L ^' azote est un facteur limitant de la croissance des végétaux (LeBauer & ïreseder, 2008). Le développement des végétaux dépend donc fortement des processus du cycle de l'azote qui conditionnent ia transformation de l'azote sous toutes ses formes notamment la disponibilité en NH et G3, qui sont les formes assimilables de l'azote par les végétaux.

L'azote atmosphérique est fixé dans les sols et transformé en ammonium ( H4 ou plus précisément MH ⁺ ) par des bactéries fixatrices, une autre source de Nf est l minéralisation des matières organiques azotées, puis la nitrif tion correspondant à la transformation de l'ammonium en nitrate (NO3, ou plus précisément NO3 ^' ) suivie de ia réduction de O3 en N ₂ O et Hz interviennent. Différentes publications ont étudié l'influence de tanins condensés ou de terpènes sur la minéralisation de l'azote et sur la nitrificatîon. Adamczyk Bartosz et al : « esponse of soi! C and transformations to condensed tannins and différent organic N~coodensed tannin complexes », voL 64, 8 janvier 20.13, pages 163-170, décrit que dans des échantillons de sols, l'addition de tanins condensés diminue la nitrificatîon, suggérant leur effet toxique et/ou précipitant des protéines, Ba!dwin I T et al : « Protein binding phenolics and the inhibition of nitrificatîon in subalpine balsam fir soils », vol. 15, n ^ô 4, 1er janvier 1983, pages 419-423, étudie les effets sur la nitrificatîon d'un extrait méthanoîique de sols de forêt. Il est conclu que les tanins condensés présents dans les extraits étudiés sont les composants présentant une activité inhibitrlce de la nitrificatîon la plus importante. Adamczyk Sylvvia et ai : « Potentiel response of soi! processes to d ^' sterpenes, triterpenes and tannins : Nitrificatîon, growfh of microorganisms and précipitation of proteins » _t vol 67, 24 mars 2013, pages 47-52, décrit l'activité de terpènes et d'acide tannique, ainsi que de tanins condensés, en tant qu'inhibiteurs de la nitrificatîon dans des suspensions de sols avec un excès de MH4-N. R L Bradley et ak « Changes to minerai N cyciing and microblal communities in black spruce humus after additions of (MH4)2S04 and condensed tannins extracted from Kalmia angustifolia and basam fir », 1er août 2000, pages 1227-1240 rapporte que ies tanins condensés diminuent la minéralisation de l'azote, en se liant et en séquestrant ies sources organiques d'azote. Sur de l'humus non fertilisé., une diminution de la concentration en nitrates est observée,

Parmi les processus du cycle de l'azote, la dénitrtlcation,, réalisée en majorité par des bactéries dites dénitrifiantes, qui consiste en la réduction du NO3 (nitrate) en H ₂ Q et 2, est considérée comme la principale voie biologique de perte d'azote des sols, Dans ies agrosystèmes européens, ces pertes représentent 59% des pertes totales du système (Genema et al., 2009), En effet, les formes gazeuses de l'azote, N3O et N¾ générées par dénitrification, sont libérées dans l'atmosphère et donc rendues inaccessibles aux plantes.

De manière classique en agriculture, les pertes d'azote causées par la dénitrlficatlon et responsables de perte de rendement sont compensées par l'ajout d'engrais azotés. Toutefois, cet apport entraîne une augmentation d'émission de Η*0, gaz à effet de serre 380 fois plus puissant que le CC¾.

Certaines solutions, à base de composés de synthèse, tel que le diméthylpyrazoiphosphate (DMPP), ont été proposées pour limiter temporairement les pertes en inhibant ia nitrlrleation, Ces composés inhibent l'activité des bactéries nitrifiantes du sol et en conséquence limitent la transformation de l'ammonium (NHU) en nitrate (NO3).

Des extraits de racines e de rhizomes de Failopla spp un complexe de plante invasive, ont, quant à eux, été décrits comme réduisant le processus de dénitrlficatlon des sois (Bardon et al, 2014). Bardon et al 2014, ont identifié dans cette publication, un certain nombre de métabolites présents dans l'extrait testé de Faiiopia spp. dont la (+)ofcéchine, la {+}- épîcatéchine., le piceatanoi glucoside, le resveratroloside, iémodine, le physion, le resvératrol et du picéide et montrent une corrélation entre ia concentration en catéchine dans les extraits et ί Inhibition de la dénitrifioation.

Par la suite, les inventeurs de la présente demande de brevet ont testé l'effet de la catéchine,, ainsi que de tous les composés identifiés dans cette publication (épicatéchine, resvératrol, picéi e, émodlne et physcion) sur la dénltrificatlon de souches bactériennes dénltrifsantes et ont constaté, de manière totalement inattendue, que la catéchine même additionnée aux autres molécules Identifiées comme majoritairement présentes dans l'extrait, n'avait pas d'effet sur la dén itrifkation,

Les Inventeurs ont alors mis en évidence que d'autres molécules, non encore identifiées dans cette publication, les proanthocyanidines étaient responsables de {Inhibition de la déni tification observée avec les extraits de Faliopsa x bohemica. De plus, ces composés n'affectent pas ou peu l'activité des enzymes de la respiration, fonction importante pour la croissance des microorganismes du sol.

Dans ce contexte, la présente invention concerne l'utilisation d'au moins une proanthocyanîdîne pour {imiter la dénitrification causée par des microorganismes, par mise en contact de ladite au moins proanthocyanîdîne avec lesdits microorganismes.

Les mlcroorganismes à l'origine de l'activité dénitrifiante qui est réduite dans le cadre de { nvention sont le plus souvent présents dans un milieu. Lors de l'utilisation selon (Invention, les microorganismes seront alors présents dans le milieu avec ladite au moins proanthocyanîdîne. Dans ce cas, la proanthocyanîdîne sera mise en contact avec le milieu et, de ce fait, avec les microorganismes à obier. Dans certains cas, la mise en contact de la proanthocyanîdîne et des microorganismes se fera suite à un phénomène de diffusion de la proanthocyanîdîne dans ie milieu. Le milieu (avec lequel la proanthocyanîdîne est mise en contact, nommé milieu traité), peut être un milieu solide, tel qu'un sol, et en particulier un sol de culture, compost, fumier, iisier, terreau., boues de station d'épuration, sédiments ou encore un milieu liquide, tel qu'un milieu aqueux du type eau de rivière, eaux usées, eaux de station d'épuration, sans que cette liste soit limitative. Dans le cadre de [Invention, la mise en contact d'au moins une proanthocyanidlne avec le milieu d'intérêt., peut être réalisée,, par toute technique appropriée _» , notamment par application de la proanthocyanidlne sur ledit milieu ou par mélange de la proanthocyanidlne avec ledit milieu. Le temps de mise en contact avec les microorganismes permettant l'effet des prooant ocyanidlnes sur lesdïts microorganismes correspond à la durée souhaitée d ^' obtention de l'effet limitant la dénitrlficatlon.

Dans le cadre de l'invention, une ou plusieurs proanihocyanidine(s) ast(sont) utillsée(s) pour limiter la dénitrlficatlon causée par des microorganismes ayant normalement la capacité de réduire du O3 (nitrate présent dans le milieu traité) en f¾0 et f¾ (capacité qualifiée d'activité dénitrlfiante), En particulier, de tels microorganismes possèdent les gènes codant pour la nitrate et nitrite réductases. De tels microorganismes sont notamment des champignons tels que Cylindrocarpan tonkmense _? Fusanum oxysporum ou des bactéries des genres Pseudonomas, Badlius _f Burkholderia, Achromobacter, Ochmbadrum, Citmbac er, Paraeoceus, Micrococcus, telles que les espèces Pseudomonas brassicacearum, Pseudomonas stutzeii, Pseudomonas aicaligenes, Pseudomonas fiuoresœns, Burkholderia vietnamiensis, Achromobacter xyiomxfdans, Parawcws denitrihcans, Badilus œreus, connues pour être des bactéries dénitrifiantes. Ces bactéries sont le plus souvent présentes dans les sols,

La mise en contact avec les microorganisme est réalisée., de manière à obtenir une diminution de la dénlthfication causée par les microorganismes présentant une activité dénîtrîfiante, ou en d'autres termes de manière à inhiber au moins partiellement l'activité dénitrifiante des microorganismes. Dans le cadre de l'invention, une telle limitation, diminution ou inhibition est à considérer, par rapport à émission de 2O et ¾ et/ou à la dénitrlficatlon (transformation de nitrate O3 ou plus précisément N<¼ ^" en N 3 et f ) qui serait obtenue en l'absence de mise en contact des microorganismes concernés avec ladite proanthocyanidlne. Pour évaluer le pourcentage d'inhibition de la dénltnflcation, l'activité de dénitrlficatlon est obtenue par mesure de l'émission de ½G -f H _2f d'une part en présence et, d'autre part en l'absence, de proanthocyanldine, ce qui permet d'obtenir un pourcentage d'inhibition de la dénitrification correspondant à (émission de ₂ 0 + H ₂ en présence de proanthocyanidine) / (émission de 2O + Nfe en absence de proanthocyanldine) *100. Dans le cadre de (Invention, l'inhibition de la dénitrification par tes proanthocyanldi nés peut notamment atteindre un niveau maximal de 100%, et on obtiendra dans le cadre de l'invention on % dinhsbitlon de la dénitrification, en général de 20 à 100 %, de préférence de 50 à 100%, La technique décrite dans Dambraville et al. 2006,, et utilisée dans les exemples, peut être mise en oeuvre pour évaluer rémission de U?Q - U ₂ > Les conditions de mise en contact et la quantité de proanthocyanidine(s) utilisées seront ajustées par l'homme du métier pour obtenir l'effet souhaité.

Les proanthocyanidlnes, également nommées tanins proanthocyanidiqyes., tanins condensés, ou proanthocyanldols, sont des fiavonoïdes, et plus précisément, des polymères dfiydroxyflavan~3-ol, Les monomères hydroxyflavan-S-ol, constitutifs des proanthocyanldi nés, présentent la structure suivante (I) :

dans laquelle R ¹ , R ² , R ³ , R ⁴ , R ⁵ et R ⁶ , identiques ou différents., sont choisis parmi l'hydrogène, les groupements hydroxyie, gallate, méthyle ou osidique.

Ces monomères sont donc plus ou moins hydroxylés sur les noyaux A et 8, allant de 0 a 3 groupements hydroxylés. Ces monomères, hydroxyflavan-3-ol, peuvent également être estérifiés par un ou des groupements gallate et/ou glycosyiés et/ou méthylés sur les noyaux A, 8 et C Il existe deux grands types de proanthocyanidines, qui peuvent tous deux être utilisés dans le cadre de l'invention, ces deux types étant définis par les liaisons entre monomères : les proanthocyanidines de type A et les proanthocyanidines de type 8, Les proanthocyanidines de type B, qui sont préférées dans le cadre de l ^' Invention, sont des polymères d ^f hydroxyffevan~3~ oî dont deux monomères consécutifs sont reliés par une seule liaison covaiente entre deux carbones, selon les positions 4-6 ou 4-8 (positions respectives chez les deux monomères), comme illustré sur la Formule correspondant à un dimère comprenant une liaison 4-8, suivie d'une liaison 4-6 :

(II)

avec R ¹ , R ² , R ³ , R ⁴ , R ⁵ et R ⁶ , R\. R ² ', R ^y et R ^6' , R ^r , R , R ^3" , R ⁴ ", R ⁵ " et R ^6" , pouvant être les mêmes groupements ou des groupements différents, représentant l'hydrogène, un groupement hydroxyle, un groupement gallate, un groupement méthyle ou encore un groupement osidique, Les proanthocyanidines de type A sont des polymères dtiydroxyflavan- 3~ol dont deux monomères consécutifs son reliés par deux liaisons covalentes entre deux carbones, en position 2-7 et 4-8 (positions respectives chez les deux monomères), illustrées dans le cas d'un dimère par ia formule (III) ci-après i

(III) avec R ¹ , R ² _f R ³ , R ⁴ _f R ^s et ⁶ _; R ^r , R _f ^4' , R ^5' et R ^6' , pouvant être les mêmes groupements ou des groupements différents, représentant l'hydrogène, un groupement hydroxyie, un groupement gailate, un groupement mèthyl ou encore un groupement osidique.

Les proanthocyanidines pouvant être utilisées dans le cadre de Hnventîon sont constituées de 2 à n monomères (hydroxyflavan~3~ol) reliés par des liaisons covalentes précédemment décrites, selon toutes les déclinaisons possibles. En particulier, on utilisera dans ie cadre de l'invention une ou plusieurs proanthocyanidines., choisies parmi les dîmères, irimères et tétramères.

Les proanthocyanidines les plus connues sont des polymères de (-/+)- catéchine, (7÷}-épicatéchine., {-/-f-)~gallocatéchine et (-/÷)- épigallocatéchine. Dans le groupe des proanthocyanidines sont retrouvés des sous-groupes de molécules, comme., par exemple,, les prodelphinidines (prodeiphinidoi) ou tes procyanidines (procyanidol). Les procyanidines correspondent à des polymères de (-/ -)~catéehine et/ou de {-/-* ^■ }- épicatéchine. Les prodelphinidines des polymères de (-/- )~galfocatéchine et (~/-f }-épIgalfocaté hlne, Par {-·/+}, on désigne lisomère {+ ) ou {Isomère {-} ou un mélange de ces isomères»

Les proanthocyanîdines sont des produits naturels qui peuvent, notamment, être obtenus et purifiés à partir d'extraits de Faifopia spp, et en particulier de Falhpia x bohemka comme mis en évidence par les inventeurs, ou encore a partir de pépins de Vitis vinifera, de Pteridium spp., VMdum spp., Schfûops/s spp,, Vicia spp _v C /5 spp., Quercus spp,, De nombreuses proanthocyanldines commerciales sont disponibles, notamment chez LAF O T (Bordeaux, France), Organic Herb Inc. (Changsha, Chine) Nanjing Zelang Médical Technology Co., Ltd. (Jiangsu, Chine),

Dans le cadre de [Invention., on utilisera, de préférence, des proanthocyanîdines de type B, et de manière encore plus préférée des procyanidines de type 8, en particulier sous la forme de dimère, trimère ou tétramère,

Selon des modes de réalisation particuliers de l'invention, ladite au moins proanthocyanidine utilisée ne se présente pas sous la forme d'un extrait de Fafiopia spp, contenant des proanthocyanîdines^ et en particulier de Faiiopia x bohemica, et/ou ladite au moins proanthocyanidine est utilisée, en l'absence de catéehine et/ou d'épicatéchine,

Dans le cadre de l'invention, la ou les proanthocyanîdines utilisées peuvent être appliquées, sur le milieu contenant les microorganismes dont l'effet dénitrif nt est à limiter, ou mélangées à ce dernier, sous la forme d'une solution ou suspension aqueuse ou encore sous la forme d'une poudre ou granulé,

Les modes de réalisation dans lesquels les microorganismes sont présents dans un sol vont maintenant être décrits, de manière plus détaillée. Dans le cadre de l'invention, au moins une proanthocyanidine pourra, notamment, être utilisée pour favoriser la croissance végétale sur un sol de culture, par réduction de la dénitrification causée par les microorganismes présentant une activ té dénitriftante, et en particulier causée par tes bactéries dénitrifiantes, présents dans ledit sol Les proanthocyanidines étant des produits naturels., leur utilisation dans des cultures est en total respect avec l'environnement Les proanthocyanidines peuvent donc être utilisées en agriculture biologique.

Dans le cadre de l'utilisation selon l'invention sur un sol, au moins une proanthoeyanidine est appliquée sur un soi, et notamment un sol de culture, par exemple par dépôt ou pulvérisation sur la terre.

En particulier, ladite au moins proanthoeyanidine est utilisée pour limiter la dénitrlfication causée par des bactéries du sol, telles que Pseudo onas brassîcacearum et/ou Sac us cernas,

Dans le cas d'une solution de proanthocyanidine(s), celle-ci pourra être appliquée par pulvérisation ou tout autre moyen approprié. Les sols qui pourron être traités dans le cadre de llnvention sont, notamment, des sois de culture, de maraîchage, de culture céréaiière, de viticulture et plus généralement, des sols où des végétaux divers d'intérêt agronomique, notamment des plantes ou fleurs diverses, sont cultivés.

L'effet de la ou des proanthocyanidines utilisées sur la dénitriflcation sera obtenue, sur une large gamme de températures, notamment à une température du sol de 0 à 5Q C et avec un effet optimum à un taux d'humidité supérieur à 50% de la capacité au champ.

Une quantité efficace de proanthocyanldine{s) pour obtenir la limitation de la dénitriflcation souhaitée sera appliquée sur le sol, La quantité appliquée sera adaptée, par l'homme du métier, notamment, en fonction de la formulation et du taux d'humidité du sol. En particulier, de 0.01 à 10 mg/g de sol sec, et de préférence de 0,05 à 5 mg/g de soi sec, de proanthocyanidlne(s) est appliqué. Ces quantités sont applicables à des milieux solides, autres que le soi, précédemment cités, dans lesquels les microorganismes pourraient être présents»

Les résultats présentés dans le cadre de llnvention mettent en évidence que les proanthocyanidines, et en particulier les procyanldines de type B, permettent de réduire le processus de dénitriflcation bactérien des sols. Les résultats ont été obtenus sur des souches de bactéries en culture., mais également sur des soi de natures différentes (un de bord de rivière et un sol de prairie) et contenant des communautés de bactéries dénitrifiantes complexes et différentes,

L'utilisation selon { nvention permet donc de limiter les pertes d'azote par dénitrif ation et, par là même, les émissions de gaz à effet de serre et, également, de réduire la nécessité d'utiliser des engrais azotés en agriculture. Néanmoins, l'utilisation de proanthocyaoidine{s) peut être associée, dans le cadre de l'invention, à un ou plusieurs autres fertilisants (azoté ou phosphaté par exemple).

Dans le cadre de l'invention, au moins une proanfhocyanidine pourra être appliquée sur un sol de culture, pour favoriser la croissance de ladite culture en lutisnt contre la dénitrification causée par ies microorganismes, et en particulier les bactéries, présents dans ledit soi. Ladite application pourra être faite, sans application conjointe d'un engrais azoté.

Concernant maintenant, les modes de réalisation dans lesquels les microorganismes sont présents dans un milieu liquide., une composition sous forme solide ou liquide sera intégrée dans ledit milieu. Une quantité efficace de proant ocyanidine(s) pour obtenir la limitation de la dénitrification souhaitée sera Incorporée dans ledit milieu, La quantité incorporée sera adaptée,, par l'homme du métier. A titre d'exemple, de 0,01 à 2,5 mg de proanthocyanidine(s) par Millilitre de milieu liquide, et de préférence de 0,01 à 1 mg de proanthocyanidine(s) par Millilitre de milieu liquide sera incorporé.

Les exemples ci-après, en référence aux Figures annexées, permettent dillustrer l'Invention, mais n'ont aucun caractère limitatif.

Figyre I : pourcentage d'inhibition (relatif par rapport au contrôle) sur la dénitrification par Pseudomonss brassicacearum d'un mélange des composés majoritaires présents dans Faliopïa x bohemica et de /'extrait Faffapta x bo emîca. Les barres verticales correspondent aux variations obtenues sur les différents essais, Les étoiles indiquent ies variations significative par rapport au contrôle (test de Tukey; α<0,05). Fîspre 2 ; Chroroatograrnnie à 280 nm de S'extrait Faiiopia x bohemica présentant les proanthocyanidines et leurs monomères détectés ainsi que leur spectre UV.

Figuras 3A à 3€ : Spectres de masse ESï positifs des proanthocyanidines de type 8 retrouvées dans Fallopîa x bohemica (Dlmères (F gyre 3A) _f Trimères (Figure 38), Tétrarnères (Figura 3£).

Figure 4 : Pourcentage d'Inhibition de la dénitrïflcatlon et de la respiration de a) Pseudomonas brassîeacearum et b) E cereus en fonction de la concentration en proanthocyanidines purifiées» Les étoiles indiquent les différences significatives de moyennes avec le contrôle sans proanthocyanidines (Test de Tukey; a<0,05).

Figure S: Pourcentage d'inhibition de la dénitrîficatîon des sols de bord de rivière (Ainiî) et de prairie (Αΐηδ ^' ) en fonction de la concentration en proanthocyanidines commerciales. Les étoiles indiquent les différences significatives de moyennes avec le contrôle (Test de Tukey; <0.05).

Figure 6 ; Pourcentage d ^' Inhibition de la dénitrification du sol de prairie Ainl i après 7 jours d'Incubation (à la capacité au champ) e présence de différentes quantités de proanthocyanidines commerciales. Les étoiles indiquent les différences significatives de moyennes avec le contrôle (Test de Tukey; a<0.05).

F g re 7 t Pourcentage d'inhibition de la nifrifieation potentielle dans le sol de Ain il (triangle) et celui de A!n6 (rond) en fonction de la concentration en proanthocyanidines. Les barres indiquent des erreurs standards.

L MATES IELS ET MÉTHODES

A)- SOURCE BIOLOGIQUE DES PROANTHOCYANIDINES

- PREPARATION DES EXTRAITS DE FÂLLQPÎA SPP,

Des composés ont été extraits de racines et de rhizomes du génotype F. x bohemica (Chrtek et Chrtkovâ), Les rhizomes collectés sur le terrain ont été plantés en pots dans du compost ( lasmann 153/sand, 80/20), Les rhizomes ont été mis en culture pendant six mois dans une serre, sous lumière artificielle à 21 °C Les rhizomes et les racines produits ont été récoltés, nettoyés à l'eau et lyophilisés. Soixante-cinq grammes de rhizomes et racines lyophilisées broyés à l'aide d'un TissueLyser il bead mil! (Qlagen Venlo, Netherlands) ont été mis en suspension dans 750 ml d'un mélange eau : méthanol (50/50; v/v) et placés aux ultrasons pendant 30 min. Après fîltration à l'aide d'une pompe à vide, l'éluat a été collecté, et une autre extraction a été réalisée sur le résidu avec 2 x 500 mL de méthanol pur, Tous les éluats ont ensuite été mélangés et séchés, Puis, ces extraits secs ont été re~suspendu$ dans un mélange eau ; méthanol (50/50; v/v) à la concentration de 10 mg ml ^'1 .

- IDENTIFICATION DES PROANTHOCYÀNIDI ES CONTENUS DANS L'EXTRAIT DE E X 80 EMICA ;

L'extrait a été analysé à l'aide d'un appareillage d'UHPLC 1290 ïnfinity séries (Agitent Technologies, Santa Clara, USA) couplé à un détecteur UV â barrette de diodes G4212A DAD (Agitent Technologies, Santa Clara, USA) et on spectromètre de masse Q-TGF 6530 séries (Agllent Technologies, Santa Clara, USA),

La séparation des composés a été réalisée sur une colonne Porosheli 120 EC-C18 (2,7 pm _f 3,0 x 100 mm, Agllent Technologies, Santa Clara, USA) à une température de 60°C. La phase mobile était un gradient linéaire de 0,4% d'acide acétique dans de l'eau (solvant A) et acétonltrile (soîvant B). La phase mobile passait à travers la colonne à un flux de 0,6 ml/min. Le gradient linéaire était de G à 1,5 min 2% solvant B; .1,5 à 22 min 2% â 17% solvant B; 22 à 41 min 17% â 1.00% solvant B; 41 à 41,5 min 100% solvant B, Le système a été préalablement équilibré avant chaque échantillon, Le volume d'Injection était de ΙμΙ.

Les spectres UV ont été enregistrés entre 190 et 600 nm et la réponse à 280 nm a été utilisée pour les interprétations qualitatives. La source ESI a été optimisée de la manière suivante : mode Ionisation positive, scan des spectres de m/z 80 à 2000, voltage du capillaire 3,0 kV, fragmenteur 70 V, la collision Induite de dissociation (collislon-induced dissociation ; CID) a été fixée à 20 eV. L'azote a été utilisé comme nébuilseur en gaz avec un flux de 12 l/min et: une température 310 °C à 40 psi» Des proanthocyanidines ont été identifiées dans l'extrait par analyse des spectres UV, HS and MS/MS, en utilisant le logiciel MassHunter Qualitative Analyste (Agitent Technologies; Santa Clara, USA), les spectres obtenus étant présentés dans la partie II B).

- PURIFICATION DES PROANTHOCYANIDINES. DE E x SOHEMICA

Les proanthocyanidines contenues dans l'extrait de E x bohe ica ont été purifiées â l'aide d'une colonne de Sephadex LH20. Le Sephadex LH 20 a été préalablement équilibré trois fois en humidifiant 25 g de Sephadex LH 20 avec 100 ml d'éthanol 80% et en retirant ensuite le surnageant L'extrait E x bohemica (100 ml) concentré à 10 mg mi ^'1 a ensuite été ajouté au Sephadex LH 20 équilibré et agité pendant: 3 min. Le Sephadex chargé en extrait a été chargé dans un Buchner en verre de 10Q ml Le Sephadex LH 20 a été lavé avec de i'éthano! 95% jusqu'à ce que j'absorbance de i'éiuat à 280 nro soit proche de zéro. Le Sephadex LH 20 a ensuite été lavé avec de l'acétone 50% jusqu'à ce que le Sephadex soit totalement lavé, L'éluat d'acétone 50% récupéré a été évaporé à l'aide d'un évaporateur rotatif. Les proanthocyanidines sèches, ainsi purifiées ont par la suite été mises en solution à 10 mg.mf ¹ dans de l'eau, cette solution étant nommée par la suite proanthocyanidines purifiées. Cette solution contient les dlmères, trimères et tétramères identifiés sur les Figures 3A et 38, mais pas les monomères catéchine et épicatéchine,

s)- SOURCE COMMERCIALE DES PROANTHOCYA DÎ ES

îl s'agit de proanthocyanidines purifiées à partir de pépins de raisins (Bîotan, Laffort, Bordeaux, France). Une analyse par UHPLC a permis de vérifier que ces proanthocyanidines n'étaient pas en mélange avec de la catéchine, ni avec de ί 'épicatéchine,

IL EFFET DES PROANTHOCYANIDINES SUR LA DENITRÎFÏCÀTÎO :

A)- TEST DE L'EFFET DES COMPOSES MAJORITAIRES CONTENUS A S LES EXTRAITS DE E X BOHEMICA

L'effet de la catéchine, l 'épicatéchine, le picéide, le resvératrol, rémodine et le physeion, Identifiés par Bardon et al (2014), comme les composés majoritaires des extraits de Failopia x bohemica, ont été testés en mélange sur l'activité de dénitrificstion de Pseudomonas brass/cacearvm, comme décrit dans le paragraphe suivant, A partir de produits commerciaux purs (Slgma-Âl rlch, Saint Louis, USA), tous ces composés ont été préparés en mélange dans une solution méthanol/eau (v/v, 50/50} à la concentration retrouvée dans les extraits de Faliopia x bohemica. Les concentrations de ces composés exposés aux bactéries dans le milieu sont de 0,0037 mg ml ^*1 catéchine, 0,0057 mg mi ^"1 épicatéchine, 0,022 mg ml ^"1 picéide., 0,0007 mg mi ^"1 resvèratrol, 0,0015 mg ml ^*1 émodine et 0,0047 mg ml ^"1 physcion),

B>- SOUCHES BACTERIENNES DEN TiRiFI ANTES

L ^' effet des proanthocyanidines purifiées à partir des extraits de F. x bohemica a été testé à des concentrations de 0,1 ; 0,05 ; 0,01 ou 0 mg.ml ^"1 sur la dénitriflcation et la respiration de Pseudomanas brasscaœaru NFH421 et Badllus œreus A19, deux bactéries dénltriflantes fréquemment rencontrées dans les sois, Four cela, 5 ml de milieu de croissance liquide MB avec 20 mM de NOs, contenant les différentes concentrations en proanthocyanidines,. a été inoculé à une densité optique de (D.O.) ~ 0 L Les mesures de dénitrification ont été réalisées dans des flacons plasma scellés par un bouchon en caoutchouc, par le dosage de l'accumulation du f¾Q, Ceci a été réalisé après avoir remplacé l'air des flacons par un mélange d'hélium et d'acétylène (He/ ^Hs; 90/10), Chacun des traitements a été réalisé en quatre répllcats. L'acétylène a pour fonction de bloquer la transformation de N ₂ 0 en _2f la mesure de l'émission de f¾G étant alors reconnue comme représentative de émission de ₂ 0 et H ₂ (Dambreville et al. 2006).

Les mesures de respiration ont été réalisées dans des flacons plasma scellés par dosage de Accumulation de CO _?. sans remplace l'atmosphère des flacons.

Le NjO et le C0 ₂ émis ont été mesurés toutes les deux heures pendant 48 heures à l'aide d'un microcatharomètre (pGO 30Q0 _f SRA instruments,. Marcy tolle, France).

C)- COMMUNAUTES COMPLEXES DE SOLS EN SUSPENSION

Afin de tester l'effet des proanthocyanidines sur la dé itrification de communautés complexes présentes dans le sol _, , des proanthocyanidines commerciales purifiées à partir de pépins de raisins ont été utilisées (Laffort, Bordeaux, France). Des échantillons de deux sols ont été récoltés sur les sites Ainlî (45°57 ^ί 53 ^ίί ; 5 ^Ό 15'25Έ) et ΑΙηβ (45°48Ί5"Ν; 5°10 ^* 29"E), puis tamisés à 2 mm, Le taux de déûitrifîcatlon a été mesuré par émission de %G toutes les deux heures pendant 30 heures en anaérobiose avec un mîcro- cathanomètre (p6C-R30Û0 _f SRA instruments., Marcy l'Etoile, France). Un gramme de sol équivalent sec a été placé dans un flacon plasma de !50mi scellé par un bouchon en caoutchouc. L'atmosphère du flacon a été remplacée par un mélange He/CiH _? . mixture (90/10 v/v). Les sols ont été mis en suspension dans 10 mi de tampon phosphate Ô.J.M (MaH^PG et NaHPO^ pH-7,5) supplémenté de glucose (0,5mg de C-giucose.mr ¹ ), d'acide glutamique (0,5mg de C-atide glutarnique.mr ¹ ) et de N£¾ (20 mM). L'effet des proanthocyanidlnes sur la déni rification a été mesuré pour des concentrations de 2,5; i; 0,5; 0,1; 0,05; 0,01 et 0 mg.ml ^* * au final, en ajoutant de l'eau ou des proanthocyanidlnes aux suspensions de sols» Les suspensions de sol on été maintenues en agitation à 28°C tout au long de l'expérience. Tous les traitements ont été réalisés en quatre réplicats.

D)- EFFETS DES PROA THOCVA ÎDINES SUR UNE COMMUNAUTÉ COMPLEXE DE SOL RAPPORTES EN MASSE DE PROANTHOCYANÏDÎNES PAR RAPPORT A UNE MASSE DE SOL SEC

Une gamme de concentrations en proanthocyanidlnes actives sur la dénitrification du sol rapportée en g de sol sec a été réalisée. L sol utilisé pour cette expérience est le soi Ain IL Dix grammes de sol équivalent sec ont été incubés en flacon plasma à l'air libre pendant ? jours à 28°€ à la capacité au champ, L'équivalent de 10; 5; 1; 0,5; 0,1; 0,05; 0,01 et mg. g ^"1 de sol sec de proanthocyanidlnes commerciales ont été apportés lors de humidification à l capacité au champ du sol. Chaque traitement a été réalisé en quatre réplicas. Après 7 jours, la mesure de dénitrlfieation des sols traités a été réalisée par mesure d'émission de i¾û en anaérobiose toutes les 30 min pendant 6 heures à l'aide d'un mîcrocatharomètre (pG€- 3000, SRA instruments, Marcy l'Etoile, France), Les flacons plasma on été scellés par un bouchon en caoutchouc, l'atmosphère des flacons s été remplacée par de l'hélium à l'aide d'un banc dlnertage. Les sols ont été supplémentés d'une solution de 0,5 ml contenant l'équivalent de 50 pgN- NCh.g ^"1 sol sec, 0,5 mg de C-aclde glutarnique.g ^"1 de sol sec et 0,5 mg de C-glucose.g ^"1 de soi sec.

IIL RESULTATS

A)- EFFET DES COMPOSES MAJORITAIRES SUR LA DENITRIFÎCAÏION DE

PSEUDQMQNÂS 8RA$STCACEARUM

La dénitrlficatlon de Pseudamo s èrassicacearu n'est pas Inhibée par 1e mélange des composés majoritaires (catéchlne., épicatéchïne,, picéide, resvératrol, émodine et physcion), présents dans les extraits de Faiïopia x ùohemÎcs, alors qu ^' un effet inhibiteur marqué est obtenu avec l'extrait Failopia x ho emiœ pour une même concentration de ces composés, comme illustré dans la Figure I. Il apparaît donc que l'activité inhibitrice obtenue n ^' implique pas ces composés,.

8)- IDENTIFICATION DES PROANTHOCYANIDINES CONTENUES DANS LES EXTRAITS DE F. X BOHEMICÂ

Les proanthocyanidines détectées par UHPLC dans l ^' extrait de de F, x bo emîca sont des procyanldines de type B allant du d mère au téfcramère de catéchlne et d'épicatéchine avec une absorbaoce maximaie à 278 nm et des masses moléculaires de 579,15, 867,21et 1155,27 g mol ^"1 , comme présenté dans les Figures 2 et 3 (le spectre de la Figyre 3Â correspond au dlmère, le spectre de la Figure 38 au trimère et le spectre de la Figure 3C au tétramère).

c)- EFFET DES PROANTHOCYANÏDINES PURIFIÉES SUR LA DENÈTRÈFICATIGN

DES BACTERIES DEN ÎXR l FI AN T E S

II apparaît que les proanthocyanidines purifiées inhibent significativement la dénitrlfication de Pseudomonas brassicacearu et B, cereus _t comme cela ressort des résultats présentés Figure 4, Pour les deux souches bactériennes,, la dénitrification est affectée jusqu'à 80%. La réponse à l'inhibition est dose-dépendante entre 0,01 et 2,,5 mg.mi . D)- EFFET DES PROANTHOCYÂNIDINES COMMERCIALES SUR LA DENITRIFICATION DES SOLS EN SUSPENSION

Il a également été observé que les proanthocyânidines commerciales testées inhibent significativement la dénit if catlon des deux sols en suspension (Figure S). L'inhibition est dose-dépendante avec un maximum d ^' Inhibition atteint dès 0,5 mg.mi ^"1 pour le sol Άίηί! et 1 nig. mi ⁱ pour le soi Ain6. Le maximum d'inhibition est de 85% pour le soi Ain il et de 80% pour le sol Αίηδ. Le plus faible effet significatif mesuré était à une concentration de 0,01 mg.mî ¹ ,

E)~ EFFETS DES PROANTHOCYÂNIDINES SUR UNE COMMUNAUTÉ COMPLEXE DE SOL RAPPORTES EN MASSE DE PROANTHOCYANIDINES PAR RAPPORT A UNE MASSE DE

SOL SEC

Les proanthocyânidines commerciales inhibent significativement la dénitrification du sol Âînll après 7 jours de contact avec lesdites proanthocyânidines (Figure S), L'Inhibition est dose-dépendante avec un maximum de 100% dinhibition atteint à 5 mg.g ^'1 de sol sec. Le plus faible effet significatif était à une concentration de ô,i mg.g ^{" ,} de sol sec,

F)- EFFET DES PROANTHOCYÂNIDINES SUR LA TFJFÎCATÎON

La nitritlcafion potentielle des deux types de sols (AM I. et Αίηβ) a été mesurée en suspension (1 g de sol équivalent sec pour 10 ml) sans proanthocyânidines (témoin) et en présence des proanthocyânidines commerciales, concentrées à 0,5 ; 0,1 ; 0,05 et 0,01 g.rni ^" *, dans une solution tampon phosphate au pH des sols 7,5 (NaHiPC? et NaHPG», 12Η ₂ 0) (pour limiter les variations de pH au court de l'incubation) supplémentée en (NH^SGs (SO g.mL ^"1 ). Les sols ont été placés dans des flacons plasma de 150 ml en aérobiose bouchés par du psrafilm, Les flacons ont été mis à agiter à 140 rpm à 28 ^e C« Chacune des conditions a été réalisée en 4 réplicas.

La mesure de nltrifscation potentielle (NEA : « nltrifylng enzymatic actlvlty »} a été réalisée en dosant la production de NC¾ au cours du temps à l'aide d ^f un chromafographe ionique Dionex DX 120 (Thermo Fisher Sclentific, Waltham, USA), en prélevant et en filtrant à 0,2 pm, 1 ml de suspension toutes les 2 h entre 2 et lOh. La mesure de nitrtficatîon potentielle correspond à la mesure du pool enzymatlque présent dans l'échantillon initialement, et est exprimée par la production de pg de N- C .g ^" de sol sec. fi ¹ entre 2 et 10 heures.

Les résultats sont présentés Figyre 7. Ces résultats montrent qu'aux mêmes concentrations testées sur ia dénitrification, les proanthocyanidines n ^' ont pas d'effet significatif sur la nitrifeation.

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