LEISHMANIOSE TEGUMENTAR"

[01] A presente tecnologia trata de composições vacinais compreendendo pelo menos um dos nove peptídeos definidos pelas SEQ ID No 1 a 9, capazes de estimular o desenvolvimento de uma resposta imune celular do tipo T helper 1 (Th1 ) com elevada produção de Interferon-gamma (IFN-γ) e baixos níveis de lnterleucina-4 (IL-4), para prevenção da leishmaniose tegumentar em mamíferos.

[02] As leishmanioses são doenças causadas por parasitas protozoários do género Leishmania, sendo endémicas em 98 países no mundo, com uma incidência estimada de 1.0 a 2.0 milhões de novos casos a cada ano. Deste montante, 0.5 a 1.5 milhões correspondem a casos de leishmaniose tegumentar (LT) (Desjeux, P. The increase in risk factors for leishmaniasis worldwide. Trans R Soe Trop Med Hyg. 95 (3): 239-43,2001 ), enquanto cerca de 500 mil casos de leishmaniose visceral (LV) são registrados anualmente (Alvar, J. et al. Leishmaniasis worldwide and global estimates of its incidence. PLoS One. 7(5):35671 , 2012).

[03] Atualmente, cerca de 20 espécies do parasita são encontradas nas Américas, das quais 14 estão associadas a casos de LT. No Brasil, sete espécies foram identificadas como agentes etiológicos da doença, das quais seis pertencem ao subgênero Viannia: Leishmania (Viannia) braziliensis, Leishmania (V.) guyanensis, Leishmania (V.) lainsoni, Leishmania (V.) shawi e Leishmania (V.) lindenbergi (Lainson, R.; Shaw, J. J. Evolution, classification and geographical distribution. Academic Press:London, 1-120, 1987; Silveira, F. T. et al. An outbreak of cutaneous leishmaniasis among soldiers in Belém, Para State, Brazil, caused by Leishmania (Viannia) lindenbergi n. sp. A new leishmanial parasite of man in the Amazon region. Parasite.9(1 ):43-50, 2002). A sétima espécie pertence ao subgênero Leishmania, sendo a espécie Leishmania (Leishmania) amazonensis (Shaw, J. J.; Lainson, R. Leishmaniasis in Brazil. VI. Observations on the seasonal variations of Lutzomyia flaviscutellata in different types of forest and its relationship to enzootic rodent leishmaniasis (Leishmania mexicana amazonensis). Trans R Soe Trop Med Hyg. 66(5):709-17, 1972; Silveira, F. T.; Lainson, R.; Corbett, C. E. Clinicai and immunopathological spectrum of American cutaneous leishmaniasis with special reference to the disease in Amazonian Brazil: a review. Mem Inst Oswaldo Cruz. 99(3):239-51 , 2004).

[04] A LT pode se manifestar sobre três formas clínicas principais: a leishmaniose cutânea (LC), forma clínica mais comum da doença, a leishmaniose mucosa (LM) e a leishmaniose cutâneo-difusa (LCD) (WHO. Leishmaniasis. Fact sheet. 375, 2014). A LC é caracterizada pela presença de uma lesão cutânea primária que se desenvolve no local da picada do flebotomíneo, sendo única ou podendo originar outras lesões. A doença tende a evoluir à cura espontânea, porém, há casos em que a lesão pode permanecer ativa por vários anos e coexistir com lesões mucosas que podem surgir mais adiante com o avançar da doença (Gontijo, B., Carvalho MDE, L. American cutaneous leishmaniasis. Rev Soe Bras Med Trop. 36(1 ): 71-80, 2003). A espécie L. braziliensis é o principal agente etiológico de LC no Brasil (Marsden, P. D. Mucosal leishmaniasis ("espundia" Escomel, 191 1 ). Trans R Soe Trop Med Hyg.80(6):859-76, 1986). A LM e LCD, formas clínicas mais graves de LT, são também causadas pela espécie L. braziliensis, embora L. amazonensis seja responsável pelas formas clínicas com pior resposta de tratamento para os pacientes acometidos (Garcez, L. M., et al. Leishmania (Leishmania) amazonensis-induced cutaneous leishmaniasis in the primate Cebus apella: A model for vaccine trials. International Journal for Parasitology. 32: 1755-1764, 2002). [05] O diagnóstico da LT baseia-se na avaliação das manifestações clínicas da doença em conjunto com inquéritos epidemiológicos e com a detecção dos estágios intracelulares dos parasitas, por meio de exames de esfregaços e/ou biópsias de lesões da pele e cultura de espécimes; além de outros exames laboratoriais. O diagnóstico rápido e preciso é fundamental para evitar danos permanentes e graves sequelas funcionais aos pacientes; porém, para o diagnóstico clínico, a sintomatologia da LT é semelhante à de outras doenças, comuns em nosso meio, tais como a tuberculose, paracoccidioidomicose e hanseníase. Doenças não infecciosas, como granulomas e neoplasias podem também causar lesões que se assemelham às úlceras causadas na LT (Junqueira-Pedras, M. et al. Antibody subclass profile against Leishmania braziliensis and Leishmania amazonensis in the diagnosis and follow-up of mucosal leishmaniasis. Diagn Microbiol Infect Dis. 47(3):477-85, 2003). Os métodos parasitológicos, apesar de apresentarem especificidade elevada, possuem limitações em sua sensibilidade, pela distribuição não homogénea dos parasitas nas lesões, além da coleta das amostras ser considerada invasiva por meio das biópsias. Além disso, tais métodos consomem grande tempo para a confecção das lâminas, fato que também dificulta sua utilização na prática médica rotineira (Weigle, K. A. et al. Diagnosis of cutaneous and mucocutaneous leishmaniasis in Colômbia: a comparison of seven methods. Am J Trop Med Hyg.36(3):489-96, 1987).

[06] O diagnóstico laboratorial baseado na presença de anticorpos específicos por parte do hospedeiro infectado constitui-se em uma alternativa, com a sensibilidade variando em torno de 62% a 100% dos casos, dependendo da preparação antigênica utilizada. Uma das desvantagens de testes de sorodiagnóstico tem sido a baixa sensibilidade e/ou especificidade dos mesmos, provocada pelos baixos títulos de anticorpos específicos e pela reatividade cruzada com antígenos presentes em agentes infecciosos causando doenças relacionadas à LT, respectivamente (Guimarães, M. C ; Celeste, B. J.; Franco, E. L. Evaluation of dot enzyme-linked immunosorbent assay for mucocutaneous leishmaniasis and comparison with microplate enzyme immunoassay. J Clin Microbiol.24(3):364-7, 1986; Valli, L. C. et al. Humoral immune responses among mucosal and cutaneous leishmaniasis patients caused by Leishmania braziliensis. J Parasitol. 85(6): 1076-83, 1999). Dessa forma, muitos pacientes são considerados falso-negativos nas triagens sorológicas realizadas, embora estejam infectados pelo parasita Leishmania (Passos, V. M. et al. American cutaneous leishmaniasis: use of a skin test as a predictor of relapse after treatment. Buli World HeaLT Organ. 78(8):968-74, 2000; Brito, M. E. et al. Dynamics of the antibody response in patients with therapeutic or spontaneous cure of American cutaneous leishmaniasis. Trans R Soe Trop Med Hyg.95(2):203-6, 2001 ).

[07] A técnica de ELISA vem sendo utilizada por apresentar melhores valores de sensibilidade e especificidade (Goto, H.; Lindoso, J. A. Current diagnosis and treatment of cutaneous and mucocutaneous leishmaniasis. Expert Rev Anti Infect Ther. 8(4):419-33, 2010). Tal técnica é considerada uma ferramenta importante para o diagnóstico da LT e o monitoramento da exposição dos indivíduos em áreas endémicas da doença. Geralmente, esses testes utilizam antígenos obtidos de frações brutas e/ou moléculas semi-purificadas do parasito, bem como proteínas recombinantes e/ou peptídeos sintéticos derivados dos mesmos (Junqueira-Pedras, M. et al. Antibody subclass profile against Leishmania braziliensis and Leishmania amazonensis in the diagnosis and follow-up of mucosal leishmaniasis. Diagn Microbiol Infect Dis.47(3):477-85, 2003). Entretanto, a heterogeneidade da resposta humoral observada em muitos pacientes com LT indica que, para um sorodiagnóstico efetivo da doença, uma combinação de antígenos em um mesmo ensaio seria desejável, quando comparado à utilização de antígenos isolados dos parasitas. Uma combinação de diferentes antígenos com valor diagnóstico também poderia detectar infecções assintomáticas sendo, dessa forma, altamente desejável para o diagnóstico da doença.

[08] Apesar dos avanços científicos, a LT constitui-se em um importante problema de Saúde Pública. Até o presente momento, o diagnóstico é realizado de forma precária e muitos pacientes acabam por receber o tratamento de forma tardia e quando a doença já se estabeleceu por muitos anos. Dessa forma, outras medidas de controle de disseminação da doença fazem-se necessárias, tais como o desenvolvimento de vacinas.

[09] As medidas de controle empregadas para reduzir o número de casos de leishmanioses visam, principalmente, à interrupção do ciclo biológico do parasita. Entretanto, o número de espécies de Leishmania, o caráter zoonótico da doença e a manutenção do parasita no ciclo silvestre dificultam a adoção de medidas efetivas (Tesh RB. Control of zoonotic visceral leishmaniasis: is it time to change strategies? Am J Trop Med Hyg.52:287-92, 1995). O controle do vetor pode ser realizado pela aplicação de inseticidas no ambiente doméstico e peridoméstico; entretanto, sua utilização apresenta relativa eficácia (Tesh RB. Control of zoonotic visceral leishmaniasis: is it time to change strategies? Am J Trop Med Hyg.52:287- 92,1995). A eliminação dos reservatórios silvestres, como marsupiais e roedores, não é considerada uma medida executável e ecologicamente correta, pois existe a possibilidade de adaptação do parasita a outros reservatórios existentes no ambiente (Grimaldi, G. e Tesh, R.B. Leishmaniasis of the New World: current concepts and implications for future research. Clin. Microbiol. Rev. 6:230-50, 1993; Gramiccia M, Gradoni L. The current status of zoonotic leishmaniases and approaches to disease control. Int J Parasitol. 35(1 1-12): 1 169-80. 2005). [010] Em modelos murinos, após a cura da LC causada pela espécie Leishmania major, os animais adquirem imunidade duradoura contra a re- infecção (Afonso LC e Scott P. Immune responses associated with susceptibility of C57BL/10 mice to Leishmania amazonensis. Infect. & Immun. 61 :2952-59, 1993). Tal fato tem estimulado o desenvolvimento de pesquisas visando à obtenção de antígenos vacinais que possam ser utilizados como uma medida efetiva de controle da doença. Existem alguns antígenos que vêm sendo avaliados e que preenchem, parcialmente, requisitos para serem empregados como candidatos à vacina contra as leishmanioses (Stáger S, Smith DF, Kaye PM. Immunization with a recombinant stage-regulated surface protein from Leishmania donovani induces protection against visceral leishmaniasis. J Immunol 165:7064-71 , 2000; Dondji B, Perez-Jimenez E, Goldsmith-Pestana K, Esteban M, McMahon-Pratt D. Heterologous prime - boost vaccination with the LACK antigen protects against murine visceral leishmaniasis. Infect Immun 73:5286-89,2005; Chávez-Fumagalli MA,et al.Vaccination with the Leishmania infantum ribosomal proteins induces protection in BALB/c mice against Leishmania chagasi and Leishmania amazonensis challenge. Microbes Infect 12:967-77, 2010). Entretanto, devido às dificuldades relacionadas à obtenção de um antígeno que seja de fácil produção e alto rendimento, baixo custo, que não estimule a produção de anticorpos específicos ao parasita nos animais imunizados, mas ao mesmo tempo em que seja imunogênico e capaz de induzir ao desenvolvimento de uma resposta imune celular específica; ainda não há disponível no mercado uma vacina eficaz para a população.

[01 1 ] Na resposta imune contra a LT, a resistência à infecção é relacionada com o desenvolvimento de uma resposta imune específica celular do tipo Th1 , primada pela produção de níveis elevados de citocinas tais como o IFN-γ por parte do hospedeiro mamífero. O mecanismo imunológico efetor responsável pelo controle dos parasitas é decorrente da ativação de macrófagos, via produção de níveis elevados de óxido nítrico, estimulado por essa citocina (Scott P. Development and regulation of cell-mediated immunity in experimental leishmaniasis. Immunol Res. 27:489-98, 2003).

[012] A utilização de modelos murinos em estudos de vacinação nas leishmanioses permitiu a identificação de dois subtipos distintos de linfócitos T que produzem e secretam citocinas capazes de induzir funções efetoras diferentes. Os estudos que utilizaram como base o modelo murino de infecção por L. major em camundongos BALB/c, proposto por Sacks & Noben-Trauth (2002), definiram o paradigma Th1/Th2 de resistência e susceptibilidade, respectivamente, à infecção e o papel de citocinas como o IFN-γ e a IL-4, respectivamente, no desenvolvimento de linhagens de células Th1 e Th2 (Sacks D and Noben-Trauth N. The immunology of susceptibility and resistance to Leishmania majo In mice. Nat Rev Immunol. 2:845-58, 2002).

[013] Na LT, o perfil de resposta Th1 é reprimido pela produção de IL-4. Neste sentido, essa citocina, tida como indutora de uma resposta Th2, é relacionada à desativação de macrófagos e ao estabelecimento da doença nos animais, enquanto citocinas como IFN-γ e IL-12 estão relacionadas com a proteção contra a doença (Coelho, E. A. F., et al.lmmune responses induced by the Leishmania (Leishmania) donovani A2 antigen, but not by the LACK antigen, are protective against experimental Leishmania (Leishmania) amazonensis infection. Infect Immun. 71 :3988-3994, 2003; Chávez-Fumagalli, M. A., et al. Vaccination with the Leishmania infantum ribosomal proteins induces protection in BALB/c mice against Leishmania chagasi and Leishmania amazonensis challenge. Microbes and Infection. 12:967-977, 2010;Nico, D., et al. Cross-protective immunity to Leishmania amazonensis is mediated by CD4+ and CD8+ epitopes of Leishmania donovani nucleoside hydrolase terminal domains. Frontiers in Immunology. 5:1-10, 2014).

[014] Em estudos de avaliação de candidatos vacinais na LT, os imunógenos são administrados em camundongos, associados aos adjuvantes de resposta Th1. Após algumas semanas, os animais vacinados são experimentalmente infectados e, após alguns meses, células do baço (chamados "esplenócitos") dos animais vacinados e infectados são retiradas, cultivadas e estimuladas in vitro com os antígenos utilizados nas imunizações e com o extrato proteico dos parasitas, a fim de se verificar o perfil de resposta imune gerada por meio da dosagem de citocinas desenvolvida nesses animais. Nesse caso, IFN-γ e IL-12, como marcadores de resposta Th1 , e IL-4 e IL-10, como marcadores de resposta Th2, têm seus níveis determinados, sendo então realizada uma comparação entre tais níveis obtidos com as cargas parasitárias encontradas nos animais (Martins VT, et al. Antigenicity and protective efficacy of a Leishmania amastigote-specific protein, member of the super-oxygenase family, against visceral leishmaniasis. PLoS Negl Trop Dis. 7:e2148, 2013). Sendo assim, os animais ditos como protegidos são aqueles que apresentam uma baixa carga parasitária associada com níveis elevados de IFN-γ e IL-12, bem como baixos níveis de IL-4 e IL-10, secretados pelos esplenócitos cultivados. Desta forma, antígenos que são capazes de estimular o desenvolvimento de uma resposta tipo Th1 , primada pela produção de IFN- γ em esplenócitos de camundongos infectados com Leishmania, poderiam ser considerados candidatos vacinais promissores para utilização como vacinas contra as leishmanioses.

[015] Os antígenos atualmente testados como vacinas contra as leishmanioses são usualmente proteínas completas, as quais contêm regiões comuns às proteínas de outros patógenos, o que pode gerar reações cruzadas nos animais vacinados. Também, tais proteínas podem conter epitopos (peptídeos) que apresentam efeito benéfico, mas outros que apresentam efeito nocivo nos animais imunizados, comprometendo, dessa forma, a eficácia da vacina. O uso de pequenos antígenos, sob a forma de peptídeos, tende a permitir o desenvolvimento de uma vacina mais específica, de modo que o cão ou homem imunizado possam desenvolver uma resposta imune benéfica frente apenas a tal antígeno, específica a ele e à doença para a qual o mesmo foi selecionado. Tais antígenos apresentam também uma produção técnica mais simples, rápida, de maior rendimento e menor custo, em relação à produção de proteínas recombinantes; além de terem boa estabilidade após sua produção e, dessa forma, poderem ser disponibilizados mais facilmente para a população.

[016] A tecnologia de phage display é baseada na expressão de peptídeos, proteínas e/ou fragmentos de anticorpos associados a proteínas presentes na superfície externa de bacteriófagos recombinantes. A sequência de nucleotídeos codificadora dos peptídeos inseridos é geneticamente fundida a uma sequência codificadora de algumas proteínas do bacteriófago, originando um produto híbrido, que é então exposto na superfície externa das partículas virais (Smith G.P. Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface. Science.228: 1315-17, 1985).

[017] Bibliotecas de bacteriófagos expressando peptídeos exógenos têm sido usadas na identificação de diversos receptores celulares, facilitando a identificação de pequenas moléculas que se ligam com alta afinidade e mimetizam a interação com seus ligantes naturais; bem como na identificação de peptídeos que interagem com anticorpos, sem a necessidade do conhecimento prévio da região antigênica reconhecida pelo anticorpo. A seleção de moléculas de alta afinidade em relação a um determinado receptor-alvo, aderido a uma superfície sólida, é realizada por etapas consecutivas de seleção denominadas de "ciclos de bio-pannings". O número de ciclos de bio-pannings realizados em phage display determina o grau de enriquecimento dos fagos que se ligam ao receptor-alvo. Uma população de clones de fagos com elevada afinidade em relação a um dado receptor pode ser obtida com a realização de 3 a 5 ciclos de bio- pannings (Crameri R, Suter M. Display of biologically active proteins on the surface of filamentous phages: a cDNA cloning system for selection of functional gene products linked to the genetic information responsible for their production. Gene.137:69-75, 1993). Metodologicamente, os ciclos de bio-pannings podem ser adaptados de acordo com o grupo de pesquisa que domina tal tecnologia. Exemplificamente, em nosso caso, moléculas de Imunoglobulinas (IgGs) provenientes de soros de pacientes a serem investigados foram fundidas à superfície de microesferas (denominadas de "beads") e tal híbrido foi submetido a processos de captação (seleção) negativa e positiva em relação aos clones de fagos presentes na biblioteca recombinante utilizada.

[018] A tecnologia de phage display vem sendo utilizada em diversos trabalhos para a pesquisa de novos antígenos, para que na forma de clones de bacteriófagos expressando os peptídeos de interesse, ou na forma de peptídeos individuais produzidos sinteticamente; possam ser testados como vacinas contra diversas doenças (Manoutcharian K., et al. Phage-displayed T-cell epitope grafted into immunoglobulin heavy-chain complementarity-determining regions: an effective vaccine design tested in murine cysticercosis. Infect lmmun.67:4764-4770,1999; Manoutcharian K., et al. Recombinant bacteriophage-based multiepitope vaccine against Taenia solium pig cysticercosis. Vet Immunol Immunopathol.99:1 1-24, 2004;. Noya, O., et al. Immunodiagnosis of parasitic diseases with synthetic peptides. Curr. Prot. Peptide Sei.4:299-308, 2003). [019] O documento de patente PI09030891 , intitulado "Peptídeos recombinantes e motivos proteicos miméticos a antígenos de Leishmania e suas aplicações", trata da caracterização e utilização de peptídeos recombinantes, suas sequencias reversas e seus motivos proteicos no tratamento das leishmanioses. A tecnologia se difere do presente pedido devido à estratégia experimental utilizada ser diferente e não contemplar o uso de células humanas nem a dosagem de citocinas humanas. Também, os peptídeos expressos nos clones selecionados são diferentes dos descritos no presente pedido, uma vez que foram usados como peptídeos sintéticos, enquanto na presente tecnologia foram usados os próprios clones de bacteriófagos expressando os peptídeos de interesse, ou seja, como sendo uma composição imunogênica já pronta.

[020] O documento de patente BR102012033552, intitulado "Peptídeos poliméricos, processo de obtenção e uso para imunodiagnóstico de leishmaniose", trata da obtenção de peptídeos poliméricos através da técnica de phage display para imunodiagnóstico da leishmaniose canina e humana. A tecnologia se difere da contida no presente pedido por compreender tipos diferentes de sequencias de peptídeos e pelo método de obtenção dos mesmos ser diferente. Além do mais, os peptídeos poliméricos contidos no citado documento são utilizados para o diagnóstico, e não como composição vacinai contra as leishmanioses.

[021 ] O documento de patente BR1020130275425, intitulado "Composição vacinai contra leishmaniose visceral canina, peptídeos sintéticos e uso", trata de uma composição vacinai para prevenção e/ou tratamento de leishmaniose visceral canina compreendida por peptídeos expressos em bacteriófagos. A referida tecnologia se diferencia do presente pedido por compreender sequências diferentes e por se tratar apenas de doença canina, além da não contemplar o uso de células humanas nem a dosagem de citocinas humanas. [022] A presente tecnologia trata de uma composição vacinai compreendendo pelo menos um dos de nove peptídeos selecionados por meio de uma abordagem proteômica de phage display, como sendo capazes de induzir uma produção elevada de IFN-γ e baixos níveis de IL-4 tanto em esplenócitos de camundongos cronicamente infectados com L. amazonensis quanto em células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) de indivíduos sadios que foram estimulados com os clones individuais demonstrando, dessa forma, a capacidade de tais imunógenos em induzir o desenvolvimento de uma resposta imune relacionada à proteção contra a leishmaniose tegumentar (formas cutânea, cutâneo- difusa e mucosa da doença), no caso, de uma resposta imune Th1 , e em dois modelos distintos de mamíferos: camundongo e homem.

[023] No estado da técnica não foi encontrada tecnologia similar utilizando os peptídeos contidos no presente pedido.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA TECNOLOGIA

[024] A presente tecnologia trata de composições vacinais compreendendo pelo menos um dos nove peptídeos definidos pelas SEQ ID No 1 a 9, capazes de estimular o desenvolvimento de uma resposta imune celular do tipo T helper 1 (Th1 ) com elevada produção de Interferon-gamma (IFN-γ) e baixos níveis de lnterleucina-4 (IL-4), para prevenção da leishmaniose tegumentar em mamíferos.

[025] A, a presente tecnologia compreende nove peptídeos definidos pelas SEQ ID N°1 a 9 e/ou clones de bacteriófagos selecionados através de phage display que expressam tais peptídeos, e adjuvantes farmacêutica e farmacologicamente aceitáveis, e seu uso.no tratamento e/ou prevenção da leishmaniose tegumentar em mamíferos.

[026] Os adjuvantes farmacêutica e farmacologicamente aceitáveis, de acordo com a presente invenção podem ser selecionados dentre moléculas ou produtos que sejam capazes de estimular ao maior desenvolvimento de uma resposta imune celular do tipo Th1 , que seja primada pela produção das citocinas IFN-γ e IL-12.

[027] A composição vacinai proposta pode ser administrada pelas vias intradérmica, intramuscular, oral, nasal, intravenosa, subcutânea e/ou como dispositivo que possa ser injetado.

[028] A presente invenção pode ser mais bem compreendida através dos seguintes exemplos, não limitantes da tecnologia.

EXEMPLO 1. OBTENÇÃO DOS CLONES DE BACTERIÓFAGOS EXPRESSANDO AS PROTEÍNAS DE INTERESSE.

[029] Amostras de soros. As seguintes amostras de soro foram utilizadas para a realização dos ciclos de bio-pannings na técnica de phage display: soros de indivíduos sadios residentes em área endémica da doença (n=20), soros de pacientes com leishmaniose cutânea (LC, n=20) ou mucosa (LM, n=20) e soros de pacientes com Doença de Chagas (DC, n=20). O projeto foi aprovado pelo COEP/UFMG (protocolo CAAE-323431.14.9.0000.5149) e pools de soros foram preparados usando quantidades iguais de cada amostra, para sua utilização nos ciclos de bio-pannings.

[030] Purificação de anticorpos IgGs. A purificação das imunoglobulinas da classe IgG a partir dos pools de soros listados acima foi realizada por meio de seu acoplamento em microesferas magnéticas (beads magnéticos) conjugadas à proteína G (Dynabeads, Invitrogen). Para tal, 2x10 ⁹ partículas de microesferas foram lavadas por 3 vezes em tampão MES 0.1 M pH 5.0 e foi adicionado às mesmas: (a) 300 do pool de soros de pacientes com LM, para um volume final de 500 μί; (b) 300 do pool de soros de pacientes com LC, para um volume final de 500 μί; (c) 300 μί do pool de soros de pacientes com DC, para um volume final de 500 μί e (d) 300 μί do pool de soros de indivíduos sadios, para um volume final de 500 μί. A proporção de anticorpos para a quantidade das microesferas em todos os casos foi de 1 :1. Em seguida, foi realizada uma incubação por 40 minutos sob agitação constante e à temperatura ambiente (T.A). As microesferas adsorvidas com os anticorpos foram lavadas por 3 vezes em tampão MES 0.1 M pH 5.0, com a finalidade de retirar os anticorpos IgGs não-aderidos. Para a finalização da ligação covalente entre as microesferas e os anticorpos, o sistema "beads-anticorpo" foi lavado 2 vezes com 1 mL de tampão trietanolamina 0.2M pH 8.2 e ressuspendido em 1 mL de tampão de ligação covalente (20 mM de dimetilpimelinidato/HCI em tampão trietanolamina) por 30 minutos, sob agitação constante e à T.A. A neutralização da reação foi feita pela incubação do sistema com 1 mL de tampão Tris 50 mM pH 7.5, por 15 minutos e à T.A. Em seguida, as microesferas incorporadas foram lavadas por 3 vezes em tampão TBS-T 0.1 % de Tween 20 e bloqueadas com solução de bloqueio (5% de BSA em TBS-T 0.05% de Tween 20) por 1 hora e a 37°C, sendo então ressuspendidas em 200 de tampão TBS. Para certificação do acoplamento, 5 dos beads cobertos pelas IgGs foram incubados por 1 hora e a 37°C com o anticorpo anti-lgG de humano (diluição de 1 :5.000). Após a incubação, os beads foram lavados por 3 vezes com TBS-Tween 0.1 % e a reação foi revelada pela adição do substrato tetrametilbenzidina. A reação foi então interrompida pela adição de ácido sulfúrico 2 N e a leitura da absorbância foi efetuada a 450 nm, em leitor de microplacas (Titertek Multiskan Plus, Flow Laboratories, USA).

[031 ] Ciclos de bio-pannings: phage display. Para a realização dos ciclos de seleção negativa e positiva nos bio-pannings, 1x10 ¹² partículas virais de uma biblioteca recombinante contendo peptídeos fusionados em fagos filamentosos (biblioteca comercial Ph.D.-C7C obtida da empresa New England, BioLabs ^® , USA) foram utilizadas. As mesmas foram diluídas em 290 de TBS-Tween 0.1 % para a seleção dos ligantes nas microesferas incorporadas pelos anticorpos IgGs. No 1 o ciclo de bio-panning, iniciou-se com a seleção negativa. Para tal, a seleção foi realizada com 150 das microesferas de proteína G acopladas com as IgGs purificadas, dos diferentes grupos de soros. Para a seleção negativa, a biblioteca de bacteriófagos recombinantes foi incubada por 30 minutos e a T.A. com as microesferas acopladas com as IgGs de indivíduos sadios e, em seguida, as microesferas foram precipitadas por atração magnética ao suporte Dynal Biotech (no. 12020), sendo o sobrenadante, contendo os clones que não se aderiram às IgGs; transferido para novo tubo contendo as microesferas acopladas com as IgGs do grupo de pacientes com Doença de Chagas. Apenas os clones de fagos que não se aderiram a tais anticorpos foram recuperados. Para a seleção positiva, o sobrenadante coletado e recuperado durante a seleção negativa foi transferido para um novo tubo contendo as microesferas acopladas com as IgGs de pacientes com LM, sendo incubadas por 30 minutos e à T.A. As microesferas contendo o sistema beads-anticorpos precipitado nos tubos dos bio-panning dos anticorpos de pacientes com (LTM), mais os fagos de interesse aderidos a tais IgGs, foram lavadas por 10 vezes com TBS-Tween 20 0.1 % e eluídos em 500 μΙ_ de tampão glicina 0.2 M pH 2.0, sendo tal solução neutralizada pela adição de 75 μΙ_ de Tris-base pH 9.0. Os clones de fagos foram recuperados para realizar a segunda etapa do processo de seleção positiva. Estes clones recuperados e eluídos foram passados para um novo tubo contendo as microesferas acopladas com as IgGs de pacientes com LC. As microesferas contendo o sistema beads-anticorpos precipitado nos tubos dos bio-panning dos anticorpos de pacientes com LC, mais os fagos de interesse aderidos a tais IgGs, foram lavadas por 10 vezes com TBS- Tween 20 0.1 % e eluídos em 500 de tampão glicina 0.2 M pH 2.0, sendo tal solução neutralizada pela adição de 75 de Tris-base pH 9.0. O processo foi repetido mais duas vezes, totalizando 3 ciclos de bio seleção. Após tal procedimento, os clones foram titulados, individualizados. [032] Titulação e amplificação dos clones selecionados. Ao fim do 3 ^o ciclo de seleção positiva, os clones de fagos recuperados foram titulados. Para cada titulação, uma placa de cultura foi confeccionada. As placas foram incubadas à 37°C por 16 horas. Após, 96 colónias azuis foram individualizadas, coletadas manualmente para a extração do DNA e posterior sequenciamento. A reação de sequenciamento foi realizada utilizando o DNA extraído (500 ng do DNA de cada fago) dos clones com 5 pmol do Primer 96 glll (5'-OH CCC TCA TAG TTA GCG TAA CG-3'- Biolabs) e o pré-mix (DYEnamic ET Dye Terminator Cycle Kit-Amersham Biosciences). A dedução in silico das sequências de aminoácidos, para a identificação dos peptídeos exógenos, foi realizada pelo programa DNA2PR012, que é designado para a dedução de sequências de insertos das bibliotecas da New England Biolabs (Ph.D.-12™ ou Ph.D.-C7C™), como de outras bibliotecas de interesse que contenham as sequências inicial e final do vetor.

EXEMPLO 2. AVALIAÇÃO DA INFECÇÃO EM ANIMAIS

[033] Camundongos BALB/c fêmeas, de 8 semanas de idade, foram utilizados. Os animais foram adquiridos junto ao Biotério do ICB/UFMG e mantidos no Biotério do Departamento de Patologia Clinica do COLTEC, sob as condições apropriadas de manejo. O projeto foi também aprovado pelo Comité de Ética em Experimentação animal da UFMG (protocolo 043/201 1 ). A amostra IFLA/BR/1967/PH-8 de L. amazonensis foi utilizada. Os parasitas foram cultivados em meio Schneider's completo, o qual foi constituído pelo meio Scheneider's (SIGMA) acrescido com 20% de soro fetal bovino (SIGMA) inativado, 20 mM de L-glutamina, 50 μg/mL de gentamicina, 200 U/mL e 100 μg/mL de estreptomicina em pH 7,4 e a 24°C.

[034] A infecção nos animais (n=8) foi realizada com 1 x 10 ⁶ formas promastigotas em fase estacionaria de crescimento de L. amazonensis por via subcutânea e no coxim plantar esquerdo. Dez semanas após, a carga parasitária foi avaliada pela técnica da diluição limitante na pata infectada, baço, fígado e linfonodos drenantes da pata infectada dos animais infectados (Coelho EAF, et al. Immune responses induced by the Leishmania (Leishmania) donovani A2 antigen, but not by the LACK antigen, are protective against experimental Leishmania (Leishmania) amazonensis infection. Infect Immun.71 :3988-94, 2003). Para tal, os mesmos foram retirados após a eutanásia dos animais, pesados e macerados em meio de Schneider ^' s completo. O macerado foi submetido a uma diluição seriada em placas de 96 poços, quando as mesmas foram incubadas durante 7 dias e a 24°C, sendo que a maior diluição na qual parasitas viáveis foram visualizados utilizando um microscópio trinocular invertido.

[035] Após as dez semanas, os animais infectados foram eutanasiados para a coleta de tecidos e órgãos para a avaliação parasitológica. Na análise dos resultados, observou-se que tanto a pata quanto os órgãos dos animais apresentavam elevada carga de parasitas (representada pelo log de parasitas), conforme mostrado na Tabela 1. Dessa forma, constatou-se que os animais estavam cronicamente infectados por L. amazonensis. Os resultados correspondem à média ± desvio-padrão dos grupos, em dois experimentos realizados e que apresentaram resultados similares.

Tabela 1. Carga parasitária em camundongos BALB/c infectados com L. amazonensis.

[036] Dessa forma, comprovando-se a infecção sistémica pelo parasita, o baço dos animais foi coletado e utilizado para a cultura e estimulação dos esplenócitos com os fagos individuais selecionados após o 3 ^o ciclo de seleção positiva, e que tiveram suas sequências válidas determinadas; com vistas a permitir a identificação daqueles mais imunogênicos e com suas identidades relevadas. Para tal, camundongos foram eutanasiados e tiveram seu baço retirado, sendo o mesmo macerado em meio DMEM (Sigma) completo, o qual foi composto por 4.5 g/L de glicose, 20 μg/mL de sulfato de gentamicina, 100 U/mL de penicilina e 50 μg/mL de estreptomicina, pH 7.4. O macerado foi centrifugado a 1.200 x g por 10 minutos e o sobrenadante foi descartado. As hemácias foram lisadas com 3 ml_ de tampão de lise (17 mM Tris-HCI pH 7.4 e 144 mM cloreto de amónio) por 4 minutos, quando foi acrescentado o meio DMEM, para um volume final de 10 ml_. O material foi centrifugado a 1.200 x g por 10 minutos e, posteriormente, o sobrenadante foi descartado. O pellet foi ressuspendido em 1 ml_ de DMEM completo, o qual foi acrescentado com 20% de soro fetal bovino inativado.

[037] Os esplenócitos foram quantificados em câmara de Newbauer e 1 x 10 ⁶ células por ml_ foram plaqueadas em placas de 24 poços (Nunc), em meio DMEM completo. Os esplenócitos foram estimulados com os clones de fagos individuais (1 x 10 ¹⁰ fagos), com o fago selvagem (1 x 10 ¹⁰ ) como controle ou com o extrato proteico solúvel dos parasitas (SLA L. amazonensis, 50 μg), ou incubadas sem estímulo. A incubação ocorreu a 37°C em estufa com 5% de CO ₂ e por 48 horas. Após, o sobrenadante das culturas foi coletado e a dosagem das citocinas IFN-γ e IL-4 foi realizada por ELISA de captura utilizando kits comerciais (BD OptEIA TM set mouse IFN-y e IL-4, Pharmingen, San Diego, CA, USA).

[038] Dos 96 clones isolados após o 3 ^o ciclo de seleção positiva, 35 tiveram suas sequências identificadas e foram utilizados para a estimulação dos esplenócitos dos camundongos infectados com L. amazonensis e posterior dosagem das citocinas IFN-γ e IL-4. Os resultados são mostrados na tabela 2.

[039] Os valores apresentados são representativos de dois experimentos realizados de maneira independente e que apresentaram resultados similares. Um clone de fago selvagem, similar ao fago usado na técnica, mas que não expressa peptídeo exógeno e o SLA L. amazonensis foram utilizados como controles. Com os valores das concentrações das citocinas, a razão entre os níveis de IFN-γ e IL-4 foram calculados, a fim de selecionarmos apenas aqueles fagos que tenham sido capazes de induzir à produção dos maiores níveis de IFN-γ e dos menores níveis de IL-4.

Tabela 2. Dosagem das citocinas IFN-γ e IL-4 após estímulo in vitro dos esplenócitos de camundongos BALB/c infectados com L. amazonensis e cálculo da razão entre os valores.

[040] Na análise dos resultados, observou-se que houve uma grande variação na produção das citocinas entre os clones avaliados. Os controles (fago selvagem e SLA L. amazonensis) apresentaram razão entre nos níveis de IFN-γ e IL-4 de 0,5 e 0,4, respectivamente. Aqueles clones cuja produção de IFN-γ foi, pelo menos, 2,0 vezes maior que a produção de IL-4 foram selecionados, haja vista que, após o estímulo de esplenócitos de camundongos infectados com L. amazonensis, os mesmos induziram a uma maior produção de citocinas do tipo Th1 , em relação à produção das citocinas Th2. Desta forma, 25 clones (A4, A8, A9, A10, A12, B2, B3, B4, B7, B8, B10, C1 , C6, C8, C12, E3, E4, E5, E8, E9, G1 , G2, G4, H1 e H4) foram selecionados para serem usados na estimulação in vitro de PBMCs derivados de indivíduos sadios.

EXEMPLO 3. CULTURA DE PBMCS E DOSAGEM DE CITOCINAS.

[041 ] Após a verificação da imunogenicidade dos clones citados acima como capazes de induzir à produção elevada de IFN-γ e baixos níveis de IL-4 (no mínimo, cerca de 4 vezes maior que o fago selvagem e o SLA L. amazonensis) em esplenócitos de camundongos BALB/c cronicamente infectados com essa espécie de Leishmania, tais imunógenos foram avaliados quanto à capacidade de induzir a produção de níveis elevados de IFN-g e baixos níveis de IL-4 em PBMCs de indivíduos sadios. Para tal, células mononucleares do sangue periférico foram isoladas conforme descrito (Khamesipour A, et al. Phenotyping of circulating CD8 ⁺ T cell subsets in human cutaneous leishmaniasis. Microbes Infect. 9:702-1 1 , 2012). A cultura das células foi realizada conforme descrito (Roatt BM, et al. Performance of LBSap vaccine after intradermal challenge with L. infantum and saliva of Lu. longipalpis: immunogenicity and parasitological evaluation. PLoS One.7(1 1 ):e49780, 2012). Para o estímulo dos PBMCs in vitro, 1 x 10 ⁶ células por poço foram incubadas em meio DMEM com 1 x 10 ¹⁰ de cada fago avaliado, ou com o fago selvagem (mesma concentração) ou com SLA de L. amazonensis (50 Mg/mL). A incubação foi realizada a 37°C com 5% de C0 ₂ durante 5 dias. Como controle positivo, as células foram incubadas com acetato de miristato de forbol (PMA, 25 ng/mL) e ionomicina (1 Mg/mL) em meio DMEM. As culturas foram incubadas durante 48 horas a 37°C e em 5% de C0 ₂ . Após, a brefeldina A (Sigma) foi adicionada (concentração de 10 Mg/mL), durante um período de 4 horas. Após, 200 de EDTA (Sigma) foram adicionados a cada tubo de cultura (para uma concentração final de 2 mM), e as células foram lavadas com tampão FACS (PBS 1x com 0,5% de albumina de soro fetal bovino e 0, 1 % de azida sódica), ressuspensas e imunocoradas com mAb marcado com FITC anti- CD4 ou anti-CD8 (Caltag, Burlingame, CA, USA), durante 30 minutos no escuro e à temperatura ambiente. Após a coloração da membrana, os procedimentos de lise e fixação foram realizados e os PBMCs foram permeabilizadas com FACS Perm-tampão (tampão do FACS mais 0,5% de saponina), com incubação durante 30 minutos no escuro e à temperatura ambiente; na presença de 20 μΙ_ de anticorpo mAbs anti-citocina PE- marcados (IFN-γ e IL-4, Serotec ^® , EUA). Após a coloração das citocinas intracitoplasmáticas, PBMCs foram lavadas com tampão FACS e fixadas em solução de fixação (10 g/L de paraformaldeído, 10,2 g/L de cacodilato de sódio e 6,63 g/L de cloreto de sódio, pH 7,2), para armazenamento a 4°C antes da aquisição dos dados e análise por citometria. As medições foram realizadas em um instrumento FACScalibur© (Becton Dickson - BD, EUA) e analisadas com o software Cell-quest™ (Franklin Lakes, NJ, EUA), na base de 30.000 eventos por amostra. Os resultados são mostrados na tabela 3. A razão entre os níveis de IFN-γ e IL-4 foram calculados para cada clone utilizado e os dados são também apresentados.

Tabela 3. Dosagem das citocinas IFN-γ e IL-4 após o estímulo in vitro de PBMCs obtidos de indivíduos sadios e cálculo da razão entre os valores.

[042] Na análise dos resultados, observou-se que houve uma grande diferença na produção de IFN-γ e IL-4 entre os clones selecionados. Os controles (fago selvagem e SLA L. infantum) apresentaram razão entre nos níveis de IFN-γ e IL-4 de 0,7 e 0,5, respectivamente. Dessa forma, aqueles clones cuja produção de IFN-γ foi, pelo menos, 3 vezes maior que a produção de IL-4, colocam-se como imunogênicos nos dois modelos mamíferos avaliados (camundongo e homem) e, dessa forma, como candidatos para serem empregados como vacinas contra a LT, haja vista que, após o estímulo de esplenócitos de camundongos infectados com L. amazonensis e de PBMCs de indivíduos sadios, tais clones tenham sido capazes de induzir uma maior produção de IFN-γ e baixos níveis de IL-4. As sequências de aminoácidos dos clones selecionados são mostradas na tabela 4.

Tabela 4. Sequências de aminoácidos dos clones selecionados após avaliação de sua imunogenicidade em esplenócitos de camundongos infectados e PBMCs de indivíduos sadios

Clone Sequências de

aminoácidos

A4 Y L L C I S P

A8 G S R C Y P R

A9 D S A F R L K

A10 A S F L K N R B2 AETVESC

B10 R S M E I D R

E3 S F I N S H G

E5 G Y S A L V E

E8 DRRGYGL

[043] Dessa forma, tais clones imunogenos A4, A8, A9, A10, B2, B10, E3, E5 e E8 colocam-se como candidatos a vacina para serem testados na prevenção contra a LT em diferentes modelos de mamíferos.