Konjugaten für Forward Primer und ZNA als Reverse Primer bleibt unverändert zu dem aus Beispiel 4.2. Als zusätzlicher Farbstoff wird Fluorescein verwendet (als Fluorescein Sodium Salz F6377 bezogen von Sigma Aldrich und zunächst gelöst in Wasser). Fluorescein hat spektral sehr ähnliche Eigenschaften wie Sybr Green I, das in Beispiel 4.1 eingesetzt wurde, jedoch zeigt Fluorescein keine interkalierenden Eigenschaften, d.h. es verändert seine Fluoreszenzeigenschaften typischerweise nicht mit Zunahme der Amplikonkonzentration in der Probe bzw. Lösung. Jede Reaktion besteht aus 9 μΙ Mastermix und 1 μΙ Nukleinsäurelösung bzw. Wasser. 9 μΙ Mastermix für eine Reaktion werden wie folgt in Tabelle 4 zusammengestellt: Tabelle 4

* die Nanopartikel-OIigonukleotid-Konjugate sind funktionalisiert (nach J. Hurst et al., Anal. Chem., 78(24), 8313-8318, 2006, dessen diesbezüglicher Inhalt durch Verweis Teil der vorliegenden Offenbarung ist). Nach Funktionalisierung und 6 Waschschritten liegen die Nanopartikel-Oligonukleotid-Konjugate in einer Konzentration von 200 pM in Phosphatpuffer (5 mM Phosphat, pH 7) mit 0,1 % Tween 20, 10 mM NaCI vor. Das PCR-Protokoll besteht wieder aus 40 Zyklen ä 5 Sekunden 90°C, 15 Sekunden 60°C und 15 Sekunden 72°C. Die Signal-Detektion findet nach jedem 72°C-Schritt statt. Aufgrund des zusätzlich eingesetzten Farbstoffes kommt es nun im Gegensatz zu Beispiel 4.2 nicht mehr zu unerkannten Proben seitens Detektionseinheit- und Software des Light Cycler Instruments.

Fig. 10 zeigt Real-Time PCR Kurven des 530 nm Fluoreszenz-Kanals (passend zur Emissions-Wellenlänge von Fluorescein) von drei verschiedenen Ausgangskonzentrationen der Nukleinsäure mit Sequenz 7 (als Oligonukleotid vorliegend) und einer Negativkontrolle ohne Nukleinsäure als Zielsequenz. Die Kurven zeigen im Wesentlichen wieder einen für Real-Time PCR typischen Verlauf, das Grundniveau des Signals (vor Erreichen der ersten signifikanten Signalerhöhung) ist nun ca. 4 mal höher als im vergleichbaren Versuch ohne Farbstoffe (Fig. 9A) und erreicht somit fast das Niveau, welches auch mit dem interkalierenden Farbstoff Sybr Green erreicht wird (Fig. 8). Aus diesem Grund kommt es nun nicht mehr zu unerkannten Proben seitens Detektionseinheit- und Software des Light Cycler Instruments. Die absolute Signalveränderung während des Nukleinsäure-induzierten signifikanten Signalanstiegs ist in diesem Beispiel 5 bis 6 mal höher als in Fig. 9A bzw. in Beispiel 4.2 ohne Farbstoff. In Fig. 10 zeigt die Probe bzw. die Lösung mit der höchsten Konzentration der Nukleinsäure mit Sequenz 7 als Ausgangsmaterial (1 μΙ einer 1 pM Lösung eingesetzt) zuerst eine signifikante Signalerhöhung (durchgezogene Linie). Wie in Beispiel 4.2 steigt bei dieser Nukleinsäure-Konzentration das Signal ab dem 20. Zyklus stark an, um dann in eine Sättigung überzugehen. Die Probe bzw. die Lösung mit 10fach geringerer Ausgangskonzentration steigt wieder erst ca. ab dem 24. Zyklus an (gestrichelte Linie), für eine 100fach geringere Ausgangskonzentration steigt sie ca. ab dem 27. Zyklus an (gepunktete Linie). Ohne Nukleinsäure mit Sequenz 7 als Ausgangsmaterial ist bis zum 40. Zyklus kein Anstieg zu erkennen (gestricheltgepunktete Linie). Diese Anstiegspunkte sind sehr gut vergleichbar mit den Anstiegspunkten in Fig. 8 des fluoreszenzbasierten Beispiels 4.1 und mit den Anstiegspunkten in Fig. 9 des fluoreszenzfreien Beispiels 4.2. Die messbare Veränderung, die ab einer bestimmten Mindestkonzentration von Amplikon nachweisbar wird, entsteht in Beispiel 4.3 durch ein Zusammenspiel von zunächst nahezu unveränderten Fluoreszenzeigenschaften des im Hintergrund der Lösung eingesetzten Fluorescein-Farbstoffes und der veränderten optischen Eigenschaften der Gold-Nanopartikel durch Verbindung mit ausreichend vielen Oligonukleotiden mit kationischer Modifikation (hier in Form eines Reverse-Primers als ZNA). Fluorescein wird durch den Light Cycler bei einer Wellenlänge von 470 nm angeregt und emittiert Fluoreszenz maximal bei 530 nm, wo im gewählten Modus im Light Cycler auch die Fluoreszenz gemessen wird. Die Nanopartikel haben im gelösten Zustand ohne Bindung zu Oligonukleotiden mit kationischer Modifikation (also z.B. in den ersten Zyklen der Real-Time PCR vor der Signalveränderung) ihr Extinktionsmaximum bei einer Wellenlänge von ca. 530 nm und noch signifikante Extinktion bei 470 nm (siehe z.B. auch Extinktionsspektren in den Fig. 3A bis 3D). Die Nanopartikel reabsorbieren somit einen beträchtlichen Teil der Fluorescein- Emission bei 530 nm und verhindern zusätzlich die Anregung der Nanopartikel bei 470 nm. Die abnehmende Nanopartikel-Extinktion in der Probe sowohl bei der Wellenlänge von 470 nm als auch bei der Wellenlänge von 530 nm durch die Verbindung der Nanopartikel mit ausreichend vielen Oligonukleotiden mit kationischer Modifikation führt nun durch effektivere Anregung und ungestörtere Emission der Fluoreszin-Farbstoffe bei gleichzeitiger geringerer Reabsorption durch die Nanopartikel zu einem erhöhten Fluoreszenz-Signals des Fluoreszeins und somit zu einer messbaren Veränderung.

Die Konzentration des Fluoreszeins kann z.B. auch 10fach höher gewählt werden. Dadurch steigt sowohl das Grundniveau des Fluoreszenzsignals als auch der absolute Signalhub (Daten hier nicht gezeigt). Bei einer deutlich verringerten Konzentration (Endkonzentration Fluoreszein 0 nM) sind sowohl das Grundniveau des Fluoreszenzsignals als auch der absolute Signalhub deutlich verringert, wobei es bei zu geringen Konzentrationen eventuell vorkommen kann, dass manche Proben bzw. Lösungen von Instrument und Software zu Beginn der Real-Time PCR im sog.„seek process" wiederum nicht erkannt werden (Daten hier nicht gezeigt). Als Beleg dafür, dass wirklich das Zusammenspiel von Nanopartikeln und ZNA für die Signalveränderung verantwortlich ist wurden folgende jeweils leicht abweichende Kontroll-Experimente durchgeführt:

Ersatz der Nanopartikel-Oligonukleotid-Konjugate durch das Oligonukleotid mit Sequenz 8 als Primer ohne Nanopartikel (Endkonzentration des Oligonukleotids mit Sequenz 8 40 pM und 300 pM getestet);

Ersatz des Oligonukleotids mit kationischer Modifikation (hier ZNA) mit Sequenz 9 durch ein DNA-Oligonukleotid ohne kationische Modifikation mit Sequenz 10 (diese ist im Wesentlichen ähnlich zu Sequenz 9, jedoch ohne kationischer Modifikation und etwas länger, um trotz der fehlenden ZNA einen ähnlich hohen Schmelzpunkt zu erreichen. Diese konnte im System mit Sybr-Green in Beispiel 4.1 erfolgreich als Ersatz für das Oligonukleotid mit kationischer Modifikation mit Sequenz 9 eingesetzt werden (Daten hier nicht gezeigt).

Alle Kontroll-Experimente zeigten auch bei der höchsten Konzentration der Nukleinsäure mit Sequenz 7 als Ausgangsmaterial (1 μΙ einer 1 pM Lösung eingesetzt) keine signifikante Signalerhöhung (Daten hier nicht gezeigt).

In Fig. 11 wurde unter den ansonsten gleichen experimentellen Bedingungen wie in Fig. 10 nun als Ausgangsmaterial für die PCR genomische DNA als nachzuweisende Nukleinsäure eingesetzt. Diese ist im Gegensatz zu den in obigen Experimenten zur Amplifikation eingesetzten synthetischen Oligonukleotiden mit Sequenz 7 deutlich komplexer, da sie nicht aus 83 Nukleotiden besteht, sondern aus ca. 3 Millionen Nukleotiden, die zudem als doppelsträngige DNA vorliegen. Sequenz 7 ist ein Teil des Resistenz-Gens MecA, das z.B. im Bakterium Methicillin- resistenter Staphylococcus aureus (MRSA) vorkommt. Dieses Resistenz-Gen kommt im Methicillin-sensitiven Staphylococcus aureus (MSSA) hingegen nicht vor. Die DNA wurde aus MRSA bzw. MSSA-Stämmen extrahiert und vor Einsetzen in die PCR 10 Minuten aufgekocht. Die Kurven in Fig. 11 zeigen Real-Time PCR Kurven (nach Software-Auswertungsfunktion„Analysis - Amplification Analysis - Absolute Quantification") mit 9 μΙ Mastermix, wie er auch in Fig. 10 eingesetzt wurde. Als Nukleinsäure wurden nun jeweils 1 μΙ genomische DNA von MRSA bzw. MSSA eingesetzt, so dass folgende Gesamtmengen als Ausgangsmaterial für die Amplifikation im jeweiligen Reaktionsvolumen von 10 μΙ enthalten waren: durchgezogene Linien: 100.000 Genomkopien MRSA

gestrichelte Linien: 10.000 Genomkopien MRSA

gepunktete Linien: 1.000 Genomkopien MRSA

gepunktet-gestrichelte Linien 100.000 Genomkopien MSSA

Diese Real-Time PCR Ergebnisse zeigen folgendes: Je mehr MRSA-Genomkopien als Ausgangsmaterial im Reaktionsvolumen vorhanden waren, desto früher zeigen die entsprechenden Kurven eine Zunahme der gemessenen Fluoreszenz. Die Nukleinsäure ist somit quantifizierbar. - Doppelbestimmungen mit gleicher Anzahl an MRSA-Genomkopien zeigen gut reproduzierbar sehr ähnliche Anstiegspunkte.

Proben, die nur MSSA-Genomkopien enthalten, zeigen bis zum 40. Zyklus kein signifikantes Ansteigen der Fluoreszenz, da Sequenz 7 nicht im MSSA-Genom vorkommt und daher die eingesetzten Primer keine Nukleinsäuren amplifizieren können. Dies zeigt die Spezifität der Methode bei entsprechend spezifischen Primern.

In Fig. 12 wurde unter den ansonsten gleichen experimentellen Bedingungen wie in Fig. 10 nun die MgC -Endonzentration von 5 mM auf 15 mM erhöht. Die Real- Time PCR Kurven (nach Software-Auswertungsfunktion„Analysis - Amplification Analysis - Absolute Quantification") von drei verschiedenen Ausgangskonzentrationen der Nukleinsäure mit Sequenz 7 (als Oligonukleotid vorliegend) und einer Negativkontrolle ohne Nukleinsäure als Zielsequenz sind wieder sehr ähnlich zu den Kurven in Fig. 10 (Zuweisung von Linienart zu Ausgangskonzentration der Nukleinsäure gleich wie in Fig. 10). Auffallend ist, dass die Kurven zur jeweiligen Nukleinsäure-Konzentration nun im Vergleich zu Fig. 10 mit 5 mM MgCte-Endonzentration mit Anstiegspunkten bei Zyklus 12, 15 und 18 nun jeweils um ca. 8-9 Zyklen früher ansteigen. Ein früheres Ansteigen ist von großem Vorteil, wenn man eine schnelle PCR durchführen möchte und das schnelle Erzielen von Ergebnissen entscheidend ist. Hier erreicht man ein schnelleres Ergebnis ohne dass dafür die Anschaffung neuer Hardware erforderlich ist, sondern bei gleicher Hardware unter Verwendung neuer Reaktionsmixe. Dies kann daher auf besonders effiziente Weise und besonders kostengünstig in bestehende System implementiert werden. Die Ursache für einen früheren Anstiegspunkt trotz gleicher Ausgangskonzentration kann entweder eine höhere Amplifikationseffizienz bedeuten, oder eine sensitivere Detektionsmethode, die bereits bei geringerer Amplikonmenge einen messbare Veränderung detektiert. Die Amplifikationseffizienz war in Fig. 8, die vergleichbare Anstiegspunkte wie Fig. 10 zeigte, mit 85,8% (Vervielfältigung pro Zyklus war 1 ,858, wobei Vervielfältigung pro Zyklus = 1 + Amplifikationseffizienz) bereits relativ hoch. Eine Erhöhung auf die vom Amplifikationsprozess grundsätzlich maximal mögliche Vervielfältigung pro Zyklus von 2 würde z.B. den ersten Anstiegspunkt bzw. den Cp-Wert in Fig. 8 für Ausgangskonzentration Co = 100 fM bei gleichem Detektionslimit von C(Cp) = 40 nM auf verschieben. Dies könnte daher nur eine Verschiebung um ca. 2 Zyklen, nicht aber eine Verschiebung um 8 bis 9 Zyklen bedeuten. Die Verschiebung der Anstiegspunkte hin zu niedrigeren Zyklen lässt sich somit nur erklären, wenn das Detektionslimit, also die Amplikon-Konzentration, bei der eine messbare Veränderung entsteht niedriger ist. Eine obere Abschätzung hierfür kann erfolgen, wenn man für die Vervielfältigung pro Zyklus das theoretische Maximum von 2 annimmt und analog zu Formel (1 ) aus Beispiel 4.1 berechnet:

C(Cp) = C ₀ ^■ 2 ^c * (3)

Es ergibt sich somit für Co = 100 fM und Cp = 12 ein neues Detektionslimit von 410 pM für die in Fig. 12 gezeigten Kurven. Eine Vervielfältigung pro Zyklus von < 2 ergibt hierbei ein noch kleineres Detektionslimit. Ein Detektionslimit von 410 pM bedeutet bei einer eingesetzten Nanopartikel-Konzentration von 40 pM etwa 10 gebundene Oligonukleotide mit kationischer Modifikation pro Nanopartikel. Die Cp- Werte, die von der Originalsoftware ermittelt werden sind für die unterschiedlichen eingesetzten Anfangskonzentrationen von Nukleinsäure in Tabelle 5 aufgelistet: Tabelle 5

Hierbei fällt auf, dass die von der Software ermittelten Wert immer etwa um ca. 2 Cp-Werte niedriger ausfallen, als ein menschlicher Betrachter per Auge ablesen würde. Dies hängt gegebenenfalls damit zusammen, dass die Kurven steiler verlaufen als die klassischen Kurven auf Farbstoffen basierend bzw. dass die Kurven plötzlicher einsetzten und einen nahezu sprunghaften Anstieg zeigen. Dies könnte von einem Schwellenverhalten der Nanopartikel kommen, die ab einer gewissen Mindestmenge von gebundenen Oligonukleotiden mit kationischer Modifikation sehr plötzlich ihre Eigenschaften verändern. Im Gegensatz hierzu ist bei dem konventionellen Farbstoff-basiertes Auslesen der Nukleinsäure-Menge in der Lösung in Bespiel 4.1 das Fluoreszenz-Signal relativ direkt proportional zur aktuellen Nukleinsäure Menge in der Lösung (zumindest sobald die durch doppelsträngige DNA erzeugte Fluoreszenz über das Grundniveau des gemessenen Signals hinauskommt) und zeigt daher im Übergangsbereich zwischen Grundniveau und steilem Anstieg auch eine Phase mit langsamem Signalanstieg. Die Auswertungs-Software des Instrumentes geht möglicherweise von derart verlaufenden Kurven aus oder Mittelungseffekte über mehrere Messpunkte beeinflussen den von der Software ermittelten Cp-Wert. In Fig. 12 fällt auf, dass auch die Proben ohne Nukleinsäure mit Sequenz 7 als Ausgangsmaterial (gestrichelt-gepunktete Linie) trotz fehlender Zielsequenz für die Amplifikation trotzdem ein eindeutiges Ansteigen des Signales etwa ab Zyklus 24 zeigen. Ein vergleichbarer Effekt war bereits in Fig. 8 im Farbstoff-basierten Beispiel 4.1 zu erkennen und ist vermutlich in beiden Fällen mit sog. Primer-Dimeren (siehe Beispiel 4.1 ) zu erklären. ln Fig. 13 sind die ersten Ableitungen von Schmelzkurven von falsch-positiven und echt-positiven Proben gezeigt, die während kontinuierlicher Temperaturerhöhung aufgenommen wurden. Falsch-positive Proben sind Proben, die z.B. wegen der Bildung von Primer-Dimeren einen positiven Signalverlauf zeigen, obwohl die nachzuweisende Nukleinsäure gar nicht in der Probe vorhanden ist. Falsch-positive Proben können oftmals anhand einer Schmelzkurve von echt-positiven Proben unterschieden werden, denn eine Schmelzkurve kann Auskunft über Länge und Zusammensetzung des Amplikons geben, da die Schmelztemperatur von der Länge und der Basen-Zusammensetzung der doppelsträngigen DNA abhängt. Dass die messbare Veränderung durch Verbindung von Nanopartikeln mit Oligonukleotiden mit kationischer Modifikation durch Temperaturerhöhung grundsätzlich wieder rückgängig gemacht werden kann wurde bereits in Fig. 3C gezeigt. Nun werden für die Aufnahme einer Schmelzkurve die Proben, die in Fig. 12 amplifiziert wurden, nach dem letzten Zyklus der Amplifikation langsam erhitzt und währenddessen die Fluoreszenz aufgenommen (Light Cycler Einstellungen: Schmelzkurve 37-95°C, Hold Time 0s, Ramp-Rate: 0,05°C/s, Acquisition Mode: Continous). Nach Abschluss der Schmelzkurven-Aufnahme wird die Auswerte- Methode„Analysis - Melting Curve Analysis - Tm-Calling" der Software ausgeführt. Die Zuweisung von Linienart zu Ausgangskonzentration der Nukleinsäure ist gleich wie in Fig. 0. Die Ableitungen der Schmelzkurven in Fig. 13 zeigen zwei Gruppen von Kurven. Die zwei Kurven mit dem Maximum der Ableitung bei ca. 79°C sind die falsch-positive Proben (also die Proben, die einen positiven Signalverlauf zeigen, obwohl die nachzuweisende Nukleinsäure gar nicht in der Probe vorhanden ist), die übrigen Proben (die die nachzuweisende Nukleinsäure mit Sequenz 7 als Ausgangsmaterial enthielten) haben das Maximum der Ableitung ca. bei 81 °C. Falsch-positive Proben und echt positive Proben sind somit anhand ihrer Schmelzkurve unterscheidbar. Die Halbwertsbreite zu den entsprechenden Maxima der Schmelzkurvenableitungen beträgt hierbei etwa 2,5 °C. Somit ist die Halbwertsbreite zu den entsprechenden Maxima der Schmelzkurvenableitungen hier bei erfindungsgemäßer Verwendung gemäß dieser bevorzugten Ausführungsform von Nanopartikeln und kationisch modifizierten Nukleinsäuren wesentlich geringer als bei Schmelzkurven aus Beispiel 4.1 nach dem Stand der Technik mit interkalierendem Farbstoff, wo die Halbwertsbreite ca. 9 °C beträgt (Daten nicht gezeigt). In anderen Worten sind die Schmelzkurven hier bei erfindungsgemäßer Verwendung gemäß dieser bevorzugten Ausführungsform von Nanopartikeln und kationisch modifizierten Nukleinsäuren wesentlich steiler als die Schmelzkurven aus Beispiel 4.1 nach dem Stand der Technik.

Beispiel 5: Real-Time Laser-PCR

Fig. 14A zeigt einen Aufbau, der zur Durchführung eines erfindungsgemäßen Verfahrens in einerweiteren bevorzugten Ausführungsform geeignet ist. Der Aufbau umfasst eine Lichtquelle, die in diesem Beispiel als Laser 11 ausgeführt ist und einen zweidimensionalen Spiegelscanner 12, der Licht von dem Laser 11 auf eine Probe lenken kann. Insbesondere kann die Vorrichtung ausgebildet sein, den Laserstrahl über den Spiegelscanner zu unterschiedlichen Zeitpunkten den Laserstrahl auf unterschiedliche Proben einer Mehrzahl von bereitgestellten Proben zu lenken. In der gezeigten bevorzugten Ausführungsform sind dabei Proben in fünf Reaktionsgefäßen R1 bis R5 bereitgestellt, welche in einer Probenhalterung 13 angeordnet sind. Die Probenhalterung kann dabei beispielsweise Öffnungen bzw. Fenster 15 aufweisen, durch welche der Laserstrahl hindurchtreten kann um auf die jeweilige Probe bzw. das jeweilige Reaktionsgefäß 15 zu treffen.

Der zweidimensionale Spiegelscanner 12 kann dabei einen vom Laser 1 1 emittierten Laserstrahl in zwei räumlichen Dimensionen ablenken. Die Denaturierung von doppelsträngiger DNA in der Probe geschieht in dem Aufbau gemäß der gezeigten bevorzugten Ausführungsform während einer Laser-PCR dadurch, dass ein Laserstrahl auf einen Teil zumindest der Probe fokussiert wird. Im Laufe des Verfahrens wird der Laserstrahl dabei vorzugsweise so abgelenkt, dass er auf unterschiedliche Teile einer oder mehrerer Proben in vorzugsweise mehreren Reaktionsgefäßen trifft. Beispielsweise können mit einer derartigen Vorrichtung erfindungsgemäße Verfahren an einer Mehrzahl vom Proben durchgeführt werden. Beispielsweise liegen dabei verschiedene Proben in jeweils separaten Reaktionsgefäßen R vor, welche von einer Probenhalterung 13 jeweils an einer angeordnet sind, so dass die Proben durch die zugeordnete Öffnung 15 mit dem Laser 1 bestrahlt werden können. Die Anordnung der Proben in bzw. an der Probenhalterung 13 erfolgt dabei vorzugsweise derart, dass die Proben von dem Laser 11 erfasst werden können, vorzugsweise ohne dass dabei der Laserstrahl die Probenhalterung 13 berührt. Die Anzahl der Reaktionsgefäße R, welche in der Probenhalterung angebracht werden können ist dabei nicht auf die in der gezeigten, bevorzugten Ausführungsform limitiert.

Fig. 14B zeigt ein weiteres Beispiel, welches ähnlich zu dem in Fig. 14A beschriebenen Beispiel ist, wobei der in Fig. 14B gezeigten Vorrichtung der Laserstrahl durch den Spiegelscanner 12 derart abgelenkt wird, dass der Laserstrahl das das Reaktionsgefäß R, in dem sich die Probe 16 befindet, zellenförmig abfährt. Der Weg, den der Laserstrahl dabei zurücklegt, ist in Fig. 14B in der Probe 16 gestrichelt dargestellt.

Dadurch, dass zu jedem Zeitpunkt des Verfahrens vorzugsweise nur Teile der Probe 16 angeregt werden, können Laser 11 mit einer kleineren Leistung verwendet werden. Da Anregungen der Nanopartikel mit einer Zeitdauer von weniger als 100 Mikrosekunden ausreichend sein können, um DNA mit Hilfe von optothermisch geheizten Nanopartikeln zu denaturieren, kann bei typischen Fokusdurchmessern eines Lasers von etwa 10 bis 100 pm ein Laserstrahl mit einer Geschwindigkeit von etwa 10 bis 100 m/s die Probe abtasten und dabei vorzugsweise an jedem Punkt, den der Laserstrahl überfährt, zu einer Denaturierung der DNA führen. Dies ermöglicht beispielsweise ein sehr schnelles Abtasten auch von großen Probenvolumina. Das komplette Abtasten einer Fläche von 1 cm ² dauert z.B. bei einem Fokusdurchmesser von 78 pm ünd 128 Zeilen im Zeilenabstand von 78 pm und einer Zeilenlänge von 1 cm bei einer Geschwindigkeit des abtastenden Laserstrahls von 10 m/s lediglich 128 ms. Hat das Volumen z.B. eine Tiefe, d.h. eine Ausdehnung in die Laserstrahl-Ausbreitungsrichtung, von 10 mm, kann beispielsweise ein Volumen von 1 ml prozessiert werden, sofern die Intensität der Anregung über die gesamte Tiefe ausreichend hoch ist um die darin befindliche doppelsträngige DNA zu denaturieren. Dies ist vorteilhafterweise in einer wesentlich kürzeren Zeit durchführbar, als ein herkömmlicher Denaturierungsschritt mittels einem globalen Erhitzen der Probe 16 bzw. der Lösung erfordern würde.

Mit optischen Elementen, wie z.B. einem in Fig. 14A und 14B gezeigten Spiegelscanner und sogenannten F Theta Linsen können beispielsweise eine gute Homogenität der Fokusqualität und -große über die gesamte abgetastete Probe erreicht werden. Alternativ zu einem kontinuierlich emittierenden Laser kann auch ein gepulster Laser oder ein thermischer Strahler eingesetzt werden. Beispiel 5.1 : Laser-PCR mit kationisch modifizierter Nukleinsäure (ZNA)

Für einen indirekten Nachweis einer Nukleinsäure wurde eine Polymerase- Kettenreaktion mit lokal geheizten Nanopartikeln durchgeführt. Das verwendete Primer-System aus Nanopartikel-Oligonukleotid-Konjugaten für Forward Primer und ZNA als Reverse Primer entspricht im Wesentlichen unverändert dem aus dem oben-genannten Beispiel 4.2. Das modifizierte Primer-Oligonukleotid mit Sequenz 4 beinhaltet als Teilsequenz die Sequenz 8 (diese Sequenz dient nach wie vor als eigentliche Primer-Sequenz), zusätzlich eine Teilsequenz aus 35 Adenin -Basen, die als Abstandshalter zwischen Partikel-Oberfläche und Primer-Teilsequenz dient und zusätzlich zwei abasische Modifikationen Spacer9 zwischen Abstandsteilsequenz und Primerteilsequenz, die das Überschreiben der Abstandsteilsequenz durch die Polymerase verhindert (siehe z.B. Patentanmeldung DE 102013215168.3). Des Weiteren enthält das modifizierten Primer- Oligonukleotid mit Sequenz 4 am 5'-Ende eine Thiol-Modifikation, mit deren Hilfe das Oligonukleotid auf die Oberfläche eines Gold-Nanopartikels gebunden wird bzw. werden kann. Es werden die gleichen Nanopartikel-Öligonukleotid-Konjugate verwendet wie in dem in Fig. 5 gezeigten Beispiel, d.h. Goldnanopartikel mit 60 nm Durchmesser (geliefert von BBI), wobei jedes Nanopartikel wobei ca. 1000 Oligonukleotide mit Sequenz 4 trägt. Der Reverse-Primer ist dabei wieder ein Oligonukleotid mit kationischer Modifikation, nun mit vier kationischen Einheiten am 5'-Ende mit Sequenz 14 (ZNA4). Als Ausgangsmaterial für die Laser-PCR mit lokal geheizten Nanopartikeln wird genomische DNA als nachzuweisende Nukleinsäure eingesetzt, wie im Wesentlichen schon in der Erläuterung zu Fig. 11 beschrieben. Sequenz 7 (die durch das vorliegende Primer-System amplifiziert werden kann) ist ein Teil des Resistenz-Gens MecA, das z.B. im Bakterium Methicillin-resistenter Staphylococcus aureus (MRSA)vorkommt. Die DNA wurde aus MRSA bzw. MSSA-Stämmen extrahiert und vor Einsetzen in die PCR 10 Minuten lang aufgekocht.

Jede Reaktion besteht aus 18 μΙ Mastermix und 2μΙ Nukleinsäurelösung bzw. Wasser. 8 μΙ Mastermix für eine Reaktion werden wie folgt zusammengestellt: Tabelle 6

^* die Nanopartikel-Oligonukleotid-Konjugate sind funktionalisiert (nach J. Hurst et al., Anal. Chem., 78(24), 8313-8318, 2006, dessen diesbezüglicher Inhalt durch Verweis Teil der vorliegenden Offenbarung ist). Nach Funktionalisierung und 6 Waschschritten liegen die Nanopartikel-Oligonukleotid-Konjugate in einer Konzentration von 200 pM in Phosphatpuffer (5 mM Phosphat, pH 7) mit 0,1 % Tween 20, 10 mM NaCI vor.

Die Vervielfältigungsreaktion wird in einem Gesamtvolumen von 20 μΙ in 200 μΙ Probenröhrchen bzw. Reaktionsgefäßen durchgeführt. Sie findet nicht in einem klassischen Thermocycler (wie etwa einem Light Cycler) statt, in dem die gesamte Probenflüssigkeit erhitzt wird, sondern in einer Vorrichtung zur Durchführung einer Laser-PCR, in der die Nanopartikel optothermisch lokal erhitzt werden. Wie in Fig. 14A dargestellt, werden die Probenröhrchen in einer Probenhalterung 13, welcher insbesondere einen temperierten Aluminiumblock umfasst, auf einer Temperatur von 61 °C gehalten, was sowohl der Annealing- als auch der Elongationstemperatur entspricht. Die Denaturierung der doppelsträngigen DNA wird durch einen Laser 1 induziert. Der Laser 11 , der zum Anregen der Nanopartikel dient, ist ein frequenzverdoppelter diodengepumpter Nd:YAG-Laser (OEM-Micro-1600, Pegasus Lasersysteme GmbH), der bei einer Ausgangsleistung von 1 ,6 W und einer Wellenlänge von 532 nm nach Strahlaufweitung um einen Faktor 2,5 mit einem Galileischen Teleskop mit einer F-Theta-Linse (Jenoptik, Brennweite 100 mm) hinter einem Spiegelscanner 12 (Cambridge Technologies, Pro Series 1 ) in die Probenröhrchen R1 bis R5 in der Probenhalterung 13 fokussiert wird (Fokusdurchmesser circa 25-30 pm). Der Spiegelscanner 12 erlaubt, den Fokus zeilenweise durch die Probenröhrchen zu bewegen, wie auch in Fig. 14B gezeigt, und somit das gesamte PCR-Reaktionsvolumen an der optothermischen Vervielfältigung zu beteiligen.

Nachdem die Probenröhrchen in den auf 61 °C vorgeheizten Aluminiumblock gebracht wurden erfolgt eine initiale einmalige Thermalisierungszeit von 30 s, anschließend erfolgt der erste Denaturierungszyklus. Pro Probenröhrchen R1 bis R5 werden hierfür 500 Zeilen mit einem Abstand von circa 14 pm bei einer Zeilengeschwindigkeit in dem Probenröhrchen von circa 4 m/s mit dem Fokus abgefahren. Dies entspricht einem Zyklus im ersten Probenröhrchen. Anschließend werden nacheinander alle anderen Probenröhrchen abgefahren, so dass jedes Probenröhrchen einen Zyklus erfahren hat. Nach einer Wartedauer von 7 Sekunden wird der nächste Zyklus gestartet. Dies wird für jedes Probenröhrchen 80 mal wiederholt. In der Probenhalterung 13 befinden sich auf zwei gegenüberliegenden Seiten (der Laser-zugewandten und der Laser-abgewandten Seite) um jedes Probenröhrchen jeweils ein Fenster 15 bzw. eine Aussparung 15, um den Laser 11 in die Probenröhrchen einkoppeln zu können und um auf der Laser-abgewandten Seite mit Hilfe einer Photodiode eine Transmissionsmessung durchführen zu können. D.h. es kann während jedem Zyklus zu jedem Probenröhrchen bestimmt werden, wie viel Intensität des Lasers 11 durch die Probe 16 transmittiert wird oder in anderen Worten wie viel Laser-Licht die Probe 16 absorbiert. Der Laser 11 dient somit dem lokalen Erhitzen der Nanopartikel und somit dem Denaturieren der doppelsträngigen DNA (Amplikon) auf den Nanopartikeln und auch der Bestimmung der messbaren Veränderung (der physikalischen bzw. optischen Eigenschaft der Lösung) durch Verbindung von Oligonukleotiden mit kationischer Modifikation (hier der Reverse-Primer) mit den Nanopartikeln, die hier Oligonukleotide als Forward- Primer tragen.

Fig. 15A zeigt Real-Time Laser-PCR Kurven, welche anhand einer Veränderung der Absorption (in willkürlichen Einheiten) der Probe 16 bzw. der Lösung bei der Zentralwellenlänge des Lasers (532 nm) gemessen wurden. Die gezeigten Messdaten wurden dabei über jeweils 5 Messpunkte gemittelt. Als Nukleinsäure wurden jeweils 2 μΙ genomische DNA von MRSA oder als Negativ-Kontrolle Wasser eingesetzt, so dass folgende Gesamtmengen als Ausgangsmaterial für die Amplifikation im jeweiligen Reaktionsvolumen von 20 μΙ enthalten waren: durchgezogene Linien: 2.000.000 Genomkopien MRSA

gestrichelte Linien: 200.000 Genomkopien MRSA

gepunktete Linien: 20.000 Genomkopien MRSA

gepunktet-gestrichelte Linien: keine Genomkopien, nur Wasser als Negativ- Kontrolle

Man beobachtet, dass die Absorption aller Proben zunächst zunimmt. Die Ursache für diese initiale Zunahme ist über weite Bereiche des sichtbaren Spektrums zu beobachten und kann anhand von Messungen bei zumindest zwei verschiedenen Wellenlängen herausgerechnet werden, indem eine Wellenlänge so gewählt ist dass sie geringfügig blauverschoben und die andere geringfügig rotverschoben zu dem Absorptionsmaximum der Nanopartikel sind. Da bei beiden Wellenlänge die initiale Zunahme der Absorption etwa gleich ist, eine Verschiebung der Nanopartikel-Absorption jedoch zu gegensätzlichen Veränderungen der Absorption bei den beiden gewählten Wellenlängen führt, können bei zweifarbiger Messung die initiale Zunahme der Absorption von dem gewünschten Effekt der Verschiebung des Absorptionsmaximums der Nanopartikel unterschieden werden. Ab einem gewissen Zeitpunkt bzw. einer gewissen Zyklenzahl (beide Größen sind über die Zyklusdauer - in diesem Fall 7s - korreliert), knickt die Absorption nach unten ab (d.h. die Absorption nimmt ab). Die abnehmende Absorption ist eine Folge der aggregierenden Nanopartikel, die durch das entstehende Amplikon zumindest teilweise mit den ZNA-Primern verbunden werden. Je höher die ursprünglich eingesetzte Menge an Ziel-DNA war, desto früher knickt die Absorptionskurve ab. Eine quantitative Aussage über die eingesetzte DNA-Menge kann z.B. dadurch getroffen werden, dass man zu jeder Kurve den Zeitpunkt der maximalen Absorption bestimmt. Dies kann beispielsweise dadurch erreicht werden, dass die erste Ableitung der Kurven aus Fig.15A nach der Zeit bildet und deren Schnittpunkt mit der Zeit-Achse (vorzugsweise bei fallender Ableitung) bestimmt.

Die Ableitungskurven der Kurven aus Fig. 15A sind in Fig. 15B dargestellt. Als Zeitpunkt maximaler Absorption, welcher als Äquivalent zum Cp-Wert in der klassischen qPCR gesehen werden kann, bekommt man somit für 2.000.000 Genomkopien MRSA eine Zeitdauer von 2,6 Minuten, für 200.000 Genomkopien MRSA eine Zeitdauer von 3,2 Minuten und für 20.000 Genomkopien MRSA eine Zeitdauer von 3,5 Minuten. Anzumerken ist, dass auch die Negativ-Kontrolle zu einem späteren Zeitpunkt (hier 4,8 Minuten) einen Abknickpunkt zeigt, welcher vermutlich auf die unspezifische Bildung von Primer-Dimeren zurückzuführen ist.

Beispiel 5.2: Laser-PCR mit DNA

Die Kurven in Fig. 16A zeigen Real-Time Laser-PCR Kurven, konkret die Veränderung der Absorption der Probe bei der Wellenlänge des Lasers (532 nm) in willkürlichen Einheiten, wobei die Messwerte über jeweils 5 Messpunkte gemittelt wurden.

Die durchgeführte Messung ist dabei im Wesentlichen identisch zu der in Beispiel 5.1 beschriebenen Messung. Während in Beispiel 5.1 ein Oligonukleotid mit kationischer Modifikation bzw. eine ZNA mit Sequenz 14 als Reverse-Primer verwendet wurde, wird in Beispiel 5.2 zu Vergleichszwecken ein DNA- Oligonukleotid ohne kationische Modifikation mit Sequenz 10 als Reverse-Primer verwendet. Die Sequenz 0 ist dabei im Wesentlichen ähnlich zur Sequenz 14, jedoch weist Sequenz 10 keine kationische Modifikation auf und ist anstatt dessen etwas länger, um trotz der fehlenden kationischen Modifikation einen ähnlich hohen Schmelzpunkt zu erreichen. Das DNA-Oligonukleotid ohne kationische Modifikation mit Sequenz 10 konnte im System mit Sybr-Green in Beispiel 4.1 erfolgreich als Ersatz für das Oligonukleotid mit kationischer Modifikation mit Sequenz 9 eingesetzt werden, das sich nur um eine kationische Einheit von Sequenz 14 unterscheidet (Daten hier nicht gezeigt). Die Konzentration dieses Oligonukleotids mit der Sequenz 10 beträgt ebenfalls 300 nM. Das Kontroll-Experiment in Fig. 16A zeigt im Gegensatz zur Messung mit Reverse-Primer mit kationischer Modifikation aus Beispiel 5.1 bei keiner der eingesetzten Ausgangsmengen an Ziel-DNA ein derartiges signifikantes Abknicken der Absorption, wie dies in Beispiel 5.1 zu beobachten ist. Die Darstellung der Kurven zu den eingesetzten Ziel-DNA-Mengen entspricht der in Fig. 15A gewählten Darstellung. Ohne Oligonukleotide mit kationischer Modifikation oder in anderen Worten nur mit Oliogonukleotiden ohne kationische Modifikation als Primer lässt sich das Amplifikat oder die ursprünglich eingesetzte Ziel-DNA im Gegensatz zu den Verfahren gemäß bevorzugter Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung nicht bzw. nicht zuverlässig nachweisen.

Die Kurven in Fig. 16B zeigen Real-Time Laser-PCR Kurven, konkret die Veränderung der Absorption der Probe bei der Wellenlänge des Lasers (532 nm) in willkürlichen Einheiten. Dabei wurde jeweils über 5 Messpunkte gemittelt. Die Messung ist dabei im Wesentlichen identisch zu der Messung in Beispiel 5.1 , jedoch wurde auch hier der Reverse-Primer durch ein DNA-Oligonukleotid ohne kationische Modifikation mit Sequenz 10 ersetzt, anstatt wie in Beispiel 5.1 ein Oligonukleotid mit kationischer Modifikation bzw. ZNA) mit Sequenz 14 zu verwenden.

Die Konzentration dieses Oligonukleotids mit der Sequenz 10 beträgt nun nur 20 nM. Zusätzlich wurden der Reaktion nun jedoch zweite Nanopartikel zugesetzt. Die Endkonzentration der zweiten Nanopartikel im Gesamtvolumen der Reaktion ist dabei 20 pM. Die zweiten Nanopartikel wurden im Wesentlichen identisch wie die ersten Nanopartikel aus der Tabelle 6 hergestellt und gelagert, jedoch tragen sie an der Oberfläche nicht das Oligonukleotid mit Sequenz 4, das in einer Teilsequenz als Forward-Primer dient, sondern das Oligonukleotid mit Sequenz 12, das in einer Teilsequenz vorzugsweise als Reverse-Primer dient. Zumindest kann das Oligonukleotid mit Sequenz 12 auf die Teilsequenz hybridisieren, die entsteht, wenn der Forward-Primer auf den ersten Nanopartikeln unter Vorlage der Ziel-Sequenz 7 (wie sie auch im MRSA vorkommt) von einer Polymerase während einer Amplifikationsreaktion elongiert wird. Da diese Teilsequenz jedoch bei Einsatz höherer Konzentrationen von Reverse-Primer mit Sequenz 10 von diesem oder von einem Amplikon-Strang besetzt sein kann und somit ggf. nicht für die Hybridisierung mit den zweiten Nanopartikeln zur Verfügung steht, muss der Reverse-Primer mit Sequenz 10 in sehr geringen Konzentrationen (hier 20 nM) eingesetzt werden, um eine asymmetrische Amplifikation zu erreichen. Bei Erreichen einer gewissen Mindestmenge von durch die Polymerase elongierten Forward-Primern auf den ersten Nanopartikeln können die ersten Nanopartikel somit durch das Ampiikon mit den zweiten Nanopartikeln durch Hybridisierung verbunden werden. Auch dies kann ein Abknicken der Absorption hervorrufen, wie in Fig. 16B gezeigt ist. Die Darstellung der Kurven zu den eingesetzten Ziel-DNA-Mengen entspricht der Darstellung in Fig. 15A.

Das Abknicken der Absorption und somit der Nachweis des Amplifikats und/oder der ursprünglich eingesetzten Ziel-DNA erfolgt mit dem Verfahren gemäß Beispiel 5.2 jedoch, je nach eingesetzter Ziel-DNA-Menge, erst nach etwa nach 7-10 Minuten und somit deutlich später als bei der Anwendung eines erfindungsgemäßen Verfahrens gemäß Beispiel 5.1 (siehe Fig. 15A), bei welchem der Nachweis mittels Oligonukleotiden mit kationischer Modifikation erfolgte. In Beispiel 5.1 konnte bereits nach etwa 2,6 bis 3,5 Minuten ein Abknicken der Absorption beobachtet werden.

Auch ist das Abknicken der Absorption in Fig. 16B nicht so stark bzw. deutlich ausgeprägt und kann somit nicht mit gleicher Zuverlässigkeit interpretiert und gemessen werden. Dies ist somit ein weiteres eindeutiges Indiz dafür, dass ein Nachweis einer Nukleinsäure mit einem erfindungsgemäßen Verfahren, d.h. insbesondere unter Verwendung von Nanopartikeln und Nukleinsäuren mit kationischer Modifikation, deutlich schneller, genauer und zuverlässiger erfolgen kann als mit anderweitigen Verfahren.

Beispiel 6: Real-Time PCR mit ZNA-Primern und DNA-Primern und Nanopartikel- gebundenen Oligonukleotiden als spezifische Probe

Für einen indirekten Nachweis einer Nukleinsäure wurde eine Polymerase- Kettenreaktion durchgeführt. Das in diesem Beispiel verwendete Primer-System besteht aus ZNA als Forward-Primer (Sequenz 15, siehe Anhang) und DNA als Reverse-Primer (Sequenz 16, siehe Anhang). Beide Primer sind zunächst nicht mit Nanopartikeln verbunden. Für den Nachweis der Nukleinsäure dienen Nanopartikel, die mit Oligonukleotiden mit Sequenz 17 (siehe Anhang) funktionalisiert sind und als Hybridisierungs-Sonden dienen. Das Oligonukleotid mit Sequenz 17 beinhaltet eine spezifische Teilsequenz B, die auf einen durch die Polymerase am ZNA- Forward-Primer elongierten Teil hybridisieren kann, wenn die ursprünglich eingesetzte Ziel-DNA entsprechend aufgebaut ist. In anderen Worten ist die spezifische Teilsequenz B des an den Nanopartikel funktionalisierten Oligonukleotids im Wesentlichen zumindest teilweise identisch mit der nachzuweisenden Nukleinsäure. Zusätzlich enthält Sequenz 17 eine Teilsequenz aus 35 Adenin-Basen, die als Abstandshalter zwischen Partikel-Oberfläche und spezifischer Teilsequenz B dient, weiter enthält das modifizierten Oligonukleotid mit Sequenz 17 am 5'-Ende eine Thiol-Modifikation, mit deren Hilfe das Oligonukleotid auf die Oberfläche von Gold-Nanopartikeln gebunden wird und weiter enthält Sequenz 17 am 3'-Ende eine ddC-Modifikation (Dideoxycytidin), die als terminierende Modifikation dient, also die Elongation durch die Polymerase verhindert. Es werden Goldnanopartikel mit 60 nm Durchmesser (geliefert von BBI) verwendet, jedes Nanopartikel trägt ca. 1000 Oligonukleotide mit Sequenz 17. Als zusätzlicher Farbstoff wird Fluorescein verwendet. Jede Reaktion umfasst 9 μΙ Mastermix und 1 μΙ Nukleinsäurelösung (Oiigonukleotid mit Sequenz 7) bzw. Wasser. 9 μΙ Mastermix für eine Reaktion werden wie folgt zusammengestellt: Tabelle 7

* die Nanopartikel-Oligonukleotid-Konjugate sind funktionalisiert (nach J. Hurst et al., Anal. Chem., 78(24), 8313-8318, 2006, dessen diesbezüglicher Inhalt durch Verweis Teil der vorliegenden Offenbarung ist). Nach Funktionalisierung und 6 Waschschritten liegen die Nanopartikel-Oligonukleotid-Konjugate in einer Konzentration von 200 pM in Phosphatpuffer (5 mM Phosphat, pH 7) mit 0,1 % Tween 20, 10 mM NaCI vor.

Das PCR-Protokoll besteht aus 50 Zyklen ä 5 Sekunden 90°C, 15 Sekunden 58°C und 15 Sekunden 72°C. Die Signal-Detektion findet nach jedem 58°C-Schritt statt.

Fig. 17 zeigt Real-Time PCR Kurven des 530 nm Fluoreszenz-Kanals (passend zur Emissions-Wellenlänge von Fluorescein) von vier verschiedenen Ausgangskonzentrationen der Nukleinsäure mit Sequenz 7 (als Oligonukleotid vorliegend) und einer Negativkontrolle ohne Nukleinsäure als Zielsequenz. Die Kurven sind im Wesentlichen sehr ähnlich zu den Kurven in Fig. 12. Mit steigender Ausgangskonzentration der Nukleinsäure mit Sequenz 7 sinkt die Zyklenzahl, nach der ein Ansteigen des Signals beobachtet bzw. gemessen werden kann.

Die Kurven in Fig. 17 haben folgende Ausgangskonzentration der Nukleinsäure (Oligonukleotid mit Sequenz 7): durchgezogene Linie: 1 fM

gestrichelte Linie: 100 aM

gepunktete Linie: 10 aM

durchgezogene Linie mit Dreiecken: 1 aM

gepunktet-gestrichelte Linie: Negativkontrolle ohne Sequenz 7

Auffallend ist in diesem Beispiel, dass die Kurve der Negativkontrolle ohne nachzuweisende Nukleinsäure (gepunktet-gestrichelte Linie) nun kein unspezifisches, ungewolltes Abknicken wie die Negativkontrolle in Fig. 12 zeigt. Dies ist eine Folge des spezifischen Detektionsformats. In den oben beschriebenen PCR- und Laser-PCR-Beispielen wurden beide Primer (ZNA-Primer und Nanopartikel-gebundene Primer) auch eingesetzt, um bei ausreichender Menge von Amplikon ein messbares Signal durch Verbindung von Nanopartikeln und kationisch modifizierter Nukleinsäuren zu erzeugen. In dem hier beschriebenen Beispiel 6 dient zwar die ZNA mit Sequenz 15 sowohl als Primer als auch zur Erzeugung eines messbaren Signals, aber die Oligonukleotide auf den Nanopartikeln dienen in diesem Fall nur der Erzeugung eines messbaren Signals, nicht aber als Primer. Um zu verhindern, dass sie auch als Primer dienen können bzw. elongiert werden können, tragen sie am 3'-Ende eine terminierende ddC- Modifikation, die die Elongation durch die Polymerase verhindert.

Die Bildung von Primer-Dimeren führt in diesem Fall nicht zu einer Verbindung von Nanopartikeln und kationisch modifizierten Nukleinsäuren und somit auch nicht zu einer messbaren Veränderung. Die spezifische Detektion ist dadurch möglich, dass die nachzuweisende Nukleinsäure mit Sequenz 7 von 3' nach 5' gelesen die Teilsequenzen C, B und A umfasst. Teilsequenz A enthält die Sequenz 16 des Reverse-Primers, Teilsequenz B ist identisch mit der Teilsequenz B des modifizierten Oligonukleotids, das an die Nanopartikel funktionalisiert ist, und Teilsequenz C enthält eine Sequenz, die komplementär zum Forward-Primer mit Sequenz 15 ist. Da der Forward-Primer im Überschuss gegenüber dem Reverse-Primer vorhanden ist, entsteht nach entsprechend vielen Zyklen ein Überschuss an dem Teilstrang des Amplikons, der aus der Elongation des Forward-Primers mit kationischer Modifikation entsteht.

Im elongierten Teil befindet sich dann die Teilsequenz B', die komplementär zur Teilsequenz B des modifizierten Oligonukleotids am Nanopartikel ist. Somit kann es zu einer Verbindung von Nanopartikeln und kationisch modifizierter Nukleinsäuren und somit zu einer messbaren Veränderung der physikalischen Eigenschaft der Lösung kommen. Der Überschuss des Forward-Primers mit ZNA kann beispielsweise notwendig sein, um eine ausreichende Anzahl von unbesetzten Teilsträngen des Amplikons zu erhalten, auf die die Teilsequenz B des modifizierten Oligonukleotids am Nanopartikel hybridisieren kann. Ohne den Überschuss könnte es beispielsweise zu einer zu starken Konkurrenz zwischen Teilsequenz B des modifizierten Oligonukleotids am Nanopartikel und dem Gegenstrang des Amplikons kommen, der aus der Elongation des Reverse-Primers entsteht. Hierdurch könnte die Verbindung zwischen Nanopartikeln und kationisch modifizierter Nukleinsäure und somit die messbare Veränderung unterdrückt oder verhindert werden. Durch den Einsatz der spezifischen und terminierten Sequenz 17 auf den Nanopartikeln, die nicht als Primer in der PCR dient, können auch geringere Anfangskonzentrationen der nachzuweisenden Nukleinsäure mit Sequenz 7 von der Negativkontrolle ohne Sequenz 7 unterschieden werden. In Fig. 12 konnte beispielsweise die Anfangskonzentration von 1 fM klar von der Negativkontrolle unterschieden werden.

In Fig. 17, d.h. mit einem erfindungsgemäßen Verfahren gemäß der in Beispiel 6 beschriebenen bevorzugten Ausführungsform, kann darüber hinaus eine 1000fach geringere Anfangskonzentration (1 aM) als im Vergleich zu Fig. 12 detektiert werden. Wie in Fig. 17 zu sehen ist, ist auch bei einer derart geringen Anfangskonzentration eine zuverlässige Unterscheidung möglich, da die Negativkontrolle kein Abknicken zeigt.

Bezugszeicheniiste

2 Nanopartikel

4 Nukleinsäure (am Nanopartikel befestigt)

6 kationisch modifizierte Nukleinsäure / kationisch modifiziertes

Oligonukleotid

6a Hybridisierungsbereich

6b kationischer Abschnitt

6c kationische Einheit

8 Farbstoff

10 (nachzuweisende) Nukleinsäure

1 Lichtquelle bzw. Laser

13 Probenhalterung

15 Fenster bzw. Aussparungen

16 Probe

R, R1 - R8 Reaktionsgefäß

11 Intensität von einfallendem Anregungslicht

T1 , T2 Intensität von tran emittiertem Licht

F1 , F2 Intensität von Fluoreszenz-Abstrahlung

Anhang

Sequenzliste (Sequenz-Abfolge je von 5' nach 3'): Sequenz 1 : 5Thiol - AAAAATCATAGCGTCATTATTCCAGGAA (SEQ ID No. 1 ) Sequenz 2: Z2- TTCCTG G AATAATG ACG CTATG A (SEQ ID No. 2)

Sequenz 3: Z2- CCAATCTAACTTCGACAT (SEQ ID No. 3)

Sequenz 4: 5'Thiol - AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA

/sp9//sp9/ AG ATG G TATG TG G AAG TTAG ATTG G

(SEQ ID No. 4; SEQ ID No. 5)

Sequenz 5: Z4-GTTCGCATCAAACGGAAAAT (SEQ ID No. 6)

Sequenz 6: Z4-CCAATCTAACTTCGACAT (SEQ ID No. 7)

Sequenz 7:

TCAATATGTATGCTTTGGTCTTTCTGCATTCCTGGAATAATGACGCTATGATCC CAATCTAACTTCCACATACCATCTTCTTT

(SEQ ID No. 8)

Sequenz 8: AGATGGTATGTGGAAGTTAGATTGG (SEQ ID No. 9)

Sequenz 9: Z3-CCTG G AATAATG ACG CTATG A (SEQ ID No. 0)

Sequenz 10: GCATTCCTGGAATAATGACGCTATGA (SEQ ID No. 11 )

Sequenz 11 : 5'Thiol-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA

/sp9//sp9/ GCAGAGCAAGGACTGATACA

(SEQ ID No. 12; SEQ ID No. 13)

Sequenz 12: 5'Thiol - AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA TTCCTG G AATAATG ACG CTATG A (SEQ ID No. 14)

Sequenz 13:

AAAGAAGATGGTATGTGGAAGTTAGATTGGGATCATAGCGTCATTATTC CAGGAATGCAGAAAGACCAAAGCATACATATTGA

(SEQ ID No. 15)

Sequenz 14: Z4-CTGGAATAATGACGCTATGA (SEQ ID No. 16)

Sequenz 15: Z4-AGATGGTATGTGGAAGTTAGATTGG (SEQ ID No.

17)

Sequenz 16: ATGTATGCTTTGGTCTTTCTGC (SEQ ID No. 18) Sequenz 17: 5'Thiol-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA TTCCTGGAATAATGACGCTATGA_ddC (SEQ ID No. 19)

Z2 bedeutet zwei kationische Einheiten in der ZNA-Modifikation

Z3 bedeutet drei kationische Einheiten in der ZNA-Modifikation

Z4 bedeutet vier kationische Einheiten in der ZNA-Modifikation

/sp9/ ist eine abasische Modifikation Spacer9

ddC ist eine ddC-Modifikation (Dideoxycytidin)