本发明涉及一种预防和治疗肿瘤药物的用途， 特别是涉及一种水溶性铂配合物在制备 防治肿瘤药物的用途。 背景技术

癌症是由于细胞的 DNA在一定条件下产生突然变异， 形成细胞分裂失控， 从而产生 不断地增殖和转移最后导致宿主死亡的疾病。 作为预防和治疗癌症的药物主要分为细胞 DNA垸化剂， 细胞代谢拮抗剂， 抗肿瘤抗生素， 植物碱， 金属铂配合物， 以及天门冬酰胺 酶制剂和荷尔蒙治疗剂等。 几乎所有的抗肿瘤药物， 其目的在于在短时间内有效地阻止细 胞的快速分裂， 因此往往在区分正常细胞和肿瘤细胞方面很难 达到高选择性地杀伤癌细胞 的目的。

铂类抗癌药是肿瘤预防和治疗领域具有代表性 的一类药物。 其属于细胞周期非特异性 药物， 对实体瘤， 恶性上皮肿瘤， 淋巴瘤以及生殖细胞肿瘤等都具有预防和治疗 功效。 目 前世界上广泛应用于临床预防和治疗的具有代 表性的铂类抗癌药主要有， 顺铂， 卡铂和奥 沙利铂。 顺铂是历史最悠久临床应用时间最长的铂类抗 癌药 （（1 )， Peyrone M. Ann Chemie Pharm ( 1845)， 51 : 129； ( 2)， Rosenberg, B. & Van Camp, L.; Krigas, T. ( 1965)， "Inhibition of cell division in Escherichia coli by electrolysis products from a platinum electrode", Nature 205 (4972): 698-699)， 自 1978年美国 FDA批准顺铂作为抗肿瘤药上市 以来对它的作用机理的研究已经非常透彻， 这也带动了铂类有机金属化合物在肿瘤医学领 域的应用和发展， 对具有新的分子结构的铂类抗肿瘤药物的设计 开发奠定了基础。

铂类上市药物普遍存在水溶性极低的特性， 给药品制剂的稳定性和临床应用带来了很 多的不利影响， 比如很难把他们顺利地配制成一种方便合适的 剂型。 临床铂类抗肿瘤药物 顺铂， 卡铂和奥沙利铂的水溶性分别为 1毫克 /毫升， 17毫克 /毫升以及 6毫克 /毫升， 药物 如此低的水溶性加之药物本身与身体内各种碱 基等亲核体的高反应性， 导致了此类药物具 有不可避免的致命缺点 --严重的肾毒性等副作用以及临床制剂的稳定� ��问题（（1 ) , Canetta R， Rozencweig M， Carter SK.， Carboplatin: the clinical spectrum to date. , Cancer Treat Rev. ( 1985 )， Sep; 12 Suppl A： 125-36; ( 2 ) ， Knox, RJ et al， Mechanism of cytotoxicity of anticancer platinum drugs: evidence that cis-diamminedichloroplatinum(II) and cis-diammine-( /, l-cyclobutanedicarboxylato)platinum(II) differ only in the kinetics of their interaction with DNA. , Cancer Res. ( 1986)， Apr; 46: 1972-9; ( 3 )， Overbeck， T， et al. "A comparison of the genotoxic effects of carboplatin and cisplatin in Escherichia Coli". Mutation Research/DNA Repair. ( 1996)， Volume: 362， Issue: 3， April 2， pp. 249-259； ( 4 )， Schnurr, B +， Gust, Ronald. "Investigations on the decomposition of carboplatin in infusion solutions". Mikrochimica Acta. ( 2002)， Volume: 140, Issue: 1-2, August, pp. 69 - 76 )。

研究表明， 铂类抗肿瘤药不仅单独使用时能够对癌细胞 DNA形成有效伤害， 为了进 一步增强此类药物的药效或者减低其对身体可 能产生的毒副作用， 铂类药物与其他化疗成 分配合使用来进行临床预防和治疗的方法也被 广泛应用。 例如， 顺铂与氟尿嘧啶类抗肿瘤 药物配合使用能够增强抗癌疗效的例子广为人 知 [ Cancer Chemotherapy and Pharmacology, Vol.32, pl67, 1993】。顺铂与氟尿嘧啶类抗肿瘤药物配合使� �能够增强抗肿瘤疗效的药理学 机理是由于顺铂会减少蛋氨酸 （Methionine ) 向细胞内部的转运， 从而形成细胞内蛋氨酸 缺乏而诱导细胞合成蛋氨酸， 由此产生还原型叶酸在细胞内的积蓄和浓度上 升。 由于 5-氟 尿嘧啶的代谢产物与还原型叶酸能够与胸腺嘧 啶脱氧核苷酸合成酶形成三分子共价键结 合， 最终导致胸腺嘧啶脱氧核苷酸合成酶的作用受 到抑制从而妨碍细胞 DNA的复制与合 成。 基于这种机理， 衍生出了顺铂与氟尿嘧啶类化疗药物配合用来 预防和治疗各种固形肿 瘤的临床预防和治疗方法。 【癌 化学療法、 Vol. l 8,p403, 1991 ; 癌 化学療法， Vol.27,p832,2000;Investigational New Drugs Vol.18, p315, 2000】。

然而， 如上所述迄今所开发的铂类抗肿瘤药物， 例如顺铂， 卡铂以及奥沙利铂等均存 在毒副作用极强以及水溶性极低的特性。 迄今开发的低水溶性铂类药物在血液中的滞留 时 间过长以及很难被肾脏排除， 是导致此类药物肾脏毒副作用的主要因素。 解决铂类药物水 溶性问题是目前世界上铂类抗癌药研发领域专 注的最重要课题之一 （Galanski, Markus; Keppler, Bernhard K Searching for the Magic Bullet: Anticancer Platinum Drugs Which Can Be Accumulated or Activated in the Tumor Tissue. Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry, ( 2007)， 7, 55-73 ) 发明内容

本发明的目的是提供一种水溶性铂配合物在制 备防治肿瘤药物的用途。

本发明的第二个目的是提供含一种水溶性铂配 合物的组合物在制备防治肿瘤药物的 用途。

本发明的技术方案概述如下：

—种水溶性铂配合物在制备防治肿瘤药物的用 途， 其特征是所述水溶性铂配合物如式

( I) 所示:

X和 Y是配位体，所述 X和 Y相同或不同并且各自代表一个 H ₃ 、一个 d-C ₈ 链状垸 基伯胺、 一个 ^ ₈ 环状垸基伯胺、 一个芳香胺、 一个至少有一个 d-C ₄ 垸基取代的芳香 胺、 一个分子式为 RrNH-R ₂ 的仲胺， 其中 1^和1 ₂ 相同或者不同分别表示 ₈ 链状垸基 或1^- -1 ₂ 共同组成 C ₄ -C 环状垸基仲胺、一个具有含氮芳香族杂环化合 物或至少有一 个 d-C ₄ 垸基取代的含氮芳香族杂环化合物、 一个具有含硫芳香族杂环化合物或含硫非芳 香族杂环化合物， 或 X和 Y—起用结构式 （VIII) 所示-

其中 D为。。或 的亚垸基； B为 C ₂ - C ₈ 的亚垸基；

配位体 X和 Y所表示的最佳例子包括但不限于： X和 Y各为 H ₃ ， 异丙胺， 环丙胺， 环丁胺， 环戊胺， 环己胺； 或者 X和 Y其中之一为 H ₃ ， 另一个为异丙胺， 环丙胺， 环丁 胺， 环戊胺， 环己胺， 2-甲基吡啶； 或者 X和 Y—起表示分子式为 H ₂ N-Z- H ₂ 的二胺化 合物， 例如： 1， 2-乙二胺， 1， 3-丙二胺， 2-甲基四亚甲基二胺， 1， 2-环己二胺， 1， 2- 环庚二胺， 1， 2-环辛二胺， 1-氨基 -2-氨甲基环己垸， 1， 1-二氨甲基环己垸， 5， 5-二氨甲 基 -1， 3-二噁垸， 2-氨甲基-吡咯垸和 2-氨甲基吡啶。 当上述配体化合物中含有手性中心时， 可以是其中任一光学异构体或者消旋体混合物 ；

优选的是 X和 Y—起为反式- ( 1R， 2R) -环己二胺， 反式- ( 1S， 2S) -环己二胺， 顺 式- ( 1R， 2S) -环己二胺， 顺式- ( 1S， 2R) -环己二胺， 消旋反式 -1， 2-环己二胺或消旋顺 式 -1， 2-环己二胺。 最好是： 反式- ( 1R， 2R) -环己二胺。

n是 1-6; 优选 1-4; 最好是 2或 3 ;

R选自下述单糖基， 单糖 1-位取代为 α或者 β或者两者的混合物：

R优选下述单糖基， 单糖 1-位取代为 α或者 β或者两者的混合物： 含水溶性铂配合物（式（1)) 的组合物在制备防治肿瘤药物的用途， 该组合物由水溶性 铂配合物与下述至少一种活性组分组成： 顺铂， 反铂， 反式 -二氨基四氯化铂， 卡铂， 奥沙 利铂， 5-氟尿嘧啶， 氟尿苷， 替加氟尿嘧啶， 吉西他滨， 卡培他滨， 氯法拉滨， 替莫唑胺， 法呢酰基转移酶抑制剂 /o« /¾ ^，厄洛替尼， 索拉非尼，舒尼替尼，伊马替尼，埃罗替尼， 硼替佐米， 吉马替康， 威保啶， 长春瑞滨 Vinorelbine' 亚叶酸， 多柔比星， 紫杉醇， 多西 他赛， 及其衍生物， 他莫昔芬， 雷洛西芬， 坦螺旋霉素， 伊立替康； 水溶性铂配合物如式 (I) 所示-

X和 Υ是配位体，所述 X和 Υ相同或不同并且各自代表一个 Η ₃ 、一个 d-C ₈ 链状垸 基伯胺、

一个 ^ ₈ 环状垸基伯胺、 一个芳香胺、 一个至少有一个 d-C ₄ 垸基取代的芳香胺、 一个 分子式为 RrNH-R ₂ 的仲胺， 其中 和 R ₂ 相同或者不同分别表示 d-C ₈ 链状垸基或 R NH-R ₂ 共同组成 C ₄ -C ₈ 的环状垸基仲胺、 一个具有含氮芳香族杂环化合物或至少有一个 d-C ₄ 垸基取代的含氮芳香族杂环化合物、 一个具有含硫芳香族杂环化合物或含硫非芳香 族杂环化合物， 或 X和 Y—起用结

其中 D为。。或 的亚垸基； B为 C ₂ -C ₈ 的亚垸基；

优选的是 X和 Y—起为反式- (1R， 2R) -环己二胺， 反式- (1S， 2S) -环己二胺， 顺 式- (1R， 2S) -环己二胺， 顺式- (1S， 2R) -环己二胺， 消旋反式 -1， 2-环己二胺或消旋顺 式 -1， 2-环己二胺。 最优选的是 X和 Y—起为反式- (1R， 2R) -环己二胺。

n是 1-6; 优选 1-4; 最好是 2或 3;

R选自下述单糖基， 单糖 1-位取代为 α或者 β或者两者的混合物： 。、

■ζ'、、

R优选下述单糖基， 单糖 1-位取代为 α或者 β或者两者的混合物:

优选的是含水溶性铂配合物的组合物在制备防 治肿瘤药物的用途， 其组合物由水溶性 铂配合物与 5-氟尿嘧啶组成； 或由水溶性铂配合物与亚叶酸组成， 或由水溶性铂配合物、 5-氟尿嘧啶和亚叶酸组成。

上述含水溶性铂配合物在制备防治肿瘤药物的 用途， 所述肿瘤为人肺癌， 人大肠癌， 人头颈癌， 人前列腺癌， 人乳腺癌， 人卵巢癌， 人子宫颈癌， 人白血病， 人淋巴癌， 人皮 肤癌， 人胰腺癌， 人肝癌， 人膀胱癌， 人食道癌， 人胃癌， 人男性生殖器癌或人骨癌。

最好是人大肠癌。

本发明的优点是- 实验证明： 一种水溶性铂配合物能预防和治疗哺乳动物癌 症， 如预防或治疗哺乳类动 物的肺癌， 大肠癌， 头颈癌， 前列腺癌， 乳腺癌， 卵巢癌， 子宫颈癌， 白血病， 淋巴癌， 皮肤癌， 胰腺癌， 肝癌， 膀胱癌， 食道癌， 胃癌， 男性生殖器癌， 骨癌等。 特别是可以预 防和治疗人肺癌， 人大肠癌， 人头颈癌， 人前列腺癌， 人乳腺癌， 人卵巢癌， 人子宫颈癌， 人白血病， 人淋巴癌， 人皮肤癌， 人胰腺癌， 人肝癌， 人膀胱癌， 人食道癌， 人胃癌， 人 男性生殖器癌或人骨癌。

含水溶性铂配合物的组合物， 由于配合物和活性组分组合在一起能产生协同 作用， 对 哺乳类动物的肺癌， 大肠癌， 头颈癌， 前列腺癌， 乳腺癌， 卵巢癌， 子宫颈癌， 白血病， 淋巴癌， 皮肤癌， 胰腺癌， 肝癌， 膀胱癌， 食道癌， 胃癌， 男性生殖器癌， 骨癌的抑制作 用和治疗作用更强。 特别是对人肺癌， 人大肠癌， 人头颈癌， 人前列腺癌， 人乳腺癌， 人 卵巢癌， 人子宫颈癌， 人白血病， 人淋巴癌， 人皮肤癌， 人胰腺癌， 人肝癌， 人膀胱癌， 人食道癌， 人胃癌， 人男性生殖器癌或人骨癌抑制作用和治疗作用 更强。 附图说明

图 1为配合物 3抗肿瘤药效 -1。

图 2为配合物 3抗肿瘤药效 -2。

图 3为配合物 6抗肿瘤药效 -1。

图 4为配合物 6抗肿瘤药效 -2。

图 5为配合物 9抗肿瘤药效 -1。

图 6为配合物 9抗肿瘤药效 -2。

图 7为配合物 9、 配合物 24和配合物 29在动物肿瘤模型中的抗肿瘤药效。 具体实施方式

本发明的实施例是为了使本领域的技术人员更 好地理解本发明， 但不以任何方式限制 本发明。

一种水溶性铂配合 （I) 所示：

当式 （I) 中的 R分别为 D-葡萄糖、 D-半乳糖或者 D-甘露糖取代基时； n和 X、 Y见 表 1 _:

表 1

n X Y

1-6 H3 H3

1-6 异丙胺 异丙胺

1-6 环丙胺 环丙胺

1-6 环丁胺 环丁胺

1-6 环戊胺 环戊胺

1-6 环己胺 环己胺

1-6 H3 环丁胺

1-6 H3 环戊胺

1-6 H3 环己胺

1-6 H3 2-甲基吡啶 1-6 1， 2-乙二胺

1-6 1， 3-丙二胺

1-6 1， 2-环丁二胺

1-6 1， 2-环戊二胺

1-6 1， 2-环庚二胺

1-6 1， 1-二氨甲基环己垸

1-6 1， 2-二氨甲基环丁垸

1-6 2-氨甲基吡啶

1-6 1， 2-环己二胺

表 1中的配体 X、 Y为 1， 2-环己二胺时， 可以是反式- ( 1R， 2R) -环己二胺， 反式- ( 1S， 2S) -环己二胺， 顺式- (R， S) -环己二胺或顺式- ( S， R) -环己二胺， 消旋反式 -1，

2-环己二胺， 消旋顺式 -1， 2-环己二胺之中的任意一种。

实验证明，按下面公开的方法，本领域的技术 人员能够制备出表 1所述的各个配合物。 本发明所提供的式（I)所示的水溶性铂配合物� ��以利用下述的方法来完成，见反应式: 方法 A:

方法 B:

(ΠΙ) (Π) (I) 在方法 A中， 当 （III) 中 M是氢原子时， 反应可以通过使用适当的无机碱， 例如氢氧 化钠， 氢氧化钾， 碳酸钠， 碳酸氢钠， 碳酸钾， 氢氧化锂以及氢氧化铯等来调节反应水溶 液的 pH维持在 7-9之间来完成式（I)各个配合物的制备； 当 M为金属原子时， 例如钠原 子、 钾原子、 钡原子或铯原子， 反应可在水溶液中顺利进行， 必要时使用少量的上述无机 碱的水溶液维持反应溶液的 pH在 7-9之间即可完成式 （I) 所示配合物的合成。

在方法 B中， 当 M是氢原子时， 反应可以通过使用等当量的氢氧化钡作为无机 碱， 在 水溶液中完成与式 （II) 所示的金属铂硫酸盐化合物的缩合反应来制备 式 （I) 所示的配合 物。 由方法 B制备本发明配合物时， 亦可以使用事先制得的钡盐， 即两个 M共同代表一 个钡原子， 与式 （II) 所示的金属铂硫酸盐配合物在水溶液中进行反 应来完成配合物的制 备过程。

上述反应的溶剂最好使用去离子水，反应温度 一般在室温或者根据需要加热到 60-9CTC 进行反应。

方法 A和 B中式 （II) 所表示的化合物可以通过相应的顺 -二氯化铂与 X和 Y的配合 物与硝酸银或硫酸银反应而制备， 例如： 顺-二氯- ( 1， 2-二氨基环己垸） 合铂与 2当量的 硝酸银或 1当量的硫酸银反应而制备。 该反应最好在水溶液中进行， 使用的水最好是去离 子水。 反应温度在室温比较合适。

如此所得到的化合物（II)与事先制备好的化合 物（III)用蒸馏水或者去离子水作溶剂 进行反应。每当量的化合物（III)选用 0.5 - 4当量的化合物（11)， 优选条件是 1至 2当量。 反应条件是在 pH在 7-9的条件下完成， 该条件可以通过使用适当的碱来维持反应介质 而 达到。 该碱的种类最好是无机碱， 例如氢氧化钠， 氢氧化钾， 氢氧化钡， 碳酸钠， 碳酸钾， 碳酸氢钠。 最好是使用这些碱的大约当量浓度 （1N) 的水溶液。 反应可以在一个比较宽的 温度范围内来进行， 例如选择在 0-100°C的温度范围来进行上述反应。 最好是从室温到 90°C， 并同时伴随搅拌为好。 根据不同的目标产物反应需要的时间变化范围 也很宽。 根据 不同反应物的性质， 一般需要 1小时到 30天来完成。 更多的情况下需要 10小时至 15天 的时间。

很多方法可以被用来精制上述反应中得到的生 成物 （1)。 例如反应完成后的混合物可 以先通过过滤除去可能生成的沉淀物， 然后通过减压蒸馏浓缩， 然后加入有机溶剂， 使所 要的目标（I)沉淀析出。 一般选择能够与水互溶的有机溶剂， 例如一种醇 （例如甲醇， 乙 醇， 丙醇， 丁醇， 异丙醇等）， 或者与水有一定互溶的一种醚 （例如二乙醚， 甲基叔丁基 醚， 四氢呋喃， 乙二醇二乙醚， 乙二醇二甲醚等）， 最后将得到的沉淀收集起来， 例如通 过过滤， 就可以得到所需要的式（I)所表示的配合物。 提纯和精制上述反应中得到的生成 物（I)也可以用色谱等的方法。 例如用离子交换树脂， 或者用制备液相色谱。 液相色谱分 离精制一般使用甲醇和水作为移动相来进行。

本发明化合物 （III) 可以由下述的反应式所给出的以葡萄糖为例的 方法 C， D或者方 法 E,F中的任意一种来进行制备：

方法 C:

方法 D:

(ΙΠ) 方法 F _:

以葡萄糖为例， 在方法 C中， 作为与糖反应的含氯 2-位取代丙二酸酯衍生物， 可以通过 使用卤代垸基醇与氯代丙二酸酯化合物例如氯 代丙二酸二甲酯， 氯代丙二酸二乙酯， 氯代 丙二酸二苯甲酯， 氯代丙二酸环异内酯等按照文献已知的一般方 法 （例如： Joumal ofthe American Chemical Society, 131(8), 2786-2787; 2009 )来制备。得到的含氯丙二酸 -2-垸基醇衍生物与 D-葡萄糖可以在路易斯酸存在下在溶剂中进行� ��合反应， 从而得到 2-氯代 -2-垸基取代丙二 酸酯的葡萄糖苷化合物。 缩合反应的条件是针对葡萄糖化合物使用 0.1-50当量的含氯丙二 酸衍生物， 或者相反针对含氯丙二酸衍生物使用 0.1-50当量的葡萄糖。 使用的路易斯酸可 以是 BF ₃ ， SnCl ₄ ， FeCl ₃ ， A1C1 ₃ ， 盐酸， 对甲苯磺酸， 樟脑磺酸等， 路易斯酸的量相对于葡 萄糖可以是 0.1-10当量。 所使用的溶剂可以是四氢呋喃， 二氯甲垸， 甲苯， 乙二醇二甲醚， 乙二醇二乙醚等也可以使用两种反应物中的任 意一种当作溶剂来进行该反应。 反应的温度 可以从零 X^I」100°C， 一般可以在 60-80°C加热完成该反应。 反应所需要的时间根据反应物 的不同而不同， 一般 1小时至 7天可以完成。 得到的反应产物可以通过一系列的提纯条件来 进行精制， 一般可以使用硅胶层析分离法， 或者液相色谱柱分离法。 得到的该产物， 经过 除去丙二酸的保护基就可以最后得到所需要的 式 （III) 所表示的化合物。 脱保护的方法根 据使用的保护基的不同而不同， 如果使用氯代苯甲基丙二酸化合物， 可以使用加氢还原的 方法进行脱保护， 如果使用氯代丙二酸二乙酯或者氯代丙二酸环 异内酯进行反应时， 脱保 护反应可以使用无机碱在甲醇 -水， 或者 THF-水溶剂中来进行， 有机溶剂与水的比例一般 为 1 : 1-4: 1。 所使用的无机碱可以是氢氧化钠， 氢氧化钾， 氢氧化钡， 氢氧化锂等。 反应温 度一般为室温至 60°C， 反应时间一般为 1-24小时。 脱保护生成的化合物的提纯可以使用硅 胶层析法或者离子交换树脂过滤法， 或者使用液相色谱法来完成， 如果用蒸馏法直接除去 反应溶剂， 所得到的生成物将会是相应的金属羧酸盐。

如方法 D所示， D-葡萄糖亦可以先转化成相应的乙酰化葡萄糖� �� 然后再实施与含氯 2- 位取代丙二酸酯衍生物的缩合反应， D-葡萄糖的乙酰化可以按照文献报道的方法实� ��， 例 如在吡啶中采用乙酸酐作为乙酰化试剂在室温 或者在 60°C加热 1-24小时即可完成。方法 D 中除乙酰化以外的各个步骤的反应条件与方法 C中所描述的相同。

方法 E和 F所示的制备方法是将卤代醇先与葡萄糖或者� �酰化葡萄糖在路易斯酸存在 下进行缩合， 然后进行与丙二酸酯衍生物的取代反应最后获 得化合物 （III) 的制备路线。 所得到的丙二酸酯的二位氯取代反应，可以使 用代表性的氯取代反应试剂 NCS来进行。反 应一般在 THF或者 DMF或者乙醚溶剂中将丙二酸酯用等当量或者过 量的碱处理后， 加入 上述氯取代反应试剂来完成。 所使用的碱可以是氢化钠， 碳酸钾， 碳酸钠， 碳酸铯， 碳酸 氢钠等， 氯取代试剂的当量为丙二酸酯的 1-3倍， 反应温度一般在零 °0至60°0， 最好在室 温条件下搅拌完成。 上述制备路线中涉及葡萄糖的乙酰化， 路易斯酸存在下的缩合反应， 丙二酸酯的 2-位垸基化取代反应以及最后的脱保护反应， 其反应条件和实施方法与方法 C 和方法 D中所叙述的相同。

实施例 1 : 水溶性铂配合物对癌细胞的增殖抑制作用

以下实验针对本发明水溶性铂配合物对不同种 类的人肿瘤细胞的增殖抑制效果进行 了实验验证。

( 1 ) 试验方法：

细胞培养液：

使用含有 10%牛胎仔血清（fetal bovine serum)， ImM丙酮酸钠， 2mM-谷氨酰胺， 50U/ml 盘尼西林， 50 g/ml链霉素 （streptomycin) 的细胞培养液。

主要实验仪器： MCO-15A型二氧化碳培养箱 （日本 SANYO公司） 、 倒置相差 显微镜 (Olympus, 日本)、 全自动酶标仪 （美国 BioTEK ELX808 ) 、 低温冰箱 （日 本 MDF-V5410) 、 超净工作台 （苏州医疗器械厂） 、 微量移液器 （法国 GILSON) 、 自动纯水蒸馏器 （上海 1810B) 。

实验试剂：

MTS:CellTiter96 Aqueous MTS Reagent Powder, Promega公司

PMS: Phenazine methosulfate(PMS), Sigma- Aldrich公司

DPBS: Sigma- Aldrich公司

肿瘤细胞：

以下活性测试实验中所使用的人肿瘤细胞： dul45 -人前列腺癌； MCF-7 -人乳腺癌； SKOV3 -人卵巢癌； HT-29 -人结肠癌； A549 -人非小细胞肺癌 （腺癌） ； H460 -人 非小细胞肺癌 （大细胞癌） ； DLD-1 -人结直肠肿瘤， 以及动物肿瘤细胞： L1210 -小鼠 白血病细胞均购自上海安妍商贸有限公司。

细胞毒性测试：

细胞毒性实验采用 MTS测试方法。 收集对数期肿瘤细胞， 调整细胞悬液浓度， 每孔加 入 100μ1， 铺板使待测细胞调密度至 1000-10000个 /孔， （边缘孔用无菌 PBS填充） 。 在 5%C02， 37°C孵育， 至细胞单层铺满孔底（96孔平底板） ， 加入不同浓度梯度的药物， 每 孔 100μ1， 设 5个复孔。 在 5% C02， 37°C条件下孵育 96小时， 倒置显微镜下观察。 向 2ml MTS(2mg/ml, DPBS配制)溶液中加入 ΙΟΟμΙ PMS(lmg/ml,DPBS配制)，混匀， 制成 MTS 工作液。 上述细胞培养板离心后弃去培养液， 小心用 PBS冲洗 3遍后， 在检测吸光度前， 向 96孔板中每孔加入 ΙΟΟμΙ细胞培养液， 再加入 2(^1MTS工作液， 在 37°C， 5%C02条件 下孵育 2h后， 在 490nm处检测 OD值 （光密度值）。

对照组： 在上述同样条件下不添加被测活性成分， 最后取得肿瘤细胞在 490nm处检测 OD值。

上述每个药物浓度的实验重复 5组， 取平均 OD值计算细胞存活率。

药物对肿瘤细胞的抑制活性 IC50:

细胞抑制率计算： 按下列公式计算药物对肿瘤细胞生长的抑制率 ：

1 ) 细胞存活率 （％) = (治疗组 OD值 /对照组 OD值） x l 00

2 ) 求出各药物浓度下的细胞存活率， 用此对药物浓度作图。 在所得的曲线上， 细胞存活 率为 50 %时所对应的浓度就是 IC50值。

( 2 ) 实验配合物：

表 -2: 实验配合物

17 半乳糖 2 H ₃ H ₃

18 半乳糖 3 H ₃ H ₃

19 葡萄糖 1 异丙胺 异丙胺

20 葡萄糖 2 异丙胺 异丙胺

21 葡萄糖 3 异丙胺 异丙胺

22 甘露糖 1 异丙胺 异丙胺

23 甘露糖 2 异丙胺 异丙胺

24 甘露糖 3 异丙胺 异丙胺

25 半乳糖 1 异丙胺 异丙胺

26 半乳糖 2 异丙胺 异丙胺

27 半乳糖 3 异丙胺 异丙胺

28 葡萄糖 1

29 葡萄糖 2

30 葡萄糖 3

31 甘露糖 1

32 甘露糖 2

33 甘露糖 3

34 半乳糖 1

35 半乳糖 2

36 半乳糖 3

(3) 实验结果- 癌细胞种类： A549-人非小细胞肺癌 （腺癌） ； SKOV3-人卵巢癌； MCF-7 -人乳 腺癌； HT-29-人结肠癌； dul45-人前列腺癌； H460 -人非小细胞肺癌 （大细胞癌） 表 -3: 各配合物对不同人肿瘤细胞的半数抑制浓度 IC50 (单位， μΜ)

配合物 3的抗肿瘤药效见图 1和图 2; 配合物 6的抗肿瘤药效见图 3和图 4; 配合物 9 的抗肿瘤药效见图 5和图 6; 为了更清晰地显示配合物的药效趋势， 所有图中的曲线均省 略了平均标准误差标记。

实施例 2: 水溶性铂配合物与其他化疗药物 （活性组分） 组成组合物时对人癌细胞的 增殖抑制作用

以下实验研究了将水溶性铂配合物与其他化疗 药物 （活性组分） 组成组合物时， 对不 同种类人肿瘤细胞的增殖抑制增强或加乘效果 。

试验方法：

细胞培养液：

使用含有 10%牛胎仔血清 （fetal bovine serum) ， ImM丙酮酸钠， 2mML-谷氨酰胺， 50U/ml盘尼西林， 5(^g/ml链霉素 （streptomycin) 的细胞培养液。

主要实验仪器： MCO-15A型二氧化碳培养箱 （日本 SANYO公司） 、 倒置相差显微 镜 (Olympus,日本；)、全自动酶标仪（美国 BioTEK ELX808)、低温冰箱（日本 MDF-V5410)、 超净工作台 （苏州医疗器械厂） 、 微量移液器 （法国 GILSON) 、 自动纯水蒸馏器 （上海 1810B) 。

实验试剂：

MTS:CellTiter96 Aqueous MTS Reagent Powder, Promega公司

PMS: Phenazine methosulfate(PMS), Sigma- Aldrich公司

DPBS: Sigma- Aldrich公司

肿瘤细胞：

以下活性测试实验中所使用的人肿瘤细胞： dul45 -人前列腺癌； MCF-7 -人乳腺癌； SKOV3 -人卵巢癌； HT-29 -人结肠癌； A549 -人非小细胞肺癌 （腺癌） ； H460 -人 非小细胞肺癌 （大细胞癌） ， 以及动物肿瘤细胞： L1210 -小鼠白血病细胞均购自上海安 妍商贸有限公司。

细胞毒性增强或加乘效果测试：

实验采用 MTS测试方法。 收集对数期肿瘤细胞， 调整细胞悬液浓度， 每孔加入 100μ1， 铺板使待测细胞调密度至 1000-10000个 /孔， （边缘孔用无菌 PBS填充） 。 在 5%C02， 37°C孵育， 至细胞单层铺满孔底 （96孔平底板） ， 加入一定浓度的水溶性含氯铂配合物与 一定浓度的其他化疗药物（活性组分）组成组 合物，每孔 100μ1，设 5个复孔。 在 5% C02， 37°C条件下孵育 96小时， 倒置显微镜下观察。 向 2ml MTS(2mg/ml, DPBS配制)溶液中加 入 10(^l PMS(lmg/ml,DPBS配制)，混匀，制成 MTS工作液。上述细胞培养板离心后弃去培 养液， 小心用 PBS冲洗 3遍后， 在检测吸光度前， 向 96孔板中每孔加入 ΙΟΟμΙ培养基， 再加入 2(^1MTS工作液，在 37°C， 5%C02条件下孵育 2h后，在 490nm处检测 OD值（光 密度值） 。

上述每个实验重复 5组， 取平均 OD值计算细胞存活率。

按下式计算细胞存活率： 细胞存活率 （％) = (治疗组 OD值 /对照组 OD值） x lOO 对照组： 在上述同样条件下不添加被测活性成分， 最后取得肿瘤细胞在 490nm处检测

OD值。

药物组 -1 : 在上述条件下只添加水溶性铂配合物， 最后取得肿瘤细胞存活率。

药物组 -2: 在上述条件下只添加其他化疗药物 （活性组分） ， 最后取得肿瘤细胞存活 率。

并用组： 在上述条件下同时添加水溶性铂配合物以及其 他化疗药物 （活性组分） ， 最 后取得肿瘤细胞存活率。

( 2 ) 评价方法：

药物并用效果：

水溶性铂配合物与其他化疗药物 （活性组分） 配合使用时， 对癌细胞的增殖抑制作用 的增强或加乘效果， 按下述公式计算：

并用效果 （％) = { 【 （A1-X) + ( A2-X) 】 I I (A1-A2) I }X100

式中， A1为药物组 -1的细胞存活率， A2为药物组 -2的细胞存活率， X为并用组的细 胞存活率， I (A1-A2) I为两组细胞存活率差值的绝对值。

按照上式计算， 其结果【并用效果 （％) 】 >+100%时， 表示对细胞增殖的抑制作用有 增强或加乘效果。

( 3 ) 实验结果-

5-FU+亚叶酸 15μΜ + 5μΜ ◎ ◎ ◎ ◎ ◎ 紫杉醇 Ι μΜ ◎ ◎ ◎ ◎ ◎ 厄洛替尼 Ι μΜ ◎ ο ο ◎ ο

*表中◎表示并用效果 >300%； o表示并用效果介于 100%至 300%

表 -6: 配合物 5与其他化疗药物的并用效果

其他化疗药物 配合物 5 其他化疗药物

(活性组分） 投 (投药量: Ι μΜ)

(活性组分

药量 Η460 SLOV3 MCF7 ΗΤ29 DU145 反铂 10 μΜ ◎ ο ◎ ◎ ◎ 伊立替康 20 μΜ ◎ ◎ ο ◎ ο 吉西他滨 Ι μΜ ◎ ο ◎ ◎ ο 卡培他滨 200μΜ ο ο ◎ ο ο

5- 氟 尿 嘧 啶 15μΜ ◎ ◎ ◎ ◎ ◎ ( 5-FU)

5-FU+亚叶酸 15μΜ + 5μΜ ◎ ◎ ◎ ◎ ◎ 紫杉醇 Ι μΜ ◎ ◎ ◎ ◎ ◎ 厄洛替尼 Ι μΜ ◎ ο ο ◎ ο

*表中◎表示并用效果 >300%; ο表示并用效果介于 100%至 300%

表 -7: 配合物 6与其他化疗药物的并用效果

*表中◎表示并用效果 >300%; ο表示并用效果介于 100%至 300%

实施例 3

在下述试验中， 使用 8-9周龄的雌性 CDF1种鼠， 动物体重平均为 20-25克， 实验动物 购自北京维通利华实验动物技术有限公司。 用 L1210肿瘤细胞 （10 ⁵ 细胞每只老鼠） 在腹 膜内进行接种。 针对制作的肿瘤动物模型， 使用水溶性铂配合物实施治疗， 并与临床使用 的铂类抗肿瘤药物进行比较， 验证本发明水溶性铂配合物对肿瘤动物的预防 和治疗效果以 及水溶性铂配合物对实验动物的毒副作用。 对于水溶性铂配合物和卡铂， 使用质量百分比 为 5%甘露糖醇水溶液，对于顺铂则使用质量百分� ��为 5%甘露糖醇生理盐水溶液制备相应 的注射液。 在肿瘤细胞移植后第 1， 4天经由腹腔内注射药物， 每组实验动物数目为 6。

动物寿命延长 （ILS) 的计算方法如下：

ILS % = [ ( St/Su) - 1] X 100 %

其中， St =接受治疗的动物存活日的加权中间数； Su = 未接受治疗的动物存活日的加权 中间数

实验结果列于表 -8中- 表 -8:

注 * 第 1天到第 7天的体重变化

实施例 4: 水溶性铂配合物在动物肿瘤模型中的抗肿瘤药 效

( 1 ) 试验方法： 使用 5-6周 Nu/nu雄性裸小鼠， 实验动物购自北京维通利华实验动物 技术有限公司。 动物饲养于 SPF级环境下 IVC系统中。 所有实验动物自由摄食、 饮水， 室温 20〜25°C， 湿度 40%〜70%， 昼夜明暗交替时间 12 h/12 h。

将人结直肠肿瘤 DLD-1细胞的细胞悬液皮下注入每只裸鼠腋部， 建立荷瘤小鼠模型。 待肿瘤长到 150〜300 mm3时， 根据肿瘤体积和体重将小鼠均衡分成 5组， 生理盐水组， 配合物 9组， 配合物 24组， 配合物 29组， 奥沙利铂组， 每组 10只。 间隔一周腹腔注射 给药 1次， 给药体积 10 mL/kg， 连续四周给药后停止给药观察肿瘤在停止给药 后的增长情 况， 停止给药后动物正常饲养， 采用隔日测量瘤径的方法， 动态观察动物肿瘤的回长趋势 和受试药的抗肿瘤作用。 实验观察至分组后第 61天。

肿瘤体积 （tumor volume, TV) 的计算公式为： V = l/2xaxb2 。 其中 a和 b分别表示肿 瘤长和宽，根据测量结果计算出肿瘤体积。相 对肿瘤体积增长百分比（％) = ((Vt- V0) I V0) XlOOo vo为分笼给药时 （即 do) 测量所得肿瘤体积， vt为每一次测量时的肿瘤体积 。 ( 2 )投药剂量： 根据预先针对同类裸鼠进行的最大耐药剂量实 验结果， 取各种药物最 大耐药剂量的 70%作为药效实验的投药量。 其中奥沙利铂临床药物的投药量为 7.5毫克每 千克体重， 配合物 9为 45毫克每千克体重， 配合物 24为 28毫克每千克体重， 配合物 29 为 20 毫克每千克体重。 药物在使用前溶解于灭菌蒸馏水中， 使用超声波将药物充分溶解 后注射给药。

( 3 )实验结果： 实验结果显示， 水溶性铂配合物与临床对比药物奥沙利铂相比 具有更 优越的肿瘤抑制效果。 尤其表现在能够在停止给药后长时间抑制肿瘤 的回长， 充分显示了 本发明铂配合物在肿瘤细胞及肿瘤组织内的选 择性积蓄和肿瘤靶向性的提高， 见图 7。

选择式 （I) 所示的任意一种水溶性铂配合物与其他一种或 多种化疗药物组成组合物， 或与止吐药、 解毒药、 抗溃疡药等组成组合物使用。 例如化疗药物为： 顺铂， 反铂， 反式 -二氨基四氯化铂， 卡铂， 奥沙利铂， 5-FU, 氟尿苷， 替加氟尿嘧啶， 吉西他滨， 卡培他滨， 氯法拉滨， 替莫唑胺，法呢酰基转移酶抑制剂 /o« /¾ ，厄洛替尼， 索拉非尼，舒尼替尼， 伊马替尼， 埃罗替尼， 硼替佐米， 吉马替康， 威保啶， 长春瑞滨 Vinorelbine' 亚叶酸， 多 柔比星， 紫杉醇， 多西他赛， 他莫昔芬， 雷洛西芬， 坦螺旋霉素， 伊立替康等。

水溶性铂配合物对癌症的预防作用， 是指式 （I)所示的水溶性铂配合物或者与其他化 疗药物配合使用时， 能够对癌细胞的转移， 或者对原发癌症初期少数癌细胞起到杀伤作用 从而在癌细胞形成危害宿主健康和生命的肿瘤 组织之前将其清除的作用。

【治疗方法】

利用式（I)所示的水溶性铂配合物， 可以制备防治肿瘤药物用于肿瘤预防和治疗。 这 些药物的制备通常使用一种或者几种有效剂量 的水溶性铂配合物， 配合药学可接受的载体 或稀释剂而完成。 这些药学上可接受的载体或稀释剂如淀粉， 葡萄糖、 糊精、 果糖和麦芽 糖， 乳糖， 明胶， 蔗糖， 羟基纤维素， 羟丙基甲基纤维素， 二氧化硅， 硬脂酸羟基乙酸淀 粉钠， 水， 乙醇， 氯化钠等可根据不同的剂型需要加以选择。 另外， 根据药物制备上的需 要， 这些药用辅料还可以包括少量的酸碱调节剂， 稳定剂等。

用式（I)所示的水溶性铂配合物预防和治疗癌� ��的方法中， 根据治疗需要将水溶性铂 配合物制备成注射剂的形式而使用。所制备的 注射液需要无菌，并且保持与血液的等张性。 使用水溶性铂配合物的冻干粉时， 例如可以选用 5%葡萄糖注射液， 0.9%氯化钠注射液， 5%葡萄糖生理盐水注射液， 5%葡萄糖林格氏注射液等将本发明活性成分的� ��干粉稀释成 临床容许的量来实施治疗。 必要的时候， 除上述药用稀释剂以外， 还可以添加缓冲剂， 无 痛化药剂等。

【投药剂量】

使用式（I)所示的水溶性铂配合物作为有效成� ��单独进行肿瘤预防或者治疗时， 投药 量根据患者的年龄， 体重， 性别以及患者所处的状态而有所区别， 一般针对成年人注射的 剂量为每次 10毫克至 1000毫克之间， 每一至四周一次或几次用药。

将式（I)所示的水溶性铂配合物的组合物与其� ��化疗药物配合使用时， 所选择的其他 化疗药物一般根据药物本身产品说明书中所规 定的剂量而进行投药。

各配合物的理化参数：

主要实验仪器： 核磁共振谱仪： BRUKER AVANCE IIL 400MHz; 分析液相色谱仪： 北京创新通恒 LC3000 型高效液相色谱仪， SPD-lOATvp 双波长紫外检测器， 7725i 手动进样器， CLASS-VP 色 谱工作站； 分析色谱柱： DaisoGel, C18, 4.6 X 250cm, 5 m KNAUER德国； 半制备液相色 谱仪：创新通恒 LC3000 半制备液相色谱， SPI001 ;半制备色谱柱： DaisoGel 250x20mmID, C18, ΙΟμιη; 质谱仪： Agilent 6310 Ion Trap LC/MS； 冷冻干燥机： FD-lc-50冻干机 （北京 博医康实验仪器有限公司）。

配合物 1 :

核磁共振谱 （400 MHz ， D20), ppm: 4.87 (0.8H， 双重峰， J=3.6Hz); 4.43 (0.2H, 双重峰, J=7.2Hz); 3.00-4.50 ( 8H， 多重峰）； 2.20-2.45 (2H， 多重峰）； 1.96 (2H， 两重峰， J=12Hz); 1.49 (2H，两重峰， J=8Hz); 1.12-1.30 (2H,单峰）； 0.95-1.10 (2H， 多重峰）； 质谱： MS， m/z: 638.16 [M+H] ⁺

配合物 2:

核磁共振谱 （400 MHz ， D20) ， ppm: 5.76 ( 1H， 单峰） ； 5.67 ( 1H， 单峰） ； 5.15 ( 1H， 单峰） ； 4.96 ( 1H， 单峰） ； 4.84 (0.8H, 双重峰， J=3.6Hz， 异构体） ； 4.40 (0.2H, 双重峰, J=7.2Hz， 异构体） ； 3.20-4.00 ( 10H， 多重峰） ； 2.20-2.45 (2H， 单峰）； 1.95 (2H， 两重峰， J=12Hz)； 1.48 (2H，两重峰， J=8Hz)； 1.12-1.30 (2H， 单峰） ； 0.95-1.10 (2H， 多重峰） ； 质谱： MS， m/z: 652.36 [M+H] ⁺

配合物 3 :

核磁共振谱 （400 MHz ， D20)， ppm: 4.88 ( 1H，双重峰， J=3.6Hz， 异构体）； 3.65-3.85 ( 5H， 多重峰）； 3.55-3.63 ( 1H， 多重峰）； 3.45-3.53 ( 1H， 多重峰）； 3.25-3.40 (2H， 多重峰）； 2.80-3.00 ( 1Η， 多重峰）； 2.25-2.45 (2H， 多重峰）； 1.85-2.05 (2H， 多重峰）； 1.56-1.73 (2H， 多重峰）； 1.49 (2H，两重峰， J=8Hz); 1.13-1.33 (2H， 多重峰）； 0.92-1.11 (2H， 多重峰）。 质谱： MS， m/z: 666.65 [M+H] ⁺

配合物 5:

核磁共振谱 （400 MHz ， D20) ， ppm: 4.89 ( 1H， 单峰） ； 3.30-4.00 (9H， 多重峰） ； 2.90-3.20 ( 1H， 多重峰） ； 2.20-2.45 (2H， 多重峰） ； 1.90-2.05 (2H， 多重峰） ； 1.50

(2H， 两重峰， J=8Hz) ； 1.16-1.30 (2H， 多重峰） ； 1.00-1.15 (2H， 多重峰） ； 质谱： MS, m/z: 652.16 [M+H] ⁺

配合物 6:

核磁共振谱 （400 MHz ， D20)， ppm: 4.86 ( 1H， 单峰）； 3.50-3.96 ( 8H， 多重峰）； 2.80-3.20 (2H, 多重峰）； 2.20-2.45 (2H， 多重峰）； 1.96 (2H， 两重峰， J=12Hz); 1.61-1.75 (2H， 多重峰）； 1.51 (2H， 两重峰， J=6Hz); 1.13-1.30 (2H， 多重峰）； 0.95-1.12 (2H， 多重峰）； 质谱： MS， m/z: 666.18 [M+H] ⁺

配合物 8:

核磁共振谱 （400 MHz,D2O) ,ppm: 4.90 ( 1H，两重峰, J=3.6Hz)； 4.10-4.30 ( 1H,多重峰）； 3.50-4.00 ( 8H,多重峰） ； 2.80-3.40 ( 1H， 多重峰） ； 2.28-2.45 (2H,多重峰） ； 1.90-2.00 (2H,多重峰) ； 1.40-1.60 (2H， 多重峰） ； 1.16-1.30 (2H， 宽峰） ； 1.00-1.15 (2H， 多 重峰） ； 质谱： MS， m/z: 652.33 [M+H] ⁺ 配合物 9:

核磁共振谱 （400 MHz ， D20)， ppm: 4.90 ( 1H， 双重峰， J=4Hz); 3.62-4.00 (7H， 多 重峰）； 3.50-3.60 ( 1Η， 多重峰）； 2.70-3.00 (2H， 多重峰）； 2.20-2.40 (2H， 多重峰）； 1.90-2.10 (2H, 多重峰）； 1.60-1.70 (2H， 多重峰）； 1.50 (2H，两重峰， J=6Hz); 1.18-1.30 (2H， 多重峰）； 1.00-1.16 (2H， 多重峰）； 质谱： MS， m/z: 666.20 [M+H] ⁺

配合物 10:

核磁共振谱 （400 MHz ， D20), ppm: 4.88 (0.8H， 双重峰， J=3.6Hz); 4.45 (0.2H, 双重峰, J=7.2Hz); 3.00-4.50 ( 8H， 多重峰）； 质谱： MS, m/z: 558.13 [M+H] + 配合物 11 :

核磁共振谱 （400 MHz ， D20)， ppm: 4.88 (0.8H， 双重峰， J=3.6Hz， 异构体） 4.42 (0.2H, 双重峰, J=7.2Hz， 异构体） 3.15-3.95 ( 10H， 多重峰）质谱： MS, m/z: 572.11 [M+H] ⁺

配合物 12:

核磁共振谱 （400 MHz ， D20)， ppm: 4.87 ( 1H，双重峰， J=3.6Hz， 异构体）； 3.64-3.83 ( 5H， 多重峰）； 3.55-3.63 ( 1H， 多重峰）； 3.43-3.53 ( 1H， 多重峰）； 3.26-3.40 (2H， 多重峰）； 2.80-2.98 ( 1Η， 多重峰）； 1.60-1.75 (2H， 多重峰）； 质谱： MS, m/z: 586.56 [M+H] ⁺

配合物 14:

核磁共振谱 （400 MHz ， D20)， ppm: 4.85 ( 1H， 单峰）； 3.50-3.95 (9H， 多重峰）； 2.80-3.20 ( 1H， 多重峰）。 质谱： MS， m/z: 572.21 [M+H] ⁺

配合物 15:

核磁共振谱 （400 MHz ， D20)， ppm: 4.90 ( 1H， 单峰）； 3.50-4.00 ( 8H， 多重峰）； 2.80-3.20 (2H， 多重峰）； 1.60-1.73 (2H， 多重峰）； 质谱： MS， m/z: 586.17 [M+H] ⁺ 配合物 17:

核磁共振谱 (400 MHz ， D20), ppm: 4.89 ( 1H， 两重峰， J=3.6Hz); 3.50-4.20 (9H， 多重峰）； 2.80-3.40 ( 1H， 多重峰）； 质谱： MS， m/z: 572.21 [M+H] ⁺

配合物 18:

核磁共振谱 （400 MHz ， D20)， ppm: 4.90 ( 1H， 双重峰， J=4Hz); 3.50-4.00 ( 8H， 多 重峰）； 2.68-3.10 (2H， 多重峰）； 1.55-1.75 (2H， 多重峰）；质谱： MS， m/z: 586.19 [M+H] ⁺ 配合物 19:

核磁共振谱 （400 MHz ， D20), ppm: 4.88 (0.8H， 双重峰， J=3.6Hz); 4.83 (4H， 宽峰） 4.44 (0.2H, 双重峰, J=7.2Hz); 3.00-4.30 ( 8H， 多重峰）； 2.41 (2H， 七重 峰）； 1.15-1.30 ( 12H, 多重峰）； 质谱： MS, m/z: 642.21 [M+H] +

配合物 20:

核磁共振谱 （400 MHz ， D20)， ppm: 4.85 ( 1H， 单峰）； 3.40-4.10 (9H， 多重峰）； 2.95-3.20 ( 1H， 多重峰）； 质谱： MS, m/z: 556.28 [M+H] ⁺

配合物 21 :

核磁共振谱 （400 MHz ， D20)， ppm: 4.85 ( 1H， 单峰）； 3.40-4.10 (9H， 多重峰）； 2.95-3.20 ( 1H， 多重峰）； 质谱： MS， m/z: 556.28 [M+H]

配合物 23 :

核磁共振谱 （400 MHz ， D20)， ppm 4.85 ( 1H， 单峰）; 3.40-4.10 ( 9H， 多重峰）; 2.95-3.20 ( 1H， 多重峰）。 质谱： MS, m/z: 656.21 [M+H] ⁺

配合物 24:

核磁共振谱 （400 MHz ， D20)， ppm 4.85 ( 1H， 单峰）; 3.40-4.10 ( 9H， 多重峰）; 2.95-3.20 ( 1H， 多重峰）。 质谱： MS, m/z: 670.28 [M+H] ⁺

配合物 26:

核磁共振谱 （400 MHz ， D20)， ppm 4.85 ( 1H， 单峰）; 3.40-4.10 ( 9H， 多重峰）; 2.95-3.20 ( 1H， 多重峰）； 质谱： MS, m/z: 656.23 [M+H] ⁺

配合物 27:

核磁共振谱 （400 MHz ， D20)， ppm 4.85 ( 1H， 单峰）; 3.40-4.10 ( 9H， 多重峰）; 2.95-3.20 ( 1H， 多重峰）； 质谱： MS, m/z: 670.20 [M+H] ⁺

配合物 29:

核磁共振谱 （400 MHz ， D20)， ppm: 4.87 ( 0.8H， 双重峰， J=3.6Hz); 4.83 (4H， 宽峰）； 4.42 ( 0.2H, 双重峰, J=7.2Hz); 3.00-4.15 ( 10H， 多重峰）； 2.68-2.79 (2H， 多重峰）； 0.75-0.95 ( 8H， 多重峰）； 质谱： MS, m/z: 652.31 [M+H] +

实施例 5: 代表化合物的制备

配合物 2的制备- ( 1 ) 1-0-D-葡萄糖苷 -2-溴 -乙垸 (IV-2) 制备：

1 ) 在室温条件下将葡萄糖 （2.7g)加入到 2-溴乙醇 （10ml) ， 冷却到 0°C， 用氮气置换烧 瓶内空气， 在氮气保护下慢慢滴加 1ml三氟化硼-乙醚配合物；

2) 将反应液在 0°C搅拌 15分钟， 然后慢慢升温到室温并搅拌 30分钟， 然后将反应液加 热到 80°C， 在 80°C反应 5小时； 反应完成后， 旋蒸除去溶剂， 使用硅胶柱色谱 （二氯甲 垸： 甲醇， 6： 1 )对反应生成物实施简单纯化，得到粗产品 2.3g (IV-2) 。 质谱： MS， m/z: 287.23 [M+H] ⁺

(2) 1-0- (2,3,4,6-四乙酰基 -D-葡萄糖苷） -2-溴 -乙焼 (V-2) 的制备：

在室温条件下， 将上一步反应得到的产品 1-0-D-葡萄糖苷 -2-溴 -乙垸（IV-1 ) 2.3g溶解 于吡啶与乙酸酐 （7ml : 7ml) 中， 搅拌过夜， 用 TLC 监测反应终点。 反应完成后， 加入 100ml 乙酸乙酯， 用体积浓度为 5%的盐酸水溶液 （2x25ml) 洗涤， 将水相用乙酸乙酯 (2x25ml) 萃取， 合并有机相。 将有机相依次用饱和氯化铵水溶液 （lxlOOml), 蒸馏水 (lxlOOml), 饱和碳酸氢钠水溶液 （lxlOOml), 饱和氯化钠水溶液 （1x100ml) 洗涤， 用 无水硫酸钠干燥。 用旋转蒸发仪将溶剂蒸干， 得到微黄色粗产品。 得到的粗产品经硅胶柱 色谱纯化 （石油醚： 乙酸乙酯， 3 : 1)， 得到无色油状目的产物 2.5g (V-2)。

核磁共振谱 （400 MHz ， CDC13), ppm: 5.45 ( 1H， 三重峰， J=9.6Hz); 5.15 ( 1H， 双 重峰, J=4Hz); 5.02 (1Η， 三重峰， J=9.6Hz); 4.80-4.83 ( 1H， 多重峰）； 4.19-4.23 ( 1H， 多重峰）； 4.04-4.15 (2H， 多重峰）； 3.92-4.00 (1H， 多重峰）； 3.75-3.85 ( 1H， 多重峰）； 3.49 (2H， 三重峰， J=6Hz); 1.91-2.11 (12H， 多重峰）。 质谱： MS， m/z: 455.15 [M+H] ⁺ (3) 1-0- (2,3,4,6-四乙 -D-葡萄糖苷） -丙垸 -3,3-二甲酸二乙酯 （VI-2) 的制备：

将上一步反应得到的产品 1-0-(2,3,4,6-四乙酰基-0-葡萄糖苷）-2-溴-乙垸（� �-2)(2.5 _§ ) 溶解于 5ml 干燥的 N， N-二甲基甲酰胺中， 向反应液中加入碳酸钾 （3g)， 丙二酸二乙酯 (1.76g)， 室温搅拌过夜。 用 TLC监测反应终点， 待反应完成后， 向反应液中加入 100ml 乙酸乙酯， 然后用饱和氯化铵水溶液（1x50ml)洗涤， 将水相用乙酸乙酯萃取（2x25ml)， 合并有机相。 将有机相依次用饱和氯化铵水溶液（lxlOOml), 蒸馏水（lxlOOml), 饱和氯 化钠溶液 （lxlOOml) 洗涤， 然后用无水硫酸钠干燥， 用旋转蒸发仪将溶剂蒸干， 得到的 淡黄色油状物用硅胶柱色谱纯化 （石油醚： 乙酸乙酯， 3 : 1)， 得到无色透明油状目的产 物 2.6g (VI-2)o

核磁共振谱 （400 MHz ， CDC13), ppm: 5.42 ( 1H， 三重峰， J=9.6Hz); 4.96-5.10 (2H， 多重峰）； 4.78-4.90 (1H， 多重峰）； 4.03-4.33 (5H， 多重峰）； 3.92-4.02 ( 1H， 多重峰）； 3.71-3.87 (1H， 多重峰）； 3.71-3.87 ( 1H， 多重峰）； 3.55 ( 1H， 三重峰， J=8Hz); 3.40-3.50 (1Η， 多重峰）； 2.13-2.28 (2H， 多重峰）； 1.94-2.14 (12H, 多重峰）； 1.15-1.35 (6H， 多 重峰）。 质谱： MS， m/z: 535.34 [M+H] ⁺

(4) 1-0- (2,3,4,6-四乙 -D-葡萄糖苷） -丙垸 -3-氯 -3,3-二甲酸二乙酯 （VII-2) 的制备

将 1-0- (2,3,4,6-四乙酰基 -D-葡萄糖苷） -丙垸 -3,3-二甲酸二乙酯 2.6g溶解在 20mL干 燥的四氢呋喃中， 冷却到 0°C。 用氮气置换烧瓶内空气， 在氮气保护下缓慢加入 235mg氢 化钠固体 （60%)。 反应液升温至室温， 搅拌 1小时。 加入 780mgN-氯代丁二酰亚胺,反应 液室温反应 2小时， 旋蒸除去溶剂。 向反应液中加入 100ml乙酸乙酯， 然后用饱和氯化铵 水溶液 （1 x50ml) 洗涤， 将水相用乙酸乙酯萃取 （2x25ml)， 合并有机相。 将有机相依次 用饱和氯化铵水溶液 （l x lOOml), 蒸馏水 （l x lOOml), 饱和氯化钠水溶液 （1 x 100ml) 洗 涤， 然后用无水硫酸钠干燥， 用旋转蒸发仪将溶剂蒸干， 得到的淡黄色油状物用硅胶柱色 谱纯化 （石油醚： 乙酸乙酯， 3 : 1 )， 得到无色透明油状目的产物 2.6g (VII-2)o

核磁共振谱 (400 MHz ， CDC13 ), ppm: 5.29 ( 1H， 三重峰， J=9.6Hz); 4.90-5.00 (2H， 多重峰）； 4.67-4.78 ( 1Η， 多重峰）； 4.15-4.35 ( 5H， 多重峰）； 3.97-4.05 (2H， 多重峰） 3.85-3.95 ( 1H， 多重峰）； 3.45-3.55 ( 1H， 多重峰）； 2.48-2.65 (2H， 多重峰）； 1.85-2.05

( 12H, 多重峰）； 1.10-1.30 (6H， 多重峰）。 质谱： MS， m/z: 569.19 [M+H] ⁺

( 5 ) 1-0- (D-葡萄糖苷） -丙垸 -3-氯 -3,3-二甲酸 （ΠΙ-2) 的制备

1 ) 将 1-0- (2,3,4,6-四乙酰基 -D-葡萄糖苷） -丙垸 -3-氯 -3,3-二甲酸二乙酯 （2.6g， ) 溶解 于 5mL甲醇中。 将氢氧化钠 （1.5g) 溶解于 10mL水中， 室温下加入到反应液中， 然后升 温至 60 V反应 24小时。 用 TLC监测反应终点。

2) 待反应完成后， 用旋转蒸发仪除去甲醇， 使用强酸性阳离子交换树脂处理产品。 用水 洗脱得到的水溶液用冷冻干燥机干燥后得到无 色粘稠状液体 1.5g， 粗产品直接用于下步反 应。 质谱： MS， m/z: 345.11 [M+H] ⁺

(6) 顺-【反式- ( 1R， 2R) -二胺基环己垸】铂 (II) ( 1-0-D-葡萄糖苷 -丙垸 -3-氯 -3， 3-二 甲酸酯） （1-2) 的制

1 ) 将 1-0-D-葡萄糖苷 -丙垸 -3-氯 -3,3-二甲酸粗产品 （1.5g) 溶解于 15mL水中， 用氢氧化 钡水溶液调节反应液 pH到 7， 室温搅拌 30分钟；

2) 在氮气保护下将反式- ( 1R， 2R)环己二胺硫酸铂 （1.7g)溶解于 2ml水中， 加入到 1 ) 的反应液中， 用氢氧化钡水溶液调节 pH到 7， 室温避光搅拌过夜。

3 ) 待反应完成后， 使用离心机除去沉淀， 收集上清液， 用半制备 HPLC分离并使用冷冻 干燥机冻干， 得到 1.5g最终产品 （1-2) ， 白色固体。

核磁共振谱 （400 MHz ， D20)， ppm: 5.76 ( 1H， 单峰） ； 5.67 ( 1H， 单峰） ； 5.15 ( 1H， 单峰） ； 4.96 ( 1H， 单峰） ； 4.84 (0.8H, 双重峰， J=3.6Hz， 异构体） ；

4.40 (0.2H, 双重峰, J=7.2Hz， 异构体） ； 3.20-4.00 ( 10H， 多重峰） ； 2.20-2.45 (2H， 单峰）； 1.95 (2H， 两重峰， J=12Hz)； 1.48 (2H，两重峰， J=8Hz)； 1.12-1.30 (2H， 单峰） ； 0.95-1.10 (2H， 多重峰） 。 质谱： MS， m/z: 652.36 [M+H] ⁺