La présente invention est relative à une nouvelle enzyme impliquée dans la biosynthèse des acides mycoliques, et à son utilisation pour le criblage d'antibiotiques, notamment d'anti-mycobactériens.

Les acides mycoliques sont des acides gras à longue chaîne, a-alkylés et p-hydroxylés, présents sous forme d'esters dans les parois cellulaires de bactéries d'une lignée phylogénétique particulière des actinomycètes, le sous-ordre des Corynebacterineae, également dénommés « mycolatas », comprenant les genres bactériens : Mycobacterium, Corynebacterium, Rhodococcus, Nocardia, Gordona et Tsukamurella.

Parmi les mycolatas, on trouve des pathogènes majeurs, notamment les mycobactéries Mycobacterium tuberculosis, agent de la tuberculose, et Mycobacterium leprae, agent de la lèpre.

Depuis une quinzaine d'années, on observe une recrudescence de la tuberculose,'notamment dans les pays industrialisés. Ce phénomène est en partie lié à l'apparition de souches du bacille tuberculeux résistantes aux antibiotiques existants. Ainsi, la conception de nouveaux médicaments antituberculeux est redevenue une priorité importante.

Parmi les médicaments anti-tuberculeux les plus efficaces, se trouvent ceux qui interfèrent avec la biosynthèse de l'enveloppe des mycobactéries, tels que l'isoniazide, l'éthionamide et l'ethambutol (WEBB et al., Molecular Biology and Virulence 1 : 287-307 (eds.

Ratledge, C. & Dale, J. ) (Blackwell Science Ltd, Oxford), 1999). Les acides mycoliques représentent un constituant majeur de cette enveloppe. Il a été rapporté qu'ils intervenaient dans des fonctions biologiques importantes, participant notamment à la virulence bactérienne (GLICKMAN

et al., Mol. Cell 5 : 717-727,2000). Ils sont également impliqués dans la faible perméabilité de l'enveloppe des mycolatas, qui leur confère une résistance naturelle à de nombreux antibiotiques (JARLIER et al., J. Bacteriol.

172 : 1418-1423, 1990 ; BRENNAN et al., Annu. Rev.

Biochem. 64 : 29-63,1995 ; DAFE et DRAPER, Adv. Microb.

Physiol. 39 : 131-203,1998).

Les chaînes a et des acides mycoliques varient en longueur et en structure (Figure 1A), mais présentent un motif commun (motif mycolique :-CHOH-CHR2- COOH), ce qui suggère qu'une étape enzymatique impliquée dans la formation de ce motif est commune à toutes les mycolatas.

Selon un modèle généralement accepté actuellement (GASTAMBIDE-ODIER et al., Biochemische Zeitschift 333 : 285-295,1960), les dernières étapes de la biosynthèse des acides mycoliques consisteraient en une cascade de réactions (Figure 1B) : (1) activation de l'acyle pour former une molécule d'acyl-CoA catalysée par une acyl-CoA synthase ; (2) carboxylation d'une molécule d'acyl-CoA pour former une molécule d'acylmalonyl-CoA catalysée par une acyl-CoA carboxylase ; (3) condensation de type Claisen ou malonique d'une molécule d'acyl-CoA ou acyl-AMP et d'une molécule d'acylmalonyl-CoA pour former l'intermédiaire p-céto acyle, catalysée par une condensase ; (4) réduction de l'intermédiaire ß-céto acyle pour former l'acide mycolique catalysée par une réductase Le motif mycolique serait probablement formé lors de la réaction de condensation de type Claisen ou malonique. Toutefois, jusqu'à présent l'enzyme responsable de cette condensation n'avait pas été identifiée.

Cette réaction de condensation apparaît similaire à la condensation d'acyl-CoA avec le methylmalonyl-CoA qui intervient dans la formation d'acides gras ramifiés polyméthylés chez les mycobactéries (MATHUR et al., J. Biol. Chem. 267 : 19388-19395,1996 ; SIRAKOVA et al., J. Biol. Chem. 276 : 16833-16839,2001 ;

DUBEY et al., Mol. Microbiol. 45 : 1451-1459,2000), où elle est catalysée par des polykétides synthases (Pks) de type I.

Les Inventeurs ont émis l'hypothèse que la réaction de condensation conduisant aux acides mycoliques chez les mycolatas pourrait tre catalysée par une Pks de type I ayant une spécificité de substrat inhabituelle.

Pour vérifier cette hypothèse, ils ont d'abord recherché, à partir de séquences de mycolatas présentes dans les bases de données, s'il existait une Pks commune à ces bactéries et comprenant les domaines fonctionnels nécessaires à la réaction de condensation, à savoir. un domaine acyl transférase (AT), un domaine kétosynthase (KS), un domaine « acyl carrier protein » (ACP), et un domaine thioestérase (TE).

Ils ont ainsi identifié chez M. tuberculosis, un gène dénommé pksl3 codant pour une Pks de type I, ainsi que des orthologues de ce gène chez les autres mycobactéries, ainsi que chez les corynébactéries. Ces protéines possèdent de fortes similarités de séquence (70 à 80% d'identité sur toute la longueur de la protéine pour les différentes Pksl3 mycobactériennes et 40 à 50% d'identité entre Pksl3 de M. tuberculosis et Pksl3 de C. glutamicum ou C. diphteriae), et possèdent en outre les domaines, mentionnés ci-dessus, qui sont nécessaires à la réaction de condensation et au relargage du produit.

Ces protéines seront donc désignées ci-après sous le terme général « Pksl3 » Les Inventeurs ont en outre montré que l'inactivation du gène codant pour Pksl3 conduisait au blocage de la synthèse des acides mycoliques, et à une perte de la viabilité bactérienne.

En outre, ils ont produit et purifié la protéine Pksl3 sous forme recombinante.

Les résultats obtenus par les Inventeurs montrent que Pksl3 est la condensase intervenant dans la synthèse des acides mycoliques, et qu'il s'agit d'une

enzyme clé dans l'assemblage de l'enveloppe des mycolatas, et essentielle pour la viabilité des mycobactéries.

La présente invention a pour objet une protéine purifiée, dénommée Pksl3, impliquée dans la biosynthèse des acides mycoliques et possédant les caractéristiques suivantes : a) elle possède au moins 40% d'identité, de préférence au moins 50% d'identité, et de manière tout à fait préférée au moins 60% d'identité sur la totalité de sa séquence, avec la protéine Pksl3 de M. tuberculosis ; b) elle possède un domaine acyl transférase (pfam00698), un domaine kétoacylsynthase (pfam02801 ou pfamOO109), au moins un domaine acyl carrier protein (COG0331 ou COG0304,), et un domaine thioestérase (COG3319 ou pfam00975) c) elle catalyse une condensation de Claisen ou malonique entre une molécule d'acyl-CoA ou acyl-AMP et une molécule d'acylmalonyl-CoA.

Selon un mode de réalisation préféré de la présente invention, ladite protéine Pksl3 catalyse une condensation de Claisen entre : a) une molécule d'acyl-CoA de formule I, ou une molécule d'acyl-AMP de formule Ibis : dans laquelle R1 est une chaîne comprenant de 6 à 68 atomes de carbone, pouvant contenir une ou plusieurs doubles liaisons-C=C-, et/ou un ou plusieurs cycles cis/trans-cyclopropane, et/ou un ou plusieurs groupes et/ou pouvant porter un ou plusieurs groupes latéraux choisis parmi-CH3, =0,-0-CH3 ; et

b) une molécule d'acylmalonyl-CoA de formule II : dans laquelle R2 est un alcane linéaire comprenant de 10 à 24 atomes de carbone ; pour former un intermédiaire ß-céto acyle de formule III, ou un ß-céto ester de formule IIIbis : dans laquelle RI et R2 sont tels que définis ci-dessus, et Xi est une molécule acceptrice.

Des dispositions particulières de ce mode de réalisation sont les suivantes : - ladite protéine Pksl3 catalyse la formation d'un ß-céto acyle de formule III ou de (3-céto ester de formule IIIbis dans laquelle Ri comprend de 6-16 atomes de carbone et R2 comprend de 12 à 16 atomes de carbones.

Ladite protéine peut notamment tre obtenue à partir du genre Corynebacterium ; - ladite protéine Pksl3 catalyse la formation d'un (3-céto acyle de formule III ou de (3-céto ester de formule IIIbis dans laquelle Ri comprend de 28-48 atomes de carbone et R2 comprend de 14 à 16 atomes de carbones.

Ladite protéine peut notamment tre obtenue à partir du genre Gordona ; - ladite protéine Pksl3 catalyse la formation d'un (3-céto acyle de formule III ou de p-céto ester de formule IIIbis dans laquelle Ri comprend de 42 à 68 atomes de carbone et R2 comprend de 18 à 24 atomes de carbones.

Ladite protéine peut notamment tre obtenue à partir du genre Mycobacterium ; - ladite protéine Pksl3 catalyse la formation d'un ß-céto acyle de formule III ou de p-céto ester de formule IIIbis dans laquelle Ri comprend de 24 à 46 atomes de carbone et R2 comprend de 10 à 16 atomes de carbones.

Ladite protéine peut notamment tre obtenue à partir du genre Nocardia ; - ladite protéine Pksl3 catalyse la formation d'un P-céto acyle de formule III ou de p-céto ester de formule IIIbis dans laquelle Ri comprend de 14 à 34 atomes de carbone et R2 comprend de 10 à 16 atomes de carbones.

Ladite protéine peut notamment tre obtenue à partir du genre Rhodoccocus ; - ladite protéine Pksl3 catalyse la formation d'un p-céto acyle de formule III ou de ß-céto ester de formule IIIbis dans laquelle Ri comprend de 40 à 56 atomes de carbone et R2 comprend de 18 à 20 atomes de carbones.

Ladite protéine peut notamment tre obtenue à partir du genre Tsukamurella.

Selon un autre mode de réalisation préféré de la présente invention, ladite protéine Pksl3 possède au moins 70% d'identité avec la protéine Pksl3 de M. tuberculosis (SEQ ID NO : 1).

Selon encore un autre mode de réalisation de la présente invention, ladite protéine Pksl3 possède au moins 50% d'identité, de préférence au moins 60%, et de manière tout à fait préférée au moins 70% d'identité avec la protéine Pksl3 de Corynebacterium glutamicum (SEQ ID NO : 2).

La présente invention a également pour objet un vecteur d'expression, comprenant une séquence polynucléotidique codant pour une protéine Pksl3 conforme à l'invention, ainsi qu'une cellule-hôte, procaryote ou eucaryote, transformée par ledit vecteur d'expression.

La présente invention a également pour objet un procédé de production d'une protéine Pksl3 conforme à l'invention, caractérisé en ce qu'il comprend la mise en culture d'une cellule-hôte conforme à l'invention, et la purification de la protéine Pksl3 à partir de ladite culture.

La présente invention a également pour objet un procédé pour inhiber la biosynthèse de l'enveloppe des mycolatas, caractérisé en ce qu'il comprend l'inhibition de l'expression ou de l'activité de la protéine Pksl3 chez lesdites bactéries.

Du fait de son caractère essentiel pour la viabilité, et de sa spécificité d'action, la condensase Pksl3 constitue une excellente cible potentielle pour la conception de nouveaux médicaments, notamment de nouveaux antituberculeux.

La présente invention a en conséquence pour objet l'utilisation d'une condensase Pksl3 conforme à l'invention, pour le criblage d'antibiotiques actifs sur les mycolatas, et notamment sur les mycobactéries.

La présente invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples illustrant l'identification, la production, et la purification de la condensase Pksl3, ainsi que les effets de son inactivation sur la viabilité des mycolatas.

EXEMPLE 1 : IDENTIFICATION DE LA CONDENSASE PKS13 M. tuberculosis contient 16 Pks de type I parmi lesquelles 9 se retrouvent également chez M. leprae.

Parmi ces 9 enzymes putatives, 7 sont déjà connues pour leur implication dans la biosynthèse d'autres groupes de lipides chez M. tuberculosis (AZAD et al., J. Biol. Chem.

272 : 16741-16745, 1997 ; CONSTANT et al., J. Biol. Chem.

277 : 38148-38158,2002). Parmi les deux protéines candidates restantes, celle dénommée ML1229 présente la mme organisation de domaine ainsi que de fortes

similarités de séquences avec les Pks de type I de M. tuberculosis impliquées dans la biosynthèse des acides gras polyméthyl ramifiés. Le second candidat est dénommé Pksl3 dans M. tuberculosis et MLO101 dans M. leprae.

L'analyse de la séquence déduite de Pksl3 (Numéro d'accession NP 338459 ; 1733 acides aminés) de M. tuberculosis CDC1551 révèle la présence des différents domaines catalytiques nécessaires et suffisants pour la catalyse de la condensation de type Claisen intervenant dans la formation des acides mycoliques : deux domaines « Acyl carrier protein » (ACP) (acides aminés 39 à 107 et 1237 à 1287), un domaine « kétosynthase » (KS) (acides aminés 119 à 543), un domaine « acyl transférase » (AT) (acides aminés 640 à 1045), et un domaine « thioestérase » (TE) (acides aminés 1464 à 1543).

Des orthologues de ML1229 et Pksl3 ont été recherchés chez différentes espèces en utilisant le programme BLAST (ALTSCHUL et al., Nuceic Acid Res. 25 : 3389-3402,1997). Les séquences de différentes condensases putatives Pksl3 codées par le gène pksl3, « acyl-CoA synthase » FadD32 et « sous-unité de l'acyl-CoA carboxylase » AccD4 (codées respectivement par deux gènes fadD32 et accD4 flanquant le gène pskl3 chez toutes les corynébactéries et mycobactéries analysées, comme illustré dans la Figure 2), ont été comparées en utilisant le programme Needleman-Wunsh disponible sur le site web de l'Institut Pasteur http : //www. pasteur. fr.

Aucun orthologue de ML1229 n'a été identifié chez trois espèces de corynébactéries (C. glutamicum, C. efficiens et C. diphteriae) alors que des orthologues de Pksl3 (ML0101) ont été retrouvés chez les trois espèces de corynébactéries susmentionnées et chez trois autres espèces de mycobactéries (M. smegmatis, M. marinum et M. avium). Ces protéines Pksl3 contiennent les domaines catalytiques requis pour la condensation conduisant à la synthèse de l'acide mycolique, et les gènes correspondants sont localisés en aval de gènes connus pour leur

implication dans le transfert de l'acide mycolique sur l'arabinogalactane (PUECH et al., Mol. Microbiol. 44 : 1109-1122,2002). Les identités des séquences des protéines Pksl3 par rapport à la séquence complète de la Pksl3 de M. tuberculosis sont présentées dans le tableau 1 ci-dessous : Tableau 1 : : 73 \ zon , Û X S-SS. o. M. tuberculosis FadD32 93% 75% 93% 83% 40% 42% 42% Pks1383% 71% 84% 81% 44% 43% 44% AccD4 91 % 81 % 85% 80% 54% 52% 53% La présence de Pksl3 a également été mise en évidence dans d'autres espèces bactériennes produisant des acides mycoliques, en amplifiant par PCR un fragment interne de 1 kb de pksl3 à partir du génome de Nocardia astéroïdes ATCC19243, Rhodococcus rhodochrous ATCC13808 et Tsukamurella paurometabolum CIP100753T, en utilisant les amorces dégénérées suivantes : pksl3a : 5'-GCTGGARCTVACVTGGGARGC-3' (SEQ ID NO : 3) pksl3b : 5'-GTGSGCGTTGGYDCCRAAVCCGAA-3' (SEQ ID NO : 4) Les conditions de PCR sont : 2,5 unités de Taq polymérase (ROCHE MOLECULAR BIOCHEMICALS), 10% de diméthyl sulfoxyde (Me2SO), 1 mM de dNTP et 4 pM de chaque amorce dans un volume final de 50 p1, dans les conditions recommandées par le fournisseur (ROCHE MOLECULAR BIOCHEMICALS). Le programme d'amplification est : 5 min à 94°C, puis 35 cycles de 1 min à 94°C, 1 min à 58°C, 1 min 30 sec à 72°C, puis 1 cycle de 10 min à 72°C. Pour T. paurometabolum, les étapes à 58°C sont remplacées par des étapes à 50°C.

Les séquences de ces fragments présentent 40% d'identité sur toute leur longueur avec la Pksl3 de M.

tuberculosis, suggérant également la présence de pksl3 chez ces bactéries.

L'ensemble de ces résultats suggère que la protéine Pksl3 est retrouvée chez toutes les mycolatas produisant des acides mycoliques, et que parmi les Pks de type I, elle est la seule enzyme susceptible de catalyser la condensation des chaînes a et ß d'acides gras pour former les acides mycoliques.

EXEMPLE 2 : CLONAGE, SUREXPRESSION ET PURIFICATION DES PROTEINES PKS13 DE MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS ET CORYNEBACTERIUM GLUTAMICUM Construction des plasmides La souche de C. glutamicum ATCC13032 (DUSCH et al., Appl. Environ. Microbiol. 65 : 1530-1539,1999) est mise en culture sur un milieu BHI (DIFCO). La souche de M. tuberculosis H37Rv est mise en culture sur un milieu liquide Middlebrook 7H9 (DIFCO) additionné de 10% ADC (DIFCO) et de 0, 05% Tween 80.

Les milieux de culture sont additionnés de kanamycine, d'hygromycine, de chloramphénicol et de sucrose quand nécessaire à une concentration finale de 40 pg/ml, 50 pg/ml, 15 E. tg/ml et 10% (p/v), respectivement.

L'ADN bactérien total est extrait à partir de 5 ml de cultures liquides saturées comme décrit dans BELISLE et al., 1998. Les culots d'ADN sont re-suspendus dans 100 p1 de Tris 10 mM (pH 8).

Plasmides pWM35 et pWM36 Le gène pksl3 de M. tuberculosis est amplifié par PCR à partir de l'ADN total de la souche H37Rv et des amorces 13Rtb 5'-GAGGACATATGGCTGACGTAGCGGAATC-3' (SEQ ID NO : 5) et 13Stb 5'-CGGTGAAAGCTTCTGCTTGCCTACCTCACTTG-3' (SEQ ID NO 6), avec 2,5 unités d'ADN polymérase Pfu (PROMEGA, Lyon, France), 10% de diméthyl sulfoxyde (Me2SO), et 1 MM de chaque amorce dans un volume final de 50 jj. l, dans les conditions recommandées par le fournisseur (PROMEGA, Lyon, France). Le programme d'amplification

est : 5 min à 94°C, puis 30 cycles de 1 min à 94°C, 1 min à 57°C, 5 min à 72°C, puis 10 min à 72°C. Le produit d'amplification est purifié en utilisant le kit Qiaquick (QIAGEN, Courtaboeuf, France), puis digéré avec les enzymes de restriction Ndel/HindIII. Le fragment obtenu est inséré dans le vecteur pET26b (NOVAGEN), lui-mme coupé avec les enzymes de restriction Ndel/HindIII. Le plasmide résultant, dénommé pWM35, contient le gène pksl3 fusionné en 3'du gène à une étiquette formée de 18 nucléotides codant pour une séquence de 6 histidines.

Le gène pksl3 de M. tuberculosis est amplifié par PCR à partir de l'ADN total de la souche H37Rv et des amorces 13Rtb 5'-GAGGACATATGGCTGACGTAGCGGAATC-3' (SEQ ID NO : 5) et 13Ttb 5'-GCTCGGGGATCCTCACTGCTTGCCTACCTCAC-3' (SEQ ID NO 7), dans les mmes conditions que celles décrites ci-dessus. Le produit d'amplification est purifié comme décrit ci-dessus puis digéré avec les enzymes de restriction Ndel/BamHI. Le fragment obtenu est inséré dans le vecteur pET15b (NOVAGEN) préalablement coupé avec les enzymes de restriction Ndel/BamHI. Le plasmide résultant, pWM36, possède le gène pksl3 fusionné en 5'du gène à une étiquette de 18 nucléotides codant pour une séquence de 6 histidines.

Plasmide pWM38 Le gène pksl3 de C. glutamicum ATCC13032 est amplifié par PCR à partir de 1'ADN total de cette souche et des amorces 13Ccg 5'-AATATGACTAGTAGCCAATCGTCGGATCAGAAG- 3' (SEQ ID NO : 8) et 13Dcg 5'- AGCTCTAGATCTCTAATTCTTCCGAGAAATCTCAT-3' (SEQ ID NO 9), dans les mmes conditions que celles décrites ci-dessus.

Le produit d'amplification est purifié comme précédemment puis digéré avec les enzymes de restriction SpeI/BglII. Le fragment obtenu est inséré dans le vecteur pET15b modifié par insertion d'un site Spel à la place du site Xhol, puis coupé avec les enzymes de restriction SpeI/BamHI. Le plasmide résultant, pWM38, possède le gène pksl3 de C.

glutamicum fusionné à une étiquette de 18 nucléotides en 5'du gène codant pour une séquence de 6 histidines.

Surexpression des protéines Pksl3 de Mycobacterium tuberculosis et Corynebacterium glutamicum chez Escherichia coli Les plasmides pWM35, pWM36 et pWM38 sont transférés dans la souche d'Escherichia coli BL21 (DE3) : pLysS (NOVAGEN).

Les trois souches sont inoculées dans 3 ml de milieu LB contenant du chloramphénicol (30 jug/ml) et de la kanamycine (40 Ug/ml) ou de l'ampicilline (100 pg/ml) en fonction des plasmides. Les cultures sont incubées à 37°C sous agitation (250 tr/min) jusqu'à saturation.

Une dilution au 1/100ème de ces cultures est réalisée dans 200 ml de milieu LB contenant de la kanamycine ou de l'ampicilline. Ces nouvelles cultures sont incubées sous agitation à 37°C pendant 2h30 (DO600 = 0,7-0, 8). De l'isopropyl-thio-P-D-galactoside (IPTG) est ajouté à une concentration finale de 0,5 mM et la culture est incubée 3h à 30°C sous agitation.

Purification des protéines Pksl3 de Mycobacterium tuberculosis et Corynebacterium glutamicum Les cellules exprimant les différentes protéines Pksl3 sont culottées par centrifugation à 2500 g pendant 15 min, puis reprises dans 40 ml de tampon de charge (Tris-HCl 50 mM pH=7,5, Imidazole 5 mM, NaCl 300 mM). Les cellules sont congelées à-20°C pendant 15h, puis elles subissent 3 cycles de décongélation-congélation dans l'azote liquide. Elles sont ensuite soniquées 3 fois pendant 30 sec (Vibra-cell, BIOBLOCK SCIENTIFIC) (50% cycle actif et puissance de sortie 5), puis centrifugées pendant 30 min à 20000 g.

Le surnageant est filtré sur microfiltre (diamètre des pores : 0, 2 um) puis chargé sur une colonne « Cheating Sepharose Fast Flow » (AMERSHAM) en FPLC (BIORAD HP duoflow). La protéine est éluée par gradient de

5 à 150 mM d'Imidazole avec un pic d'élution à 90 mM. Les fractions enrichies en protéines sont mélangées, concentrées par filtration sur centripep 30 (AMICON), et la protéine est séparée des contaminants résiduels par chromatographie d'exclusion (S-200 16/60 mm, AMERSHAM) en FPLC.

En suivant cette procédure, environ 20 mg de protéines Pksl3 de M. tuberculosis ou de C. glutamicum sont obtenus.

EXEMPLE 3 : ANALYSE BIOCHIMIQUE DE MUTANTS Apksl3 DE CORYNEBACTERIUM GLUTAMICUM ET MYCOBACTERIUM SMEGMATIS La souche de C. glutamicum ATCC13032 est mise en culture comme précédemment décrit.

La souche de M. smegmatis mc2155 de type sauvage (SNAPPER et al., Mol. Microbiol. 4 : 1911-1919, 1990) est mise en culture sur un milieu ZB (DIFCO) supplémenté par 0, 05% de Tween 80 afin d'éviter l'agrégation.

Les milieux de culture sont additionnés de kanamycine, d'hygromycine, de chloramphénicol et de sucrose quand nécessaire à une concentration finale de 40 pg/ml, 50 pg/ml, 15 Mg/ml et 10% (p/v), respectivement.

L'ADN bactérien total est extrait à partir de 5 ml de culture liquide saturée comme décrit dans BELISLE et al., 1998. Le culot d'ADN est re-suspendu dans 100 l de Tris 10 mM (pH 8).

Construction d'un mutant de C. glutamicum Souche mutante JpJcsI3 de C. glutamicum Deux fragments d'ADN de 0,9 kb et 0,7 kb chevauchant le gène pksl3 sur ses extrémité 5'et 3'sont amplifiés par PCR à partir de l'ADN total de C. glutamicum en utilisant respectivement les couples d'amorces suivants : pkdel5 : 5'-GAAATCTCGAGCCACGGCGAAA-3' (Tm=54°C) (SEQ ID NO : 10) pkdel2 : 5'-ACGATTGCCGCGGTTCCATATTG-3' (Tm=54°C)

(SEQ ID NO : 11) et pkdel3 : 5'-CATCCTGTTCCGCGGAACGCATGC-3' (Tm=54°C) (SEQ ID NO : 12) pkdel4 : 5'-CAGCATGATGGAGATCTGAGGGC-3' (Tm=54°C) (SEQ ID NO : 13) Les conditions de PCR sont : 1 unité de Taq polymérase (ROCHE MOLECULAR BIOCHEMICALS), 2 mM MgCl2, 0,2 mM de dNTP et 0, 5 jiM de chaque amorce dans un volume final de 50 u. l, dans les conditions recommandées par le fournisseur (ROCHE MOLECULAR BIOCHEMICALS). Le programme d'amplification est : 2 min à 94°C, puis 35 cycles de 1 min à 94°C, 30 sec à 54°C, 1 min 30 sec à 72°C, puis 1 cycle de 10 min à 72°C.

Ces fragments sont insérés dans le plasmide pMCS5 (MOBITEC, Gôttingen, Allemagne). Une cassette de résistance à la kanamycine est insérée entre ces deux fragments PCR pour donner le plasmide pCMS5 : : pks. Ce plasmide est transféré dans la souche C. glutamicum et les transformants sont sélectionnés sur un milieu gélosé contenant de la kanamycine.

La Figure 3A présente schématiquement la structure génétique du locus pksl3 dans la souche de type sauvage (WT) et dans la souche mutante apksl3 de C. glutamicum. Dans cette dernière, l'allèle de type sauvage de pksl3 présent sur le chromosome est remplacé par un allèle muté contenant une délétion interne de 4,3 kb dans laquelle le gène km codant pour la kanamycine est inséré.

Les boîtes indiquent les différents gènes du locus pksl3.

La localisation et le nom des amorces utilisées pour l'analyse par PCR des souches mutantes sont indiqués par des ttes de flèche. Les produits d'amplification PCR attendus pour les différentes souches sont indiqués sous chaque structure génétique.

Les transformants Jpksl3 dans lesquels le remplacement allélique est intervenu entre le gène pksl3

chromosomique de type sauvage et l'allèle plasmidique muté présentent (1) un changement de morphologie des colonies passant d'un aspect brillant lisse à rugueux (2) une courbe de croissance considérablement diminuée (doublement du temps de division) par rapport au type sauvage (3) une thermosensibilité qui les rend incapables de croître à des températures supérieures à 30°C contrairement au type sauvage qui produit des colonies sur milieu gélosé jusqu'à 37°C (4) une forte agrégation en culture liquide en absence de détergent.

Ces transformants sont caractérisés par PCR en utilisant les amorces suivantes : fa2 : 5'-TCTGACCACCTTCCGTGAAGC-3' (Tm=55°C ou 62°C) (SEQ ID NO : 14) ac2 : 5'-GAACGAGTTCAGAGCTTC-3' (Tm=55°C ou 62°C) (SEQ ID NO : 15) K10 : 5'-TATTTCGAATGGTTCGCTGGGTTTATC-3' (Tm=55°C) (SEQ ID NO : 16) K7 : 5'-TAAAAAGCTTATCGATACCG-3' (Tm=55°C) (SEQ ID NO : 17) pkl : 5'-GCCGTGACGGTATCTCGG-3' (Tm=55°C) (SEQ ID NO : 18) pk2 : 5'-CCAGGGCAGTTGCTTCAATG-3' (Tm=55°C) (SEQ ID NO : 19) La Figure 3B présente les résultats d'analyse par PCR du mutant Spksl3 et de la souche de type sauvage (WT) de C. glutamicum.

Souche mutante pksl3 : pCGL2308 de C. glutamicum Un plasmide de complémentation, pCGL2308, est produit par l'insertion dans le vecteur pCGL482 (PEYRET et al., Mol. Microbiol. 9 : 97-109,1993) d'un fragment de 5,3 kb de C. glutamicum, comprenant le gène pksl3 et la région de 417 pb en amont de ce gène, obtenu par PCR à partir de l'ADN total de C. glutamicum en utilisant le couple d'amorces suivant : pk3 : 5'-TCCGGAAAGATCTCACGCCGCG-3' (Tm=62°C)

(SEQ ID NO : 20) pk4 : 5'-GCGTGCGCGCAGATCTGCTAGC-3' (Tm=62°C) (SEQ ID NO : 21) Le plasmide pCGL2308 résultant est transféré par électroporation dans la souche Apksl3 de C. glutamicum et les transformants pksl3 : pCGL2308 sont sélectionnés sur milieu gélosé contenant de la kanamycine.

Les transformants Spksl3 : pCGL2308 présentent une morphologie brillante et lisse, une vitesse de croissance intermédiaire entre la souche sauvage et la souche mutante, une incapacité à pousser à des températures supérieures à 32°C (alors que la souche sauvage pousse à 37°C), ainsi qu'une teneur en acide mycolique beaucoup plus faible que celle de la souche sauvage.

Il apparaît donc que la complémentation par le plasmide induit une réversion partielle vers le phénotype sauvage.

Construction d'un mutant conditionnel de M. smegmatis Souche mutante PMM47 de M. smegmatis Deux fragments d'ADN d'environ 1 kb chevauchant le gène pksl3 sur ses extrémités 5'et 3'sont amplifiés par PCR à partir de l'ADN total de M. smegmatis en utilisant respectivement les couples d'amorces suivants : 13F : 5'-GCTCTAGAGTTTAAACGCTGGACCTGTCCAACGTCAAGG-3' (SEQ ID NO : 22) 13G : 5'-GGACTAGTCGTCGAAACCGACCGTCACCAG-3' (SEQ ID NO : 23) et 13H : 5'-GGACTAGTCGGCATCTTCAACGAGTTGC-3' (SEQ ID NO : 24) 13I : 5'-CCCAAGCTTGTTTAAACTTGTCGAAGTGGTTCGACGG-3' (SEQ ID NO : 25) Les conditions de PCR sont : 3 unités de polymérase Pfu (PROMEGA, Lyon, France), 10% de diméthyl

sulfoxyde (Me2SO), 1 mM de dNTP et 1 tM de chaque amorce dans un volume final de 50 pilz dans les conditions recommandées par le fournisseur (PROMEGA, Lyon, France).

Le programme d'amplification est : 5 min à 94°C, puis 30 cycles de 1 min à 94°C, 1 min à 58°C, 3 min à 72°C, puis 1 cycle de 10 min à 72°C.

Ces fragments sont insérés dans le plasmide pJQ200 (QUANDT et al., Gene 127 : 15-21,1993). Une cassette de résistance à l'hygromycine est insérée entre ces deux fragments PCR pour donner le plasmide pDP28. Ce plasmide non réplicatif contenant le marqueur sacB et une copie de l'allèle muté pksl3 : : hyg est transféré dans la souche M. smegmatis par électroporation et les transformants sont sélectionnés sur milieu gélosé contenant de l'hygromycine.

Les transformants ayant intégré le plasmide pDP28 par simple recombinaison entre les copies du type sauvage et muté du gène pksl3 sont caractérisés par PCR en utilisant les amorces suivantes : 13J : 5'-CTTCCACGACATGGTCTGAT-3' (SEQ ID NO : 26) 13K : 5'-CACGATCGAGTCGAGCTCGA-3' (SEQ ID NO : 27) H1 :5'-AGCACCAGCGGTTCGCCGT-3' (SEQ ID NO : 28) H2 : 5'-TGCACGACTTCGAGGTGTTCG-3' (SEQ ID NO : 29) Les conditions de PCR sont : 2,5 unités de Taq polymérase (ROCHE MOLECULAR BIOCHEMICALS), 10% de diméthyl sulfoxyde (Me2SO), 1 mM de dNTP et 1 jiM de chaque amorce dans un volume final de 50 ul, dans les conditions recommandées par le fournisseur (ROCHE MOLECULAR BIOCHEMICALS). Le programme d'amplification est : 5 min à 94°C, puis 30 cycles de 1 min à 94°C, 1 min à 62°C, 2 min 30 sec à 72°C, puis 1 cycle de 10 min à 72°C. Une souche dénommée PMM47 de M. smegmatis est sélectionnée, dans laquelle le plasmide pDP28 s'est inséré au locus pksl3 par simple recombinaison. Des étalements à différentes températures (25°C, 32°C ou 37°C) d'une culture de PMM47, sur un milieu contenant 10% de sucrose et de l'hygromycine produit des clones avec une mutation dans le gène sacB

mais aucun événement de seconde recombinaison pouvant produire une souche portant seulement l'allèle muté pksl3 : : hyg n'est sélectionné.

Ce résultat indique que le gène pksl3 est essentiel pour la croissance des mycobactéries. Afin de confirmer cette hypothèse, une seconde copie du gène pksl3 de type sauvage est transférée dans PMM47 clonée sur un vecteur mycobactérien thermosensible.

Souche mutante thermosensible PMM48 : pDP32 de M. smegmatis Pour produire le plasmide de complémentation pDP32, le gène pksl3 est amplifié par PCR à partir de l'ADN total de M. smegmatis en utilisant les amorces 13R 5'-ATGAGATCTGATGAAAACCACAGCGAT-3' (SEQ ID NO 30) et 13P 5'-GGACTAGTCTTGGCGACGGCCTTCTCAC-3' (SEQ ID NO 31).

Les conditions de PCR sont : 3 unités d'ADN polymérase Pfu (PROMEGA, Lyon, France), 10% de diméthyl sulfoxyde (Me2SO), 1 mM de DNTP, et zip de chaque amorce dans un volume final de 50 jn. l, dans les conditions recommandées par le fournisseur (PROMEGA, Lyon, France).

Le programme d'amplification est : 5 min à 94°C, puis 30 cycles de 1 min à 94°C, 1 min à 58°C, 5 min à 72°C, puis 10 min à 72°C.

Le gène pksl3 est inséré dans un plasmide mycobactérien thermosensible dérivé du plasmide pCG63 (GUILHOT et al., FEMS Microbiol. Letter 98 : 181-186, 1992) et contenant une cassette d'expression mycobactérienne, avec un promoteur mycobactérien, pBlaF*, en amont d'un site multiple de clonage lui-mme en amont d'un terminateur de transcription (LE DANTEC et al., J.

Bacteriol. 183 : 2157-2164, 2001). Le plasmide pDP32 résultant est transféré par électroporation dans la souche PMM47 de M. smegmatis et les transformants sont sélectionnés sur milieu gélosé contenant de la kanamycine et de l'hygromycine. La seconde recombinaison au locus chromosomique pksl3 est sélectionnée par étalement d'une culture liquide de ces transformants à 30°C sur milieu

gélosé contenant de la kanamycine, de l'hygromycine et du sucrose à 30°C. Les colonies sont criblées par PCR en utilisant les amorces suivantes : 13J : 5'-CTTCCACGACATGGTCTGAT-3' (SEQ ID NO : 26) 13K : 5'-CACGATCGAGTCGAGCTCGA-3' (SEQ ID NO : 27) H1 :5'-AGCACCAGCGGTTCGCCGT-3' (SEQ ID NO : 28) H2 : 5'-TGCACGACTTCGAGGTGTTCG-3' (SEQ ID NO : 29) Les conditions de PCR sont : 2,5 unités de Taq polymérase (ROCHE MOLECULAR BIOCHEMICALS), 10% de diméthyl sulfoxyde (Me2SO), 1 mM de dNTP et 1 MM de chaque amorce dans un volume final de 50 p1, dans les conditions recommandées par le fournisseur (ROCHE MOLECULAR BIOCHEMICALS). Le programme d'amplification est : 5 min à 94°C, puis 30 cycles de 1 min à 94°C, 1 min à 62°C, 2 min 30 sec à 72°C, puis 1 cycle de 10 min à 72°C.

La Figure 4A présente schématiquement la structure génétique du locus pksl3 obtenu au cours de la construction du mutant conditionnel PMM48 : pDP32 de M. smegmatis. Les boîtes indiquent les différents gènes du locus pksl 3. La localisation et le nom des amorces utilisées pour l'analyse par PCR des souches mutantes sont indiqués par des ttes de flèche. Les produits d'amplification PCR attendus pour les différentes souches sont indiqués sous chaque structure génétique.

La Figure 4B présente les résultats d'analyse par PCR du mutant conditionnel PMM48 : pDP32 de M. smegmatis et de ses souches parentales PMM47 et mu2155 (WT).

En utilisant ces conditions, 8% des colonies sélectionnées HygR, KmR, SucR sont le résultat d'un échange allélique ; les autres clones étant le résultat d'une mutation du gène sack.

La souche dénommée PMM48 : pDP32, dans laquelle la copie chromosomique de type sauvage du gène pksl3 est remplacée par l'allèle muté pks : : hyg et une copie du gène pksl3 fonctionnelle se trouve sur un plasmide thermosensible, est sélectionnée pour une analyse

phénotypique. Les résultats sont représentés dans la Figure 4C.

Légende de la Figure 4C : souche recombinante PMM48 : pDP32 de M. smegmatis = souche de type sauvage (WT) Des étalements de cette souche recombinante sur milieu gélosé contenant de l'hygromycine à 32°C ou 42°C révèlent qu'elle est incapable de former des colonies à température élevée. En culture liquide à 32°C, cette souche croît aussi vite que la souche de type sauvage, une température permissive pour le plasmide pDP32. Cependant, lorsque la culture est placée à 42°C, une température non permissive pour le plasmide pDP32, le nombre de bactéries viables augmente jusqu'au temps 12h à 24h post- inoculation, puis demeure stable au cours des 24 heures suivantes avant de décroître ; les seules bactéries viables sont celles qui ont conservé une copie du plasmide de complémentation.

Ces résultats montrent que le gène pksl3 est essentiel pour la survie de M. smegmatis, comme attendu d'un gène codant pour une enzyme impliquée dans la biosynthèse des acides mycoliques.

Analyse biochimique des mutants Xpksl3 de C. glutamicum et PMM48 : pDP32 de M. smegmatis Protocole d'analyse Les souches de C. glutamicum sont mises en culture jusqu'en phase exponentielle et marquées avec de l'acétate [14C] 05 pCi/ml (activité spécifique de 54 mCi/mmol ; ICN, Orsay, France) pendant 3h. Pour le radiomarquage du mutant conditionnel de M. smegmatis à température non permissive, PMM48 : pDP32 et la souche de type sauvage mu2155 sont mises en culture à 30°C. Ces cultures sont ensuite diluées dans du milieu frais à une D06oonm= 0, 005 et incubées à 42°C jusqu'à une D06oonm= 0, 3.

Les cellules sont ensuite marquées pendant 3h avec de l'acétate [14C] 0,5 pCi/ml.

Les acides gras sont préparés à partir des cellules marquées et séparés par chromatographie sur couche mince sur Durasil 25 en utilisant du dichlorométhane ou un mélange éther/diéthyléther (9 : 1) comme éluant comme décrit dans LAVAL et al. (Anal. Chem.

73 : 4537-4544,2001). Les composés marqués sont quantifiés sur un Phosphomalger (AMERSHAM BIOSCIENCES).

Pour les analyses par chromatographie en phase gazeuse suivie d'une analyse par spectromètre de masse (GC-MS), des dérivés triméthylsilyl d'acides gras sont obtenus comme décrit dans CONSTANT et al. (J. Biol. Chem.

277 : 38148-38158,2002) et analysés sur un spectromètre de masse Hewlett-Packard 5889 X (énergie d'électron, 70eV) travaillant en modes capture électronique (EI) en utilisant du NH3 comme gaz de réaction (Cl/NH3), couplé avec un chromatographe en phase gazeuse Hewlett-Packard 5890 series II associé à une colonne OV1 similaire (0,30 mm x 12 m).

Résultats Mutants Spksl3 et dpksl3 : pCGL2308 de C. glutamicum La Figure 3C illustre le résultat de l'analyse des acides gras libérés après saponification à partir de la souche de type sauvage (WT) et des mutants pksl3 et Apksl3 : PCGL2308 de C. glutamicum. L'analyse par chromatographie sur couche mince de ces produits révèle que les spots correspondant aux acides mycoliques ou à la palmitone, un produit de dégradation de l'intermédiaire ß- céto acyle résultant de la réaction de condensation, ne sont plus détectables chez les mutants. Cette observation est confirmée par l'analyse en GC-MS qui démontre que le mutant Spksl3 de C. glutamicum ne synthétise plus d'acides mycoliques mais produit une quantité similaire d'acides gras C16-C18, le précurseur de mycolate, de celle de la souche de type sauvage (données non représentées). Cette production d'acides mycoliques est partiellement restaurée suite au transfert dans la souche mutante XpBsl3 d'un

plasmide portant le gène pksl3 fonctionnel de C. glutamicum ; ce qui démontre que ces phénotypes sont effectivement dus à la délétion de pksl3. La restauration partielle suggère soit que l'expression de pksl3 par le plasmide n'est pas du mme niveau que celle dans la souche de type sauvage, soit que l'insertion chromosomique de la cassette kanamycine exerce un effet polaire sur l'expression du gène accD4, ou les deux.

En outre, dans les Mycolatas, les acides mycoliques sont supposés contribuer à la bicouche lipidique qui forme un homologue fonctionnel à la membrane externe des bactéries Gram-négative. Chez les corynébactéries et les mycobactéries, un plan de cryofracture se propage entre les deux couches de cette pseudo membrane externe. Comme attendu, la Figure 3D montre la perte de ce plan de fracture dans la souche mutant Apksl3 de C. glutamicum alors qu'il est clairement visible dans la souche de type sauvage, ce qui suggère que la bicouche lipidique composée majoritairement d'acides mycoliques n'est plus présente dans le mutant.

Ces résultats montrent que le mutant Spksl3 de C. glutamicum est bien dépourvu d'une enzyme essentielle dans la biosynthèse les acides mycoliques.

Mutant PMM48 : pDP32 de M. smegmatis La Figure 4D illustre le résultat de l'analyse des acides gras libérés après saponification à partir de la souche de type sauvage de M. smegmatis et du mutant conditionnel PMM48 : pDP32, après croissance à température permissive (30°C) ou non permissive (42°C). Le rapport mycolates/acides gras à chaîne courte est quantifié pour le mutant PMM48 : pDP32 et divisé par celui obtenu pour la souche de type sauvage cultivée dans les mmes conditions.

Le graphe montre qu'après transfert à 42°C, le contenu moyen en mycolate dans le mutant PMM48 : pDP32 est diminué de plus de 60%. Comme attendu, cette synthèse n'est pas complètement stoppée dans la culture du fait que la

population bactérienne restante conservant le plasmide de complémentation non réplicatif produit des acides mycoliques.

Ces résultats montrent que le gène pksl3 est impliqué dans la biosynthèse des acides mycoliques chez M. smegmatis.

EXEMPLE 4 : CRIBLAGE D'ANTIBIOTIQUES ACTIFS SUR LES MYCOLATAS Criblage de xénobiotiques inhibant la condensation par la Pksl3, directement ou indirectement Comme illustré à la figure 5, la Pksl3 permet la condensation de deux substrats, qui résultent eux-mmes de deux réactions indépendantes.

L'absence d'acides mycoliques dans des mycolatas peut donc provenir de l'inhibition de la Pksl3 et/ou de l'inhibition de la FadD32, et/ou de l'inhibition du complexe carboxylase dans lequel intervient la protéine AccD4.

Plusieurs tests permettent de cribler l'action d'un xénobiotique sur la synthèse des acides mycoliques par les mycolatas.

Comme vu à l'exemple 3 ci-dessus, les transformants Spksl3 dans lesquels le gène pksl3 a été inactivé présentent un changement de morphologie des colonies, qui passent d'un aspect brillant lisse à un aspect rugueux. Ceci est également le cas pour des bactéries C. glutamicum dans lesquelles le gène accD4 ou fadD32 est muté (voir la figure 6). Un premier test pour déterminer l'impact d'un xénobiotique sur la synthèse des acides mycoliques consiste donc à étaler des mycolatas capables de survivre sans produire d'acides mycoliques, par exemple des bactéries C. glutamicum (par exemple, la souche ATCC13032), sur un milieu de culture gélosé contenant le xénobiotique à tester. L'observation visuelle des colonies obtenues permet d'identifier les antibiotiques potentiels.

Un autre test consiste à faire pousser des bactéries C. glutamicum en milieu liquide, tel que décrit ci-dessus, en présence ou en absence du xénobiotique à tester. De l'acétate [14C] 0, 5 pCi/ml (activité spécifique de 54 mCi/mmol ; ICN, Orsay, France) est ajouté pendant la phase exponentielle de croissance, pendant au moins 3 heures, avant de faire l'analyse biochimique des acides gras contenus dans les bactéries par chromatographie sur couche mince, comme décrit ci-dessus et dans Portevin et al, PNAS 2004, Vol. 101, p314-319 (voir notamment le premier paragraphe de la page 316). Comme illustré à la figure 3C, il est possible de détecter les acides mycoliques synthétisés par la souche cultivée en l'absence du xénobiotique (témoin), ainsi que le palmitone, produit de dégradation résultant de la réaction de la condensation par la Pksl3. Une altération de la fonction de la Pksl3, et/ou de la FadD32, et/ou du complexe carboxylase, liée à la présence du xénobiotique, entraînera une diminution, voire une disparition, des bandes correspondant.

Bien évidemment, un xénobiotique identifié selon un des deux tests décrits ci-dessus peut ensuite tre testé pour son aptitude à inhiber la croissance des mycolatas incapables de survivre sans produire des acides mycoliques, telles que Mycobacterium tuberculosis et Mycobacterium leprae.

Détermination de l'étape de la synthèse des acides mycoliques effectivement inhibée par le xénobiotique Une deuxième étape d'analyse est nécessaire pour déterminer plus finement la cible d'un xénobiotique inhibant la synthèse des acides mycoliques, c'est-à dire pour déterminer s'il agit sur la Pksl3 ou sur une enzyme impliquée dans l'activation d'un de ses substrats.

Ceci peut tre effectué en analysant les acides gras présents dans les bactéries C. glutamicum cultivées en présence du xénobiotique (candidat

antibiotique), par exemple par chromatographie en phase gazeuse suivie d'une spectrométrie de masse (GC-MS).

Pour cela, des esters méthylés d'acides gras peuvent tre obtenus par saponification des cellules, suivie par une méthylation avec du diazométhane, comme cela est décrit par Laval et al (Annal. Chem., 2001, Vol.

73, p. 4537-4544). Ils sont ensuite fractionnés sur colonne Florisil irriguée avec de l'éther de pétrole contenant 0,1, 2,3 et 100% de diéthyléther. Les esters méthylés d'acides gras polaires sont contenus dans la dernière fraction éluée. Alternativement il est possible d'obtenir des dérivés triméthylsilylés par la méthode décrite par Constant et al (J. Biol. Chem. 2002, Vol. 277, p. 38148-38158).

Les analyses par chromatographie en phase gazeuse et par chromatographie en phase gazeuse suivie d'une spectrométrie de masse peuvent tre effectuées comme décrit par Portevin et al (PNAS 2004, supra).

Ces analyses du contenu en acides gras des bactéries cultivées en présence et en absence du xénobiotique inhibant la synthèse des acides mycoliques permettent de déterminer si le xénobiotique agit sur la Pksl3ou la FadD32, ou sur l'acyl carboxylase contenant AccD4. L'inhibition de la condensation par la Pksl3 ou de la formation d'acyl-AMP par FadD32 entraîne l'accumulation des intermédiaires résultant de la carboxylation par l'acyl-CoA carboxylase, tel que l'acide tétradécylmalonique. L'absence d'accumulation de ce composé indique que le xénobiotique agit sur la carboxylase contenant AccD4. Pour déterminer si le xénobiotique agit sur FadD32, un test peut tre réalisé en purifiant la protéine FadD32 et en mesurant la formation d'acyl-AMP in vitro, comme décrit par Trivedi et al, (Nature 2004, Vol. 428, p. 441-445), en présence ou absence du xénobiotique. L'observation d'une absence de formation d'acyl-AMP en présence du xénobiotique indique

qu'il agit sur FadD32. Le résultat contraire indique que le xénobiotique agit sur la Pksl3.

Une bactérie dont le gène Pksl3 a été muté peut servir de contrôle pour vérifier l'accumulation de ces deux substrats. Pour cela, il est préférable d'inactiver le gène de la Pksl3 par une mutation ponctuelle ou une délétion, plutôt qu'en introduisant une séquence étrangère dans le gène pksl3, comme décrit ci- dessus. En effet, l'introduction de la cassette km dans le gène pksl3 est susceptible d'induire un défaut d'expression du gène accD4 dans le mutant décrit ci- dessus. La comparaison de spectres obtenus avec (i) des bactéries C. glutamicum cultivées en l'absence du xénobiotique, (ii) ces mmes bactéries, cultivées en présence du xénobiotique, (iii) des bactéries C. glutamicum comportant une mutation non-sens dans le gène pksl3, et, le cas échéant, (iv) des bactéries C. glutamicum dont le gène accD4 ou le gène fadD32 a été muté, permet de déterminer si l'inhibition de la synthèse des acides mycoliques par le xénobiotique est liée à son action sur la Pksl3, ou sur une enzyme située en amont dans la biosynthèse des acides mycoliques.