Hersteller biochemischer Reagenzien bieten eine Vielzahl von Enzymen für die unterschiedlichsten Anwendungszwecke an, wobei diese Enzyme allgemein in Form stabilisierter Lösungen vertrieben werden, die von Anbieter zu Anbieter unterschiedliche Mengen an Zusätzen wie z. B. Bovines Serum Albumin (BSA) oder Tenside enthalten können.

Es hat sich nunmehr gezeigt, daß die kommerziell erhältlichen Enzymlösungen in manchen Anwendungsbereichen nicht ohne weiteres in dieser Form einsetzbar sind. So wurde zum Beispiel festge- stellt, daß beim Dosieren von Enzymlösungen zu einem Substrat- haltigen Reaktionspuffer in hohen Verdünnungen (1 : 500, 1 : 1000

oder mehr) ein beträchtlicher Teil an Enzymaktivität verloren- geht, was zu einer Verlangsamung der Enzymreaktion führt.

Häufig wird das Enzym vollständig inaktiviert, und es erfolgt keine Umsetzung. Ferner können die derzeit erhältlichen Enzymlösungen ebenfalls nicht mit dem Mikrodosiersystem der DE 197 37 173 Al dosiert werden, da es wegen der hohen Geschwindigkeit des Konzentrationsausgleichs zwischen Enzympuf- fer und Reaktionspuffer im Enzymmolekül zu teilweise beträcht- lichen Aktivitätsverlusten bzw. zur Enzym-Denaturierung kommt.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, ein Verfahren zur Dosierung von Enzymen in hohen Verdünnungen oder unter Verwendung des obengenannten Mikrodosiersystems zur Verfügung zu stellen, bei dem Verluste der Enzymaktivität ganz oder zumindest weitgehend vermieden werden.

Die Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß man die Enzyme in Gegenwart einer bestimmten Mindestmenge nichtionoge- ner Tenside dosiert.

Der Erfindung liegt die Erkenntnis zugrunde, daß bei Dosierung von Enzymen in hohen Verdünnungen (1 : 500 oder mehr) und/oder unter Verwendung des obengenannten Mikrodosiersystems ein bestimmter Mindestgehalt an nichtionogenem Tensid in der Enzymlösung oder in der Reaktionslösung erforderlich ist, um ein Denaturieren des Enzyms und den damit einhergehenden Aktivitätsverlust zu verhindern. Es hat sich gezeigt, daß Enzymlösungen mit mindestens 0, 2 % (w/v) Tensid, vorzugsweise mindestens 0, 4 % (w/v) Tensid, die der Erfindung zugrundelie- gende Aufgabe lösen. Der notwendige Mindestgehalt an Tensid liegt bei (Restriktions-) Enzymlösungen in der Regel über demjenigen kommerziell erhältlicher Enzymlösungen. Lediglich in einigen wenigen Fällen werden von einzelnen Herstellern bereits jetzt Enzymlösungen vertrieben (wie z. B. Ddel, EcoRl, Pvul, Sspl oder Thal von Gibco oder Notl von Stratagene), die

für die genannten Zwecke ausreichende Tensidmengen enthalten.

Andere Hersteller bieten diese Enzyme jedoch in der Regel mit voneinander abweichenden und für die Dosierung in hohen Verdünnungen oder unter Verwendung des Mikrodosiersystems gemäß DE 197 37 173 A1 unzureichenden Tensidgehalten an. Ein Zusammenhang zwischen einer bestimmten Mindest-Tensidmenge in der Enzymlösung und/oder dem verwendeten Reaktionspuffer und der Vermeidung einer Enzymdenaturierung bzw. eines Aktivitäts- verlusts des Enzyms wurde im Stand der Technik für die genannten Anwendungen bislang nicht erkannt. Nichtionogene Tenside werden daher bislang in variierenden Mengen bei der kommerziellen Herstellung von Enzymlösungen verwendet und dienen lediglich der Verbesserung der Enzym-Löslichkeit (vgl.

Ullmann-Enzyklopädie der Technischen Chemie, Band 10, "Enzyme").

Die vorliegende Erfindung betrifft somit die Verwendung nichtionogener Tenside (s. o.) zur Durchführung einer enzymati- schen Reaktion, bei der man Enzym in einer Verdünnung von 1 : 500 oder mehr und/oder mit Hilfe des Milcrodosiersystems gemäß DE 197 37 173 A1 zudosiert, bei der man vor der Reaktion entweder die Enzymlösung mit nichtionogenem Tensid in einem Anteil von mindestens 0, 2 % (w/v) (vorzugsweise 0, 4 % oder mehr) oder den Reaktionspuffer mit nichtionogenem Tensid in einem Anteil von mehr als 0, 0001 % (w/v), vorzugsweise minde- stens 0, 02 % (w/v) und besonders bevorzugt mindestens 0, 04 % (w/v), versetzt.

Gemäß einem Teilaspekt der Erfindung wird eine Tensid-haltige Enzymlösung zur Verfügung gestellt, die einen Gehalt von minde- stens 0, 2 % (w/v) (vorzugsweise 0, 4 % oder mehr) nichtionogenem Tensid aufweist. Gemäß einer besonderen Ausführungsform handelt es sich bei den Enzymen um Restriktionsenzyme, es kommen aber auch thermostabile Enzyme in Betracht, wie z. B. Polymerasen, insbesondere Taq-Polymerase, pfu-Polymerase und Vent-DNA- Polymerase. Das nichtionogene Tensid wird vorzugsweise aus der

Gruppe bestehend aus 4- (1, 1, 3, 3-Tetramethylbutyl) phenol (Triton X-100), Benzyltrimethylammoniumhydroxid (Triton# B), Ethylphenol-Polyethylenglykolether (Nonidet P40) oder Poly- oxyethylenderivaten von Fettsäureestern mit Zuckeralkoholen (wie zum Beispiel Polysorbat ; Tween), ausgewählt. Erfindungs- gemäß ausgenommen sind Lösungen von Ddel, EcoRl, Notl, Pvul, Sspl oder Thal mit 0, 2 % (w/v) Tritron# X-100 sowie Polymerasen mit 0, 5 % (w/v) Tween 20, Triton X-100 oder Nonidet~ P40.

Rahmen der vorliegenden Erfindung sind Enzymlösungen mit einem Gehalt von mindestens 1 % (w/v), insbesondere aber von mindestens 2 % (w/v) nichtionogenen Tensiden bevorzugt.

Die erfindungsgemäßen Enzymlösungen weisen überraschenderweise den Vorteil auf, daß sie in einem Verdünnungsverhältnis von 1 : 500 oder mehr zu einer Substrat-haltigen Reaktionslösung zudosiert werden können, ohne daß es zu einer Inaktivierung bzw. Denaturierung des Enzyms und damit zu einem Verlust an Enzymaktivität kommt. Die Enzymlösungen können in ebenso vorteilhafter Weise zum Dosieren mit Hilfe des Mikrodosiersy- stems gemäß DE 197 37 173 Al verwendet werden.

Die vorliegende Erfindung betrifft daher ferner ein Verfahren zur Durchführung einer enzymatischen Reaktion, bei der man eine Enzymlösung in einer Verdünnung von mindestens 1 : 500 (d. h. in einer Verdünnung von 1 : 500 oder in einer höheren Ver- dünnung, wie z. B. 1 : 1000) zu einer Substratlösung hinzugibt, indem man eine Enzymlösung verwendet, die mindestens 0, 2 % (w/v), vorzugsweise mindestens 0, 4 % (w/v), nichtionogenes Tensid enthält, wobei Lösungen von Ddel, EcoRl, Notl, Pvul, Sspl oder Thal mit 0, 2 % (w/v) (Triton# X-100) und Lösungen von Polymerasen mit 0, 5 % (w/v) Tween 20, TritonCX-lOO oder Nonidet P40 ausgenommen sind.

Ferner betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Dosieren von Enzymlösungen mit Hilfe des Mikrodosiersystems gemäß DE

197 37 173 A1, bei dem man die oben genannten Enzymlösungen einsetzt.

Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung gewonnene Erkenntnis, daß sich Enzyme beim Dosieren in einem Verdünnungsverhältnis von mindestens 1 : 500 und/oder mit dem o. g. Mikrodosiersystem auch dadurch stabilisieren lassen, daß man dem Reaktionspuffer (anstelle der Enzymlösung), d. h. der Substrat-haltigen Reaktionslösung, nichtionogenes Tensid zugibt (s. o.), ist insofern von großer praktischer Bedeutung, als im Stand der Technik viele Enzymlösungen vertrieben werden ohne Angabe, wie ein Denaturieren oder ein Aktivitätsverlust z. B. beim Dosieren des Enzyms in einem Verdünnungsverhältnis von 1 : 500 oder mehr vermieden werden kann. Andererseits werden Reaktionspuffern zum Teil Tenside zugesetzt, wobei in diesen Fällen von den lösungsvermittelnden Eigenschaften der Tenside Gebrauch gemacht wird (s. o.). Die Verwendung von Reaktionspuffern mit einem Gehalt von mehr als 0, 0001 % (w/v), vorzugsweise mindestens 0, 02 % (w/v) und besonders bevorzugt mindestens 0, 04 % (w/v), nichtionogenem Tensid (bzw. die Verwendung nichtionogener Tenside als solches) zur Durchführung einer enzymatischen Reaktion, bei der man Enzym in einer Verdünnung von 1 : 500 oder mehr und/oder mit Hilfe des Mikrodosiersystems gemäß DE 197 37 173 A1 zum Reaktionspuffer zudosiert, ist im Stand der Technik weder offenbart noch nahegelegt.

Gegenstand der Erfindung ist somit ferner die Verwendung eines Reaktionspuffers, der mindestens 0, 0001 % (w/v), vorzugsweise mindestens 0, 02 % (w/v) und besonders bevorzugt mindestens 0, 04 % (w/v), nichtionogenes Tensid enthält, zur Durchführung einer enzymatischen Reaktion, bei der man Enzym (s. o.) in einer Ver- dünnung von mindestens 1 : 500 und/oder mit Hilfe des Mikrodo- siersystems gemäß DE 197 37 173 A1 zudosiert.

Erfindungsgemäß eingeschlossen ist auch ein Verfahren zur Durchführung einer enzymatischen Reaktion, bei der man eine

Enzymlösung in einer Verdünnung von 1 : 500 oder in einer höheren Verdünnung (z. B. 1 : 1000) zu einer Substratlösung bzw. einem Reaktionspuffer zugibt, der mehr als 0, 0001 % (w/v), insbesondere mindestens 0, 02 % (w/v) und besonders bevorzugt mindestens 0, 04 % (w/v), nichtionogenes Tensid (s. o.) enthält.

Polyoxyethylenderivate von Fettsäureestern mit Zuckeralkoholen, (ri wie zum Beispiel Polysorbat (Tween~), sind besonders bevorzugt.

Die Dosierung des Enzyms kann mit konventionellen Techniken oder mit Hilfe des Mikrodosiersystems gemäß DE 197 37 173 Al erfolgen. Es ist selbstverständlich auch möglich, eine Tensid- haltige Enzymlösung zu einer Tensid-haltigen Substratlösung (Reaktionspuffer) zu dosieren.

Die vorliegende Erfindung betrifft ferner einen (Substrat- freien) Reaktionspuffer, der mindestens 0, 04 % (w/v) nichtiono- genes Tensid, vorzugsweise Polyoxyethylenderivate von Fett- säureestern mit Zuckeralkoholen wie zum Beispiel Polysorbat (Tween), enthält.

Die vorliegende Erfindung wird nachfolgend anhand von Bei- spielen beschrieben.

BEISPIELE Mit Hilfe des Restriktionsenzyms EcoRl wurden anhand einer Dosierung im Verdünnungsverhältnis 1 : 500 enzymatische Reak- tionen mit ADNA durchgeführt, wobei EcoRl in der Lage ist, die ADNA in fünf Fragmente zu zerlegen, die gelelektrophoretisch aufgetrennt und mit herkömmlichen Methoden nachgewiesen werden können.

Die mit verschiedenen Anteilen an nichtionogenen Tensiden (entweder als Zusatz zur Enzymlösung oder als Zusatz zum Reaktionspuffer) erhaltenen Ergebnisse sind nachfolgend anhand der Figuren 1 bis 9 dargestellt, wobei die Reaktionsbedingungen jeweils in der Legende zu den Figuren angegeben sind.

Fig. 1 : 1 Hl Enzymlösung EcoRl (10 U/µl) in 499 l Reak- tionspuffer (Tris-HCl 50 mM, MgCl2, 10 mM, NaCl 100 mM, Dithioerythritol 1 mM, pH 7, 5 bei 37 °C), enthaltend 10 pg A-DNA.

Das Enzym wird nahezu vollständig zerstört.

Zeitpunkt des Abbruchs der Reaktion : Bahn 1-10 = 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120 Minuten Fig. 2 : 1 µl Enzymlösung EcoRl + 9 µl Verdünnungslösung (Tris-HCl 20 mM, KCl 500 mM, EDTA 1 mM, Dithioery- thritol 1 mM, Thesit 0, 05 %, Glycerin 50 %) in 490 Vl Reaktionspuffer (s. o.), enthaltend 10 DNA.

Das Substrat wird in zu erwartender Geschwindig- keit abgebaut.

Zeitpunkt des Abbruchs der Reaktion : Bahn 1-10 = 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60 Minuten Fig. 3 : 1 µl Enzymlösung + Gemisch aus 490 µl Reaktions- puffer + 9 Hl Verdünnungslösung, Gemisch enthält 10 ng X-DNA.

Das Substrat wird in befriedigender Geschwindig- keit, jedoch langsamer abgebaut.

Zeitpunkt des Abbruchs der Reaktion : Bahn 1-10 = 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60 Minuten

Fig. 4 : 1 Ml EcoRl mit 10 % Tween 20 + Gemisch aus 490 ul Reaktionspuffer + 9 ul Verdünnungslösung, Gemisch enthält 10 ug A-DNA.

Das Substrat wird noch schneller als in Versuch 2 (Fig. 2) abgebaut.

Zeitpunkt des Abbruchs der Reaktion : Bahn 1 - 10 = 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60 Minuten Fig. 5 : 1 l EcoRl mit 10 % Tween 20 + und 499 pl Reak- tionspuffer, enthaltend 10 g #-DNA (ähnlich dem in Fig. 4 dargestellten Versuch, jedoch ohne Verdünnungspuffer).

Das Substrat wird in zu erwartender Geschwindig- keit abgebaut.

Zeitpunkt des Abbruchs der Reaktion : Bahn 1-10 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 120 Minuten Fig. 6 : 1 ul EcoRl und 499 pl Reaktionspuffer, enthaltend 0, 02 % Tween und 10 µg A-DNA.

Das Substrat wird mindestens ebenso schnell wie bei dem Versuch gemäß Fig. 5 abgebaut.

Zeitpunkt des Abbruchs der Reaktion : Bahn 1 - 10 = 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 120 Minuten

Fig. 7 : EcoRl, gemischt mit verschiedenen Mengen Tween 20, so daß Enzymlösungen mit folgendem Tween-Gehalt entstehen. Je 1 pl dieser Verdünnun- gen in 499 µl Reaktionspuffer enthaltend 10 Mg A- DNA.

Bahn 1+2 : EcoRl mit 10 % Tween 20 (wie oben). Abbruch nach 20 und 60 Mi- nuten.

Bahn 3+4 : EcoRl mit 2 % Tween 20 (wie oben). Abbruch nach 20 und 60 Mi- nuten.

Bahn 5+6 : EcoRl mit 0, 5 % Tween 20. Abbruch nach 20 und 60 Minuten.

Bahn 7+8 : EcoRl mit 0, 1 % Tween 20. Abbruch nach 20 und 60 Minuten.

Bahn 9+10 : EcoRl ohne Tween 20. Abbruch nach 20 und 60 Minuten.

Deutlich ist zu erkennen, daß noch geringe Mengen Tween 20 (0, 1 %) in der Enzymlösung die Reaktion ermöglichen.

Fig. 8 : EcoRl, gemischt mit verschiedenen Mengen Tri- ton X-100, so daß Enzymlösungen mit folgendem Triton-Gehalt entstehen. Je 1 µl dieser Ver- dünnungen in 499 µl Reaktionspuffer enthaltend 10 µg A-DNA.

Bahn 1+2 : EcoRl mit 10 % Triton X-100. Ab- bruch nach 20 und 60 Minuten.

Bahn 3+4 : EcoRl mit 2 % Triton X-100. Ab- bruch nach 20 und 60 Minuten.

Bahn 5+6 : EcoRl mit 0, 5 % Triton X-100.

Abbruch nach 20 und 60 Minuten.

Bahn 7+8 : EcoRl mit 0, 1 % Triton X-100.

Abbruch nach 20 und 60 Minuten.

Bahn 9+10 : EcoRl ohne Triton X-100. Abbruch nach 20 und 60 Minuten.

Deutlich ist zu erkennen, daß TritonC X-lO0 die Reaktion zwar auch ermöglicht, jedoch in höherer Konzentration angewendet werden muß als Tween.

Fig. 9 : Denaturierungshemmende Wirkung von Tween 20.

Daß Tween in erster Linie die Denaturierung des Enzyms verhindert, zeigen folgende Versuche : Bahn 1-5 : EcoRl in Reaktionspuffer dosiert, der 0, 02 % Tween a 20 enthält, nor- maler Verdau von A-DNA. Abbruch nach 20, 30, 40, 60 Minuten.

Bahn 6-10 : EcoRl in Reaktionspuffer dosiert, dem 0, 02 % Tween 20 erst 20 Se- kunden danach zugegeben wurde.

Zeiten wie Bahn 1-5. Die Aktivi- tät des Enzyms ist bereits deut- lich vermindert.

Bahn 11-15 : Zugabe von Tween 20 20 Minuten später, Aktivität von EcoRl nahezu Null.

Bahn 16-20 : Ohne Zugabe von Tween 20.

Nach diesem Versuch verbessert Tween 20 nicht die Wirkung des Enzyms, sondern verhindert ein Denatu- rieren.