UV-sensitive Sicherheitsstämme für die biotechnologische Produktion

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur die Erhöhung der UV-Sensitivität bestimmter Bakterien, welche sich damit als Sicherheitsstämme für die biotechnologische Produktion eignen.

Die vorliegende Erfindung liegt auf dem Gebiet der Biotechnologie, insbesondere der Herstellung von Wertstoffen durch Fermentation von Mikroorganismen, die zur Bildung der interessierenden Wertstoffe in der Lage sind. Hierzu zählen beispielsweise die Herstellung niedermolekularer Verbindungen, etwa von Nahrungsmittelergänzungsstoffen oder pharmazeutisch relevanten Verbindungen, oder von Proteinen, für welche aufgrund ihrer Diversität wiederum ein großes technisches Einsatzgebiet besteht. Im ersten Fall werden die Stoffwechseleigenschaften der betreffenden Mikroorganismen zur Herstellung der Wertstoffe ausgenutzt und/oder verändert; im zweiten Fall werden Zellen eingesetzt, die die Gene der interessierenden Proteine exprimieren. In beiden Fällen handelt es sich zumeist also um gentechnisch veränderte Organismen (GVO).

Zur Fermentation von Mikroorganismen besteht ein reichhaltiger stand der Technik, insbesondere auch zur Fermentation im großtechnischen Maßstab; er reicht von der Optimierung der betreffenden Stämme hinsichtlich der Bildungsrate und der Nährstoffausnutzung über die technische Gestaltung der Fermenter bis hin zur Gewinnnung der Wertstoffe aus den betreffenden Zellen selbst und/oder dem Fermentationsmedium. Hierfür kommen sowohl genetische und mikrobiologische als auch verfahrenstechnische und biochemische Ansätze zum Tragen. Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, diesen Prozeß hinsichtlich der sicherheitsrelevanten Aspekte der eingesetzten Mikroorganismen zu verbessern, und zwar auf der Ebene der genetischen Eigenschaften der betrachteten Stämme.

Dies steht vor dem Hintergrund, dass die Verwendung gentechnisch veränderter Organismen im Allgemeinen strengen gesetzlichen Richtlinien bezüglich der biologischen Sicherheit unterliegt. In den meisten Ländern sind die Betreiber von Anlagen mit GVO gehalten, dafür zu sorgen, dass nach Möglichkeit keine GVO in die Umgebung gelangen.

Zusätzlich sollen für die Produktion verwendete GVO Eigenschaften aufweisen, die es ihnen - falls sie doch in die Umgebung gelangen sollten - erschweren oder je nach Gefahrenpotential sogar unmöglich machen sollen, sich dort zu vermehren („Containmenf-Konzept).

Dem übersichtsartikel „Suicidal genetic elements and their use in biological Containment of bacteria" von S. Molin et al. (Annu. Rev. Microbiol., 1993, Band 47, Seiten 139 bis 166) zufolge wird dabei zwischen den beiden grundsätzlichen Strategien differenziert, als „aktive" Komponenten kontrollierte Suizidsysteme in die Zellen einzuführen oder über „passive" Systeme die Zelleigenschaften so zu verändern, dass ihre überlebenschancen unter Streßbedingungen sinken. Die zweite, auch für die vorliegende Anmeldung relevante Strategie wird darin auch als „Disablement approach" bezeichnet.

Stämme von GVO mit einem verminderten Risiko für Mensch und Umwelt im Falle einer unbeabsichtigten Freisetzung werden als Sicherheitsstämme bezeichnet. Je nach den grundsätzlichen Eigenschaften der Mikroorganismen werden zunehmend mehrere Eigenschaften gefordert, von denen jede für sich einen Sicherheitsaspekt darstellt. Somit ist es vorteilhaft, verschiedene Instrumente zur Erzeugung von Sicherheitsstämmen zur Verfügung zu haben. Hiervon sind einige „passive" Systeme bereits im Stand der Technik beschrieben.

So betrifft die Anmeldung EP 369817 A1 Bacillus-Stämme, insbesondere B. subtilis, zur Herstellung und Sekretion von Proteinen, bei denen die Gene für extra- und intrazelluläre Proteasen, nämlich epr, rp-l, rp-ll, isp-1 , apr und/oder npr durch Punktmutationen oder Insertionen inaktiver Genkopien funktionell inaktiviert worden sind. Der Sinn dieser gentechnischen Veränderungen besteht darin, die für die mit diesen Stämmen hergestellten, interessierenden Proteine schädlichen Protease-Aktivitäten zu minimieren. Die betreffenden Stämme können zusätzlich über Mutationen verfügen, die die Sporulation und damit eine Bildung ebenso schädlicher Sporulationsproteasen verhindern. Hierunter wird das in Phase Null der Sporulation (siehe unten) von B. subtilis aktive Gen spoOA genannt, um durch dessen Inaktivierung die mit der Sporulation verbundene Bildung intrazellulärer Proteasen zu verhindern.

Die Anmeldung WO 92/16642 A1 verfolgt den gleichen Lösungsansatz: sie offenbart, dass durch Inaktivierung der Proteasegene apr, npr, isp-1 , epr, bpr, rsp und mpr von

Bacillus ein Großteil der extrazellulären Protease-Aktivität ausgeschaltet wird, und lehrt, dass dies durch die Inaktivierung des neu beschriebenen Gens vpr für die Rest- Protease IM noch verbessert werden kann. Auch hier wird auf die Möglichkeit der Inaktivierung von spoOA hingewiesen, um die Bildung intrazellulärer Proteasen zu verhindern.

Ein weiterer Ansatzpunkt zur Erzeugung „passiver" Systeme von grampositiven Bakterien ist deren Sporulationsprozeß. So offenbart die Anmeldung EP 492274 A2, dass im Stand der Technik bereits über unspezifische Mutagenese die Inaktivierung von Sporulations- genen gelungen sei, wodurch asporogene Mutanten (spo-Minus-Phänotyp) erhalten worden seien. EP 492274 A2 selbst beschreibt einen durch gezielte Mutagenese in dem frühen Sporulationsgen spollD behandelten B. subtilis-Stamm, der mit einer Reversionsrate von weniger als 10 ^"8 praktisch nicht mehr in der Lage ist, Sporen zu bilden. Diese Anmeldung lehrt, diesen Stamm erst nach Inaktivierung der weiteren Gene leu (für die Leucin-Synthese), pyrD1 (für die Uracil-Synthese), apr und npr für die Herstellung von Wertstoffen für die biotechnologische Produktion zu verwenden, weil hiermit Vorteile in der Produktion sowie Sicherheitsaspekte verbunden seien.

Die Anmeldung WO 97/03185 A1 befaßt sich ebenfalls mit der Inaktivierung der Sporulationsfähigkeit von Bacillus-Spezies mit Ausnahme von B. subtilis und Verwendung dieser Stämme zur biotechnologischen Herstellung von Wertstoffen. Dieser Anmeldung zufolge soll das frühe, für den Sigmafaktor F codierende Gen spollAC funktionell inaktiviert werden, vorteilhafterweise in Kombination mit Deletionen in Genen der ebenfalls früh aktivierten Sporulationsgengruppen spo2, spo3. Hierfür wird eine irreversible Inaktivierung der betreffenden chromosomalen Abschnitte für spollAC beschrieben.

Die Anmeldung WO 02/097064 A1 (EP 1391502 A1 ) betrifft Mikroorganismen, bei denen Gene aus den Stadien II, III, IV oder V der Sporulation deletiert oder inaktiviert worden sind. Hierbei handelt es sich um die Gene sigE, sigF, spollE, spollSB und sigG von B. subtilis, die innerhalb des Genorts von spolVCB bis spolllC von B. subtilis liegen. Dieser kann anhand der Datenbank SubtiList (zugänglich über http://genolist.pasteur.fr/SubtiList/genome.cgi) auf den Bereich der Positionen von ca. 2.642.000 kb bis ca. 2.700.000 kb des inzwischen bekannten Gesamtgenoms von B. subtilis eingegrenzt werden. Dieser Anmeldung hatte die Aufgabe zugrundegelegen,

überflüssige oder schädliche Aktivitäten von Bacillus-Stämmen auszuschalten, um die biotechnologische Produktion zu verbessern. Durch die genannten Modifikationen der mittleren bis späten Sporulationsgene würde bei Einsatz der betreffenden Stämme für die biotechnologische Produktion die Sporenbildung unterdrückt; dies wirke sich vorteilhaft auf die Nährstoff- und Energieverwertung aus; gleichzeitig könne die Dauer der Fermentation erhöht werden, um darüber die Gesamtausbeute an interessierendem Wertstoff zu erhöhen.

Die Anmeldung WO 2005/095446 A1 betrifft den Faktor RecA aus Bacillus licheniformis DSM 13 und die Verwendung des zugehörigen Gens zur Konstruktion von grampositiven bakteriellen Sicherheitsstämmen für die biotechnologische Produktion. Diese Verwendung erfolgt, indem dieses Gen in den betreffenden Stämmen inaktiviert wird. Diese Stämme weisen, sofern sie natürlicherweise zur Sporulation befähigt sind, in einer speziellen Ausführungsform dieser Anmeldung zusätzliche funktionelle Deletionen in Phase-IV- Sporulationsgenen auf, vorzugsweise im Gen spolV (bei Bacillus licheniformis), im Gen yqfD (bei B. subtilis) beziehungsweise in dem hierzu jeweils homologen Gen.

Ein wesentlicher Nachteil der Inaktivierung von recA besteht allerdings darin, dass die betreffenden Stämme hinsichtlich ihrer Fähigkeit zur DNA-Rekombination beeinträchtigt sind. Dies beeinträchtigt die Möglichkeiten, diese Stämme weiter gentechnisch zu verändern, das heißt beispielsweise Transgene einzubringen und korrekt zur Transkription zu bringen. Darüber hinaus zeigen sie insgesamt ein unter Fermentationsbedingungen gegenüber dem Ausgangsstamm deutlich verschlechtertes Wachstum. Sie eignen sich somit nur eingeschränkt für die biotechnologische Herstellung von Wertstoffen.

Ein bislang kaum beschrittener Weg zur Erzeugung von Sicherheitsstämmen ist die Ausnutzung des UV-induzierten DNA-Reparatursystems, welches den Bakterien einen Schutz gegen die DNA-schädigende, beispielsweise Pyrimidin-Dimere induzierende UV- Strahlung vermittelt. Dazu gehören bei Bakterien unter anderem die Genprodukte UvrA, UvrB, UvrC und andere, die an der Reparatur der DNA-Schäden beteiligt sind.

Die Publikation „Structural and functional characterization of the Bacillus megaterium uvrBA locus and generation of UV-sensitive mutants" von Nahrstedt und Meinhardt in Appl. Microbiol. Biotechnol. (2004), Band 65, Seiten 193-199, befasst sich mit diesem

System, und zwar anhand von Bacillus megaterium. In dieser Arbeit wird gezeigt, dass die beiden Gene für UvrA und UvrB in diesem Bakterium auf einem Operon liegen und ein Knockout jedes dieser beiden Gene wie auch des kompletten Locus zu UV-sensitiven Stämmen führt. In allen drei Fällen zeigte sich praktisch die gleiche Erhöhung der UV- Sensitivität dieses Stamms. Mit einer Inaktivierung von uvrC befaßt sich diese Arbeit nicht.

Bacillus megaterium verfügt über ein SOS-System, das sich von allen anderen Systemen nicht nur bei Vertretern der Gattung Bacillus, sondern bei allen bislang untersuchten Bakterien unterscheidet. B. megaterium besitzt nämlich zwei funktionelle recA-Gene, von denen eines essentiell ist und daher nicht deletiert werden kann. Eine Mutante ohne RecA-Aktivität ist daher für B. megaterium nicht zu realisieren. (Nahrstedt H, Schröder C, Meinhardt F; Evidence for two recA genes mediating DNA repair in Bacillus megaterium; Microbiology SGM, Band 151, Seiten 775-787 (2005)).

Wegen der besonderen Eigenschaften von Bacillus megaterium wie beispielsweise auch dessen besonderer Größe im Vergleich zu B. subtilis, B. licheniformis oder B. lentus und des geringeren Verwandtschaftsgrads zu anderen biotechnologisch wichtigen Spezies wie Staphylococcus oder Corynebakterien sind daran gewonnene Erkenntnisse bezüglich der UV-induzierten DNA-Reparatur somit nicht ohne weiteres auf andere Mikroorganismen übertragbar.

In der Veröffentlichung von Englih und Vary (Journal of Bacteriology 1986, Seite 155-160) UV-sensitive Mutanten von Bacillus megaterium mit UV-sensitiven Mutanten von Bacillus subtilis verglichen. Die offenbarten UV-sensitiven Bacillus subtilis-Stämme uvrA19 und uvrB109 sind jeweils defizient in einem der Gene uvrA oder uvrB. Sie weisen jedoch weder eine funktionelle Inaktivierung beider Gene uvrA und uvrB auf noch die eine funktionelle Inaktivierung eines dieser Gene in Kombination mit einem weiteren Gen. UV- sensitive Bakterien, deren UV-Sensitivität durch die funktionelle Inaktivierung eines DNA- Elements bzw. DNA-Abschnitts bewirkt ist, der nicht die Gene uvrA und uvrB umfasst, ist ebenfalls nicht offenbart.

Insgesamt sind inzwischen also zur Herstellung von Sicherheitsstämmen für die biotechnologische Produktion verschiedene alternative genetische Systeme nach einem „passiven" Wirkmechanismus etabliert. Dabei wird es als vorteilhaft angesehen, über

mehrere, unterschiedlich wirkende Systeme zu verfügen, um sie nebeneinander auf einen bestimmten Stamm anzuwenden, damit dieser als besonders sicher eingestuft werden kann.

Es stellte sich somit die Aufgabe, ein weiteres geeignetes Sicherheitssystem für gentechnisch veränderte grampositive Bakterien, insbesondere der Gattungen Bacillus (mit Ausnahme von Bacillus megaterium), Staphylococcus und Corynebakterium zu entwickeln, wofür als Grundlage zunächst geeignete Faktoren und/oder geeignete Gene zu identifizieren waren. Vorteilhafterweise sollte dieses System eine möglichst hohe UV- Sensitivität der veränderten, grampositiven Bakterien bewirken.

Einen Teilaspekt dieser Aufgabe stellte nach Feststellung der grundsätzlichen Eignung eines solchen Systems die Isolierung eines hierfür verwendbaren genetischen Elements, eventuell eines Gens, und der Aminosäuresequenz eines hiervon gegebenenfalls codierten Faktors dar, um dieses System entsprechenden molekularbiologischen Konstruktionen für den Einsatz in Produktionsstämmen zugänglich zu machen, insbesondere in Kombination mit einem oder mehreren weiteren der Sicherheit dienenden Regulationsmechanismen.

Diese Aufgabe wird durch Verfahren zur Erhöhung der UV-Sensitivität grampositiver Bakterien, welche nicht Bacillus megaterium sind, gelöst, wobei man a) einen Teil des uvrBA-Operons, der nicht die Gene uvrA und uvrB umfasst oder b) die Gene uvrA und uvrB und/oder das Gen uvrC dieser Bakterien beziehungsweise deren jeweilige Homologe aus dem betreffenden Bakterium funktionell inaktiviert,

Eine erste Ausführungsform dieses Verfahrens beinhaltet die funktionelle Inaktivierung beider Gene uvrA und uvrB. Eine zweite Ausführungsform beinhaltet die funktionelle Inaktivierung eines Teils des uvrBA-Operons, der nicht die Gene uvrA und uvrB umfasst. Eine dritte Ausführungsform beinhaltet die funktionelle Inaktivierung des Gens uvrC. Weitere Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens entsprechen der vorstehend genannten ersten und zweiten Ausführungsform, wobei man allerdings zusätzlich auch das Gen uvrC funktionell inaktiviert. Anstelle der genannten Gene können auch die jeweiligen Homologen aus dem betreffenden Bakterium verwendet werden.

Eine weitere Lösung der vorstehenden Aufgabe stellen Verfahren dar zur Erhöhung der UV-Sensitivität grampositiver Bakterien, welche nicht Bacillus megaterium sind, wobei man einen Teil des uvrBA-Operons, der nicht die Gene uvrA und uvrB umfasst, und/oder das Gen uvrC dieser Bakterien funktionell inaktiviert und zusätzlich mindestens eines der Gene uvrB und uvrA beziehungsweise deren jeweilige Homologe aus dem betreffenden Bakterium funktionell inaktiviert.

Weitere Lösungen der vorstehenden Aufgabe sind Verwendungen eines oder mehrerer Nukleinsäurebereiche a) des bakteriellen uvrBA-Operons, der nicht die Gene uvrA und uvrB umfasst oder b) der Gene uvrA und uvrB und/oder des Gens uvrC zur Erhöhung der UV-Sensitivität grampositiver Bakterien, welche nicht Bacillus megaterium sind.

Ebenso stellt die Verwendung einer oder mehrerer Nukleinsäurebereiche des bakteriellen uvrBA-Operons, der nicht die Gene uvrA und uvrB umfasst, und/oder des Gens uvrC und zusätzlich einen oder mehrere Nukleinsäurebereiche aus mindestens einem der

Gene uvrB und uvrA beziehungsweise deren jeweiligen Homologen aus dem betreffenden

Bakterium zur Erhöhung der UV-Sensitivität grampositiver Bakterien, welche nicht Bacillus megaterium sind, eine weitere Lösung der Aufgabe dar.

Alle aufgeführten, erfindungsgemäße Verfahren kennzeichnenden Merkmale gelten in gleichermaßen vorteilhafter Weise auch für diese Verwendungen und umgekehrt. Ferner wird die vorliegende Aufgabe durch die auf erfindungsgemäße Weise erzeugten Bakterienstämme gelöst, sowie durch Fermentationsverfahren, die auf diesen Stämmen aufbauen. Des Weiteren werden mit SEQ ID NO. 1 bis 6 Oligonukleotide zur Verfügung gestellt, mit denen erfindungsgemäße Lösungen verwirklicht werden können.

Erfindungsgemäß dienen das uvrBA-Operon und/oder das Gen uvrC als die wesentlichen Komponenten des UV-induzierten DNA-Reparatursystems als Ansatzpunkte zur Erzeugung von UV-sensitiven grampositiven Bakterien. Erfindungsgemäß differenziert wird zwischen denjenigen Teilen bzw. Genen oder Sequenzen des uvrBA-Operons, die nicht die Gene uvrA und uvrB umfassen, und den Genen uvrA und uvrB des uvrBA- Operons. Zusammen mit dem Gen uvrC sind erfindungsgemäße Verfahren,

Verwendungen und Bakterien durch Kombinationen von funktionellen Inaktivierungen realisierbar, wie sie vorstehend beschrieben sind. Zur weiteren Erläuterung erfindungsgemäß möglicher Inaktivierungskombinationen sind Beispiele für solche Kombinationen in nachfolgender Tabelle 1 dargestellt, wobei diese Beispiele nicht als abschließende Aufstellung zu verstehen sind. Erfindungsgemäß funktionell inaktivierte Gene sind durch ein Kreuz (X) markiert.

Tabelle 1 : Beispiele für Kombinationen erfindungsgemäßer Geninaktivierungen

In einer bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung ist mindestens eines der beiden Gene uvrA und uvrB in Kombination mit dem Gen uvrC und/oder mindestens einem weiteren Teil des uvrBA-Operons, der nicht die Gene uvrA und uvrB umfasst, funktionell inaktiviert. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform sind beide Gene uvrA und uvrB funktionell inaktiviert. Der Erfolg dieses Vorgehens wird mit den Beispielen zur vorliegenden Anmeldung belegt, wonach UV-sensitive Stämme der Spezies B. licheniformis erhalten worden sind, die sich als Sicherheitsstämme im Sinne des Containment-Konzepts eignen und trotz der vorgenommenen erfindungsgemäßen Modifikation(en) als Produktionsstämme geeignet sind.

Ein Vorteil der Erfindung gegenüber einer Inaktivierung des recA-Gens besteht darin, dass die Bakterien weiterhin zur homologen Rekombination in der Lage und damit

weiterhin gentechnisch modifizierbar sind. Des Weiteren ist diese Art der Sensibilisierung mit anderen passiven Systemen zur Erzeugung von Sicherheitsstämmen vereinbar, insbesondere mit der gleichzeitigen Inaktivierung von Sporulationsgenen.

Die einzelnen Arbeitsschritte der erfindungsgemäßen Verfahren sind an sich dem auf dem Gebiet der Biotechnologie arbeitenden Fachmann vertraut. Standardmethoden können beispielsweise dem Handbuch von Fritsch, Sambrook und Maniatis „Molecular cloning: a laboratory manual", CoId Spring Harbour Laboratory Press, New York, 1989, oder „Mikrobiologische Methoden: Eine Einführung in grundlegende Arbeitstechniken" von E. Bast (1999) Spektrum, Akademischer Verlag, Heidelberg, Berlin, oder vergleichbaren einschlägigen Werken entnommen werden.

Unter grampositiven Bakterien sind diejenigen Bakterien zu verstehen, die nach allgemeinem mikrobiologischen Verständnis dazu gerechnet werden, insbesondere die unten einzeln aufgeführten.

Unter UV-Sensitivität ist im Sinne der vorliegenden Anmeldung eine Beeinträchtigung der Lebensfähigkeit der grampositiven Bakterien unter Einfluss von UV-Strahlung zu verstehen. Grundsätzlich sind alle Lebewesen UV-empfindlich. Ein erfindungsgemäß erzeugter Mikroorganismus wird erfindungsgemäß dann als „verstärkt UV-sensitiv" bezeichnet, wenn seine UV-Sensitivität höher als die des Ausgangsbakterienstamms ist, auf den das erfindungsgemäße Verfahren angewendet worden ist. Dies kann anhand qualitativer und quantitativer Tests überprüft werden, wie sie in den Beispielen zur vorliegenden Anmeldung offenbart sind.

Das uvrBA-Operon ist ein aus mehreren Komponenten bestehendes genetisches Element mit mehreren Genprodukten. Figur 4 und SEQ ID NO. 7 (in umgekehrter Leserichtung zu der Darstellung in Figur 4) zeigen den DNA-Abschnitt aus der genomischen Sequenz von B. licheniformis DSM13, wie sie in Veith et al.; 2004; J. Mol. Biotechnol., Band 7, Seiten 204 bis 21 1 ) und dem Eintrag AE017333 (Basen 1 bis 4.222.645) in der Datenbank GenBank (National Center for Biotechnology Information NCBI, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA; http://www.ncbi.nlm.nih.gov; Stand 2.12.2004) als der die Gene uvrA, insbesondere uvrA2, und uvrB enthaltende Teil offenbart ist. Dieser Stamm ist beispielsweise über die DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und

Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1 b, 38124 Braunschweig; http://www.dsmz.de) als DSM13 erhältlich.

In folgender Tabelle 2 sind die im Sequenzprotokoll angegebenen Erläuterungen zu den einzelnen Bereichen dieses DNA-Abschnitts wiedergegeben. Hierunter werden die im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung besonders relevanten Gene csbA, uvrB und uvrA2 zusätzlich als codierende Sequenzen (CDS) vermerkt. Die davon abgeleiteten Aminosäuresequenzen folgen im Sequenzprotokoll unter SEQ ID NO. 8, 9 beziehungsweise 10.

Tabelle 2: Genetische Elemente des DNA-Abschnitts gemäß SEQ ID NO. 7

Ein Teil hieraus, der die Gene csbA, uvrB und uvrA umfasst, ist in Figur 1 (wild type) dargestellt. Das Gen csbA weist gemäß den Angaben im Sequenzprotokoll in dem genannten GenBank-Eintrag AE017333 zu B. licheniformis die Nummer RBL05040 auf und codiert für CsbA, ein vermutliches Membranprotein. Die beiden anderen, ebenfalls aus B. licheniformis erhaltenen Gene codieren für die beiden Untereinheiten A und B der UV-indizierten Exinuclease, die die Excision von Pyrimidin-Dimeren aus der DNA katalysiert.

Das genetische Element uvrC, wie es ebenfalls aus Bacillus licheniformis DSM 13 erhalten werden kann, ist im Sequenzprotokoll unter SEQ ID NO. 1 1 angegeben. Es

umfaßt einschließlich Stop-Codon 1773 Positionen. Es codiert (Feld <221>: CDS) für die C-Untereinheit der UV-indizierten Exinuclease (Feld <223>: uvrC; exinuclease ABC subunit C). Die abgeleitete Aminosäuresequenz dieser Untereinheit folgt in SEQ ID NO. 12 und umfaßt 590 Aminosäuren.

Wie unten näher erläutert stellt insbesondere die Verringerung der UV-induzierten Exinuclease-Aktivität eine Verwirklichung der vorliegenden Erfindung dar.

Zu diesen Genen gibt es in den meisten anderen Organismen Homologe. So kennt man beispielsweise aus E. coli die gleichwirkende uvrABC-Exinuclease. Insbesondere bei grampositiven Organismen und hierunter ganz besonderes anderen Bacillus-Spezies ist die gleiche genomische Organisation wie in B. licheniformis DSM 13 zu erwarten.

Im Sinne der vorliegenden Erfindung werden unter dem Begriff uvrBA-Operon alle Gene, genregulatorischen Elemente und sonstigen DNA-Sequenzen verstanden, die in SEQ ID NO:7 für Bacillus licheniformis DSM 13 sowie in Tabelle 2 angegeben sind, auch wenn sie aus mehr als einer Regulationseinheit bestehen. Zu SEQ ID NO:7 homologe DNA- Sequenzen anderer Bakterien, beispielsweise mit einer funktionellen Entsprechung zu den Genen oder genregulatorischen Elementen gemäß SEQ ID NO:7 oder Tabelle 2, sind ausdrücklich in diese Definition eingeschlossen. Auch weitere Gene des jeweiligen Bakteriums, deren funktionelle Inaktivierung ein funktionell abgeschwächtes oder völlig inaktiviertes UV-induziertes DNA-Excisions-Reparatursystem, beispielsweise auf Grund einer verminderten oder völlig inaktivierten UvrABC Excinuclease-Aktivität, bedingt, sind in diese Definition mit eingeschlossen.

Erfindungsgemäß bevorzugt ist der hinsichtlich seiner Regulation eine Einheit bildende Teil des uvrBA-Operons, der zumindest eines der beiden Gene uvrA oder uvrB enthält. In der Regel und insbesondere bei Bacillus-Spezies liegen beide Gene nebeneinander und werden gemeinsam unter der Kontrolle derselben Elemente reguliert. Hierzu zählen insbesondere die in SEQ ID NO. 7 aufgeführten Elemente DinR-Box (1 1 13 bis 1126), (vermutliche) -10-Region (1150 bis 1155), die Ribosomenbindungsstellen (776 bis 1009 für csbA beziehungsweise 1181 bis 1185 für uvrB/uvrA2) sowie der Terminator (6061 bis 6095). Insbesondere auf den Bereich von Position ca. 1 150 bis 6095 trifft der Begriff Operon zu, weil er vom Ort der Ribosomenbindung bis zu deren Dissoziation eine Regulationseinheit umfasst.

An dieser Stelle wird weiterhin explizit darauf hingewisen, dass sich auch stromauf- oder stromabwärts der für die Untereinheit C codierenden DNA-Sequenz (SEQ ID NO. 11 ) Regulationselemente befinden.

Eine Inaktivierung kann beispielsweise durch partielle oder vollständige Deletion des beziehungsweise der genannten Gene oder auch von genregulatorischen Elementen, die die Expression dieser Gene (beispielsweise durch deren Transkription oder Translation) bewirken, erfolgen. Die im Stand der Technik etablierte Methode der Deletion führt dazu, dass das betreffende Genprodukt von dem modifizierten Bakterium nicht mehr hergestellt werden kann. Sie ist beispielsweise über homologe Rekombination mit einem entsprechend verkürzten Fragment durchführbar. Zur Kontrolle dieses Vorgehens kann auch ein Fragement mit einer anderen Funktion hineinrekombiniert werden, so dass de facto eine Substitutionsmutation durchgeführt wird. Alternativen hierzu sind partielle oder vollständige Deletionen beziehungsweise Substitutionen des zugehörigen Promotors und Punktmutationen im Gen oder in regulatorischen Bereichen. Insbesondere letztere dienen dazu, das Gen vollständig zu inaktivieren oder nur eine Schwächung, das heißt Absenkung der Genaktivität oder Enzymreaktivität hervorzurufen, so dass in dem betreffenden Bakterium eine gewisse Grundrate der betreffenden Aktivität erhalten bleibt. Das betreffende Gen bleibt also aktiv und das abgeleitete Protein wirkt als Enzym, jedoch abgeschwächt, so dass es hinsichtlich seiner Wirkung herabgesetzt ist; es ist im Sinne der Erfindung funktionell inaktiviert.

Eine weitere Möglichkeit der Inaktivierung besteht darin, die genannten Gen-Bereiche weiträumig zu deletieren. Hierzu eignet sich insbesondere der weit über csbA, uvrB und uvrA hinausgehende in SEQ ID NO. 7 gezeigte DNA-Abschnitt oder kleinere, uvrB und/oder uvrA umfassende Abschnitte davon. Dadurch können auch weitere Gene, insbesondere die flankierenden Gene yvjD, ywkF, gloA, das Gen für eine vermutliche Dioxygenase (BIJ03755), yvkN und/oder yvIA (vergleiche SEQ ID NO. 7) inaktiviert werden. Die Ausnutzung weiter flankierender Bereiche erleichtert die Inaktivierung über homologe Rekombination. Auf analoge Weise ist eine uvrC-Deletion anhand der Sequenzinformationen aus SEQ ID NO. 1 1 möglich. All diese Eingriffe sind jeweils dann erfindungsgemäß, wenn darüber in den Mutanten eine erhöhte UV-Sensitivität und insbesondere eine gegenüber dem Ausgangsstamm verringerte uvrABC-Exinuclease- Aktivität erreicht wird.

Eine weitere Möglichkeit der Inaktivierung besteht darin, über Interferenz mit reiner komplementären RNA die von den betreffenden Genen abgeleitete mRNA zu inaktivieren. Hierdurch bleiben die Gene an sich intakt, aber auf der Ebene der Genwirkung kommt es je nach Reaktionsführung zu einer teilweisen oder sogar vollständigen funktionellen Inaktivierung. Da im Falle von B. licheniformis die Gene uvrB und uvrA2 monocistronisch vorliegen und höchstwahrscheinlich über den vor dem uvrB-Gen gelegenen Promotor reguliert werden, lassen sich auf diese Weise gezielt nur uvrA2 oder beide zusammen ausschalten.

Sollte aus einem bestimmten, für ein erfindungsgemäßes Verfahren vorgesehenen grampositiven Bakterienstamm dieses Operon oder das Gen uvrC beziehungsweise einer der zu deren Inaktivierung verwendbaren DNA-Bereiche nicht bekannt sein, so kann man er mithilfe von Routinemethoden erhalten werden. Dazu gehört beispielsweise die Erstellung einer Genbank und Isolierung desjenigen Bereichs, der über Hybridisierung mit einem uvrB und/oder uvrA beziehungsweise uvrC enthaltenden Teile von SEQ ID NO. 7 beziehungsweisel 1 oder hiervon abgeleiteten Oligonukleotiden identifiziert werden kann.

Alternativ hierzu sind Inaktivierungs-Konstrukte aufgrund von SEQ ID NO. 7 oder 11 selbst oder der jeweils abgeleiteten Aminosäuresequenz möglich. So können aus den Aminosäuresequenzen SEQ ID NO. 8, 9, 10 und 12 rückwärts DNA-Sequenzen abgeleitet werden, die als Primer zur Isolierung der entsprechenden Bereiche aus Genbanken verwendbar sind. Deren Konstruktion kann zum Beispiel Beispiel 1 der vorliegenden Anmeldung entnommen werden. Denn aufgrund der hohen Inter-Spezies-Homologie kann davon ausgegangen werden, dass in den meisten Fällen die Oligonukleotide SEQ ID NO. 1 bis 6 und/oder sogar die damit bereits aus B. licheniformis hergestellten Deletionskonstrukte in entsprechender weise zur Deletion des betreffenden Genorts in den meisten anderen grampositiven Bakterien geeignet sind. Als weitere Alternativen ist es möglich, auf die für die ExinucleaseABC von E. coli codierenden Bereiche zurückzugreifen und hierüber Hybridisierungssonden oder Deletionskonstrukte herzustellen und auf die betreffenden Spezies anzuwenden.

Durch die aufgeführten Modifikationen zur Erhöhung der UV-Sensitivität werden Bakterienstämme erhalten, in deren betroffenen Zellen die DNA-Excisionsreparatur beeinträchtigt oder sogar gänzlich unmöglich ist. Hierdurch werden UV-induzierte DNA-

Schäden in Form von Pyrimidin-Dimeren nicht mehr repariert, so dass die betreffenden Zellen innerhalb kurzer Zeit und insbesondere unter UV-Einstrahlung ihre Lebensfähigkeit verlieren. Dies entspricht insofern den einleitend dargestellten Anforderungen an Sicherheitsstämme, als solche Zellen bei Austritt in die Umgebung durch zwangläufig auf sie einwirkende UV-Strahlung abgetötet werden. Solche Bakterienstämme sind in einer natürlichen Umgebung nicht dauerhaft lebensfähig. Dies wird mit den Beispielen zur vorliegenden Anmeldung belegt.

Die Erfindung ist nicht auf B. megaterium sondern auf andere Bacillus-Gattungen, darunter insbesondere auf B. licheniformis, sowie auf Staphylococcus und Corynebakterien ausgerichtet.

Eine bevorzugte Ausführungsform bilden somit erfindungsgemäße Verfahren, wobei es sich bei den in das Verfahren eingebrachten Bakterien um ein grampositives Bakterium der Gattungen Staphylococcus, Corynebakterien oder Bacillus (nicht B. megaterium) handelt, insbesondere der Spezies Staphylococcus carnosus, Corynebacterium glutamicum, Bacillus subtilis, B. licheniformis, B. amyloliquefaciens, B. globigii, B. lentus, B. alcalophilus, B. gibsonii, B. pumilus, Bacillus sp., und ganz besonders um B. licheniformis.

Hierunter sind diejenigen Gattungen und Spezies zu verstehen, die nach allgemeinem mikrobiologischen Verständnis dazuzurechnen sind. In Zweifelsfällen entscheidet die von der DSMZ (siehe oben) vorgenommene Klassifikation.

Unter den genannten Spezies läßt sich die Erfindung insbesondere auf solche Bacillus- Spezies anwenden, die taxonomisch als Bacillus sp. bezeichnet werden müssen und zu B. licheniformis einen höheren Verwandtschaftsgrad aufweisen als zu B. megaterium. Unter den verwendbaren Stämmen sei auf B. lentus DSM 5483, Bacillus alcalophilus (DSM 1 1233), Bacillus gibsonii (DSM 14391 ), Bacillus sp. (DSM 14390), Bacillus sp. (DSM 14392) und Bacillus gibsonii (DSM 14393) verwiesen, die bei der DSMZ hinterlegt sind. Gemäß den Beispielen zur vorliegenden Anmeldung läßt sie sich insbesondere anhand von B. licheniformis, konkret B. licheniformis DSM 13 umsetzen.

Eine bevorzugte Ausführungsform bilden erfindungsgemäße Verfahren, wobei man eines oder mehrere der Gene uvrB, uvrA und/oder uvrC beziehungsweise die jeweiligen

Homologen aus dem betreffenden Bakterium funktionell inaktiviert, vorzugsweise uvrB und uvrA beziehungsweise die jeweiligen Homologen aus dem betreffenden Bakterium.

Im Gegensatz zu mehreren in SEQ ID NO. 7 angegebenen Gensequenzen, für die nur eine hypothetische Funktion besteht (zum Beispiel ywkF) oder die im Stoffwechsel eine Rolle spielen (zum Beispiel gloA) sind die Genprodukte von uvrB, uvrA (in B. licheniformis uvrA2) und uvrC beziehungsweise deren Homologe unmittelbar an der UV-induzierten DNA-Reparatur beteiligt. Also werden erfindungsgemäß vorzugsweise eines oder mehrere dieser Gene, optinonal in Kombination mit weiteren Genen, funktionell inaktiviert. Dadurch wird eine weniger oder sogar völlig inaktive UvrABC-Exinuklease erhalten, so dass in den betreffenden Zellen die DNA-Excisionsreparatur und damit insgesamt ihre Lebensfähigkeit beeinträchtigt ist. Erfindungsgemäß werden diesbezüglich nie uvrA oder uvrB alleine inaktiviert, sondern entweder beide Gene uvrA und uvrB oder eines der genannten Gene in Komination mit mindestens einem weiteren Gen, beispielsweise mit uvrC oder csbA. Diesbezüglich wird nochmals auf die vorstehende Tabelle 1 verwiesen, die Beispiele für mögliche Kombinationen funktionell inaktivierter Gene zeigt.

Den Erfolg dieses Vorgehens belegen die Beispiele der vorliegenden Anmeldung anhand von partiellen Deletionen der Gene uvrB und uvrA von B. licheniformis DSM 13. Da das Genprodukt von uvrC die dritte Untereinheit der Exinuclease bildet, führt dessen Inaktivierung zu grundsätzlich dem gleichen phänotypischen Bild, das heißt der Beeinträchtigung der Lebensfähigkeit durch erhöhte UV-Sensitivität.

Eine bevorzugte Ausführungsform bilden erfindungsgemäße Verfahren, wobei man an einem oder mehreren der genannten Gene eine Deletionsmutation, eine Substitutionsmutation oder eine Punktmutation durchführt.

Wie oben erläutert stehen dem Fachmann zahlreiche im Stand der Technik etablierte Möglichkeiten zur Verfügung, um erfindungsgemäß eines oder mehrere der genannten Gene soweit zu modifizieren, daß in den betreffenden Zellen die DNA-Excisionsreparatur und damit insgesamt ihre Lebensfähigkeit beeinträchtigt ist. Sie können die regulatorischen DNA-Abschnitte betreffen, beispielsweise die Ribosomenbindungsstellen oder -10-Regionen, wie sie für B. licheniformis DSM 13 in SEQ ID NO. 7 dargestellt sind und in ähnlicher Organisation auch in anderen Mikroorganismen, insbesondere anderen

Bacillus-Spezies zu finden sind. Sie können auch die codierenden Bereiche selbst betreffen.

Der Vorteil einer Deletionsmutation, insbesondere des codierenden Bereichs, besteht darin, dass das betreffende Gen nur bruchstückhaft oder überhaupt nicht abgelesen wird und das zugehörige Genprodukt nur als entsprechendes Fragment oder überhaupt nicht in der Zelle auftritt. Dieses Vorgehen illustriert Figur 1 , wonach ein kurzer 5'-Bereich des Gens uvrB mit einem kurzen 3'-Bereich des Gens uvrA fusioniert und der dazwischenliegende Teil entfernt werden kann. Beide Genprodukte stehen den betreffenden Zellen damit nicht mehr zur Verfügung. Den Erfolg dieses Vorgehens demonstrieren die Beispiele zur vorliegenden Anmeldung anhand entsprechender Mutanten von B. licheniformis DSM 13.

Dasselbe wie eine Deletionsmutation kann eine Substitutionsmutation eines DNA- Abschnitts leisten. Zusätzlich bietet diese den Vorteil, dass darüber ein Indikator, etwa ein für ein leicht nachweisbares Genprodukt codierender Abschnitt, eingebracht kann. über dessen Nachweisbarkeit kann der Erfolg des Vorgehens überprüft werden.

Auch eine Punktmutation kann zu einer Inaktivierung des Gens führen. Dieses Vorgehen ist dann empfehlenswert, wenn das Genprodukt nicht vollständig sondern nur teilweise inaktiviert werden soll, so dass eine gewisse Basisaktivität des betreffenden Genprodukts weiterhin in den Zellen vorhanden bleibt.

Eine bevorzugte Ausführungsform bilden erfindungsgemäße Verfahren, wobei man zusätzlich recA beziehungsweise dessen Homologes inaktiviert.

Der für Prokaryonten beschriebene Faktor RecA und das hierfür codierende Gen recA sind in der Molekularbiologie sehr bekannt. Dieser Faktor bindet spezifisch und kooperativ an einzelsträngige DNA und sorgt unter ATP-Hydrolyse für eine teilweise Entwindung doppelsträngiger DNA. Dieser Vorgang ermöglicht den genetischen Vorgang der Rekombination, das heißt den Strangaustausch zwischen ähnlichen DNA-Molekülen. So ist es in der Molekularbiologie ein übliches Vorgehen, das recA-Gen dadurch zu verwenden, dass es über ein entsprechendes genetisches Konstrukt mit einer defekten recA-Kopie inaktiviert und somit ein recA-Minus-Phänotyp erzeugt wird, welcher nicht mehr zur Rekombination in der Lage ist.

Der Faktor RecA aus Bacillus licheniformis DSM 13 wird zusammen mit dem zugehörigen Gen recA als SEQ ID NO. 2 beziehungsweise SEQ ID NO.1 in WO 2005/095446 A1 offenbart. Diese Sequenzen können dazu verwendet werden, um die homologen Gene aus anderen Bakterien zu isolieren, sofern sie aus dem interessierenden Bakterium nicht schon bekannt sind. Gemäß WO 2005/095446 A1 wird recA unter anderem zur Konstruktion von grampositiven bakteriellen Sicherheitsstämmen für die biotechnologische Produktion eingesetzt, indem es in den betreffenden Stämmen inaktiviert wird. Dadurch wird die überlebensfähigkeit der betreffenden Stämme beträchtlich herabgesetzt.

Die im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung vorgenommenen Beeinträchtigungen der an der UV-Reparatur beteiligten Systeme werden in bevorzugten Ausführungsformen mit Inaktivierungen des Gens recA kombiniert. Hierunter sind entsprechend den oben gemachten Ausführungen sowohl teilweise als auch vollständige Inaktivierungen von recA zu verstehen. Besonders bevorzugt sind diejeingen Vorgehensweisen, die in WO 2005/095446 A1 beschrieben sind. Der Vorteil solch einer Kombination unterschiedlich wirkender Sicherheitssysteme besteht darin, dass die betreffenden Zellen gegenüber verschiedenen Umwelteinflüssen empfindlich werden und ihre überlebensrate weiter verringert wird. Des Weiteren sinkt dadurch die Wahrscheinlichkeit, dass aufgrund von Rückmutationen oder horizontalem Gentransfer, wie er in der Umgebung stattfinden könnte, die sicherheitsrelevante Mutation wieder rückgängig gemacht wird. Dies trifft insbesondere auf solche Mutanten zu, in denen über Beeinträchtigung des Faktors RecA die Rekombination selbst beeinträchtigt ist.

Eine bevorzugte Ausführungsform bilden erfindungsgemäße Verfahren, wobei es sich bei den in das Verfahren eingebrachten Bakterien um solche Bakterien, vorzugsweise der Gattung Bacillus, handelt, die natürlicherweise zur Sporulation befähigt sind, und man gleichzeitig ein Sporulations-Gen funktionell inaktiviert.

Die grundsätzliche Möglichkeit, Sicherheitsstämme über die Beeinträchtigung der Sporulationsfähigkeit zu erzeugen, ist im Stand der Technik beschrieben. Hierzu sei auf die Darstellungen in WO 2005/095446 A1 verwiesen. Erfindungsgemäß lassen sich die Beeinträchtigungen des UV-Reparatursystems und gegebenenfalls des Rekombinationsapparats mit denen der Sporulationsfähigkeit kombinieren, um in weiterer Hinsicht

weniger überlebensfähige Stämme zu erhalten. Im Falle der zusätzlichen Beeinträchtigung der Sporulationsfähigkeit wird die Fähigkeit der Zellen beeinträchtigt oder sogar ganz unterbunden, unter den in der Umgebung herrschenden Bedingungen Dauerformen, die sogenannten Sporen, zu entwickeln und dadurch dem möglicherweise nur vorübergehenden Selektionsdruck zu entgehen.

Der Erfolg des Vorgehens, Sporulations-Gene funktionell zu inaktivieren, geht aus der Anmeldung WO 2005/095446 A1 hervor. Dort werden auch geeignete gentechnische Konstrukte offenbart, die im Zusammenhang mit der vorliegenden Anmeldung mit erfindungsgemäßen Verfahren zur Beinträchtigung des UV-Reparatursystems kombiniert werden können.

Eine bevorzugte Ausführungsform bilden erfindungsgemäße Verfahren, wobei es sich bei dem inaktivierten Gen aus der Phase IV der Sporulation in der Nomenklatur von B. subtilis um eines der Gene spolVA, spoIVB, spolVCA, spolVCB, spoIVFA, spoIVFB oder yqfD beziehungsweise um ein hierzu homologes Gen handelt, vorzugsweise im Fall von B. subtilis um das Gen yqfD, im Fall von Bacillus licheniformis um das Gen spolV und in jedem anderen Fall um ein hierzu homologes Gen.

Hierzu sei insbesondere auf die Darstellungen in WO 2005/095446 A1 verwiesen, wonach gerade diese Beeinträchtigungen in einem vergleichweise späten Stadium der Sporulation besonders erfolgreich zur Herstellung von Sicherheitsstämmen eingesetzt werden können. Denn damit stehen die Genprodukte der früheren Sporulationsphasen den betreffenden Mikroorganimen weiterhin zur Verfügung. Das ist dann vorteilhaft, wenn sie im üblichen Stoffwechsel ebenfalls eine Rolle spielen.

Eine bevorzugte Ausführungsform bilden erfindungsgemäße Verfahren, wobei man genau ein Gen aus der Phase IV der Sporulation funktionell inaktiviert.

Wie in WO 2005/095446 A1 diskutiert ist es vorteilhaft, das Ziel der Unterbindung der Sporulation ab Phase IV mit möglichst wenig Arbeitsschritten zu erreichen, um die Konstruktion geeigneter Stämme mit möglichst geringem Arbeitsaufwand zu verbinden. Das gilt insbesondere für die hier angegebene Ausführungsform, wonach ohnehin mindestens eine Modifikation im UV-Reparatursystem erfolgen muß.

Die vorliegende Erfindung wird auch durch die Verwendung eines oder mehrerer Nukleinsäurebereiche a) des bakteriellen uvrBA-Operons, der nicht die Gene uvrA und uvrB umfasst oder b) der Gene uvrA und uvrB und/oder des Gens uvrC zur Erhöhung der UV-Sensitivität grampositiver Bakterien, welche nicht Bacillus megaterium sind., verwirklicht.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung stellt die Verwendung eines oder mehrerer

Nukleinsäurebereiche des bakteriellen uvrBA-Operons, der nicht die Gene uvrA und uvrB umfasst, und/oder des Gens uvrC und zusätzlich einen oder mehrere Nukleinsäurebereiche aus mindestens einem der

Gene uvrB und uvrA beziehungsweise deren jeweiligen Homologen aus dem betreffenden

Bakterium zur Erhöhung der UV-Sensitivität grampositiver Bakterien, welche nicht Bacillus megaterium sind, dar.

Wie oben erläutert umfaßt das uvrBA-Operon neben weiteren Genen und den zugehörigen regulatorischen Elementen die Gene uvrB und uvrA, welche bei B. licheniformis DSM 13 und verwandten Spezies tatsächlich gemeinsam transkribiert und translatiert werden dürften. Die zugehörigen Sequenzen gehen zusammen mit den regulatorischen Elementen aus SEQ ID NO. 7 beziehungsweise Figur 1 hervor. Die Aminosäuresequenzen für CsbA, UvrB und UvrA offenbaren SEQ ID NO. 8, 9 beziehungsweise 10. Die Sequenzinformationen zu uvrC offenbaren SEQ ID NO. 1 1 und 12.

Insbesondere diese Sequenzinformationen können erfindungsgemäß dazu genutzt werden, um diese Gene in grampositiven Bakterium außer Bacillus megaterium teilweise oder vollständig zu inaktivieren. Die Verwendung gestaltet sich unter Rückgriff auf das allgemeine Fachwissen so, dass die betreffenden Sequenzinformationen unmittelbar oder nach Ermittlung der homologen Sequenzen aus den jeweils interessierenden Bakterien- Spezies für biotechnologische Konstrukte genutzt werden. Wie in Beispiel 1 illustriert, können beispielsweise Deletionskonstrukte hergestellt werden, die über Rekombination in die betreffenden Zellen eingeschleust werden und über homologe Rekombination zu einer Inaktivierung der betreffenden Gene führen. Dieses Vorgehen ist an sich dem Fachmann bekannt. Die oben bereits gemachten Ausführungen gelten entsprechend.

Entsprechend den oben gemachten Ausführungen stellt solch eine erfindungsgemäße Verwendung eine bevorzugte Ausführungsform dar, wobei es sich bei den in das Verfahren eingebrachten Bakterien um grampositive Bakterien der Gattungen Staphylococcus, Corynebakterien oder Bacillus handelt, insbesondere der Spezies Staphylococcus carnosus, Corynebacterium glutamicum, Bacillus subtilis, B. licheniformis, B. amyloliquefaciens, B. globigii, B. lentus, B. alcalophilus, B. gibsonii, B. pumilus, Bacillus sp., und ganz besonders um B. licheniformis.

Entsprechend den oben gemachten Ausführungen stellt solch eine erfindungsgemäße Verwendung eine bevorzugte Ausführungsform dar, wobei es sich um einen oder mehrere Nukleinsäurebereiche aus einem oder mehreren der Gene uvrB, uvrA und/oder uvrC beziehungsweise die jeweiligen Homologen aus dem betreffenden Bakterium handelt, vorzugsweise aus uvrB und uvrA, beziehungsweise aus den jeweiligen Homologen aus dem betreffenden Bakterium.

Entsprechend den oben gemachten Ausführungen stellt solch eine erfindungsgemäße Verwendung eine bevorzugte Ausführungsform dar, wobei in einem oder mehreren der genannten Gene eine Deletionsmutation, eine Substitutionsmutation oder eine Punktmutation durchgeführt wird.

Eine bevorzugte Ausführungsform hiervon bilden erfindungsgemäße Verwendungen, wobei eine für ein nichtaktives Protein codierende Nukleinsäure mit einer Punktmutation eingesetzt wird.

So ist es über die Arbeitsschritte (1.) Isolierung des Gens, (2.) ortsgerichtete Mutagenese, beisielsweise über einen Mismatch-Primer, (3.) Transformation des mutierten Gens und (4.) homologe Rekombination in das bakterielle Chromosom vergleichsweise einfach möglich, die oben als erfindungswesentlich dargestellten Gene zu mutieren. Das Vorgehen über Einführen einer Punktmutation ist sehr zielgerichtet. Auf diese Weise können auch Mutanten erhalten werden, in denen die betreffenden Genprodukte nicht vollständig inaktiv sondern in ihrer Reaktivität lediglich herabgesetzt worden sind. Das ist dann sinnvoll, wenn eine gewisse Basisaktivität erhalten bleiben soll. Das ist auch dann empfehlenswert, wenn das mutagenisierte Genprodukt in vivo beispielsweise über Wechselwirkung mit einem anderen Faktor eine weitere Funktion ausübt, die durch geschickte Auswahl der erfindungsgemäßen Punktmutation aufrechterhalten bleibt.

Eine weitere bevorzugte Ausführungsform bilden erfindungsgemäße Verwendungen, wobei eine Nukleinsäure mit einer Deletions- oder Insertionsmutation eingesetzt wird, vorzugsweise umfassend die jeweils mindestens 70 bis 150 Nukleinsäurepositionen umfassenden Randsequenzen des für das Protein codierenden Bereichs.

Denn wie oben erläutert findet bei derartigen M utagenesesch ritten nach Transformation mit den betreffenden DNA-Konstrukten homologe Rekombination statt. Diese erfordert flankierende, übereinstimmende Bereiche einer gewissen Länge, die den Strangaustausch ermöglicht. Diese sind geeigneterweise jeweils mindestens 70 bis 150 Nukleinsäurepositionen lang.

Zweckmäßigerweise umfassen sie Randsequenzen des für das Protein codierenden Bereichs, so dass der dazwischenliegende Bereich deletiert beziehungsweise durch ein eingefügtes Element, beispielsweise ein Markergen ersetzt wird. Hierdurch kommt es in der Regel nur noch zur Transkription und Translation kleiner N-terminaler Proeinbereiche, die in vivo praktisch keine Funktion mehr ausüben.

Eine weitere bevorzugte Ausführungsform bilden erfindungsgemäße Verwendungen, wobei Nukleinsäuren mit insgesamt zwei Nukleinsäureabschnitten eingesetzt werden, die jeweils mindestens 70 bis 150 Nukleinsäurepositionen umfassen und damit einen Teil des Gens oder der Gene flankieren.

Als Alternative zum vorherigen Ansatz werden diesem Aspekt zufolge Randbereiche der betreffenden proteincodierenden Bereiche ausgewählt. Hierfür stehen beispielsweise über SEQ ID NO. 7 entsprechend große Abschnitte zur Verfügung. Die zu uvrC flankierenden Bereiche können allgemein zugänglichen Datenbanken entnommen werden oder beispielsweise über nach außen gerichtete, anhand von SEQ ID NO. 11 entworfene Primer aus Genbanken zum interessierenden Mikroorganimus erhalten werden.

Der Vorteil dieses Vorgehens besteht darin, dass von den jeweils umschlossenen, zu inaktivierenden Genabschnitten überhaupt kein abgeleitetes Genprodukt mehr erhalten wird. Die erfindungsgemäße Verringerung der UV-Excisisions-Reparatur kommt somit einem vollständigen Ausschalten gleich.

Eine bevorzugte Ausführungsform hiervon bilden erfindungsgemäße Verwendungen, wobei es sich um einen oder mehrere Nukleinsäurebereiche handelt, die aus SEQ ID NO. 7 und/oder SEQ ID NO. 1 1 stammen oder davon abgeleitet sind.

So offenbart SEQ ID NO. 7 neben weiteren Bereichen die codierenden Bereiche der Gene csbA, uvrB und uvrA, welche sich insbesondere für die genannten Verwendungen eignen, in denen die codierenden Bereiche mutiert werden. Entsprechendes gilt für uvrC, welches in SEQ ID NO. 11 gezeigt ist. Diese Sequenzen sind insbesondere auf B. licheniformis-Spezies anwendbar, da sie aus einem solchen erhalten worden sind. Zudem ist der Erfolg dieses Vorgehens durch die Beispiele zur vorliegenden Anmeldung belegt. Aufgrund der hohen Interspezies-Homologie bei lebenswichtigen Genen, die in SEQ ID N0:7 offenbart sind, können diese konkreten Sequenzen auch für andere Spezies verwendet werden, wie etwa Staphylococcus oder Corynebakterium, zunehmend bevorzugt für weitere Bacillus-Spezies, insbesondere für Staphylococcus carnosus, Corynebacterium glutamicum, Bacillus subtilis, B. licheniformis, B. amyloliquefaciens, B. globigii, B. lentus, B. alcalophilus, B. gibsonii, B. pumilus, Bacillus sp. und ganz besonders für andere Stämme von B. licheniformis.

Zusätzlich gehen aus SEQ ID NO. 7 die flankierenden Bereiche zu diesen Genen von B. licheniformis hervor beziehungsweise können anhand von SEQ ID NO. 11 nach Standardmethoden erhalten werden. Darüber sind die genannten Verwendungen realisierbar, bei denen auf die flankierenden Regionen zurückgegriffen wird, insbesondere bei homologer Rekombination.

Wie oben erläutert umfasst das uvrBA-Operon die Gene csbA, uvrB und uvrA wobei die beiden letzteren bei und verwandten Spezies gemeinsam transkribiert und translatiert werden dürften. Da diese beiden für zwei Untereinheiten desselben Enzyms codieren, ist es sinnvoll, beide gleichzeitig auszuschalten, um der Zelle überflüssige Protein- Synthesearbeit zu ersparen. Optional können weitere Gene oder Sequenzen des uvrBA- Operons im weiteren Sinne, wie vorstehend insbesondere anhand von SEQ ID N0:7 oder Tabelle 2 beschrieben, ebenfalls funktionell inaktiviert werden. Durch weiträumigere Deletionen werden mehrere dieser Gene gleichzeitig inaktiviert. So stellt es beispielsweise Ausführungsformen der vorliegenden Anmeldung dar, große Teile des in SEQ ID NO. 7 gezeigten Bereichs, diesen kompletten Bereich oder noch weiträumigere

Abschnitte des Baktereinchromosoms zu deletieren, sofern dadurch die DNA- Excisionsreparatur beeinträchtigt wird.

Eine bevorzugte Ausführungsform hiervon bilden erfindungsgemäße Verwendungen, wobei eines der Oligonukleotide gemäß SEQ ID NO. 1 bis 6 verwendet wird, vorzugsweise mehrere davon, besonders bevorzugt in paarweiser Ergänzung.

Dieses Vorgehen ist im Zuge der mit der vorliegenden Anmeldung beschriebenen Beispiele angewendet worden. Das demnach erfolgreiche Vorgehen, bei dem die in SEQ ID NO. 1 bis 4 aufgeführten Oligonukleotide zum Einsatz kamen, ist zusätzlich in Figur 1 dargestellt. Mit Hilfe dieser Primer konnten PCR Konstrukte hergestellt werden, die weite Bereiche der Gene uvrA und uvrB umfassen und wie in Beispiel 1 beschrieben zu deren weitgehender Deletion verwendet wurden. Der Erfolg dieses Vorgehens wurde mit dem Primerpaar gemäß SEQ ID NO. 5 und 6 überprüft. Als Variation dieses Vorgehens ist es auch möglich, SEQ ID NO. 5 anstelle von SEQ ID NO. 1 und/oder SEQ ID NO. 6 anstelle von SEQ ID NO. 4 einzusetzen und dadurch Bereiche zu amplifizieren, die die Randsequenzen der betreffenden Gene umfassen. Als weitere Alternative kann mit Hilfe des Primerpaars gemäß SEQ ID NO. 5 und 6 ein größerer Bereich aus dem Genom amplifiziert werden, das dadurch erhaltene Produkt weiter mutiert und über homologe Rekombination wieder den betreffenden Zellen zugeführt werden.

Wegen der hohen Interspezies-Homologien (siehe oben), insbesondere innerhalb der Gattung Bacillus ist zu erwarten, dass diese Primer mit dem gleichen Erfolg auch bei anderen Spezies, insbesondere bei Bacillus eingesetzt werden können. Aufgrund der wesentlichen Bedeutung, die bei bei den geschilderten Vorgehen der PCR zukommt, werden diese Primer vorzugsweise paarweise eingesetzt.

Entsprechend den oben gemachten Ausführungen stellen folgende erfindungsgemäße Verwendungen entsprechend bevorzugte Ausführungsformen dar:

• Erfindungsgemäße Verwendung, wobei zusätzlich recA beziehungsweise dessen Homologes inaktiviert wird;

• Erfindungsgemäße Verwendung, wobei wobei es sich bei den Bakterien um solche Bakterien, vorzugsweise der Gattung Bacillus, handelt, die natürlicherweise zur Sporulation befähigt sind, und gleichzeitig ein Sporulations-Gen funktionell inaktiviert wird;

• hierunter eine erfindungsgemäße Verwendung, wobei es sich bei dem inaktivierten Gen aus der Phase IV der Sporulation in der Nomenklatur von B. subtilis um eines der Gene spolVA, spoIVB, spolVCA, spolVCB, spoIVFA, spoIVFB oder yqfD beziehungsweise um ein hierzu homologes Gen handelt, vorzugsweise im Fall von B. subtilis um das Gen yqfD, im Fall von Bacillus licheniformis um das Gen spolV und in jedem anderen Fall um ein hierzu homologes Gen, und/oder

• wobei genau ein Gen aus der Phase IV der Sporulation funktionell inaktiviert wird.

Die vorliegende Erfindung wird auch durch ein verstärkt UV-sensitives grampositives Bakterium, welches nicht Bacillus megaterium ist, bei dem a) ein Teil des uvrBA-Operons, der nicht die Gene uvrA und uvrB umfasst oder b) die Gene uvrA und uvrB und/oder das Gen uvrC funktionell inaktiviert ist, verwirklicht.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist ein verstärkt UV-sensitives grampositives

Bakterium, welches nicht Bacillus megaterium ist, bei dem ein Teil des uvrBA-Operons, der nicht die Gene uvrA und uvrB umfasst, und/oder das Gen uvrC funktionell inaktiviert ist, und zusätzlich mindestens eines der Gene uvrB und uvrA beziehungsweise deren jeweilige Homologe aus dem betreffenden Bakterium funktionell inaktiviert ist.

Unter verstärkt UV-sensitiven grampositiven Bakterien sind im Sinne der vorliegenden Erfindung solche zu verstehen, die eine höhere UV-Sensitivität als diejenigen ohne die anspruchsgemäße Sequenzabweichung besitzen. Hierbei kann es sich um Wildtyp- Stämme handeln, die sich diesbezüglich von anderen Wildtypstämmen unterschieden. Insbesondere sind darunter solche Bakterien zu verstehen, die durch gentechnische Modifizierung des uvrBA-Operons und/oder des Gens uvrC von Ausgangsbakterien erhalten worden sind und insofern einem neuen Bakterienstamm zugerechnet werden können. Beispiele hierfür sind die Gemäß Beispiel 1 und 2 der vorliegenden Anmeldung erhaltenen Stämme B. licheniformis DSM 13 δuvrBA und δspolV/δuvrBA.

Zu den hierfür dem Fachmann zur Verfügung stehenden Möglichkeiten sei auf Routinemethoden wir die Isolierung von Mikroorganismen aus einem natürlichen Habitat, auf die bisherigen Ausführungen und auf die Beipiele der vorliegenden Anmeldung verwiesen. Erfindungsgemäß sind die dadurch erhaltenen Bakterienstämme dann, wenn

die von den genannen Genen codierten Bestandteile der UV-induzierten DNA-Excisions- Reparatur hinsichtlich ihrer in den Zellen ausgeübten Funktion schwächer, abgeschwächt oder vollständig inaktiviert sind. Solche Stämme sind gemäß der gestellten Aufgabe als Sicherheitsstämme für den biotechnologischen Einsatz geeigent, weil sie außerhalb der geschützen Labor- und/oder Fermentationsbedingungen, insbesondere unter Einwirken von UV-Strahlung eine deutlich verringerte überlebensrate besitzen. Dabei handelt es sich um einen üblichen Umweltfaktor, mit dem Bakterien bei einem eventuellen Austritt aus der Produktionsanlage in die Umgebung konfrontiert sind. Zudem stellt die UV- Bestrahlung eine übliche Sterilisierungsmethode für Labors und biotechnologische Produktionsstätten dar.

Die erhöhte UV-Sensitivität erfindungsgemäßer Stämme belegen Beispiel 3 und Figur 2 der vorliegenden Anmeldung.

Dass sie sich dennoch als biotechnologisch verwendbare Produktionsstämme, etwa zur Herstellung von extrazellulären Enzymen eignen, belegen Beispiel 5 und Figur 3 der vorliegenden Anmeldung.

Entsprechend den oben gemachten Ausführungen stellen folgende erfindungsgemäßen UV-sensitiven grampositiven Bakterien entsprechend bevorzugte Ausführungsformen dar:

• Erfindungsgemäßes Bakterium, wobei es sich um ein grampositives Bakterium der Gattungen Staphylococcus, Corynebakterien oder Bacillus handelt, insbesondere der Spezies Staphylococcus carnosus, Corynebacterium glutamicum, Bacillus subtilis,

B. licheniformis, B. amyloliquefaciens, B. globigii, B. lentus, B. alcalophilus, B. gibsonii, B. pumilus, Bacillus sp., und ganz besonders um B. licheniformis.

• Erfindungsgemäßes Bakterium, wobei eines oder mehrere der Gene uvrB, uvrA und/oder uvrC beziehungsweise die jeweiligen Homologen aus dem betreffenden Bakterium funktionell inaktiviert sind, wobei uvrA oder uvrB beziehungsweise die jeweiligen Homologen aus dem betreffenden Bakterium nie alleinig inaktiviert sind. Vorzugsweise sind uvrB und uvrA beziehungsweise die jeweiligen Homologen aus dem betreffenden Bakterium funktionell inaktiviert.

• Erfindungsgemäßes Bakterium, wobei die funktionelle Inaktivierung an einem oder mehreren der genannten Gene über eine Deletionsmutation, eine Substitutionsmutation oder eine Punktmutation erfolgt ist.

• Erfindungsgemäßes Bakterium, wobei zusätzlich recA beziehungsweise dessen Homologes inaktiviert ist.

Eine bevorzugte Ausführungsform hiervon bildet solch ein erfindungsgemäßes Bakterium, das natürlicherweise zur Sporulation befähigt ist, vorzugsweise eines der Gattung Bacillus, bei dem zusätzlich ein Gen aus der Phase IV der Sporulation funktionell inaktiviert ist.

Die Vorteile auch dieser Ausführungsform ergeben sich aus den bisherigen Ausführungen.

Entsprechend den oben gemachten Ausführungen stellen folgende erfindungsgemäßen UV-sensitiven grampositiven Bakterien entsprechend bevorzugte Ausführungsformen dar:

• Erfindungsgemäßes Bakterium, wobei es sich bei dem inaktivierten Gen aus der Phase IV der Sporulation in der Nomenklatur von B. subtilis um eines der Gene spolVA, spoIVB, spolVCA, spolVCB, spoIVFA, spoIVFB oder yqfD beziehungsweise um ein hierzu homologes Gen handelt, vorzugsweise im Fall von B. subtilis um das Gen yqfD, im Fall von Bacillus licheniformis um das Gen spolV und in jedem anderen Fall um ein hierzu homologes Gen.

• Erfindungsgemäßes Bakterium, wobei genau ein Gen aus der Phase IV der Sporulation funktionell inaktiviert ist.

Gemäß der gestellten Aufgabe sollte durch Bereitstellung von Sicherheitsstämmen die biotechnologische Produktion verbessert werden. Diese erfolgt durch Kultivieren, das heißt in der Regel durch Fermentation hierfür geeigneter Mikroorganismen.

Die vorliegende Erfindung wird somit auch durch Verfahren zur Kultivierung, insbesondere zur Fermentation eines oben als erfindungsgemäß beschriebenen Bakteriums verwirklicht.

Unter Kultivieren ist jede Art von Aufbewahren und/oder Lebenderhaltung der betreffenden Bakterien zu verstehen. Dazu gehören beispielsweise das Ausplattieren auf Nährmedien-haltigen Platten oder die Schüttelkultur in Flüssigmedium. Bereits in diesem Kulturstadium können biotechnologisch relevante Produkte detektiert (siehe Figur 3 B) und gegebenenfalls sogar isoliert werden.

Biotechnologisch wesentlich bedeutsamer, weil ertragreicher als die Platten- oder Schüttelkultur, ist die Fermentation. Hierunter werden alle Verfahren verstanden, bei denen Mikroorganimen unter kontrollierten Bedingungen - insbesondere hinsichtlich der Nährstoff- und Gasversorgung -kultiviert werden. In der Regel geschieht dies in sogenannten Fermentern mit Fassungsvermögen von einigen Millilitern bis hin zu vielen tausend Litern, in denen die betreffenden Organismen zu definierten Zelldichten heranwachsen können. Hierbei können als Verfahrensweisen insbesondere die Batch- Kultur, das heißt das Anwachsen bis zu einem Maximalwert und abschließendes Abernten oder die kontinuierliche Kultur unterschieden werden. Bei letzterer wird eine über einen längeren Zeitraum konstante Zelldichte eingestellt und Nährstoffe beziehungsweise Stoffwechselprodukte sowie Wertstoffe kontinuierlich zu- beziehungsweise abgeführt. Diese dem Fachmann an sich vertrauten Techniken sind hinsichtlich des interessierenden Wertstoffs ausgestaltbar, beispielsweise ob es sich um eine sekretierte Verbindung handelt oder um einen Stoff, der aus der Biomasse der kultivierten Organismen isoliert werden muß.

Erfindungsgemäß sind all diese Verfahren dann, wenn es sich bei dem in Kultur genommenen Mikroorganimus um ein grampositives Bakterium, mit Ausnahme von Bacillus megaterium, handelt, das ein funktionell abgeschwächtes oder völlig inaktiviertes UV-induziertes DNA-Excisions-Reparatursystem auf der Grundlage einer erfindungsgemäßen Modifizierung des uvrBA-Operons und/oder des Gens uvrC besitzt und somit als erfindungsgemäßer Sicherheitsstamm anzusehen ist.

Bevorzugt ist darunter ein Verfahren zur Herstellung eines Wertstoffs, insbesondere einer niedermolekularen Verbindung oder eines Proteins.

Denn dieses sind die wirtschaftlich bedeutendsten Anwendungsgebiete der biotechnologischen Produktion.

Eine bevorzugte Ausführungsform davon ist ein erfindungsgemäßes Verfahren, wobei es sich bei der niedermolekularen Verbindung um einen Naturstoff, einen Nahrungsmittelergänzungsstoff oder um eine pharmazeutisch relevante Verbindung handelt.

Hierunter sind beispielsweise Aminosäuren oder Vitamine zu nennen, die besonders als Nahrungsmittelergänzungsstoffe Verwendung finden. Bei pharmazeutisch relevanten Verbindungen kann es sich um Vor- oder Zwischenstufen zu Medikamenten oder sogar um diese selbst handeln. In all diesen Fällen spricht man auch von Biotransformation, wonach die Stoffwechseleigenschaften der Mikroorganismen ausgenutzt werden, um die ansonsten aufwendige chemische Synthese ganz oder zumindest in einzelnen Schritten zu ersetzen.

Eine nicht minder bevorzugte Ausführungsform davon ist ein erfindungsgemäßes Verfahren, wobei es sich bei dem Protein um ein Enzym handelt, insbesondere eines aus der Gruppe der α-Amylasen, Proteasen, Cellulasen, Lipasen, Oxidoreduktasen, Peroxidasen, Laccasen, Oxidasen und Hemicellulasen.

Industrielle Enzyme, die mit derartigen Verfahren hergestellt werden, finden beispielsweise in der Nahrungsmittelindustrie Verwendung. So dienen α-Amylasen beispielsweise dazu, um das Altbackenwerden von Brot zu verhindern oder um Fruchtsäfte zu klären. Proteasen werden zum Aufschluß von Proteinen verwendet. All diese Enzyme sind für den Einsatz in Wasch- und Reinigungsmitteln beschrieben, wobei insbesondere die von grampositiven Bakterien bereits natürlicherweise hergestellten Subtilisin-Proteasen einen prominenten Platz einnehmen. Insbesondere in der Textil- und Lederindustrie dienen sie der Aufarbeitung der natürlichen Rohstoffe. Ferner können all diese Enzyme wiederum im Sinne der Biotransformation als Katalysatoren für chemische Reaktionen eingesetzt werden.

Wie oben erläutert und durch die Beispiele 1 und 2 belegt ist, konnte die gestellte Aufgabe letztlich dadurch gelöst werden, dass die in den genannten Beispielen beschriebenen und zum Teil in Figur 1 eingezeichneten Oligonukleotide zur Amplifizierung des in vivo davon umschlossenen DNA-Bereichs verwendet wurden. Hierauf bauen die bisher beschriebenen Erfindungsaspekte auf.

Die vorliegende Erfindung wird somit auch durch die Verwendung mindestens einer, vorzugsweise von mindestens zwei einander entgegenorientierten Nukleinsäuren gemäß SEQ ID NO. 1 bis 6 zur Amplifizierung eines in vivo davon umschlossenen DNA-Bereichs verwirklicht.

Wie oben erläutert lassen sich darüber genetische Inaktivierungskonstrukte erhalten, mit denen insbesondere die Gene uvrA und uvrB beziehungsweise deren Homologe in anderen, vorzugsweise zu B. licheniformis verwandten Spezies inaktiviert werden können. Auch die Kontrolle mithilfe weiter außen im betreffenden Chromosomenabschnitt bindender Oligonukleotide, inwiefern die betreffenden Ansätze erfolgreich sind, stellt einen Aspekt der Erfindung dar. Ferner können auch die Primer gemäß SEQ ID NO. 5 und/oder 6 zur funktionellen Inaktivierung des dazwischenliegenden Bereich verwendet werden.

Sofern auf diese Weise hinsichtlich der UV-induzierten DNA-Excisions-Reparatur beeinträchtigte grampositive Bakterien (mit Ausnahme von Bacillus megaterium) erhalten werden, handelt es sich um erfindungsgemäße Verwendungen einer oder mehrerer Nukleinsäuren gemäß SEQ ID NO. 1 bis 6.

In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich dabei um eine solche Verwendung im Rahmen eines oben als erfindungsgemäß beschriebenen Verfahrens zur Erzeugung eines verstärkt UV-sensitiven grampositiven Bakteriums, welches nicht Bacillus megaterium ist.

In einer ebenso bevorzugten Ausführungsform handelt es sich dabei um eine solche Verwendung im Rahmen einer oben als erfindungsgemäß beschriebenen Verwendung einer oder mehrerer Nukleinsäurebereiche zur Erzeugung eines verstärkt UV-sensitiven grampositiven Bakteriums, welches nicht Bacillus megaterium ist.

In einer ebenso bevorzugten Ausführungsform handelt es sich dabei um eine solche Verwendung im Rahmen einer oben als erfindungsgemäß beschriebenen Verwendung zur Erzeugung eines Bakteriums wie er oben als erfindungsgemäß beschrieben worden ist.

Beispiele

Alle molekularbiologischen Arbeitsschritte folgen Standardmethoden, wie sie beispielsweise in dem Handbuch von Fritsch, Sambrook und Maniatis „Molecular cloning: a laboratory manual", CoId Spring Harbour Laboratory Press, New York, 1989, oder „Mikrobiologische Methoden: Eine Einführung in grundlegende Arbeitstechniken" von E. Bast (1999) Spektrum, Akademischer Verlag, Heidelberg, Berlin, oder vergleichbaren einschlägigen Werken angegeben sind. Enzyme und Baukästen (Kits) wurden nach den Angaben der jeweiligen Hersteller eingesetzt.

Beispiel 1

Inaktivierung der uvrBA-Region von B. licheniformis

Genomische DNA aus B. licheniformis wurde wie in Gärtner et al. (1988), J. Bacteriol., Band 170, Seiten 3102 bis 3109 beschrieben, isoliert. Hierfür wurde der über die DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1 b, 38124 Braunschweig; http://www.dsmz.de) erhältliche Stamm B. licheniformis DSM13 verwendet.

Basierend auf der genomischen Sequenz von B. licheniformis DSM13 (Veith et al.; 2004; J. Mol. Biotechnol., Band 7, Seiten 204 bis 211 ) und dem Eintrag AE017333 (Basen 1 bis 4.222.645) in der Datenbank GenBank (National Center for Biotechnology Information NCBI, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA; http://www.ncbi.nlm.nih.gov; Stand 2.12.2004) wurden die in folgender Tabelle 3 zusammengestellten sechs Oligonukleotide als Primer entworfen.

Tabelle 3: Oligonukleotide, die sich als PCR-Primer für die Inaktivierung des uvrBA- Operons von B. licheniformis eignen.

Um eine uvrBA-Deletion zu erzielen, die sowohl uvrA als auch uvrB beeinträchtigt, wurden ausgehend von der chromosomalen B. licheniformis-DNA zwei PCR-Produkte hergestellt: Eine Flanke wurde mit dem Primerpaar uvrB-Bali1/uvrB-Bali2 und die andere mit dem Primerpaar uvrA-Bali1/uvrA-Bali2 amplifiziert (siehe Figur 1 ). Diese beiden Fragmente wurden unter Ausnutzung der Hincll-Schnittstellen hintereineinander in den E. coli- Klonierungsvektor pUCBM21 (Boehringer Mannheim, Deutschland) zwischenkloniert, wordurch eine uvrBA-Deletionskassette erhalten wurde. Diese wurde anschließend in die Pstl-Schnittstelle des E. coli/Bacillus-Shuttlevektors pSKE194 (Nahrstedt et al.; 2005; J. Biotechnol., Band 1 19, Seiten 245 bis 254) ligiert, wodurch der Vektor pSKE194uvrBA erhalten wurde.

Nach Restriktion dieses Vektors mit Xbal wurde das den Bacillus-Origin, das Erythromycin-Resistenzgen und die uvrBA-Deletionskassette enthaltende Fragment religiert, wodurch der Deletionsvektor pδuvrBA erhalten wurde. Dieser wurde als Knock- Out-Vektor in einen B. licheniformis-Wildtypstamm transformiert, und zwar über PEG- vermittelte Protoplasten-Transformation, entsprechend Chang, Cohen (1979), Mol. Gen. Genet, Band 168, Seiten 11 1 bis 1 15.

Die Selektion erfolgte bei Inkubation in Kulturmedium mit 5 μg Erythromycin ml ^"1 bei 30°C. Anschließend wurden Klone mit integriertem Vektor dadurch indentifiziert, dass sie bei 0,3 μg Erythromycin ml ^"1 und der nicht-permissiven Temperatur von 42°C Wachstum zeigten, nicht aber mehr bei 5 μg/ml ^"1 Erythromycin und 42°C. Die selektierten, dann bei 42°C und ohne Antibiotikum angezogenen Klone wurden über PCR auf Deletionen getestet.

Diese PCR-Untersuchungen erfolgten mit dem Primer-Paar uvrBA_527 (SEQ ID NO. 5) und uvrBA_7771c (SEQ ID NO. 6). Sie lieferten für Wildtyp-Klone Fragmente mit ca. 7,7 kb Länge und für KO-Klone solche mit ca. 3,7 kb.

Zur weiteren überprüfung der chromosomalen Organisation der uvrBA-Region wurde DNA aus dem Ausgangsstämmen und den Mutanten mit einer DIG-markierten uvrBA- PCR-Probe hybridisiert (erhalten über die Primer uvrB-Bali1/uvrA-Bali2). Erwartungsgemäß zeigten die Deletionsmutanten in der Southern-Analyse mit ca. 3,4 kb ein um ca. 3,5 kb kleineres Fragment als die Ausgangsstämme mit ca. 6,9 kb. Schließlich wurde dieses Ergebnis noch anhand einer Sequenzierung überprüft. Sie bestätigte, dass auf diese Weise aus einem Wildtypstamm eine δuvrBA-Deletionsmutante abgeleitet worden war.

Beispiel 2

Inaktivierung der uvrBA-Region eines hinsichtlich der Sporulation defizienten B. licheniformis-Stammes

Parallel zu dem Vorgehen gemäß Beispiel 1 wurde auch ein hinsichtlich der Sporulation inaktivierter Stamm von B. licheniformis mit dem genannten Deletionsvektor transformiert und hieraus eine Deletionsmutante isoliert. Dieser Ausgangsstamm ist in Nahrstedt et al. (2005), J. Biotechnol., Band 119, Seiten 245 bis 254 als δspolV-Stamm beschrieben und unterschiedet sich von dem Wildtypstamm des vorangegangenen Versuchs im wesentlichen durch diese Deletion.

Wie über die Beispiel 1 entsprechenden Untersuchungen und entsprechend der genannten Publikation zu δspolV eine zusätzliche Kontroll-PCR hinsichtlich der Deletion des Sporulationsgens gezeigt wurde, wurde dadurch ein B. licheniformis δspolV/δuvrBA erhalten. Dieser war auch nicht mehr zur Sporulation befähigt.

Beispiel 3

Untersuchung der UV-Sensitivität der Mutanten δspolV, δuvrBA und δspolV/δuvrBA in

Vergleich zum Wildtypstamm

Zellen der vier in den vorangegangenen Beispielen beschriebenen Stämme

B. licheniformis Wildtyp, δspolV, δuvrBA und δspolV/δuvrBA wurden in parallelen

Ansätzen in Minimalmedium bis zur mittleren exponentiellen Phase kultiviert und

Verdünnungen dieser Kulturen in 15 mM NaCI-Lösung auf LB-Medium-Platten aufgebracht.

Für eine qualitative Untersuchung wurden diese Platten mit O, 2, 4, 6, 8, 10 beziehungsweise 20 J/m ² UV-Licht bestrahlt und über Nacht im Dunkeln inkubiert. Eine Hälfte der Agarplatte ist dabei zur Kontrolle während der Bestrahlung mit Plexiglas abgedeckt worden. Das Ergebnis ist in Figur 2 (A) dargestellt: Während der Wildtyp und die δspolV-Mutante praktisch keine Beeinträchtigung ihres Zellwachstums zeigten, wurde durch die uvrBA-Deletion eine deutliche Sensitivität hervorgerufen. Diese ist überraschenderweise bei der Doppelmutante noch stärker ausgeprägt.

Zur quantitativen Auswertungs dieses Versuchs wurden die jeweils erhaltenen Koloniezahlen in Relation zu der bei 0 J/m ² (100%) gesetzt. Das Ergebnis ist in Figur 2 (B) dargestellt. Demnach sind die δuvrBA- und die δspolV/δuvrBA-Doppelmutante meßbar in ihrer überlebensrate beeinträchtigt. So reichte eine Strahlungsintensität von 10 J/m ² , um alle Zellen von δuvrBA und δspolV/δuvrBA abzutöten, während 24,6% und 34,6% der Wildtyp- beziehungsweise δspolV-Zellen nach derselben UV-Dosis überlebten.

Zur Kontrolle war auch eine gemäß WO 2005/095446 A1 hergestellte recA- Deletionsmutante getestet worden, die eine mittlere überlebensrate zeigte.

Beispiel 4

Wachstumskurven und extrazelluläre Enzymaktivitäten der Mutanten δspolV, δuvrBA und

δspolV/δuvrBA in Vergleich zum Wildtypstamm

Zellen der vier in den vorangegangenen Beispielen beschriebenen Stämme B. licheniformis Wildtyp, δspolV, δuvrBA und δspolV/δuvrBA wurden in einem Minimai- Medium (100 ml M9-Lösung, 10 ml Glucose (20% w/v), 10 ml MgSO ₄ 100 mM, 2 ml Casaminoacids (10% w/v), 1 ml CaCI ₂ 100 mM, 1 ml Hefeextrakt (10% w/v), 100 μl MnSO ₄ (2mg/ml); destilliertem Wasser ad 1 I, pH 7,4; M9-Lösung: 60 g Na ₂ HPO ₄ , 30 g KH ₂ PO ₄ , 10 g NH ₄ CI, 5 g NaCI, destilliertem Wasser ad 1 I, pH7,4), das als einzige C- Quelle 2 g/l Glucose enthielt, für 48 h bei 37°C in einem 100 ml-Batch-Fermenter kultiviert. Hierbei wurden regelmäßig die optische Dichte (OD) bei 546 nm und die Glucosekonzentration bestimmt. Gleichzeitig wurden nach 6, 9, 12, 24, 30, 36 und 48 h

Aliquots aus den überständen entnommen und darin die Protease- und die α- Amylaseaktivität bestimmt. Hierfür wurden in den Aliquots die enthaltenen Zellen bei 7.000 g pelletiert und die überstände vermessen.

Die Bestimmung der Glucosekonzentration erfolgte gemäß FitzGerald und Vermerris (2005), Biotechnol. Appl. Biochem., Band 41 , Seiten 233 bis 239, mit Accu-Chek Sensor Comfort strips (Fa. Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany). Die Proteinkonzentration wurde mithilfe eines auf der Bradford-Bestimmungsmethode beruhenden Test-Kits bestimmt.

Die Proteaseaktivität wurde über die Hydrolyse von Succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-p-Nitroanilid (AAPF), ermittelt, welches von der Firma Bachern AG (Weil am Rhein, Germany) als Lösung in DMSO erhältlich ist und für den Test in Testpuffer auf eine Endkonzentration von 1 ,1 mM verdünnt worden war. Die Messungen wurden in 0,1 M Tris-HCI (pH 8.6) bei 25°C durchgeführt. Die Menge an freigesetztem p-Nitroanilin wurde bei 410 nm bestimmt (molarer Absorptionskoeffizient: 8.480 M ^"1 cm ^"1 ). Eine Aktivitätseinheit ist als die Menge definiert, die 1 μmol p-Nitroanilin pro Minute freisetzt. Die spezifische Aktivität ist die Aktivität pro mg Protein.

Die α-Amylaseaktivität wurde über den Phadebas ^® Test (Fa. Pharmacia Diagnostics, Freiburg, Germany) durch Messung der Freisetzung löslicher blauer Fragmente in den überstand aus einem unlöslichen blauen Polymer bestimmt. Dafür wird eine Phadebas ^® - Tablette in 10 ml destilliertem Wasser suspendiert und Aliquots von jeweils 500 μl zur Messung von 50 μl überstand verwendet. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 150 μl 0.5 M NaOH nach 15 min beendet. Kontrollen wurden auf die gleiche Weise behandelt, allerdings unter Zugabe des überstands nach Abstoppen der Reaktion mit NaOH. Die löslichen blauen Hydrolyseprodukte wurden vom unlöslichen blauen Substrat durch Zentrifugation bei 14.000 g abgetrennt und die Absorption bei 620 nm gegen die Kontrolle gemessen.

Diese Untersuchungen erfolgten nacheinander an drei identisch durchgeführten Meßreihen; die jeweiligen arithmetischen Mittelwerte sind in Figur 3 (A) dargestellt.

Anhand der Messungen der optischen Dichte bei 546 nm erkennt man, dass alle Stämme über ein praktisch gleiches Wachstumsverhalten verfügen. Es zeigten sich keine

Beeinträchtigungen durch den Verbrauch der Glucose als einziger C-Quelle nach jeweils ca. 8 h. Daraus kann man schließen, dass die Deletionsmutanten gegenüber dem jeweiligen Ausgangsstamm praktisch keine signifikanten Nachteile besitzen. Auch bei vorangegangenen Untersuchungen zum Wachstum auf Agarplatten mit LB-Medium und auf Minimalmedium, das mit Glucose supplementiert war, hatten sie keine Beeinträchtigungen gezeigt.

Sowohl die Protease- als auch die Amylase-Aktivitäten nehmen mit jedem Meßpunkt zu und erreichen gegen Ende der Fermentation ihren Höhepunkt. Die Messungen der extrazellulären Enzymaktivitäten zeigen ebenfalls keine Beeinträchtigung durch die erfindungsgemäßen Deletionen. Die Maximalwerte der Protease- wie der Amylase- Aktivitäten wurden sogar bei einer Mutante, nämlich δuvrBA beobachtet.

Beispiel 5

Extrazelluläre Enzymaktivitäten der Mutanten δspolV, δuvrBA und δspolV/δuvrBA in

Vergleich zum Wildtypstamm

Die Protease-, Cellulase- und α-Amylase-Aktivitäten der Stämme δspolV, δuvrBA und δspolV/δuvrBA wurden auch qualitativ in Vergleich zum Wildtypstamm untersucht. Hierfür wurden Zellen über Nacht in LB-Medium kultiviert und jeweils gleiche Zellmengen auf Magermilch- (skim milk), Carboxymethylcellulose- (cmc) und Stärke-haltigen (starch) Minimalmedium-Agarplatten bei 37°C inkubiert. Nach 30 h wurden die Stärke-haltigen Platten mit Lugolscher Lösung und die Carboxymethylcellulose-haltigen Platten mit Kongorot überschichtet und die Lysehöfe aller Platten ermittelt.

Das Ergebnis ist in Figur 3 (B) dargestellt. Alle Stämme zeigten qualitativ dieselben Ergebnisse, nämlich je Substrat ungefähr gleichgroße Lysehöfe. Somit haben die Deletionsmutanten trotz der genetischen Modifikationen alle drei gemessenen Enzymaktivitäten, einschließlich des zugehörigen Detektions- und Sekretionsapparats beibehalten und sind somit weiterhin als Produktionsstämme für extrazelluläre Enzyme geeignet. Dieses Ergebnis bestätigte sich in einer Wiederholung des Versuchs auf entsprechend supplementierten LB-Agarplatten.

Beschreibung der Figuren

Figur 1 : Teil des uvrBA-Operons, der die Gene csbA, uvrB und uvrA umfasst, von

B. licheniformis

Schematische Darstellung der für uvrBA codierenden Bereiche der Wildtyp- Region (wild type) und der in Beispiel 1 beschriebenen Deletionsmutante (δuvrBA). Offene Leseraster (open reading frames; ORF) sind als Pfeile dargestellt; die Positionen der PCR-Primer zur Erzeugung der Deletionsmutanten sind als kleine Dreiecke angezeigt. Die zugehörige DNA-Sequenz ist in SEQ ID NO. 7 angegeben; die abgeleiteten Aminosäuresequenzen für CsbA, UvrB und UvrA2 in SEQ ID NO. 8, 9 beziehungsweise 10.

Figur 2 (A): Qualitative Untersuchung der UV-Sensitivität der B. licheniformis-Mutanten δspolV (1.1 ), δuvrBA (1.10) und δspolV/δuvrBA (1.11 ) in Vergleich zum Wildtypstamm (1 ) gemäß Beispiel 3.

In der Kopfzeile sind die jeweiligen Strahlungsintensitäten in J/m ² angegeben.

Figur 2 (B): Quantitative Untersuchung der UV-Sensitivität der B. licheniformis- Mutanten δspolV, δuvrBA und δspolV/δuvrBA in Vergleich zum Wildtypstamm gemäß Beispiel 3 und zu einer recA-Deletionsmutante. Aufgetragen ist die jeweilige überlebensrate in Abhängigkeit von der Strahlungsintensität in J/m ² .

Dabei bedeuten: schwarze Rauten (♦): B. licheniformis Wildtyp schwarze Quadrate (■) B. licheniformis δspolV schwarze Dreiecke (A): B. licheniformis δrecA (gemäß WO 2005/095446 A1 ) weiße Rauten (0): B. licheniformis δuvrBA weiße Quadrate (D): B. licheniformis δspolV/δuvrBA

Figur 3 (A): Wachstumskurven der Mutanten δspolV, δuvrBA und δspolV/δuvrBA in

Vergleich zum Wildtypstamm gemäß Beispiel 4. Dabei bedeuten:

durchgezogene Linien: Zelldichte (Optische Dichte bei 546 nm) gepunktete Linien: Glucose-Konzentration kurz-gestrichelte Linien: Protease-Aktivität lang-gestrichelte Linien: α-Amylase-Aktivität schwarze Rauten (♦): B. licheniformis Wildtyp schwarze Punkte (•): B. licheniformis δspolV weiße Rauten (0): B. licheniformis δuvrBA weiße Kreise (o): B. licheniformis δspolV/δuvrBA

Figur 3 (B): Qualitativer Nachweis der Enzymaktivitäten der B. licheniformis-Mutanten δspolV (1.1 ), δuvrBA (1.10) und δspolV/δuvrBA (1.11 ) in Vergleich zum Wildtypstamm (1 ) gemäß Beispiel 5.

Dabei bedeuten: skim milk: Magermilch-haltige Minimalmedium-Agarplatte zum Nachweis einer Protease-Aktivität cmc: Carboxymethylcellulose-haltige Minimalmedium-Agarplatte zum Nachweis einer Cellulase-Aktivität starch: Stärke-haltige Minimalmedium-Agarplatte zum Nachweis einer α-Amylase-

Aktivität

Figur 4: Das komplette uvrBA-Operon aus B. licheniformis DSM13 einschließlich benachbarter genetischer Elemente; die zugehörige DNA-Sequenz ist in umgekehrter Leserichtung in SEQ ID NO. 7 angegeben.