ϋTTT.T.SATTC-ï D'UNE SUBSTANCE POLD_ QDE EN TAOT Qσ'AG__KT ANΩlCKEGtm PL__QP_ÏTIAIHE

DOHAINE DE L'INV_5NΗ.GN

La présente invention concerne l 'utilisation de composés foliniques appartenant à la famille des dérivés et analogues de l' acide folinique comprenant dans leur molécule le radical 5,6,7,8-tétrahydrofolique de formule

où les tirets — désignent une liaison avec un atome d'hydrogène en position A, 5 et /ou 10, une liaison avec un groupe OH comme substituant d'au moins un des deux groupes carbonyle du reste glutarπyle, ou encore tout autre groupe convenable en position A, 5 et/ou 10 ou comme substituant d'au moins un - des deux groupes carbonyle du reste glutamyle. ART ANTERIEUR

On sait que l 'acide folique, qui répond à la nomenclature systématique d' acide N-[A-[ [(2-aτιino-l ,4-dlhydro-A-oxo-6-ptéri- clinyl)__éthyl]aιnino]benzoyl]-L-glutaπ_iqτje, et ses sels de métaux alcalins et alcalino-terreux agissent dans l ' organisme en tant que substances vitaminiques [voir Merck Index, 10e édition (1983) ,

pages 602-603].

On sait que l'acide folinique qui répond à la nomenclature systématique d'acide N-[A-[[(2-araino-5-foππyl- 1,4,5,6,7,8-hexahydrcrA-oxo-6-ptéridinyl)mét_ιyl]aπ_ino3 benzoyl]- L-glutamique, et à la nomenclature abrégée d'acide 5-forayl- 5,6,7,8-tétrahydrofolique, et ses sels interviennent dans l'organisme en tant que substances antidotes vis-à-vis des antagonistes de l'acide folique [voir Merck Index, 10e édition (1983), page 603]. On sait que le méthotréxate, qui répond à la nomenclature systématique d'acide N-[A-[[(2,A-diamino-6-ptériά___yl)-méthyl]- raéthyla__ no]beιιzoyl]-L-glutamique, et à la nomenclature abrégée d'acide A-amino-N ¹⁰ -méthylfolique, est un antagoniste de l'acide folique et agit dans l'organisme en tant qu'agent antinéoplasique et antimétabolite. Plus précisément, on sait que le méthotréxate bloque (i) la conversion de l'acide folique en acide folinique et (ϋ) la synthèse de l'ADN, d'une part, et intervient en tant que substance induisant l'agrégation des plaquettes sanguines, d'autre part. On sait aussi que le méthotréxate a provoqué des accidents quand il a été administré à des patients atteint d'un cancer [voir Merck Index, 10e édition (1983), pages 859-860].

On sait en particulier que l'article de M.T. SHA , Scand. J. Haemat., 10, pages 2A-27, 1973, fait état, chez la femme enceinte présentant des tumeurs throphoblastiques, d'une diminution du nombre de plaquettes après administration d'un traitement comprenant en combinaison du méthotréxate (par voie I.V. ou I.M.) et de l'acide folinique (par voie I.M.). Le protocole suivi et les résultats fournis par ledit article ne permettent pas de suggérer que l'acide folinique a des propriétés antiagrégantes vis-à-vis des plaquettes sanguines, dès lors que notamment ledit acide n'a pas été utilisé seul.

On sait que la méthoptérine, qui répond à la nomenclature systématique d'acide N-[A-[[(2-amino-A-hydroxy-6-ptéridiπyl)- raéthyl]-méthylamino]_>enzoyl]-L-glutamique, et qui est également dénommée acide N ¹⁰ -méthylfolique, est un dérivé de l'acide folique qui a été décrit dans US-A-2 563707 [voir également Merck Index, 10e édition (1983), page 859].

On sait enfin que l'acide 5-méthyl-5,6,7,8-tétrahydrofo- lique, qui répond à la nomenclature systématique d'acide N-[4- [[(2-amino-l,4,5,6,7,8-hexahydro-5-_i-éthyl-4-oxo-6-ptérid inyl)- méthyl]amino]benzoyl]-L-gluta__tique et a pour nomenclature ^" abrégée 5-N-Me-THF, d'une part, et l'acide folinique, d'autre part, ont été proposés en thérapeutique ^" en tant que médicaments anti-stress. OBJET DE L'__NVl_NTiσN

Suivant l'invention on propose une nouvelle utilisation d'une substance folinique ou analogue à l'acide folinique en tant que moyen antiagrégant plaquettaire.

Plus précisément on préconise suivant l' invention une nouvelle utilisation en thérapeutique d'une substance folinique ou analogue à l' acide folinique, ladite utilisation étant caracté¬ risée en ce que l'on fait appel à une substance choisie parmi l'ensemble comprenant l'acide 5,6,7,8-tétrahydrofolique, ses dérivés et leurs mélanges , pour l'obtention d'un médicament antiagrégant plaquettaire destiné à une indication thérapeutique dans les cas où il convient d' inhiber ou réduire l'agrégation des

. plaquettes sanguines. Cette nouvelle utilisation en thérapeutique suivant l'invention n'est pas décrite ni suggérée par l'enseignement de l' art antérieur résumé ci-dessus.

En - d'autre terme l' ingrédient actif antiagrégant plaquettaire suivant l' invention comprend dans sa molécule le radical 5,6,7,8-tétrahydrofolyle de formule

où. les tirets désignent une liaison avec un atome d'hydrogène en position 4,5 et/ou 10, une liaison avec un groupe OH comme substituant d'au moins un des deux groupes carbonyle du reste glutarayle, ou encore tout autre groupe convenable en position 4,5

^* et/ou 10- ou comme substituant d'au moins un des deux groupes carbonyle du reste glutamyle.

DESCIPΠON DÉTAILLÉE DE *INVENTION

L'invention vise donc une nouvelle utilisation en tan que substances antiagrégantes plaquettaires de l'acide 5,6,7,8- tétrahydrofolique et de ses dérivés. 5 Lesdits dérivés comprennent notamment ceux qui présentent dans leur molécule

a) un groupe hydroxyle, amino ou oxo en position 4, b) un groupe alkyle en C^-C^ (notamment raéthyle) ou un groupe acyle (notamment foππyle ou acétyle) en position 5, c) un groupe alkyle en C1-C (notamment méthyle) en position 10, et/ou, d) un des groupes COOH du reste acide glutaraique ou les deux groupes dudit reste acide glutamique transfoπné(s) en groupe(s) ester ou amide.

D'un point de vue pratique la substance antiagrégante plaquettaire est choisie.parmi l'ensemble comprenant (i) les acides 5,6,7,8-tétrahydrofoliques et leurs sels de formule

dans laquelle

X*ι et Xo, identiques ou différents, représentent chacun H, OH ou

NH2 _. i et considérés ensemble pouvant former avec l'atome de carbone auquel ils sont liés un groupe oxo,

Y représente H, CHO, COCH3 ou un groupe alkyle en C^-C^, le groupe alkyle préféré étant CH3,

Z représente H ou un groupe alkyle en C-^-C^, le groupe alkyle préféré étant CH3,

R^ et R2, identiques ou différents, représentent chacun OH ou un reste basique, notairment NH^ ⁺ ou ^~ l/m M ⁺ m où M est un atome de métal et m sa valence ;

(ii) les esters où l'un au moins des R*^ et R2 représente un groupe alkoxy, aralkoxy, aryloxy ou hétéroaryloxy ; (iii) les a ides où l'un au moins des R-i et R2 représente un

groupe amino éventuellement substitué ; et (iv) leurs mélanges.

Suivant le meilleur mode de mise en oeuvre de l'invention l'ingrédient actif antiagrégant plaquettaire est choisi parmi l'ensemble constitué par a) l'acide folinique, qui répond à la nomenclature systématique d'acide N-[4-[[(2-amino-5-foππyl-l,4,5,6,7,8-hexahydro-4-oxo-6- ptéridinyl)méthyl]-amino]benzoyl]-L-glutamique, b) l'acide 4-amino-N^-méthyl-5,6,7,8-tétrahydrofolique, qui répond.à la nomenclature systématique d'acide N-[4-[[(2,4-di_mino-

1,4,5,6,7,8-hexahydro-6-ptéridinyl)méthyl]-méthylamino ]benzoyl]-L- gluta ique, c) l'acide N ¹⁰ -méthyl-5,6,7,8-tétrahydrofolique, qui répond à la nomenclature systématique d'acide N-[4-[[(2-amino-l,4,5,6,7,8- hexahydro-A-hydroxy-6-ptéridi_nyl)mét yl]-méthylamino]benzoyl]-L- glutamique, d) l'acide 5-forrayl-N ¹⁰ -raéthyl-5,6,7,8-tétrahydrofolique, qui répond à la nomenclature systématique d'acide N-[A-[[(2-amino-5- forrayl-1,4,5,6,7,8-hexahydro-4-hydroxy-6-ptéridiπyl)méth yl]- méthylam-no]ber_z.oyl]-L-glutamique, e) l'acide 5-__éthyl-5,6,7,8-tétrahydrofolique, et qui répond à la nomenclature systématique d'acide -[4-[[(2-__π_ino-l,4,5,6,7,8- hexahydro-5-r__éthyl-4-oxo-6-ptéridinyl)π_éthyl)__m_no]b enzoyl]-L- glutamique, f) leurs sels de métaux alcalins et alcalino-terreux.

Les produits les plus intéressants suivant l'invention eu égard à leurs propriétés antiagrégantes plaquettaires sont sur¬ tout l'acide 5-méthyl-5,6,7,8-tétrahydrofolique et ses sels de métaux alcalins et alcalino-terreux, tels que les sels de sodium, potassium et calcium.

D'une façon pratique, on présume que l'efficacité de l'acide 5-méthyl-5,6,7,8-_tétrahydrofolique est en relation avec le caractère hydrophobe du groupe 5-mé hyl qui facilite ou améliore la biodisponibilité au niveau cellulaire. Bien que le demandeur ne soit pas lié par cette théorie, on préfère, selon l'invention, les

composés de formule II qui sont hydrophobes comme ledit acide 5-méthyl-5,6,7,8-tétrahydrofolique et qui exercent, de manière générale, une activité antiagrégante plaquettaire supérieure à celle de l'acide folinique eu égard à leur pouvoir de pénétration dans les cellules.

On préconise suivant l'invention une composition thérapeutique qui renferme en association avec un excipient physiologiquement acceptable une quantité phaπoaceutiquement efficace de substance antiagrégante plaquettaire appartenant à la famille des acides 5,6,7,8-tétrahydroliq_es et de leurs dérivés.

Une telle composition est utile en thérapeutique humaine et vétérinaire pour les animaux à sang chaud. Elle convient plus précisément pour le traitement des mammifères et surtout de l'homme. Les principes actifs antiagrégants plaquettaires suivant l'invention peuvent être préparés selon une méthode connue en soi par application de mécanismes réactiormels classiques.

D'autres avantages et caractéristiques de l'invention seront mieux compris à la lecture qui va suivre de résultats d'essais pharmacologiques, mettant en oeuvre, le composé antiagrégant préféré suivant l'invention, à savoir l'acide 5-méthyl-5,6,7,8-tétrahydrofolique, en présence d'une substance connue pour ses propriétés agrégantes, le méthotréxate, d'une part, et en présence d'un agent contraceptif, l'éthynyl-estradiol, d'autre part.

P__I___I__ E SERIE D'EXPERIENCES

Dans une première série d'expériences, les essais pharmacologiques ont été entrepris chez le rat mâle adulte, les rats étant répartis en lots de dix animaux chacun, à savoir : un.lot contrôle C recevant uniquement le véhicule, constitué de diméthylformaraide et de NaCl à 9 g/1, par voie sous cutanée; un lot traité M recevant le méthotréxate (0,5 mg/kg) dans le véhicule précité par voie sous-cutanée; et, un lot traité N recevant le méthotréxate (0,5 mg/kg) dans le véhicule précité par voie sous-cutanée et l'acide 5-méthyl-

5,6,7,8-téttahydrofolique (0,5 mg/kg) également par voie sous-

cutanée.

Les injections sont effectuées à heure fixe pendant 3 jours. Le quatrième jour, des prises de sang sont effectuées sur les animaux à jeun et les plaquettes sanguines sont isolées par les techniques habituelles et remises en suspension dans un tampon. L'activité agrégante de ces plaquettes est testée lors de la stimulation par des doses faibles de thrombine. Les résultats sont exprimés (en mm) par la pente de la courbe d'agrégation obtenue. Ces résultats sont consignés dans le tableau I ci-après.

TABI_E__U I

DWX l bME SERIE D'___r__U__C_S

Dans une seconde série d'expériences, on a administré à des rats femelles pesant 200 à 300 g du méthotréxate par voie sous-cutanée ou un moyen contraceptif par intubation, d'une part, et l'acide folinique ou l'acide 5-méthyl-5,6,7,8-tétrahydro- folique, par voie sous-cutanée ou par gavage, d'autre part.

a) Des lots de rats femelles reçoivent du méthotréxate (0,5 mg/kg) par voie S.C. pendant trois jours. D'autres lots sont traités pendant la même durée par de l'acide fol.inique ou de l'acide 5-méthyl-5,6,7,8-tétrahydrofolique (0,5 mg/kg) par voie S.C. ou par voie orale (par gavage), le lot témoin recevant l'excipient du méthotréxate, l'excipient de l'acide folinique et l'excipient de l'acide 5-méthyl-5,6,7,8-tétrahydrofolique. Les analyses sont effectuées le lendemain du dernier jour de traitement sur les animaux à jeun. Les prises de sang ont lieu par 0 la veine jugulaire après anesthésie légère. Les prélèvement sont effectués pour préparation des plasmas, des hématies et des plaquettes sanguines.

Agrégation sur plasma riche en plaquettes (PRP) L'induction de l'agrégation est effectuée par la 5 thrombine et l'ADP. Le méthotréxate est administré entre 9 et 10 heures les jours J^, J2 et J3, l'acide folinique et l'acide 5-méthyl-5,6,7,8-tétrahydrofolique sont administrés entre 9 et 10 heures les jours J > J2 et J3. Les prélèvements ont lieu le jour JΛ sur les animaux à jeun. 0 Les résultats obtenus figurent dans le tableau II ci- après.

Agrégation de plaquettes isolées

L'induction de l'agrégation est effectuée par la thrombine et l'ADP. Le méthotréxate est administré entre 9 et 10 5 heures les jours J- J2 et J3, l'acide folinique et l'acide

5-méthyl-5,6,7,8-tétrahydrofolique sont administrés entre 9 et 10 heures les jours J-^, J2 et J3. Les prélèvements ont lieu le jour J sur les animaux à jeun.

Les résultats obtenus figurent dans le tableau III ci- ³⁰ après. b) Des lots de rats femelles reçoivent un moyen contraceptif : 5 micrograπmes d'éthyπyl-estradiol et 250 micrograπmes de lynestrénol par voie orale (intubation) pendant qautre jours. D'autres lots sont traités pendant la même durée par

^• 3C de l'acide folinique ou de l'acide 5-méthyl-5,6,7,8-tétrahydrofo- lique (0,5 mg/kg) par voie S.C. ou par voie orale (par gavage), le

lot témoin recevant l'excipient du moyen contraceptif , l'excipient de l'acide folinique et l'excipient de l'acide 5- roét__ιyl-5,6,7,8-tétrahydrofolique. Les analyses sont effectuées le lendemain du dernier jour de traitement sur les animaux à jeun. Les prises de sang ont lieu par la veine jugulaire après anesthésie légère. Les prélèvement sont effectués pour préparation des plasmas, des hématies et des plaquettes sanguines. Agrégation sur plasma riche en plaquettes (PRP) L'induction de l'agrégation est effectuée par la thrombine et l'ADP. Le moyen contraceptif est administré entre 9 et 10 heures les jours J _f J2, J3 et J^ ^~ l'acide folinique et l'acide 5-méthyl-5,6,7,8-tétrahydrofqlique sont administrés entre 9 et 10 heures les jours J*^, J2, J3 et J . Les prélèvements ont lieu le jour Je sur les animaux à jeun. Les résultats obtenus figurent dans le tableau IV ci- après.

Agrégation de plaquettes isolées

L'induction de l'agrégation est effectuée par la thrombine et l'ADP. Le moyen contraceptif est administré entre 9 et 10 heures les jours J*^, Jo, J3 et J , l'acide folinique et l'acide 5-méthyl-5,6,7,8-tétràhydrofolique sont administrés entre 9 et 10 heures les jours J^, J2, J3 et J . Les prélèvements ont lieu le jour J5 sur les animaux à jeun.

Les résultats obtenus figurent dans le tableau V ci- après.

L'ensemble des résultats relatif aux mesures de l'agrégation plaquettaire est exprimé en millimètres sur les courbes d'agrégation suivant le système moyenne/écart type (n = 3 à 5). Ils mettent en évidence que le produit préféré selon l'invention, à savoir l'acide 5-méthyl-5,6,7,8-tétrahydrofolique, désigné ici 5-N-Me-THF, manifeste surtout ses effets antiagrégants quand l'agrégation plaquettaire du sujet est trop importante.

TABIEAΠ II

Produit Agrégation plaquettaire (mm)

Thrombine ADP

Contrôle 55 ± 6 (d) 132 +_ 14 (d)

Acide folinique 74 + 11 136 +.27

5-N-Me-THF 65 +.10 128 + 9

Méthotréxate 135 + _, 9 (d) 202 +_ 11 (d)

Méthotréxate + acide folinique 120 + 11 (a) 141 + 9 (c)

Méthotréxate + 5-N-Me-THF 120 + 11 (b) 115 + 8 (d)

Notes

5-N-Me-THF : acide 5-méthyl-5,6,7,8-tétrahydrofoliq_e;

(a) p<0,05, statistiquement significatif selon le test de Student;

(b) p<0,025, statistiquement significatif selon le test de Student;

(c) p<0,005, statistiquement significatif selon le test de Student;

(d) p<0,001, statistiquement significatif selon le test de Student. - -

TABUEAΠ m

Produit Agrégation plaquettaire (ma)

Thrombine ADP

Contrôle 118 ± 8 (c) 130 ±11 (d)

Acide folinique 120 + 11 126 ± 13

5-N→_e-THF 82 + 7 (b) 101 ± 8 (a)

Méthotréxate 161 +_ 6 (d) 231 ± 7 (d)

Méthotréxate + acide folinique 136 + 17 202 + 14

Méthotréxate + 5-N-ï-fe-THF 63 + 6 (d) 96 + 6 (d)

Notes

5-N-Me-THF : acide 5-méthyl-5,6,7,8-tétrahydrofolique;

(a) p<0,05, statistiquement significatif selon le test de Student;

(b) p<0,025, statistiquement significatif selon le test de Student;

(c) p<0,005, statistiquement significatif selon le test de Student;

(d) p<0,001, statistiquement significatif selon le test de Student.-

TABLEAU I?

TABLEAU V