O presente relatório de Patente de Invenção se refere à utilização de biocida natural no processo de produção de etanol de diversas fontes, e, mais especificamente, da utilização de uma mistura de biocidas a base de ingredientes naturais biológicos, que auxiliam no controle microbiano no processo de fermentação alcoólica de fontes amiláceas e/ou outros açúcares de cana de açúcar, milho, sorgo, trigo, cevada, batata, mandioca, arroz, malte, uvas, sucos e de frutas diversas, podendo ainda ser utilizadas fontes lignocelulósicas, tais como folhas, madeiras, bagaços, farelos, capim, cascas, sementes, após tratamento químico e/ou enzimático, para obtenção de etanol combustível de I ^a e 2 gerações.

A utilização de biocida natural no processo de produção de etanol de diversas fontes, ora proposta, aplica-se também a processos de fermentação para produção de etanol destinado ao consumo humano, tais como álcool de cereais e de milho, além de bebidas fermentadas e/ou destiladas como cerveja, vinho e cachaça.

A fermentação alcoólica é um processo realizado por diversos organismos, entre os quais podemos destacar: Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces uvarum, Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces chevalieri, Cândida krusei, Cândida guilliermondii, Cândida tropicalis, Cândida diddensiae, Cândida fabianii, Cândida intermédia, Cândida maltosa, Cândida santamariae, Cândida colliculosa, Pichia membranaefaciens, Cryptococcus kuetzingii, Hansenula polymorpha, Kloeckera corticis, Rhodotorula pallida, Rhodotorula rubra, Rhodotorula minuta, Torulopsis norvegica e Trichosporon cutaneum.

No processo fermentativo, o mosto possui nutrientes (sacarose, glicose, aminoácidos, minerais, vitaminas, ácido fólico, etc.) e condições favoráveis (temperatura, pH, quantidade de oxigénio) ao desenvolvimento bacteriano.

Portanto, é necessário controlar tal crescimento, sem interferir no processo de fabricação de etanol ou em seus produtos, já que as bactérias contaminantes, normalmente Gram-positivas, acidificam o meio, por meio de fermentação láctica, butírica, acética principalmente e outras que podem ocorrer isoladamente ou de forma concomitante, e inibem a ação da levedura, através dos produtos de seu metabolismo, ou pela diminuição drástica da quantidade de nutrientes, afetando assim a qualidade e o rendimento do etanol produzido.

A fermentação acética é atribuída principalmente às espécies Acetobacter aceti, A. pasteurianum, A. acetosum, A. kuntzegianum e A. suboxydans.

A fermentação láctica é atribuída principalmente às espécies Lactobacillus acidophilus, L. bulgaricus, L. casei e L. leischmanii e Streptococcus lactis.

A fermentação butírica é atribuída principalmente às espécies Clostridium pasteurianum e C. saccharobutyricum.

A fermentação da dextrana é atribuída principalmente à espécie Leuconostoc mesenteróides .

A fermentação da levana é atribuída principalmente às espécies dos géneros Bacillus, Aerobacter e Streptococcus.

As etapas da fermentação até etanol combustível, a partir da cana de açúcar, são:

- moagem (a fim de obter o caldo);

- tratamento do caldo (cal, sulfito, H ₂ SO ₄ );

- pré-evaporação; preparo do mosto;

- fermentação; - centrifugação, e

- destilação.

O processo de fermentação não é asséptico, e, portanto muito susceptível à contaminação microbiana.

A obtenção de etanol a partir de amido ocorre em diferentes etapas; primeiramente ocorre a moagem dos grãos (amido), que pode ser realizada de modo seco ou úmido; em seguida adiciona-se água para tornar o meio reacional mais adequado e adicionam-se enzimas alfa amilases (que podem ser de diferentes cepas) para que ocorra a liquefação do amido; após esta etapa ocorre a sacarificação, onde se visa obter um mosto com altas concentrações de glicose, para essa conversão são utilizadas glicoamilases, ocorrendo então a fermentação do mosto, e, nessa etapa, deve-se atentar a contaminação microbiana, que pode interferir na eficiência do processo e na qualidade/quantidade do produto final, sendo finalmente o etanol obtido através de processos de destilação.

0 etanol celulósico possui diversas fontes, que podem ser divididas em seis classificações:

1 - Resíduos de colheita (bagaço de cana, palha de milho, palha de trigo, casca de arroz, palha de cevada, casca de cevada, bagaço de sorgo, semente de oliva e polpa de oliva);

2 - Hardwood / madeira dura: aspen, poplar;

3 - Softwood/ madeira macia: pinheiro, spruce;

4 - Resíduos de celulose: jornal; papéis de escritório, e lodo de papel reciclado;

5 - Biomassa herbárea: alfafa; feno, e diferentes tipos de capim, e

6 - Resíduos sólidos urbanos.

Atualmente no Brasil a matéria prima mais abundante são os resíduos de colheita, mais especificamente o bagaço de cana de açúcar, que é constituído de lignina (20 a 30%), celulose (40 a 45%) e hemiceluloses (30 a 35%).

A produção de etanol celulósico engloba cinco etapas principais; pré- tratamento da biomassa; hidrólise de celulose; fermentação das hexoses; separação, e tratamento de efluentes.

O pré-tratamento da biomassa pode ser realizado de diversos modos; pela utilização de ácidos (clorídrico, sulfúrico, nítrico); de hidróxidos (hidróxido de sódio, hidróxido de cálcio); tratamento térmico; oxidação úmida, pela utilização de solventes orgânicos, enzimas ou o uso combinado desses métodos.

A parte sólida, obtida com o pré-tratamento, contem celulose e a fiação líquida contem hidrolisados de hemicelulose. Essa parte sólida é então hidrolisada por enzimas ou ácidos, o caldo é fermentado e os açúcares provenientes da hidrólise da celulose transformados em álcool.

Outro modo de se produzir etanol celulósico possui as mesmas etapas que o processo descrito acima, porém a sacarificação e a fermentação ocorrem simultaneamente, a fim de aumentar o rendimento do processo e diminuir os custos com manutenção de equipamentos. Esse processo é denominado Sacarificação e Fermentação Simultâneas (SSF).

Nos dois processos descritos a conversão da celulose a glicose ocorre de 12 a 96 horas. Esse tempo propicia o crescimento de bactérias contaminantes, que consomem a glicose formada diminuindo o rendimento e causando problemas na fermentação posterior. Por isso se faz necessário o uso de um antimicrobiano eficaz contra as bactérias e inerte à levedura. O antimicrobiano também deve ser resistente aos inibidores gerados durante o pré-tratamento da matéria-prima lignocelulósica (furfural, hidroximetilfurfural, ácidos de cadeias curtas). O Biocida em questão também pode ser aplicado para etanol para consumo humano. A bebida alcoólica mais consumida no Brasil é a cerveja. Para fabricação da cerveja algumas etapas são necessárias com o objetivo de produzir um mosto rico em açúcares e aminoácidos que será fermentado. As etapas da fabricação de cerveja são:

- moagem do malte;

- mosturação;

- fervura;

- fermentação;

- maturação;

- filtração, e

- envase.

As etapas da fermentação de caldo de cana para produção de cachaça são:

- moagem (a fim de obter o caldo);

- tratamento do caldo (cal, sulfito, H ₂ SO ₄ );

- pré-evaporação;

- preparo do mosto;

- fermentação;

- centrifugação, e

- destilação.

O processo de fermentação não é asséptico, e, portanto muito susceptível à contaminação microbiana.

O controle da contaminação em fabricas de etanol proveniente tanto de cana quanto de amido pode ser realizado com o uso de antibióticos sintéticos, porém há uma necessidade do setor em não utilizar esses antibióticos uma vez que os mesmos deixam residual nos subprodutos que são usados para alimentação animal, humano ou usados como fertilizantes nas plantações, que é um subproduto com alto valor agregado.

O principal subproduto da indústria sucroalcoleira (cana) é a levedura. A restrição do uso de antibióticos é válida, pois essas leveduras secas, extratos de levedura, e outros produtos provenientes da levedura são utilizados em alimentação animal e em alguns casos humana.

O principal subproduto da indústria de etanol de amido é um resíduo sólido que é bastante utilizado para alimentação animal, portanto também necessita ser livre de antibióticos.

Outra vantagem do biocida natural em relação aos antibióticos sintéticos é o não desenvolvimento de resistência das bactérias ao composto, podendo ser usado constantemente sem perda da ação.

A PI0705512-9 A2 reivindica, além do processo de produção da nisina, o uso da molécula em conjunto com EDTA, lisozima e Tween 80 nas etapas de moagem da cana e fermentação do mosto.

A presente invenção difere da PI0705512-9 A2, citada anteriormente, pois considera, além das interações entre os ingredientes citados, os pontos de dosagem, já que o biocida em questão pode precisar de condições extremas para ação (concentração de açúcares, presença de inibidores na matéria-prima, pH, temperatura, concentração de sólidos totais e quantidade de água no meio de fermentação).

O objetivo do biocida é controlar a proliferação de microrganismos prejudiciais ao processo fermentativo, tanto de cana, amido e outros açúcares.

O biocida é composto na sua maioria de polilisina (10 a 100%) podendo conter os aditivos lisozima (l a 10%), glicose oxidase (l a 10%), alfa e beta ácidos do lúpulo (l a 20%), sulfito de sódio (10 a 90%), EDTA (até 90%) e nisina (l a 10%), dependendo do processo a ser controlado. O biocida tem ação principal contra bactérias Gram positivas, mas também atua em Gram negativas.

O biocida é resistente ao ácido (pH 2,0) e aquecimento (105 °C), pois no processo de fermentação esses parâmetros são importantes.

Em usinas de cana, os pontos de dosagem ideais para o biocida em questão são:

1. na água da moenda (5 a 80 ppm em relação ao volume de agua);

2. no tanque de decantação (5 a 80 ppm em relação ao caldo);

3. no fermentador - dorna de fermentação (5 a 80 ppm em relação ao caldo), e

4. na cuba de tratamento do fermento antes da fermentação (5 a 80 ppm em relação ao volume total da dorna).

O biocida pode ser dosado nos pontos isolados (1 ou 2 ou 3 ou 4) ou combinados nos pontos (1 e 2; 1 e 3; 1 e 4; 2 e 3; 2 e 4; 3 e 4; 1, 2 e 3; 1, 2 e 4; 1, 3 e 4; 2, 3 e 4; 1, 2, 3 e 4), com doses menores ao longo da fermentação (1 a 40 ppm) para manter a contaminação baixa.

No processo de fermentação fontes amiláceas (milho, sorgo, trigo, cevada, batata, mandioca, arroz, malte, uvas, sucos e frutas diversas), o biocida pode ser dosado:

1. na liquefação (5 a 80 ppm), e

2. no mosto na dorna de fermentação (5 a 80 ppm), com doses menores ao longo da fermentação (1 a 40 ppm) para manter a contaminação baixa.

O biocida pode ser dosado nos pontos isolados (1 ou 2) ou combinados nos pontos (1 e 2).

No processo de fermentação de fontes lignocelulósicas o biocida pode ser dosado: 1. durante a hidrólise da celulose, hemicelulose, lignina (5 a 100 ppm), e

2. durante a fermentação (5 a 100 ppm).

O biocida pode ser dosado nos pontos isolados (1 ou 2) ou combinados nos pontos (1 e 2), quando ocorrer o processo de sacarificação e fermentação simultânea.

Para produção de cerveja o biocida pode ser dosado:

1. na mostura (5 a 80 ppm);

2. na fermentação (5 a 80 ppm), e

3. na maturação (5 a 80 ppm).

O biocida pode ser dosado nos pontos isolados (1, 2 ou 3) ou combinados nos pontos (l, 2 e 3; 1 e 3; 2 e 3).

Na produção de cachaça, as etapas são similares as da fermentação de caldo de cana. Os pontos de dosagem são:

1. na água da moenda;

2. no tanque de decantação, e

3. no dorna de fermentação.

O biocida pode ser dosado nos pontos isolados (1, 2 ou 3) ou combinados nos pontos (1, 2 e 3; 1 e 3; 2 e 3).

Alguns testes industriais foram feitos para demonstrar a eficácia dessas bacteriocinas em usinas de cana de açúcar, e os resultados demonstraram uma rápida diminuição na população bacteriana, dentre os efeitos, podemos destacar a diminuição de 48,46% de Lactobacillus fermentum; 84,38% de L. plantarum; 93,86% de L. casei; 77,21% de Bacillus subtilis, e 55,11% de Acetobacter pasteurianus.