精浆的用途 技术领域

本发明涉及精浆的用途。

背景技术

肿瘤发生是由于细胞电子平衡失调所致。 活性氧 （自由基 ROS ) 是一种 缺乏电子的物质 （不饱和电子物质）， 进入人体后到处争夺电子， 如果夺去细 胞蛋白分子的电子， 使蛋白质接上支链发生垸基化， 形成畸变的分子而致癌。 该畸变分子由于自己缺少电子， 又要去夺取邻近分子的电子， 又使邻近分子 也发生畸变而致癌。 这样， 恶性循环就会形成大量畸变的蛋白分子。 这些畸 变的蛋白分子繁殖复制时， 基因突变， 形成大量癌细胞， 最后出现癌症症状。 而当自由基或畸变分子抢夺了基因的电子时， 人就会直接得癌症。 人体得到 负离子后， 由于负离子带负电荷， 有多余的电子， 可提供细胞缺失的电子， 从而阻断恶性循环， 癌细胞就可防止或被抑制。

专利 CN200710017785.3已描述了动物精液药材在治疗肿� �、抑郁症等多 种疾病中的药物应用， 而精液包括精浆与精子， 精浆是由前列腺液、 精囊液、 附睾液和尿道球腺分泌的少量液体一起组成， 精浆是输送精子的必须介质， 并为精子提供能量和营养物质； 精浆由前列腺、 精囊腺和尿道球腺分泌产生， 精浆里含有果糖和蛋白质， 是精子的营养物质， 精浆中还含有前列腺素和一 些酶类物质， 是一类天然有机物质， 没有毒副作用。

现有技术并未确定动物精液中何种物质起到抑 制肿瘤等疾病的作用， 直 接应用动物精液制备的药物纯度也较低， 因此效用较差， 患者的服用剂量大; 同时， 在传统的认识中， 人们并没有发现精浆的药用价值。

发明内容

本发明提供的精浆的新用途， 主要用于抑制癌细胞的扩散， 特别是大于

3kDa的精浆蛋白， 对癌细胞的扩散抑制效果非常明显。

本发明的具体技术解决方案如下：

精浆用于抑制癌细胞的扩散， 精浆用于抑制肺癌细胞、 乳腺癌细胞、 大 肠癌细胞、 宫颈癌细胞、 肝癌细胞或胃癌细胞等癌细胞的扩散。 精浆为活性成分的药物制剂。

精浆在制备治疗癌症的药物中的应用。

精浆在制备治疗肺癌、 乳腺癌、 大肠癌、 宫颈癌、 肝癌或胃癌等癌症的 药物中的应用。

精浆用于制备胶囊、 颗粒、 片剂、 滴丸、 中西药复方制剂、 口服液或注 射液。

精浆蛋白用于抑制癌细胞的扩散， 精浆蛋白用于抑制肺癌细胞、 乳腺癌 细胞、 大肠癌细胞、 宫颈癌细胞、 肝癌细胞或胃癌细胞等癌细胞的扩散。

精浆蛋白为活性成分的药物制剂。

精浆蛋白在制备治疗癌症的药物中的应用。

精浆蛋白在制备治疗肺癌、 乳腺癌、 大肠癌、 宫颈癌、 肝癌或胃癌等癌 症的药物中的应用。

精浆用于制备胶囊、 颗粒、 片剂、 滴丸、 中西药复方制剂、 口服液或注 射液。

上述精浆蛋白尤其是分子直径大于 3kDa， 和 /或浓度大于 2.5%的精浆蛋 白， 效果更佳。

本发明的优点在于：

本发明通过大量的实验研究， 突破现有技术应用上的局限性， 获取了精 浆在治疗肺癌、 乳腺癌、 大肠癌、 宫颈癌、 肝癌或胃癌等癌症的药物中的应 用。

同时， 本发明通过实验发现， 抑制癌细胞的作用还与精浆中精浆蛋白的 分子直径以及与精浆浓度有关， 精浆蛋白分子大于 3kDa后抑制作用明显， 精 浆浓度或精浆蛋白浓度处于 2.5%~5.0%时效果一般， 5.0%~7.5%效果较佳， 大 于 7.5%~10.0%后抑制作用明显。

精浆可制成可制成胶囊、 颗粒、 片剂、 滴丸、 口服液、 注射液等各种制 剂应用于临床， 优选为胶囊。 本品也可与其他药物制成中西药复方制剂应用 。 具体实施方式

人大细胞肺肿瘤细胞株 NCI-H460分析， 所用试剂如下：

RPMI-1640培养基为 Thermo公司 （北京） 产品； 胎牛血清为 Thermo公 司 （北京） 产品； MTT为 Invitrogen公司产品； 其余试剂均为进口分析纯； 磷酸缓冲盐溶液（PBS ) : NaCl 8g， KC1 0.2g, Na ₂ HP0 ₄ 1.44g， KH ₂ P0 ₄ 0.24g,溶于 800mlddH ₂ O， HC1调节 PH值至 7.4，定容至 1L， 121 °C高压灭菌，

4°C保存。

0.25%胰酶溶液： 1.25g胰酶， 溶解于 500mlPBS,过滤除菌后 4°C保存。 首先进行样品分离： 取 -20°C保存于精液 37°C缓慢融化后， 冰浴条件下， 吸取 2ml样品， 4°C， 3000rpm离心 10min， 精液样品清晰分层， 其中上清部 分为精浆， 将精浆移入另一支 EP管中， 标记为 "上清"， 沉淀部分为精子， 以 2mlPBS重悬， 标记为 "沉淀"；

同取融化后样品，冰浴条件下，吸取 4ml，加入超滤离心管中， 4°C， 7500rpm 离心 30min， 吸取滤过液补足 4ml， 标记为 "小分子"， 吸取 PBS将滤出部分 充分混悬并补足 4ml， 标记为 "大分子"；

其次进行目标细胞培养： 复苏 NCI-H460—支， 37°C， 5% C0 ₂ 培养 5天 至细胞增殖至一定数量， 0.25%胰酶消化， 1640培养基将细胞稀释至 1*10 ⁵ 个 /ml, 接种至 96孔板， 每孔 lOO L,继续于 37°C， 5% C0 ₂ 培养 24h至 细胞稳 定贴壁；

然后进行加药及检测： 按表 1所示浓度分别加入样品， 每个浓度取 3个 畐 IJ孔， 37°C， 5% C0 ₂ 培养 24h后， 换液并用 PBS轻柔吹吸洗去孔内残余培养 液后， 每孔加入 MMT溶液 5μ 新鲜培养基 100μΙ^。 37°C孵育 3h， 吸去培 养基， 每孔加入 DMSO150 L将 MTT-甲充分溶解， 溶解液转移至 96孔酶标 板中， 每孔转移 ΙΟΟμ 490nm处读取吸光度。

按表 1 所示浓度分别加入样品上清、 沉淀， 大分子部分、 小分子部分， 每个浓度取 4个副孔， 37°C， 5% C0 ₂ 培养 24h后， 换液并用 PBS轻柔吹吸洗 去孔内残余培养液后， 每孔加入 MMT溶液 5 L， 新鲜培养基 100μΙ^。 37°C孵 育 3h， 吸去培养基， 每孔加入 DMSO150 L将 MTT-甲充分溶解， 溶解液转 移至 96孔酶标板中， 每孔转移 ΙΟΟμ 490nm处读取吸光度。

(μ! (μ!

A 2.5 97.5 2.5%

B 5.0 95.0 5.0%

C 7.5 92.5 7.5%

D 10.0 90.0 10.0%

E 12.5 87.5 12.5%

F 15.0 85.0 15.0%

G 17.5 82.5 17.5%

H 20.0 80.0 20.0% 结果与讨论： 酶标仪分别读取样品混合物、 样品上清、 样品沉淀、 样品 大分子、 样品小分子对细胞作用作用的读数， 求均值， 并以浓度为 0处读数 作为对照， 按以下公式求抑制百分率：

抑制百分率 = ( 1-实验组 OD值 /对照组 OD值） *100%，

结果见表 2、 表 3、 表 4、 表 5、 表 6:

样品浓度 0D490 抑制百分

(ν/ν) 孔 1 孔 2 孔 3 均值 ^"牛

( % )

0 0.611 0.664 0.576 0.617 --

2.5% 0.608 0.464 0.621 0.564 8.59

5.0% 0.425 0.227 0.264 0.305 50.57

7.5% 0.267 0.148 0.070 0.162 73.74

10.0% 0.044 0.024 0.020 0.029 95.30

12.5% 0.014 0.010 0.010 0.011 98.22

15.0% 0.010 0.009 0.009 0.009 98.54

17.5% 0.013 0.006 0.008 0.009 98.54

20.0% 0.011 0.008 0.007 0.009 98.54 表 3作用后 MMT实验结果

表 4样品沉淀作用后 MMT实验结果

表 5样品小分子作用后 MMT实验结果 样品浓度 0D490

(v/v) 孔 1 孔 2 孔 3 孔 4 均值

0.00% 0.405 0.355 0.387 0.404 0.388

2.50% 0.324 0.395 0.401 0.450 0.392

5.00% 0.254 0.342 0.245 0.250 0.273

7.50% 0.165 0.325 0.231 0.220 0.235

10.00% 0.283 0.347 0.410 0.307 0.337

12.50% 0.315 0.335 0.457 0.315 0.356

15.00% 0.258 0.359 0.378 0.269 0.316

17.50% 0.246 0.257 0.382 0.282 0.291

20.00% 0.259 0.247 0.255 0.271 0.258 表 6样品大分子作用后 MMT实验结果

综合分析以上各表。 由表 2可知， 该样品对肿瘤细胞有致死作用， 尤其 是浓度大于 10%后， 抑制作用明显； 表 3~表4显示， 将该样品离心分离后， 上清即精浆部分对肿瘤细胞有明显致死作用， 并有剂量依赖性， 沉淀即精子 部分对肿瘤细胞则无明显致死作用； 表 5~表6则表明， 该样品经过超滤离心 管分离后，小于 3kDa的小分子部分对肿瘤细胞无明细致死作用� �而大于 3kDa 的大分子部分对肿瘤细胞致死作用明显， 具有明显的剂量依赖性。

综上所述， 精浆对肺癌细胞有明显的致死作用。 人大肠癌细胞株 PA319分析， 所用试剂如下：

RPMI-1640培养基为 Thermo公司 （北京） 产品； 胎牛血清为 Thermo公 司 （北京） 产品； MTT为 Invitrogen公司产品； 其余试剂均为进口分析纯； 磷酸缓冲盐溶液（PBS ): NaCl 8g， KC1 0.2g, Na ₂ HP0 ₄ 1.44g， KH ₂ P0 ₄ 0.24g，溶于 800mlddH ₂ O， HC1调节 PH值至 7.4，定容至 1L， 121 °C高压灭菌，

4°C保存。

0.25%胰酶溶液： 1.25g胰酶， 溶解于 500mlPBS,过滤除菌后 4°C保存。 首先进行样品分离： 取 -20°C保存于精液 37°C缓慢融化后， 冰浴条件下， 吸取 2ml样品， 4°C， 3000rpm离心 10min， 精液样品清晰分层， 其中上清部 分为精浆， 将精浆移入另一支 EP管中， 标记为 "上清"， 沉淀部分为精子， 以 2mlPBS重悬， 标记为 "沉淀"；

同取融化后样品，冰浴条件下，吸取 4ml，加入超滤离心管中， 4°C， 7500rpm 离心 30min， 吸取滤过液补足 4ml， 标记为 "小分子"， 吸取 PBS将滤出部分 充分混悬并补足 4ml， 标记为 "大分子"；

其次进行目标细胞培养： 复苏 PA319—支， 37°C， 5% C0 ₂ 培养 5天至细 胞增殖至一定数量， 0.25%胰酶消化， 1640培养基将细胞稀释至 1*10 ⁵ 个 /ml, 接种至 96孔板，每孔 lOO L,继续于 37°C， 5% C0 ₂ 培养 24h至 细胞稳定贴壁； 然后进行加药及检测： 按表 1所示浓度分别加入样品， 每个浓度取 3个 畐 IJ孔， 37°C， 5% C0 ₂ 培养 24h后， 换液并用 PBS轻柔吹吸洗去孔内残余培养 液后， 每孔加入 MMT溶液 5μ 新鲜培养基 100μΙ^。 37°C孵育 3h， 吸去培 养基， 每孔加入 DMSO150 L将 MTT-甲充分溶解， 溶解液转移至 96孔酶标 板中， 每孔转移 ΙΟΟμ 490nm处读取吸光度。

按表 1 所示浓度分别加入样品上清、 沉淀， 大分子部分、 小分子部分， 每个浓度取 4个副孔， 37°C， 5% C0 ₂ 培养 24h后， 换液并用 PBS轻柔吹吸洗 去孔内残余培养液后， 每孔加入 MMT溶液 5 L， 新鲜培养基 100μΙ^。 37°C孵 育 3h， 吸 每孔加入 DMSO150 L将 MTT-甲充分溶解， 溶解液转

\〇

移至 96孔酶标板中， 每孔转移 ΙΟΟμ 490nm处读取吸光度。

结果与讨论： 酶标仪分别读取样品混合物、 样品上清、 样品沉淀、 样品 大分子、 样品小分子对细胞作用作用的读数， 求均值， 并以浓度为 0处读数 作为对照， 按以下公式求抑制百分率：

抑制百分率 = ( 1-实验组 OD值 /对照组 OD值） *100%，

结果见表 2、 表 3、 表 4、 表 5、 表 6:

样品浓度 0D490 抑制百分

(v/v) 孔 1 孔 2 孔 3 均值 ^"牛

(% )

0 0.622 0.583 0.604 0.603

2.5 % 0.512 0.633 0.538 0.561 6.97

0.339 0.385 0.356 0.360 40.30 7.5 % 0.164 0.243 0.241 0.216 64.18

10.0% 0.041 0.126 0.049 0.072 88.06

0.016 0.028 0.058 0.034 94.36 o

15.0% 0.014 0.035 0.017 0.022 96.35

0.008 0.037 0.024 0.023 96.19

20.0% 0.028 0.019 0.016 0.021 96.52 表 3作用后 MMT实验结果

表 4样品沉淀作用后 MMT实验结果

样品浓度 0D490

(v/v) 孔 1 孔 2 孔 3 孔 4 均值

0 0.479 0.363 0.455 0.407 0.426

0.382 0.436 0.413 0.397 0.407

0.392 0.422 0.385 0.377 0.394

7.5 % 0.426 0.397 0.402 0.419 0.411

10.0 % 0.406 0.355 0.395 0.372 0.382

12.5 % 0.296 0.381 0.318 0.357 0.338 0.318 0.384 0.402 0.344 0.362

17.5 % 0.356 0.382 0.317 0.357 0.353

20.0 % 0.371 0.296 0.372 0.337 0.344 o 表 5样品小分子作用后 MMT实验结果 样品浓度 0D490

(v/v) 孔 1 孔 2 孔 3 孔 4 均值

0 0.421 0.373 0.369 0.365 0.382

0.443 0.348 0.364 0.433 0.397

0.389 0.312 0.338 0.385 0.356

7.5 % 0.287 0.354 0.306 0.317 0.316

10.0 % 0.255 0.362 0.208 0.339 0.291

12.5 % 0.214 0.387 0.223 0.232 0.264

0.372 0.241 0.335 0.288 0.309

17.5 % 0.310 0.246 0.326 0.251 0.283

20.0 % 0.334 0.207 0.258 0.220 0.255

表 6样品大分子作用后 MMT实验结果 样品浓度 0D490 抑制百分

(v/v) 孔 1 孔 2 孔 3 孔 4 均值 ^"牛

( % )

0 0.372 0.466 0.414 0.472 0.431

2.5 % 0.311 0.438 0.339 0.296 0.346 19.72

5.0 % 0.155 0.131 0.118 0.160 0.141 67.29

7.5 % 0.041 0.028 0.024 0.035 0.032 92.58

10.0% 0.011 0.038 0.022 0.045 0.029 93.27

12.5 % 0.033 0.012 0.019 0.032 0.024 94.43

15.0% 0.009 0.041 0.029 0.025 0.026 93.97

17.5 % 0.021 0.017 0.035 0.023 0.024 94.43 20.0% 0.019 0.035 0.023 0.023 0.025 94.20 综合分析以上各表。 由表 2可知， 该样品对肿瘤细胞有致死作用， 尤其 是浓度大于 10%后， 抑制作用明显； 表 3~表4显示， 将该样品离心分离后， 上清即精浆部分对肿瘤细胞有明显致死作用， 并有剂量依赖性， 沉淀即精子 部分对肿瘤细胞则无明显致死作用； 表 5~表6则表明， 该样品经过超滤离心 管分离后，小于 3kDa的小分子部分对肿瘤细胞无明细致死作用� �而大于 3kDa 的大分子部分对肿瘤细胞致死作用明显， 具有明显的剂量依赖性。

综上所述， 精浆对大肠癌细胞有明显的致死作用。 人宫颈癌细胞株 Hda229分析， 所用试剂如下：

RPMI-1640培养基为 Thermo公司 （北京） 产品； 胎牛血清为 Thermo公 司 （北京） 产品； MTT为 Invitrogen公司产品； 其余试剂均为进口分析纯； 磷酸缓冲盐溶液（PBS ) : NaCl 8g， KC1 0.2g, Na ₂ HP0 ₄ 1.44g， KH ₂ P0 ₄ 0.24g,溶于 800mlddH ₂ O， HCl调节 PH值至 7.4，定容至 1L， 121 °C高压灭菌， 4°C保存。

0.25%胰酶溶液： 1.25g胰酶， 溶解于 500mlPBS,过滤除菌后 4°C保存。 首先进行样品分离： 取 -20°C保存于精液 37°C缓慢融化后， 冰浴条件下， 吸取 2ml样品， 4°C， 3000rpm离心 10min， 精液样品清晰分层， 其中上清部 分为精浆， 将精浆移入另一支 EP管中， 标记为 "上清"， 沉淀部分为精子， 以 2mlPBS重悬， 标记为 "沉淀"；

同取融化后样品，冰浴条件下，吸取 4ml，加入超滤离心管中， 4°C， 7500rpm 离心 30min， 吸取滤过液补足 4ml， 标记为 "小分子"， 吸取 PBS将滤出部分 充分混悬并补足 4ml， 标记为 "大分子"；

其次进行目标细胞培养： 复苏 Hela229—支， 37°C， 5% C0 ₂ 培养 5天至 细胞增殖至一定数量，0.25%胰酶消化， 1640培养基将细胞稀释至 1*10 ⁵ 个 /ml, 接种至 96孔板，每孔 lOO L,继续于 37°C， 5% C0 ₂ 培养 24h至 细胞稳定贴壁； 然后进行加药及检测： 按表 1所示浓度分别加入样品， 每个浓度取 3个 畐 IJ孔， 37°C， 5% C0 ₂ 培养 24h后， 换液并用 PBS轻柔吹吸洗去孔内残余培养 液后， 每孔加入 MMT溶液 5μ 新鲜培养基 100μΙ^。 37°C孵育 3h， 吸去培 养基， 每孔加入 DMSO150 L将 MTT-甲充分溶解， 溶解液转移至 96孔酶标 板中， 每孔转移 ΙΟΟμ 490nm处读取吸光度。

按表 1 所示浓度分别加入样品上清、 沉淀， 大分子部分、 小分子部分， 每个浓度取 4个副孔， 37°C， 5% C0 ₂ 培养 24h后， 换液并用 PBS轻柔吹吸洗 去孔内残余培养液后， 每孔加入 MMT溶液 5 L， 新鲜培养基 100μΙ^。 37°C孵 育 3h， 吸去培养基， 每孔加入 DMSO150 L将 MTT-甲充分溶解， 溶解液转 移至 96孔酶标板中， 每孔转移 ΙΟΟμ 490nm处读取吸光度。

结果与讨论： 酶标仪分别读取样品混合物、 样品上清、 样品沉淀、 样品 大分子、 样品小分子对细胞作用作用的读数， 求均值， 并以浓度为 0处读数 作为对照， 按以下公式求抑制百分率：

抑制百分率 = ( 1-实验组 OD值 /对照组 OD值） *100%，

结果见表 2、 表 3、 表 4、 表 5、 表 6:

抑制百分 (v/v) 孔 1 孔 2 孔 3 均值 ^"牛

( % )

0 0.633 0.487 0.518 0.546

2.5 % 0.586 0.495 0.473 0.518 5.13

0.269 0.368 0.344 0.327 40.11

7.5 % 0.273 0.185 0.277 0.245 55.13

10.0% 0.212 0.098 0.101 0.137 74.91

0.033 0.092 0.037 0.054 90.11

15.0% 0.018 0.055 0.041 0.038 93.04

0.039 0.013 0.056 0.036 93.41

20.0% 0.011 0.048 0.052 0.037 93.22 表 3作用后 MMT实验结果

表 4样品沉淀作用后 MMT实验结果

样品浓度 0D490

(v/v) 孔 1 孔 2 孔 3 孔 4 均值 0 0.367 0.435 0.377 0.377 0.389

0.386 0.344 0.462 0.236 0.357

0.364 0.421 0.335 0.364 0.371 o o

7.5 % 0.388 0.426 0.289 0.293 0.349

10.0 % 0.401 0.335 0.273 0.299 0.327

12.5 % 0.319 0.265 0.292 0.260 0.284

0.216 0.312 0.357 0.379 0.316

17.5 % 0.342 0.355 0.246 0.289 0.308

20.0 % 0.384 0.229 0.273 0.306 0.298

表 5样品小分子作用后 MMT实验结果 样品浓度 0D490

(v/v) 孔 1 孔 2 孔 3 孔 4 均值

0 0.453 0.411 0.314 0.286 0.366

0.398 0.333 0.312 0.361 0.351

0.386 0.299 0..346 0.481 0.378

7.5 % 0.223 0.354 0.466 0.285 0.332

10.0 % 0.242 0.338 0.267 0.369 0.304

12.5 % 0.211 0.374 0.283 0.208 0.269

0.328 0.392 0.203 0.225 0.287

17.5 % 0.288 0.312 0.195 0.233 0.257

20.0 % 0.303 0.215 0.228 0.306 0.263

表 6样品大分子作用后 MMT实验结果 样品浓度 0D490 抑制百分

(v/v) 孔 1 孔 2 孔 3 孔 4 均值 ^"牛

( % )

0 0.363 0.389 0.457 0.403 0.403

2.5 % 0.376 0.324 0.433 0.423 0.389 3.47 0.191 0.255 0.327 0.271 0.261 35.24

7.5 % 0.128 0.089 0.176 0.083 0.119 70.47

10.0% 0.053 0.037 0.33 0.049 0.043 89.33

0.013 0.086 0.026 0.039 0.041 89.83

15.0% 0.035 0.046 0.039 0.040 0.040 90.07

0.067 0.025 0.046 0.026 0.041 89.83

20.0% 0.018 0.052 0.063 0.031 0.041 89.83 综合分析以上各表。 由表 2可知， 该样品对肿瘤细胞有致死作用， 尤其 是浓度大于 10%后， 抑制作用明显； 表 3~表4显示， 将该样品离心分离后， 上清即精浆部分对肿瘤细胞有明显致死作用， 并有剂量依赖性， 沉淀即精子 部分对肿瘤细胞则无明显致死作用； 表 5~表6则表明， 该样品经过超滤离心 管分离后，小于 3kDa的小分子部分对肿瘤细胞无明细致死作用� �而大于 3kDa 的大分子部分对肿瘤细胞致死作用明显， 具有明显的剂量依赖性。

综上所述， 精浆对宫颈癌细胞有明显的致死作用。 人乳腺癌细胞株 MCF-7分析， 所用试剂如下：

RPMI-1640培养基为 Thermo公司 （北京） 产品； 胎牛血清为 Thermo公 司 （北京） 产品； MTT为 Invitrogen公司产品； 其余试剂均为进口分析纯； 磷酸缓冲盐溶液（PBS ) : NaCl 8g， KC1 0.2g, Na ₂ HP0 ₄ 1.44g， KH ₂ P0 ₄ 0.24g,溶于 800mlddH ₂ O， HCl调节 PH值至 7.4，定容至 1L， 121 °C高压灭菌， 4°C保存。

0.25%胰酶溶液： 1.25g胰酶， 溶解于 500mlPBS,过滤除菌后 4°C保存。 首先进行样品分离： 取 -20°C保存于精液 37°C缓慢融化后， 冰浴条件下， 吸取 2ml样品， 4°C， 3000rpm离心 10min， 精液样品清晰分层， 其中上清部 分为精浆， 将精浆移入另一支 EP管中， 标记为 "上清"， 沉淀部分为精子， 以 2mlPBS重悬， 标记为 "沉淀"；

同取融化后样品，冰浴条件下，吸取 4ml，加入超滤离心管中， 4°C， 7500rpm 离心 30min， 吸取滤过液补足 4ml， 标记为 "小分子"， 吸取 PBS将滤出部分 充分混悬并补足 4ml， 标记为 "大分子"；

其次进行目标细胞培养： 复苏 MCF-7—支， 37°C， 5% C0 ₂ 培养 5天至自 胞增殖至一定数量， 0.25%胰酶消化， 1640培养基将细胞稀释至 1*10 ⁵ 个 /ml 接种至 96孔板，每孔 lOO L,继续于 37°C， 5% C0 ₂ 培养 24h至 细胞稳定贴壁 然后进行加药及检测： 按表 1所示浓度分别加入样品， 每个浓度取 3 副孔， 37°C， 5% C0 ₂ 培养 24h后， 换液并用 PBS轻柔吹吸洗去孔内残余培 液后， 每孔加入 MMT溶液 5μ 新鲜培养基 100μΙ^。 37°C孵育 3h， 吸去' 养基， 每孔加入 DMSO150 L将 MTT-甲充分溶解， 溶解液转移至 96孔酶 板中， 每孔转移 ΙΟΟμ 490nm处读取吸光度。

按表 1 所示浓度分别加入样品上清、 沉淀， 大分子部分、 小分子部分， 每个浓度取 4个副孔， 37°C， 5% C0 ₂ 培养 24h后， 换液并用 PBS轻柔吹吸 去孔内残余培养液后， 每孔加入 MMT溶液 5 L， 新鲜培养基 100μΙ^。 37°C| 育 3h， 吸去培养基， 每孔加入 DMSO150 L将 MTT-甲充分溶解， 溶解液 移至 96孔酶标板中， 每孔转移 ΙΟΟμ 490nm处读取吸光度。

结果与讨论： 酶标仪分别读取样品混合物、 样品上清、 样品沉淀、 样品 大分子、 样品小分子对细胞作用作用的读数， 求均值， 并以浓度为 0处读数 作为对照， 按以下公式求抑制百分率：

抑制百分率 = ( 1-实验组 OD值 /对照组 OD值） *100%，

结果见表 2、 表 3、 表 4、 表 5、 表 6:

表 3作用后 MMT实验结果

样品浓度 0D490 抑制百分

(v/v) 孔 1 孔 2 孔 3 孔 4 均值 ^"牛

( % )

0 0.421 0.399 0.372 0.428 0.405

2.5 % 0.411 0.464 0.388 0.481 0.436 0

0.398 0.455 0.392 0.327 0.393 2.96

7.5 % 0.423 0.386 0.309 0.346 0.366 9.63

10.0% 0.183 0.221 0.253 0.147 0.201 50.37

0.069 0.123 0.057 0.059 0.077 80.99

15.0% 0.011 0.029 0.016 0.020 0.019 95.31 0.007 0.038 0.026 0.013 0.021 94.81 % 0.041 0.007 0.009 0.019 0.019 95.31 表 4样品沉淀作用后 MMT实验结果

表 5样品小分子作用后 MMT实验结果

表 6样品大分子作用后 MMT实验结果

综合分析以上各表。 由表 2可知， 该样品对肿瘤细胞有致死作用， 尤其 是浓度大于 10%后， 抑制作用明显； 表 3~表4显示， 将该样品离心分离后， 上清即精浆部分对肿瘤细胞有明显致死作用， 并有剂量依赖性， 沉淀即精子 部分对肿瘤细胞则无明显致死作用； 表 5~表6则表明， 该样品经过超滤离心 管分离后，小于 3kDa的小分子部分对肿瘤细胞无明细致死作用� �而大于 3kDa 的大分子部分对肿瘤细胞致死作用明显， 具有明显的剂量依赖性。

综上所述， 精浆对乳腺癌细胞有明显的致死作用。 人肝癌细胞株 HepG2分析， 所用试剂如下：

RPMI-1640培养基为 Thermo公司 （北京） 产品； 胎牛血清为 Thermo公 司 （北京） 产品； MTT为 Invitrogen公司产品； 其余试剂均为进口分析纯； 磷酸缓冲盐溶液（PBS ) : NaCl 8g， KC1 0.2g, Na ₂ HP0 ₄ 1.44g， KH ₂ P0 ₄ 0.24g,溶于 800mlddH ₂ O， HCl调节 PH值至 7.4，定容至 1L， 121 °C高压灭菌，

4°C保存。

0.25%胰酶溶液： 1.25g胰酶， 溶解于 500mlPBS,过滤除菌后 4°C保存。 首先进行样品分离： 取 -20°C保存于精液 37°C缓慢融化后， 冰浴条件下， 吸取 2ml样品， 4°C， 3000rpm离心 10min， 精液样品清晰分层， 其中上清部 分为精浆， 将精浆移入另一支 EP管中， 标记为 "上清"， 沉淀部分为精子， 以 2mlPBS重悬， 标记为 "沉淀"；

同取融化后样品，冰浴条件下，吸取 4ml，加入超滤离心管中， 4°C， 7500rpm 离心 30min， 吸取滤过液补足 4ml， 标记为 "小分子"， 吸取 PBS将滤出部分 充分混悬并补足 4ml， 标记为 "大分子"；

其次进行目标细胞培养： 复苏 HepG2—支， 37°C， 5% C0 ₂ 培养 5天至细 胞增殖至一定数量， 0.25%胰酶消化， 1640培养基将细胞稀释至 1*10 ⁵ 个 /ml, 接种至 96孔板，每孔 lOO L,继续于 37°C， 5% C0 ₂ 培养 24h至 细胞稳定贴壁； 然后进行加药及检测： 按表 1所示浓度分别加入样品， 每个浓度取 3个 畐 IJ孔， 37°C， 5% C0 ₂ 培养 24h后， 换液并用 PBS轻柔吹吸洗去孔内残余培养 液后， 每孔加入 MMT溶液 5μ 新鲜培养基 100μΙ^。 37°C孵育 3h， 吸去培 养基， 每孔加入 DMSO150 L将 MTT-甲充分溶解， 溶解液转移至 96孔酶标 板中， 每孔转移 ΙΟΟμ 490nm处读取吸光度。

按表 1 所示浓度分别加入样品上清、 沉淀， 大分子部分、 小分子部分， 每个浓度取 4个副孔， 37°C， 5% C0 ₂ 培养 24h后， 换液并用 PBS轻柔吹吸洗 去孔内残余培养液后， 每孔加入 MMT溶液 5 L， 新鲜培养基 100μΙ^。 37°C孵 育 3h， 吸去培养基， 每孔加入 DMSO150 L将 MTT-甲充分溶解， 溶解液转 移至 96孔酶标板中， 每孔转移 lOO L, 490nm处读取吸光度。

官 样品体积 培养基体积 样品浓度（v/v)

(μ! (μ!

A 2.5 97.5 2.5%

B 5.0 95.0 5.0%

C 7.5 92.5 7.5%

D 10.0 90.0 10.0%

E 12.5 87.5 12.5% F 15.0 85.0 15.0%

G 17.5 82.5 17.5%

H 20.0 80.0 20.0% 结果与讨论： 酶标仪分别读取样品混合物、 样品上清、 样品沉淀、 样品 大分子、 样品小分子对细胞作用作用的读数， 求均值， 并以浓度为 0处读数 作为对照， 按以下公式求抑制百分率：

抑制百分率 = ( 1-实验组 OD值 /对照组 OD值） *100%，

结果见表 2、 表 3、 表 4、 表 5、 表 6:

表 3作用后 MMT实验结果

样品浓度 0D490 抑制百分

(v/v) 孔 1 孔 2 孔 3 孔 4 均值 ^"牛

( % )

0 0.403 0.456 0.389 0.444 0.423 0.464 0.449 0.426 0.425 0.441 0

0.386 0.417 0.461 0.452 0.429 0

0.344 0.404 0.431 0.397 0.394 6.9 o o

% 0.195 0.173 0.229 0.247 0.211 50.1

0.037 0.094 0.133 0.072 0.084 80.1% 0.009 0.031 0.015 0.029 0.021 95.0

0.023 0.007 0.013 0.033 0.019 95.5% 0.006 0.024 0.011 0.043 0.021 95.0

表 4样品沉淀作用后 MMT实验结果

样品浓度 0D490

(v/v) 孔 1 孔 2 孔 3 孔 4 均值

0 0.403 0.456 0.389 0.444 0.423

0.386 0.446 0.397 0.407 0.409

0.391 0.423 0.417 0.389 0.405

7.5 % 0.346 0.397 0.409 0.392 0.386

10.0 % 0.355 0.396 0.426 0.379 0.389

12.5 % 0.298 0.394 0.305 0.447 0.361

0.264 0.291 0.384 0.317 0.314

17.5 % 0.328 0.266 0.389 0.429 0.353

20.0 % 0.377 0.342 0.293 0.208 0.305

表 5样品小分子作用后 MMT实验结果

样品浓度 0D490

(v/v) 孔 1 孔 2 孔 3 孔 4 均值

0 0.421 0.407 0.364 0.480 0.3931

0.404 0.341 0.395 0.364 0.376

0.233 0.396 0.267 0.284 0.295

7.5 % 0.188 0.259 0.307 0.222 0.244 10.0 % 0.266 0.408 0.339 0.255 0.317

12.5 % 0.413 0.329 0.306 0.332 0.345

0.264 0.295 0.349 0.324 0.308

17.5 % 0.211 0.294 0.269 0.334 0.277

20.0 % 0.264 0.237 0.217 0.210 0.232 表 6样品大分子作用后 MMT实验结果

综合分析以上各表。 由表 2可知， 该样品对肿瘤细胞有致死作用， 尤其 是浓度大于 10%后， 抑制作用明显； 表 3~表4显示， 将该样品离心分离后， 上清即精浆部分对肿瘤细胞有明显致死作用， 并有剂量依赖性， 沉淀即精子 部分对肿瘤细胞则无明显致死作用； 表 5~表6则表明， 该样品经过超滤离心 管分离后，小于 3kDa的小分子部分对肿瘤细胞无明细致死作用� �而大于 3kDa 的大分子部分对肿瘤细胞致死作用明显， 具有明显的剂量依赖性。

综上所述， 精浆对肝癌细胞有明显的致死作用。 人胃癌细胞株 SGC-7901分析， 所用试剂如下： RPMI-1640培养基为 Thermo公司 （北京） 产品； 胎牛血清为 Thermo公 司 （北京） 产品； MTT为 Invitrogen公司产品； 其余试剂均为进口分析纯； 磷酸缓冲盐溶液（PBS ) : NaCl 8g， KC1 0.2g, Na ₂ HP0 ₄ 1.44g， KH ₂ P0 ₄ 0.24g,溶于 800mlddH ₂ O， HC1调节 PH值至 7.4，定容至 1L， 121 °C高压灭菌， 4°C保存。

0.25%胰酶溶液： 1.25g胰酶， 溶解于 500mlPBS,过滤除菌后 4°C保存。 首先进行样品分离： 取 -20°C保存于精液 37°C缓慢融化后， 冰浴条件下， 吸取 2ml样品， 4°C， 3000rpm离心 10min， 精液样品清晰分层， 其中上清部 分为精浆， 将精浆移入另一支 EP管中， 标记为 "上清"， 沉淀部分为精子， 以 2mlPBS重悬， 标记为 "沉淀"；

同取融化后样品，冰浴条件下，吸取 4ml，加入超滤离心管中， 4°C， 7500rpm 离心 30min， 吸取滤过液补足 4ml， 标记为 "小分子"， 吸取 PBS将滤出部分 充分混悬并补足 4ml， 标记为 "大分子"；

其次进行目标细胞培养： 复苏 SGC-7901—支， 37°C， 5% C0 ₂ 培养 5天 至细胞增殖至一定数量， 0.25%胰酶消化， 1640培养基将细胞稀释至 1*10 ⁵ 个 /ml, 接种至 96孔板， 每孔 lOO L,继续于 37°C， 5% C0 ₂ 培养 24h至 细胞稳 定贴壁；

然后进行加药及检测： 按表 1所示浓度分别加入样品， 每个浓度取 3个 畐 IJ孔， 37°C， 5% C0 ₂ 培养 24h后， 换液并用 PBS轻柔吹吸洗去孔内残余培养 液后， 每孔加入 MMT溶液 5 L， 新鲜培养基 100μΙ^。 37°C孵育 3h， 吸去培 养基， 每孔加入 DMSO150 L将 MTT-甲充分溶解， 溶解液转移至 96孔酶标 板中， 每孔转移 ΙΟΟμ 490nm处读取吸光度。

按表 1 所示浓度分别加入样品上清、 沉淀， 大分子部分、 小分子部分， 每个浓度取 4个副孔， 37°C， 5% C0 ₂ 培养 24h后， 换液并用 PBS轻柔吹吸洗 去孔内残余培养液后， 每孔加入 MMT溶液 5 L， 新鲜培养基 100μΙ^。 37°C孵 育 3h， 吸去培养基， 每孔加入 DMSO150 L将 MTT-甲充分溶解， 溶解液转 移至 96孔酶标板中， 每孔转移 ΙΟΟμ 490nm处读取吸光度。 表 1样品浓度梯度 官 样品体积 培养基体积 样品浓度（v/v)

(μ! (μ!

A 2.5 97.5 2.5%

B 5.0 95.0 5.0%

C 7.5 92.5 7.5%

D 10.0 90.0 10.0%

E 12.5 87.5 12.5%

F 15.0 85.0 15.0%

G 17.5 82.5 17.5%

H 20.0 80.0 20.0% 结果与讨论： 酶标仪分别读取样品混合物、 样品上清、 样品沉淀、 样品 大分子、 样品小分子对细胞作用作用的读数， 求均值， 并以浓度为 0处读数 作为对照， 按以下公式求抑制百分率：

抑制百分率 = ( 1-实验组 OD值 /对照组 OD值） *100%，

结果见表 2、 表 3、 表 4、 表 5、 表 6:

样品浓度 0D490 抑制百分

(v/v) 孔 1 孔 2 孔 3 均值 ^"牛

( % )

0 0.638 0.591 0.655 0.628

2.5 % 0.538 0.614 0.587 0.579 7.80

5.0 % 0.351 0.265 0.347 0.321 48.89

7.5 % 0.239 0.158 0.167 0.188 70.06

10.0% 0.033 0.052 0.050 0.045 92.83

12.5 % 0.011 0.023 0.023 0.019 96.97

15.0% 0.009 0.016 0.011 0.012 98.09

17.5 % 0.015 0.006 0.012 0.011 98.25 20.0% 0.006 0.012 0.015 0.011 98.25

表 3作用后 MMT实验结果

表 4样品沉淀作用后 MMT实验结果

表 5样品小分子作用后 MMT实验结果

表 6样品大分子作用后 MMT实验结果

综合分析以上各表。 由表 2可知， 该样品对肿瘤细胞有致死作用， 尤其 是浓度大于 10%后， 抑制作用明显； 表 3~表4显示， 将该样品离心分离后， 上清即精浆部分对肿瘤细胞有明显致死作用， 并有剂量依赖性， 沉淀即精子 部分对肿瘤细胞则无明显致死作用； 表 5~表6则表明， 该样品经过超滤离心 管分离后，小于 3kDa的小分子部分对肿瘤细胞无明细致死作用� �而大于 3kDa 的大分子部分对肿瘤细胞致死作用明显， 具有明显的剂量依赖性。

综上所述， 精浆对胃癌细胞有明显的致死作用。 现有技术中， 对精浆从精液中分离的技术已经相当成熟， 而从精浆中提 取精浆蛋白以及筛选分子直径大于 3kDa的技术也相当成熟，故本发明主要陈 述的是精浆对癌细胞的抑制作用。

结合上述， 本发明通过对精浆的不同条件下对肺癌细胞、 乳腺癌细胞、 大肠癌细胞、 宫颈癌细胞、 肝癌细胞或胃癌细胞的抑制作用整体分析， 得出 了精浆对癌细胞有明显的抑制作用的结论， 同时， 对精浆进一步解析后， 抑 制癌细胞的作用还与精浆中精浆蛋白的分子直 径以及与精浆浓度有关， 精浆 蛋白分子大于 3kDa 后抑制作用明显， 精浆浓度或精浆蛋白浓度处于 2.5%~5.0%时效果一般， 5.0%~7.5%效果较佳，大于 7.5%~10.0%后抑制作用明 显， 具体数据与所抑制的癌细胞类型相关。 实施例 1

精浆为活性成分制备的月 I交： 囊 用于治疗肺癌、 乳腺癌、 大肠癌、 宫颈癌 肝癌或胃癌， 但不限于上述癌症 其中精浆含量为 52.5%。

实施例 2

精浆为活性成分制备的颗粒 用于治疗肺癌、 乳腺癌、 大肠癌、 宫颈癌 肝癌或胃癌， 但不限于上述癌症 其中精浆含量为 60.2%。

实施例 3

精浆为活性成分制备的片剂 用于治疗肺癌、 乳腺癌、 大肠癌、 宫颈癌. 肝癌或胃癌， 但不限于上述癌症 其中精浆含量为 73.5%。

实施例 4

精浆为活性成分制备的滴丸 用于治疗肺癌、 乳腺癌、 大肠癌、 宫颈癌. 肝癌或胃癌， 但不限于上述癌症 其中精浆含量为 81.9%。 实施例 5

精浆为活性成分制备的口服液， 用于治疗肺癌、 乳腺癌、 大肠癌、 宫颈 癌、 肝癌或胃癌， 但不限于上述癌症， 其中精浆含量为 90.1%。

实施例 6

精浆为活性成分制备的注射液， 用于治疗肺癌、 乳腺癌、 大肠癌、 宫颈 癌、 肝癌或胃癌， 但不限于上述癌症， 其中精浆含量为 77.3%。

实施例 7

精浆蛋白为活性成分制备的胶囊， 用于治疗肺癌、 乳腺癌、 大肠癌、 宫 颈癌、 肝癌或胃癌， 但不限于上述癌症， 其中精浆蛋白含量为 40.5%。

实施例 8

精浆蛋白为活性成分制备的颗粒， 用于治疗肺癌、 乳腺癌、 大肠癌、 宫 颈癌、 肝癌或胃癌， 但不限于上述癌症， 其中精浆蛋白含量为 51.3%。

实施例 9

精浆蛋白为活性成分制备的片剂， 用于治疗肺癌、 乳腺癌、 大肠癌、 宫 颈癌、 肝癌或胃癌， 但不限于上述癌症， 其中精浆蛋白含量为 56.5%。

实施例 10

精浆蛋白为活性成分制备的滴丸， 用于治疗肺癌、 乳腺癌、 大肠癌、 宫 颈癌、 肝癌或胃癌， 但不限于上述癌症， 其中精浆蛋白含量为 73.2%。

实施例 11

精浆蛋白为活性成分制备的口服液， 用于治疗肺癌、 乳腺癌、 大肠癌、 宫颈癌、 肝癌或胃癌， 但不限于上述癌症， 其中精浆蛋白含量为 79.2%。

实施例 12

精浆蛋白为活性成分制备的注射液， 用于治疗肺癌、 乳腺癌、 大肠癌、 宫颈癌、 肝癌或胃癌， 但不限于上述癌症， 其中精浆蛋白含量为 55.4%。

实施例 13

大于 3kDa的精浆蛋白为活性成分制备的胶囊， 用于治疗肺癌、 乳腺癌、 大肠癌、 宫颈癌、 肝癌或胃癌， 但不限于上述癌症， 其中大于 3kDa的精浆蛋 白含量为 13.5%。

实施例 14 大于 3kDa的精浆蛋白为活性成分制备的颗粒， 用于治疗肺癌、 乳腺癌、 大肠癌、 宫颈癌、 肝癌或胃癌， 但不限于上述癌症， 其中大于 3kDa的精浆蛋 白含量为 18.2%。

实施例 15

大于 3kDa的精浆蛋白为活性成分制备的片剂， 用于治疗肺癌、 乳腺癌、 大肠癌、 宫颈癌、 肝癌或胃癌， 但不限于上述癌症， 其中大于 3kDa的精浆蛋 白含量为 20.1%。

实施例 16

大于 3kDa的精浆蛋白为活性成分制备的滴丸， 用于治疗肺癌、 乳腺癌、 大肠癌、 宫颈癌、 肝癌或胃癌， 但不限于上述癌症， 其中大于 3kDa的精浆蛋 白含量为 22.6%。

实施例 17

大于 3kDa的精浆蛋白为活性成分制备的口服液，用� �治疗肺癌、乳腺癌、 大肠癌、 宫颈癌、 肝癌或胃癌， 但不限于上述癌症， 其中大于 3kDa的精浆蛋 白含量为 24.9%。

实施例 18

大于 3kDa的精浆蛋白为活性成分制备的注射液，用� �治疗肺癌、乳腺癌、 大肠癌、 宫颈癌、 肝癌或胃癌， 但不限于上述癌症， 其中大于 3kDa的精浆蛋 白含量为 19.5%。