La présente invention concerne le domaine technique des herbicides. Plus précisément, la présente invention concerne l'utilisation d'une plante Myrica gale pour la production d'un agent herbicide ou pour la préparation d'une composition herbicide, ainsi que les compositions herbicides correspondantes et les compositions herbicides contenant un agent herbicide nouvellement mis en évidence.

Les Myricacées sont, au vu des données de paléobotanique, très certainement la plus ancienne famille de plantes actinorhizienne et seraient apparues au Cénomanien durant le Crétacé Supérieur (96 millions d'années) (Eriksson O. et Bremer B. 1992, Pollination Systems, dispersai modes, life forms, and diversification rates in angiosperm families. Evolution 46 : 333). Plus de 50 espèces appartiennent à cette famille, toutefois la taxonomie intrafamiliale a posé beaucoup de difficultés aux botanistes et deux hypothèses, quant au nombre de genres au sein de cette famille, ont été débattues depuis plus d'un siècle, en particulier en ce qui concerne le rang taxonomique à donner à Myrica gale (Wilbur R.L. 1994, The Myricaceae of the United States and Canada : gênera, subgenera, and séries. SIDA 16 : 93; et Gleason H.A. et Cronquist A. 1991, Manual of vascular plants of northeastem United States and adjacent Canada. 2 ^nd Edition. New York Botanical Garden, Bronx, pp 80-81 notamment). Récemment, les travaux de Huguet et al 2005 (Huguet V. Gouy M. Normand P. Zimpfer J. F. et Fernandez M. P. 2005, Molecular Phylogeny of Myricaceae : a reexamination of host- symbiont specificity. Molec.Phylo.Evol. 34 : 557) ont confirmé que le genre Myrica gale était un genre à part entière de la famille des Myricacées, au côté du genre Comptonia et du genre Morella.

Le genre Myrica gale (également nommée Myrica gale), dont la distribution géographique est la plus importante, est décrit pour certaines propriétés thérapeutiques tant en Amérique du Nord qu'en Europe (Sylvestre M. Legault J. Dufour D. et Pichette A. 2005, Chemical composition and anticancer activity of leaf essential ol of Myrica gale L. Phytomedicine 12: 299). Des infusions de ses feuilles sont utilisées pour le traitement de troubles gastriques et de difficultés cardiaques (Svoboda K.P. Inglis A. Hampson J. Galambosi B. Asakawa Y. 1998, Biomass production, essentiel oil yield and composition of Myrica gale L. harvested from wild populations in Scotland and Finland. Flav.Frag. 13: 367). L'huile essentielle de feuilles de Myrica gale est utilisée en aromathérapie pour son action mucolytique et anticatarrhaie en cas de problèmes respiratoire (Bremness, L. (Ed) 1996 L'œil Nature : Les plantes aromatiques et médicinales. Bordas, Paris). Cette huile essentielle aurait également des propriétés abortives et est utilisée également comme répulsif d'insectes en Scandinavie (Svoboda et al 1998 ; Jaenson T.G.T. Palsson K. et Borg-Karlson A. K. 2005 Evaluation of extracts and oils of tick-repellent plants from Sweden Med.Vet.Entomol. 19 : 345). Par ailleurs, les feuilles et les fruits de Myrica gale, très aromatiques et couvertes de cellules glandulaires, sont utilisés comme épices pour aromatiser breuvages, soupes et bière (Behre, K.E. 1999 The history of béer additives in Europe-a review. Végétation History and Archaeobotaπy, 8, 35).

Le document US 4,309,207 décrit l'utilisation de parties aériennes de plantes du genre Myrica ou Vaccinium pour leur activité antifongique ou inhibitrice de la croissance des plantes. Depuis la publication de ce brevet US qui date de 1982, une reclasssification au sein de la famille des Myricaccées a été opérée. Les Myrica décrites dans ce document, et en particulier la Myrica Pensylvaπia qui fait l'objet de l'exemple 4 de ce document, ont maintenant été reclassées dans le genre Morella et cette dernière s'appelle maintenant Morella Pensykarûca, comme mentionné dans la publication de Huguet et al de 2005 citée supra. De plus, il existe une grande différence physiologique et génétique entre les plantes Myrica gale et les plantes du genre More/la et notamment Morella Peπsylvaπica (ex Myrica Pensylvania). Tout d'abord, les plantes Myrica gale ont une interaction très spécifique avec les bactéries. De plus, les inventeurs ont mis en évidence que ces différentes plantes {Myrica gale et Morella) expriment des principes actifs différents et présentent des profils de dérivés phénoliques très différents. Par conséquent, une activité herbicide de plantes du genre Morella ne peut nullement présager d'une activité herbicide de Myrica gale.

Dans le cadre de l'invention, et ce de façon totalement inattendue, les inventeurs ont mis en évidence que les plantes Myrica gale, sous la forme de partie brute de la plante ou d'extraits, présentaient une activité phytotoxique et pouvaient par conséquent être utilisées, en tant que telles comme bioherbicides ou encore pour la production de bioherbicides.

Dans ce contexte, la présente invention a pour objet l'utilisation d'une plante Myrica gale pour la préparation d'une composition herbicide. Selon un mode de réalisation particulier, un extrait d'une plante de

Myrica gale est préparé et incorporé dans la composition herbicide. L'extrait utilisé est, par exemple, issu des racines, des feuilles, des tiges, des fruits, des graines et/ou des fleurs. De façon avantageuse, l'extrait utilisé est issu des feuilles, des fruits ou des graines. L'extrait utilisé peut, notamment, être obtenu par extraction avec un solvant choisi parmi l'eau, les alcools, les cétones, les esters, les éthers, les polyols, les solvants chlorés et les mélanges d'au moins deux des solvants précités.

Les inventeurs ont préparé, dans le cadre de l'invention, des extraits riches en flavonoïdes et dérivés. Selon un autre de ses aspects, l'invention concerne l'utilisation d'une plante Myrica gale pour la production d'un agent herbicide. En fonction des étapes mises en œuvre, l'agent herbicide pourra être sous une forme isolée et purifiée ou en mélange dans un extrait de Myrica gale. L'agent herbicide produit est, notamment, choisi parmi : la Myrigalone A, la Myrigalone E, la Myrigalone B, l'uvangoletin, le demethoxymatteucinol, la Myrigalone D, le demethoxymatteucinol-7-methyl ether, la 2',4',6'-trihydroxy-3',5'- dimethyldihydrochalcone, composés dont les inventeurs ont mis en évidence l'activité herbicide dans des extraits de fruits produits.

L'invention a également pour objet des compositions herbicides comprenant un extrait de Myrica gale, ainsi que des compositions herbicides comprenant un composé choisi parmi : l'agent herbicide est choisi parmi : la Myrigalone A, la Myrigalone E, la Myrigalone B, l'uvangoletin, le demethoxymatteucinol, la Myrigalone D, le demethoxymatteucinol-7-methyl ether, la 2',4',6'-trihydroxy-3',5'-dimethyldihydrochalcone.

L'extrait utilisé dans le cadre de l'invention est un extrait cellulaire ou un extrait extracellulaire (lessivage de feuilles par exemple) de la plante qui peut être préparé selon toute méthode connue de l'homme du métier pour extraire des composés des tissus végétaux. L'extrait peut être obtenu à partir des racines, des feuilles, des tiges, des fruits, des graines et/ou des fleurs. De façon avantageuse, l'extrait sera issu des feuilles, des fruits ou des graines, dont l'utilisation n'entraîne pas la mort de la plante dont ils sont extraits. De plus, les extraits des feuilles et des fruits sont particulièrement actifs.

A titre d'exemples de méthodes d'extraction, on peut citer les méthodes classiques d'extraction en solvant à chaud ou à froid, la macération, la lixiviation, la cryoextraction, la digestion, la décoction, les extractions par le CO2 supercritique, seul ou en mélange avec un co-solvant les extractions utilisant un rayonnement ondulatoire, tel que les micro-ondes ou les ultrasons. Ces méthodes peuvent être combinées à une étape ultérieure de purification, filtration, concentration et/ou séchage.

De façon avantageuse, l'extrait utilisé est obtenu par extraction avec un solvant choisi parmi l'eau, les alcools, les alcanes, les cétones, les esters, les éthers, les polyols, les solvants chlorés et les mélanges d'au moins deux des solvants précités. En particulier, l'extraction pourra être réalisée à l'aide d'un solvant, tel qu'un solvant alcoolique choisi parmi l'éthanol ou le méthanol ou encore le polyéthylène glycol ou le chloroforme. Un solvant tel que précédemment cités est particulièrement préféré pour l'extraction à partir des feuilles, des fleurs et des fruits de la plante. Dans le cas d'une extraction par solvant, par exemple, on peut procéder de la façon suivante : la partie de la plante sélectionnée est récoltée. Cette partie de la plante dont l'extrait est souhaité, qui peut se trouver sous forme fraîche ou sèche, est broyée et/ou déchiquetée, dans le solvant sélectionné ou pas, puis laissée à macérer, de préférence sous agitation, dans le solvant, de préférence pendant 1 heure à 30 jours. De façon avantageuse, on utilisera un rapport massique partie de la plante sur solvant compris entre 1/1 et 1/10 (m/m). L'extraction peut être réalisée à une température comprise entre -10 et 70 ⁰ C, et notamment entre 18 et 60 ⁰ C ou à reflux du solvant d'extraction utilisé. L'extraction peut également être réalisée par lixiviation. L'extrait obtenu peut alors être concentré, ou séché, par exemple par évaporation ou lyophilisation. L'extrait obtenu peut être incorporé tel quel à la composition ou bien être purifié, traité ou fractionné, de façon à enrichir en principe actif recherché. En particulier, l'extrait utilisé sera riche en flavonoïdes, et pourra notamment contenir un ou plusieurs composés choisis parmi la Myrigalone A, la Myrigalone E, la Myrigalone B, l'uvangoletin, le demethoxymatteucinol, la Myrigalone D, le demethoxymatteucinol-7-méthyl ether, la 2',4',6'-trihydroxy-3',5'-dimethyldihydrochalcone.

Les extraits de Myrica gale ou directement les composés ci-dessus, obtenus de préférence à partir de plantes Myrica gale, et notamment des fruits, peuvent être utilisés pour préparer des compositions herbicides. La Myrigalone A, la Myrigalone E, la Myrigalone B, l'uvangoletin, le demethoxymatteucinol, la Myrigalone D, le demethoxymatteucinol-7-méthyl ether et/ou la 2',4',6'-trihydroxy-3',5'-dimethyldihydrochalcone obtenus par synthèse chimique, ou obtenus à partir de la plante Myrica gale présentent une activité herbicide et peuvent être utilisés en tant qu'agent herbicide. L'activité herbicide recherchée peut être de nature à inhiber la germination de graines, à empêcher la reprise de développement de méristèmes et de bourgeons souterrains ou aériens, à inhiber le développement et la croissance des racines ainsi que des hypocotyles, des épicotyles et de toutes parties aériennes des plantes.

Tout type de compositions herbicides connues pourra être préparé. On pourra notamment utiliser des compositions herbicides sous la forme de granules, de liquides, d'émulsions aqueuses ou de concentrés émulsifiables, comme adjuvants pour bouillie herbicide. Dans des adjuvants pour bouillie herbicide, la partie brute de Myrica gale, un de ses extraits ou un des agents herbicides précédemment cités pourra être associé à un ou plusieurs composés choisis parmi : sulfate d'ammonium, huile de pétrole, huile de colza estérifiée, aminé grasse de suif éthoxylée, huile minérale de paraffine, nonylphénol polyéthoxyle, Laminaria digitata, polymère d'aminé gras, polysorbate 20, Huile de pin, dérives d'acides gras végétaux, alcools terpéniques, acide oléique, esters méthyliques d'acides gras, esters de phosphate d'alcools gras polyoxyalkyles, polyoxyéthylène aminé, alkyl polysaccharides, lécithine de soja, octylphénol octaglycol éther, ester sulfurique, alcools et acides gras sulfones, triéthanolamine, polymère complexe d'éthylène et de propylène, heptaméthyltrisiloxane modifié polyalkylèneoxide, alkyl phénol, polyoxyéthylène, heptaméthyltrisiloxane modifié, polyalkylèneoxide, oxyde d'éthylène, couramment utilisés dans des adjuvants pour bouillie herbicide, comme le montre la liste publiée par le ministère de l'agriculture et de la pêche français sur le site http://e- phy.aQriculture.Qouv.fr/usa/31651003.htm auquel on pourra se référer. Les compositions herbicides pourront également être incorporées à des tissus imprégnés ou des films polymères.

Les compositions seront, par exemple, utilisées de manière à avoir des concentrations, au moment du traitement, allant de 10 ^'12 à 10 ² M, de préférence de 10 ^"5 et 10° M d'agent herbicide actif. Dans le cas de compositions sous la forme de granulés notamment, l'ajout d'eau sera alors nécessaire.

Les exemples ci-après, en référence aux Figures annexées, permettent d'illustrer l'invention, mais n'ont aucun caractère limitatif.

La Figure 1 résume le protocole de fractionnement utilisé. La Figure 2 présente les données RMN des composés isolés. Les Figures 3 à 6 présentent les longueurs moyennes (cm) des racines de moutarde en présence, respectivement, de différentes quantités de broyats de feuilles de Myrica gale, de graines entières de Myrica gale, de lessivât méthanolique de graines de Myrica gale et de Myrigalone A en solution méthanolique. La Figure 7 présente des chromatogrammes démontrant les différences très nettes en terme de contenu chimique, d'extrait de Myrica gale par rapport à des extraits de Morella cerifera et Morella peπsylvanica et extraits de Myrica gale et identification des Métabolites

Matériel végétal

Les fruits de Myrica gale ont été récoltés le long de l'étang de Biscarosse en Gironde en décembre 2004. L'extraction par lessivage assisté aux ultrasons de 350g de fruits secs dans 2L de méthanol a permis d'obtenir 35g de résidu sec. L'extrait est résineux à température ambiante.

Fractionnement et Purification

Systèmes analytiques et détection Après chaque étape de la purification, les fractions obtenues sont analysées sur différents systèmes chromatographiques, CCM et HPLC, afin de déterminer leur composition et de réunir celles qui sont qualitativement homologues. Les fractions réunies, considérées comme intéressantes, sont conservées pour la suite du travail et font alors l'objet de mises au point de nouveaux systèmes de séparation.

A chaque étape du fractionnement, la révélation et la visualisation des plaques CCM font appel à l'irradiation UV à 254 et 366nm.

Les analyses HPLC sont réalisées sur un Agilent 1100, la colonne

Kromasil (250 x 4,6 mm, 5μm, 100Â) est constituée de silice greffée en C18. Le volume d'échantillon injecté dans la colonne est de 5 μL avec une détection UV entre 200 et 700 nm grâce à un détecteur à barrettes de diodes. Quatre longueurs d'onde particulières sont utilisées pour la visualisation des chromatogrammes : 254, 280, 320 et 350 nm. Le solvant d'élution est un gradient d'acétonitrile dans l'eau avec 0,4% d'acide acétique.

Systèmes préparatifs

Le protocole de fractionnement est résumé Figure 1 sur laquelle les fractions n'ayant donné lieu à l'obtention d'aucune molécule pure ne sont pas représentées.

Le lessivât de fruits de Myrica gale est fractionné par une première chromatographie sur colonne ouverte de Sephadex LH-20 (600x45mm) avec un solvant d'élution constitué de méthaπol. Ce partage permet la récupération de 13 fractions (A à M).

L'analyse de la fraction C a montré qu'elle n'était constituée que d'une molécule, le composé 1, à hauteur de 12g. Le composé 2 (6mg) a été obtenu suite à sa cristallisation dans la fraction D à -2O ⁰ C. Les fractions de plus grandes masses (E, 8g et F, 7g) ont ensuite fait l'objet de chromatographies supplémentaires. Une MPLC (450x25mm) de la fraction E sur silice 60 (15x40μm) avec un solvant d'élution constitué d'un gradient d'acétone dans de l'hexane a permis l'obtention de 2 molécules pures (3, 200mg et 4,100mg). Les 13 fractions FA à FM ont été obtenues par chromatographie de la fraction F par MPLC (450x25mm) sur phase inverse (RP18 15x40μm). Deux de ces fractions étaient constituées chacune d'une molécule pure (composés 5, 26mg et 6, 8mg). La fraction FL a fait l'objet d'une HPLC semi-préparative sur phase inverse (X-Terra Prep MS C18, 5μm, 10 x 100mm, isocratique 40% de solvant A (H ₂ O) 60% de solvant B (acétonitrile), débit 3 ml/min). Cette dernière chromatographie a permis la purification des composés 7 et 8 (4 et 3,6mg). Analyses Structurales L'élucidation structurale des composés a été établie par l'interprétation des données de spectroscopie UV, de spectrométrie de masse et de RMN monodimensionnelle ¹ H et ¹³ C ainsi que RMN bidimensionnelle hétéronucléaire ¹ H- ¹³ C HSQC et ¹ H- ¹³ C HMBC. Les spectres UV ont été enregistrés sur un appareil UVIKON 943 dans le méthanol. Les spectres de masse ont été réalisés sur une chaîne LC-MS Agilent 1100 équipé d'un détecteur MSD 1100 avec une interface APCI positive et négative. Les spectres RMN ont été réalisés au service commun de RMN de I ¹ UCBL sur un appareil Bruker DRX500 dans le méthanol-d ₄ à 500,13 MHz en proton et 125,77 MHz en carbone-13.

Les différentes étapes de chromatographies successives réalisées sur le lessivât de fruits de Myrica gale ont permis de purifier et d'identifier 8 métabolites. Les structures de ces composés sont les suivantes :

Les élucidations structurales ont été établies par l'interprétation des données RMN du proton et du carbone en respectant les corrélations observées en HMBC (Figure 2). Les tableaux présentés Figure 2 donnent les valeurs des déplacements RMN IH et 13C des chalcones et dihydrochalcones (A) et des flavanones (B). Les déplacements sont donnés en ppm, les constantes de couplage entre parenthèse sont en Hz. Toutes les molécules purifiées sont des flavonoïdes. Toutes les formules proposées sont cohérentes avec l'ensemble des autres données spectrales, UV et masse. Tous les composés avaient déjà été décrits dans la littérature. Sur les 8 molécules purifiées, 5 avaient déjà été identifiées chez Myrica gale et portent les noms suivants : Myrigalone A, E et B, pour les composés 1, 2 et 3 respectivement, Myrigalone D, pour le composé 7 et l'uvangoletin pour le composé 4. Les autres composés suivants n'avaient jamais été décrits chez Myrica gale : deméthoxymatteucinol, pour le composé 6, deméthoxymatteucinoi-7-méthyl ether, pour le composé 8. Enfin, la 2',4',6'- trihydroxy-3',5'-diméthyldihydrochalcone pour le composé 5 n'avait jamais été décrite comme substance naturelle. Activité Bio-herbicide de Myrica αale Matériel et Méthodes

Extraits végétaux utilisés pour évaluer leur activité herbicide : Les extraits suivants ont été testés quant à leurs propriétés herbicides : - Feuilles sèches réduites en poudre

- Fruits entiers, secs

- Lessivât méthanolique de fruits

- Myrigalone A pure en solution méthanolique

Plantes utilisées comme cible de l'activité herbicide

Les plantes suivantes ont été utilisées pour évaluer l'activité herbicide des différents extraits de Myrica gale :

- Sorgho - Blé - Moutarde

- Cresson

- Renouée

Tests d'activité de phytotoxicité Les graines des plantes cibles sont déposées à la surface d'un papier filtre (Whatman n°l) au sein d'une boite de Pétri (9cm de diamètre). En fonction des plantes cibles, le nombre de graines par boite de Pétri varie de 8 à 15 graines.

Dans la boite de Pétri, 8mL d'eau sont rajoutés pour assurer la germination des graines cibles.

A ces 8mL d'eau sont incorporés les différents extraits méthanoliques de Myrica gale à tester à des concentrations de 0,lmg/mL, 0,5 mg/mL ou lmg/mL apportés par 50μL de méthanol. Les témoins sont constitués de méthanol. Pour les évaluations des activités des extraits secs (broyât de feuilles et fruits entiers), à la surface des boites de Pétri sont saupoudrés les extraits à des concentrations de lOmg/mL, 20mg/ml_ ou 30mg/mL Les témoins ne sont pas saupoudrés.

Toutes les conditions testées sont répétées au moins 3 fois (3 boites de Pétri par traitement contenant chacune de 8 à 15 graines). Les expériences ont été reproduites indépendamment plusieurs fois.

Après ajout des différents extraits à tester, les boites de Pétri sont mises à 28°C.

La lecture des boites est réalisée dès que les témoins ont convenablement poussés avant le stade 1 feuille.

Paramètres mesurés pour l'évaluation herbicide

Après germination des graines cibles, les longueurs des racines et des hypocotyles de chaque plantule sont mesurées ainsi que le taux de germination des graines.

Résultats

La Figure 3 présente les longueurs moyennes (cm) des racines de moutarde en présence de 1O ₇ 20 et 30 mg/mL de broyats de feuilles de Myrica gale. L'inhibition du développement des plantules est totale dès lOmg/mL.

La Figure 4 présente les longueurs moyennes (cm) des racines de cresson en présence de 10, 20 et 30 mg/mL de graines entières de Myrica gale.

La Figure 5 présente les longueurs moyennes (cm) des hypocotyles de moutarde en présence de 0,1, 0,5 et 1 mg/ml de lessivât méthanolique de graines de Myrica gale.

La Figure 6 présente les longueurs moyennes (cm) des racines de moutarde en présence de 0,1, 0,5 et 1 mg/ml de Myrigalone A en solution méthanolique. Analyse de la variabilité des composés phénoliques produits dans les différents organes de la plante par Myrica αale et deux espèces à spectre de nodulation larαe. Morella cerifera et Morella pensylvanica.

1- Matériel Végétal Les analyses de variabilité inter et intra spécifiques ont été effectuées sur des feuilles, des racines et des graines prélevées sur des plantes adultes des espèces Myrica gale, Morella cerifera et Morella pensylvanica. Deux types de matériel ont été utilisés. Le 1 ^er type concerne des plantes nodulées âgées de 12 à 18 mois cultivées hors sol en conditions contrôlées (Huguet, 2003). Les échantillons de feuilles et de racines issus de ces plantes ont été conservés à température ambiante après un séchage à l'obscurité et à l'air libre. Le 2 ^ème type de matériel concerne des plantes adultes, de terrain, dont les échantillons de feuilles et de racines sont conservées à -20 ⁰ C sans avoir été séchées (Tableau 2). 2- Préparation des extraits végétaux

2-1-Exsudats des feuilles et des graines Les composés présents à la surface des feuilles et des graines sont récupérés par lessivage des échantillons dans 40 mL d'un mélange éthanol/méthanol (1:1) à température ambiante pendant 20 minutes, sous agitation. Le solvant est ensuite évaporé à sec sous pression réduite et le résidu obtenu est alors repris dans 1,5 mL de méthanol.

2-2- Contenu des feuilles, des racines, des graines et des plantules

Les échantillons sont broyés dans de l'azote liquide, puis les composés cellulaires sont extraits à chaud dans 50 mL de méthanol/éthanol (1/1) par chauffage à reflux pendant 2 x 15 minutes. Après filtration, le solvant est évaporé à sec sous pression réduite et le résidu est repris dans 2 à 3 mL de méthanol.

Tous les échantillons sont conservés à -20 ⁰ C. 3- Analyse des composés phénoliques

L'analyse des différents échantillons se fait par chromatographie HPLC. L'appareil utilisé est un Agilent 1100, la colonne Kromasil (250 x 4,6 mm, 5μm, 100Â) est constitué de silice greffée en C18. Le volume d'échantillon injecté dans la colonne est de 20 μl_. Le gradient des solvants d'élution pour l'analyse des lessivats est différent de celui de l'analyse des broyats et est présenté dans le TABLEAU 1 ci-dessous :

TABLEAU 1 : Conditions d'élution utilisées en HPLC.

Solvant A* Pour les lessivats : H ₂ O / HCOOH (100/4) Pour les broyats : H ₂ O / HCOOH (100/2)

Solvant B ⁺ Pour les lessivats : Acétonitrile / H ₂ O / HCOOH (80/20/4) Pour les broyats : Acétonitrile / H ₂ O / HCOOH (80/20/2)

Le détecteur à barrettes de diodes permet d'effectuer la détection à toutes les longueurs d'ondes du spectre UV-Visible. Trois longueurs d'ondes ont alors été utilisées pour suivre les analyses : 280, 320 et 350 nm. De plus, ce détecteur réalise un spectre d'absorption toutes les 30 ms et permet donc d'attribuer à chaque signal (suffisamment intense), en sortie de colonne, son spectre d'absorption UV.

4- Analyse statistique

Les résultats de l'HPLC sont consignés dans une matrice de données binaires (1/0) à x colonnes (pics du chromatogramme) et y lignes (échantillons). Cette matrice est ensuite analysée en AFC. Ces tests statistiques sont réalisés avec le logiciel ADE4 (www.pbil.univ-lyonl.fr).

5- Résultats

Le gradient du solvant d'élution utilisé pour les analyses HPLC des lessivats foliaires étant différent de celui utilisé pour les broyats, la comparaison des temps de rétention entre ces deux types d'échantillons n'est pas possible et leurs profils chromatographiques sont donc analysés séparément.

La comparaison des chromatogrammes est faite à deux longueurs d'onde de détection : 280 nm qui permet d'observer les composés phénoliques en général et 350 nm qui correspond à l'absorbance plus spécifique des flavonoïdes.

5-1- Lessivats foliaires et broyats foliaires et racinaires L'analyse en AFC des chromatogrammes des lessivats et broyats foliaires et des broyats racinaires, sépare systématiquement, sur le premier axe, les échantillons de Myrica gale de ceux des deux autres espèces (Figure 5). Cette dichotomie s'observe aux deux longueurs d'onde de détection utilisées, 280 et 350 nm.

Seule l'AFC issues des signaux des broyats foliaires permet de séparer sur le deuxième axe et surtout aux deux longueurs d'onde de détection, les échantillons de Morella cerifera de ceux de More/fa pensylvanica (Figure 7).

Le nombre de signaux détectés dans les broyats foliaires et racinaires est sensiblement le même pour les trois espèces étudiées. Par contre, environ deux fois plus de signaux sont détectés dans les exsudats foliaires de Myrica gale que dans ceux des deux autres espèces.

Dans ces trois compartiments (lessivats et broyats foliaires et racinaires), les échantillons de Myrica gale présentent deux à trois fois plus de signaux qui lui sont spécifiques que n'en présentent Morella cerifera et Morella pensylvanlca.

5-2- Broyats et lessivats de graines

Les profils chromatographiques du broyât de graines de Myrica gale sont visuellement extrêmement différents de ceux des broyats de graines de Morella pensylvanlca et de Morella cerifera, en particulier, l'intensité et le nombre des signaux les plus lipophiles sont plus élevés chez Myrica gale. Le broyât de graines de Myrica gale est très riche en métabolites secondaires avec plus d'une centaine de signaux détectés dont 37% sont absents des extraits de graines des deux autres espèces. Parmi ces pics spécifiques, une douzaine sont situés en fin de chromatogramme (à partir de 45 minutes), correspondant aux molécules les plus lipophiles de l'extrait. Les spectres UV des pics spécifiques à Myrica gale révèlent une très grande diversité de composés dont des acides phénoliques, des flavonoïdes ainsi que des composés aux spectres atypiques. Seule une origine de graines de chaque espèce étant disponible, aucune analyse statistique n'a été réalisée.

En conclusion, les analyses HPLC réalisées sur tous les échantillons des différents organes et compartiments montrent que les trois espèces étudiées produisent une diversité de métabolites très importante avec la présence de plusieurs dizaines de signaux détectés.

Les analyses de variabilité qualitative en composés phénoliques séparent sur le premier axe de toutes les analyses AFC, les échantillons de Myrica gale de ceux des deux espèces à large spectre de nodulation, More/la cerifera et More/la pensylvanlca. Cette séparation est systématiquement corrélée à des dizaines de pics des chromatogrammes des extraits. Il apparaît donc que Myrica gale se distingue de ces deux espèces par un contenu phénolique original.