Zielstrukturen von Vakzinen gegen Erreger infektiöser Erkrankungen und nicht infektiöser Erkrankungen, einschließlich Tumoren, können Proteine bzw. Peptide, Kohlenhydrate oder Lipide, sowie Kombinationen aus diesen sein. Bei Proteinen bzw. Peptiden kann die immunogene Determinante (Epitop) entweder durch die Sequenz der Aminosäuren eines Abschnitts des Moleküls (Sequenzepitop) oder durch eine bestimmte räumliche Anordnung von Bindungskräften, die nicht der linearen Anordnung der Aminosäuren entspricht, bestimmt sein (Konformationsepitop). Konformationsepitope sind häufiger als Sequenzepitope ; Mischformen kommen ebenfalls vor.

Konformationsepitope und Antigene, die keine oder nicht ausschließlich Proteine oder Peptide sind, sind nur schwer in eine wirksame und praktikable Vakzine umzusetzen. Konformationsepitope bilden sich in der Regel nur im nativen Protein und nicht in kürzeren Peptiden aus. Antigene, die keine oder nicht ausschließlich Proteine oder Peptide sind, wie beispielsweise Glykostrukturen oder Lipide, sind wenig immunogen. Ihre Synthese ist oft aufwendig. Ein besonders schwerwiegender Umstand ist, daß diese Antigene dem Immunsystem in vielen Fällen nicht richtig präsentiert werden. Eine effektive Antigenpräsentation ist aber unter anderem eine Voraussetzung für die Entstehung zytotoxischer T-Lymphozyten, d. h. für eine wirksame zelluläre Abwehr. Schließlich ist die sehr wirksame Form der DNA-Vakzinierung auf diese Antigene nicht anwendbar.

Bei der DNA-Vakzinierung (genomischen Vakzinierung) wird anstelle eines Protein-oder Peptidantigens die kodierende DNA-Sequenz als solche oder in einen Vektor verpackt intramuskulär oder intradermal als Vakzine injiziert. Auf diese Weise kann eine effektive humorale Antwort und zelluläre Antwort erreicht werden (Wolff, J. A. et al., Science 247 : 1465,1990 ; Ulmer, J. B. et al., Vaccine 12 : 1541,1994 ; Raz, E. et al., Cancer Res.

52 : 1954,1992). Ein besonders erfolgreiches Verfahren ist das sog."Prime-Boost-Protocol" (Keystone Symposia : DNA-Vaccines, 12.-17.4.99, Snowbird, Utah, USA, Konferenzband), bei dem die intradermale, intramuskuläre oder intrarektale Injektion einer DNA (Priming), von einer Boosterung mit dem korrespondierenden Antigen gefolgt wird. Für die Boosterung kann auch ein entsprechendes rekombinantes Virus-Vektorpartikel (z. B.

Fowlpox-, Adeno-oder Alphavirus-abgeleitete Konstrukte) erfolgreich eingesetzt werden.

Das"Prime-Boost"-Verfahren führt bekannterweise zu einer starken zellulären Immunantwort mit der Aktivierung spezifischer zytotoxischer T Zellen, die im Falle von Tumorvakzinen besonders erwünscht ist. Deutlich verstärkt werden kann die Immunantwort durch zusätzliche Gabe von geeigneten Cytokinen, ebenfalls in Form einer DNA, von immunstimulatorischen CpG-DNA-Motiven (nichtmethylierte Cytosin-Guanin- Dinukleotide) oder von geeigneten Adjuvantien (z. B. Aluminiumphosphaten).

Die Aufgabe der Erfindung besteht darin, die oben genannten Nachteile zu umgehen und eine Vakzine, insbesondere eine DNA-Vakzine, auch für die Fälle zu entwickeln, die einer entsprechenden Vakzinierung bisher nicht zugänglich sind.

Die Erfindung wird gemäß den Ansprüchen realisiert. Sie betrifft zum einen ein Verfahren, mit dem der Anwendungsbereich der Vakzinierung, insbesondere der DNA-Vakzinierung auf konformationsabhängige Antigene und Mischformen, diese fallen im Sinne der Erfindung ebenfalls unter den Begriff der Konformationsepitope, sowie Antigene, deren relevante Epitope keine oder nicht ausschließlich Proteine oder Peptide sind, z. B.

Kohlenhydrate, kombinierte Kohlenhydrat-Peptidepitope, Lipide, Glykolipide, erweitert wird und somit die oben aufgeführten Nachteile umgangen werden können. Dies geschieht erfindungsgemäß auf dem Umweg über ein das ursprüngliche Epitop (die Antigen- Determinante) immunologisch abbildendes, aber in seiner Aminosäuresequenz verschiedenes Peptid (Mimikry-Peptid). Dabei wird das Mimikry-Peptid vorzugsweise mit Hilfe der an sich bekannten Methoden des Phagen-Displays oder Ribosomen-Displays (Scott, J. K. und Smith, G. P. Science, 249 : 386,1990 ; Winter, G. et al, Annu Rev Immunol, 12 : 433,1994 ; Hanes, J. et al, Proc Natl Acad Sci USA, 95 : 14130,1998) gewonnen, und zwar entweder als kürzeres Peptid aus Peptid-Genbanken oder in Form eines antiidiotypischen Antikörperfragments aus entsprechenden Genbanken. Als dritte, allerdings aufwendigere Methode kommt die Gewinnung antiidiotypischer Antikörper mittels der Hybridomtechnik in Frage. Das gemeinsame Ziel der drei genannten methodischen Varianten ist, das ursprüngliche Konformationsepitop oder das Epitop, das kein oder nicht ausschließlich ein Protein oder Peptid ist, in ein immunologisch entsprechendes Sequenzepitop"umzuschreiben", das eine bessere immunologische Präsentation ermöglicht und für eine DNA-Vakzinierung geeignet ist. Erfindungsgemäß können die Vakzinen, insbesondere die DNA-Vakzinen nicht nur in Form des beschriebenen Beispiels (Prime-Boost-Protokoll), sondern, auch in vergleichbaren Varianten und in Form der DNA-Vakzine allein oder der Mimikry-Strukturen allein in entsprechend geeigneten Formulierungen eingesetzt werden.

Außerdem betrifft die Erfindung Vakzinen gegen konformationsabhängige Antigene gemäß Anspruch 1. In dem erfindungsgemäßen Verfahren werden dabei die relevanten Konformationsepitope mit Hilfe der Phagen-Display-oder Ribosomen-Display-Methode in ein immunologisch entsprechendes und das Konformationsepitop imitierendes Sequenzepitop"umgeschrieben". Als primäre Reagenzien dienen dabei Moleküle, die das Zielantigen in seiner gewünschten Konformation spezifisch binden, z. B. Antikörper, Antikörperfragmente oder Rezeptoren. Aus den verschiedenen Genbibliotheken werden so Antikörperfragmente (antiidiotypische Antikörperfragmente, Ab2) oder lineare oder zirkuläre Peptide gewonnen, die die primären Reagenzien spezifisch binden und das Antigen immunologisch imitieren. Alternativ werden antiidiotypische Antikörper mit Hilfe der Hybridomtechnik gewonnen und gegebenenfalls Fragmente daraus isoliert. Diese Mimikry-Peptide werden in eine DNA umgeschrieben und als DNA-Vakzine eingesetzt.

Ein Verfahren ist dabei das sog."Prime-Boost-Protocol", bei dem die intradermale, intramuskuläre oder intrarektale Injektion einer DNA (Priming), in Form einer Plasmid- DNA, linearen DNA oder eines Plasmid-Replikon-Vektors, von einer Boosterung mit dem korrespondierenden Antigen, alleine, in Form einer chemischen Kopplung an Proteine, in Form von Bakteriophagen als Fusionsproteine mit Phagenhüllproteinen auf deren Oberfäche, in Form eines Fusionsproteins auf der Oberfläche anderer Viren oder attenuierter biologischer Träger oder in Form mit dem Peptid beladener dendritischer Zellen, gefolgt wird. In diesem Fall werden sowohl die DNA als auch das exprimierte Mimikry-Peptid benötigt, was bei Anwendung der Phagen-Display-bzw. Ribosomen- Display-Technik problemlos möglich ist. Alternativ kann für die Boosterung ein entsprechendes rekombinantes Virus-Vektorpartikel (z. B. Fowlpox-, Adeno-oder Alphavirus-abgeleitete Konstrukte) erfolgreich eingesetzt werden. Die Immunantwort kann deutlich durch die zusätzliche Gabe von geeigneten Cytokinen, ebenfalls in Form einer DNA, von immunstimulatorischen CpG-DNA-Motiven (nichtmethylierte Cytosin-Guanin- Dinukleotide) oder von geeigneten Adjuvantien (z. B. Aluminiumphosphaten) verstärkt werden.

Die Erfindung betrifft neben Vakzinen gegen konformationsabhängige Antigene auch Vakzinen gegen Antigene, die keine oder nicht ausschließlich Proteine oder Peptide sind, gemäß Anspruch 3. Ein Zielantigentyp der Gruppe Antigene die keine oder nicht ausschließlich Proteine oder Peptide sind, sind Glykostrukturen, weitere, immunogene Strukturen sind kombinierte Kohlenhydrat-Proteinepitope, Lipide, Glykolipide oder synthetische Strukturen.

Aus DE 196 27 352 A1 ist ein Verfahren bekannt, mit dem ein monoklonaler antiidiotypischer Antikörper mit Hilfe der Hybridomtechnik gewonnen wird, der reine Kohlenhydratstrukturen immunologisch imitiert. Erfindungsgemäß wird ausgehend von diesem antiidiotypischen Antikörper wird eine Vakzine, bevorzugt eine DNA-Vakzine dieses Antikörpers oder eines geeigneten Fragmentes davon für die Vakzinierung verwendet. So erweitert die vorliegende Erfindung dieses Verfahren aus DE196 27 352 A1 in mehreren Punkten. Es können antiidiotypische Antikörperfragmente direkt aus Antikörper-Genbibliotheken mittels der Phagen-Display-Technik oder der Ribosomen- Display-Technik gewonnen werden. Mit Hilfe dieses Verfahrens können direkt auch humane Antikörperfragmente gewonnen werden. Darüber hinaus können auch kombinierte Kohlenhydrat-Peptidepitope angewendet werden. Hinzu kommt weiter ein Verfahren, mit dem kurze lineare oder zirkuläre Peptide, die das Antigen immunologisch imitieren (sogenannte Mimikry-Peptide), aus Peptid-Genbibliotheken, ebenfalls mittels der Phagen- Display-Technik oder der Ribosomen-Display-Technik, gewonnen werden können. Dabei dienen nicht nur spezifische idiotypische Antikörper (Abl), sondern auch andere Substanzen, die die Glykostruktur spezifisch erkennen, wie z. B. Lektine oder Rezeptoren, als primäre Reagenzien zur Selektion dieser imitierenden Strukturen. Das Verfahren schließt weiterhin die Verwendung dieser gewonnenen Strukturen bevorzugt als DNA- Vakzine ein, allein oder in Kombination mit den das Antigen immunologisch imitierenden Antikörpern, Antikörperfragmenten oder Peptiden in einer geeigneten Formulierung (siehe oben und Ansprüche), beispielsweise in der Formulierung des Prime-Boost-Protokolls. Außerdem können gemäß der Erfindung die imitierenden Proteinstrukturen auch alleine zur Vakzinierung verwendet werden.

Die Erfindung betrifft auch Vakzine, im vollen Umfang wie für konformationsabhängige Antigene beschrieben, gegen die Antigene Glykopeptide, Glykolipide, Lipide, synthetische Strukturen oder weitere Antigene, die keine oder lediglich teilweise Proteine oder Peptide sind, wobei die relevanten Epitope verbesserte immunogene Strukturen aufweisen, Verfahren ihrer Herstellung und ihre Verwendung.

Der Ansatz einer Immuntherapie bei Tumorerkrankungen geht davon aus, daß es möglich ist, die natürliche Immunantwort zu verstärken oder zu aktivieren. Die Rationale einer Vakzinierung besteht in der Bekämpfung der Residualerkrankung (Metastasenprophylaxe) nach einer konventionellen Therapie (z. B. chirurgischer Entfernung der Hauptmenge der Tumorzellen). Mimikry-Peptide imitieren definitionsgemäß immunologisch das ursprüngliche Antigen bzw. Epitop. Sie tun dies weitestgehend, aber nicht hundertprozentig. Dies ist für den Anwendungsfall im Rahmen einer Vakzine (im besonderen bei einer Tumorvakzine) eher positiv in dem Sinne zu sehen, daß spezifisch inhibierende Prozesse, z. B. Toleranzphänomene, umgangen werden.

Voraussetzung für die Entwicklung definierter Tumorvakzinen ist nicht nur das Vorhandensein tumorspezifischer Antigene, sondern auch ihre Kenntnis. Auf diesem Gebiet sind in den letzten drei Jahrzehnten große Fortschritte erzielt worden, nicht zuletzt durch die Entwicklung monoklonaler Antikörper.

Ein weitverbreitetes Karzinomantigen ist das epitheliale Muzin, MUC1, dessen immundominantes Epitop in vielfacher Wiederholung auf dem extrazellulären Teil des Moleküls vorkommt. Dieses Epitop bildet im nativen Zustand einen Typ-I-ß-Turn aus, an synthetischen Peptiden allerdings nur unter bestimmten Bedingungen, z. B., wenn das Threonin der immundominanten Region mit GalNAcal-0-Thr oder Galßl-3GalNAcal-0- Thr glykosyliert ist (Karsten, U., et al., Cancer Res. 58 : 2541-2549,1998). Dieses Epitop wird vom Immunsystem in der Regel als typisches Konformationsepitop wahrgenommen, vgl.

Beispiel 1. Erfindungsgemäß wird dieses Konformationsepitop mittels der Phagen-Display- Technik durch immunologisch identische (oder nahezu identische) Sequenzepitope imitiert, die in Form einer DNA in einem DNA-Vakzinierungsvektor Bestandteil einer Tumorvakzine sind (Beispiel 1).

Gegenstand der Erfindung sind deshalb auch humane antiidiotypische Antikörperfragmente gegen das MUCl-Konformationsepitop sowie alle DNA Sequenzen, die diese Fragmente kodieren, und Proteinsequenzen oder DNA-o. Proteinteilsequenzen, die von diesen abgeleitet werden können und die die entsprechenden Eigenschaften aufweisen.

Bevorzugt handelt es sich um die folgenden humanen antiidiotypischen Antikörperfragmente gegen das MUCl-Konformationsepitop mit den folgenden Sequenzen Nr. 1 bis 31.

Fragmente, die die gewünschte DNA der scFv und der Peptide enthalten, wurden mit Hilfe der PCR vermehrt und anschließend sequenziert.

(Die Bezifferung, z. B. Q33, entspricht einem bestimmten isolierten Klon ; die Sequenzen der verschiedenen scFv sind gegeneinander ausgerichtet (Alignment) ; die komplette Sequenz eines Klones ist für jeden Klon durchgehend über die verschiedenen Blöcke zu lesen) Nr. l : Q33 EVQLLESGEGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIQRHGTWTGY Nr. 2 : Q1.3 EVQLLESGEGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSINYNGDATSY Nr.3:EVQLLESGEGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSTINAAG AQTGY EVQLLESGEGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSRIGQKGNKTTY Nr.4:Q4 EVQLLESGEGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSRITQSGTYTQY Nr.5:R2 EVQLLESGEGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSINAFGQSTRY Nr.6:Q15 Nr.7: R10 EVQLLESGEGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSGINASGTLTRY EVQLLESGEGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSISDTGSATTY Nr.8:Q5 EVQLLESGEGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSNISDAGCATYY Nr.9:N6 EVQLLESGEGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSTIHSAGQETIY Nr.10:Q32 Nr.11:EVQLLESGEGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSAMSWVRQAPGKGLEWVSYITTNG STTSY EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSYITTNGSTTSY Nr.12:Q9.3 EVQLLESGEGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSITTSGGDTAY Nr.13:Q24 Nr.14:EVQLLESGEGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSYINAS GASTSY EVQLLESGEGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSTITSSGQQTFY Nr.15:Q25 EVQLLESGEGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIYSQGPVTWY Nr.16:N2 EVQLLESGEGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSGISTSGSYTTY Nr.17:Q3.3 EVQLLESGEGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSTINGLGTPTAY Nr.18:Q21 Nr.19:EVQLLESGEGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSTIQTS GRDTTY EVQLLESGEGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAITQYGGDTGY Nr.20:R3 EVQLLESGEGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSTISNLGQPTHY Nr.21:Q2 Nr.22:Q30 EVQLLESGEGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSTISNLGQLTHY EVQLLESGEGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSTIDPMGQSTNY Nr.23:Q16 EVQLLESGEGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAITNTGQWTTY Nr.24:R5 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SGGGGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLI Q5 SGGGGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLI N6 SGGGGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLI Q32 SGGGGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLI R6 SGGGGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLI Q9.3 SGGGGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLI Q24 SGGGGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLI Q3.1 SGGGGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLI Q25 SGGGGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLI N2 SGGGGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLI Q3.3 SGGGGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLI Q21 SGGGGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLI N4 SGGGGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLI R3 SGGGGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLI Q2 SGGGGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLI Q30 SGGGGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLI Q16 SGGGGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLI R5 SGGGGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLI Q26 SGGGGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLI Q34 SGGGGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLI Q6.1 SGGGGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLI Q1.2 SGGGGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLI R4 SGGGGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGEAPKLLI N1 SGGGGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLI R7 SGGGGSGGGGSTDIQMTQSPPSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLI Q33 YSASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQNSTIPRTFGQGTKVEIKR <BR> Q1.3 YSASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTSNSPATFGQGTKVEIKR Q12 YSASALQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTNTDPATFGQGTKVEIKR Q4 YRASDLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQPWDPPRMFGQGTKVEIKR R2 YHASFLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQPWEPPRTFGQGTKVEIKR Q15 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Eigenschaften aufweisen.

Insbesondere handelt es sich um die Aminosäurensequenzen von Mimikry-Peptiden mit den folgenden Sequenzen Nr. 32 bis 47.

(Die Bezifferung, z. B. S1, entspricht einem bestimmten isolierten Klon ; die Sequenzen der verschiedenen Peptide sind gegeneinander ausgerichtet) Nr. 32 : S1 CEYYDVPMARC Nr. 33 : S12 CDYPSRLIDLC Nr. 34 : Rol CGLACERPCGWVC Nr. 35 : Ro5 CLGGCERPCMYSC Nr. 36 : Rol3 CRGRCGEWCSRPC Nr. 37 : Ro6 CRGRCDQRCSRPC Nr. 38 : Rol2 CPARCGVPCAMGC Nr. 39 : Vll CIPHRHDGC Nr. 40 : V4 CQPHRYDKSLPC Nr. 41 : V10 CTTRLLNEDGSC Nr. 42 : U7 LHGPLWD Nr. 43 : U10 LHGPLGM Nr. 44 : U6 LHGPLWE Nr. 45 : U7a LHGPLWDGAAGAETVES Nr. 46 : U10a LHGPLGMGPLGPKLLKV Nr. 47 : U6a LHGPLWEGPLGPKLLKV Antigene, die keine oder nicht ausschließlich Proteine oder Peptide sind (z. B.

Kohlenhydrat-Antigene) werden, ähnlich wie Konformationsepitope von Proteinen, vom Immunsystem als dreidimensionale Muster von Ladungen und anderen molekularen Wechselwirkungen wahrgenommen und unterliegen wie diese Einschränkungen bei der Generierung einer zellulären Immunantwort. Auch in diesen Fällen kann die erfindungsgemäße Selektion von Mimikry-Peptiden mittels der Phagen-Display-Technik zu einem"Umschreiben"des Antigens in eine Peptid-Sequenz führen, die wiederum die Anwendung der DNA-Vakzinierungstechnik ermöglicht, vgl. Beispiel 2.

Gegenstand der Erfindung sind auch Protein-Sequenzen antiidiotypischer Antikörperfragmente gegen TF sowie Aminosäurensequenzen von Mimikry-Peptiden gegen das TF-Kohlenhydratepitop sowie alle DNA Sequenzen, die diese Aminosäuresequenzen kodieren und DNA sowie Protein-bzw. Peptid-sowie-teilsequenzen, die von diesen abgeleitet werden und die die gleichen Eigenschaften aufweisen.

Insbesondere handelt es sich um die folgenden Protein-Sequenzen antiidiotypischer Antikörperfragmente gegen TF mit den Sequenzen Nr. 48 bis 71.

Nr. 48->H16 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSMIDGSGSQTYY ADSVKGRFTISRDN <BR> <BR> <BR> <BR> SKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSDLDFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSTDI QMTQSPSSLSASVG<BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> DRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTIS SLQPEDFATYYCQQ SYSTPNTFGQGTKVEIKR Nr. 49->P3 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSISYSGATTNY ADSVKGRFTISRDN SKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSDASFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSTDI QMTQSPSSLSASVG DRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTIS SLQPEDFATYYCQQ DYGGPTTFGQGTKVEIKR Nr. 50->P8 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSTISATGGSTYY ADSVKGRFTISRDN SKNTLYLQMNSLRAVDTAVYYCAKSSDGFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSTDI QMTQSPSSLSASVG <BR> DRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYSASNLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTIS SLQPEDFATYYCQQ ASSAPATFGQGTKVEIKR Nr. 51->H6 <BR> EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSTISAQGLTTTY ADSVKGRFTISRDN SKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGRSSFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSTDI QMTQSPSSLSASVG DRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYGASGLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTIS SLQPEDFATYYCQQ RKLLPWTFGQGTKVEIKR Nr. 52->H1 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSITELGRSTQY ADSVKGRFTISRDN <BR> SKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPWPHFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSTDI QMTQSPSSLSASVG DRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYGASGLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTIS SLQPEDFATYYCQQ AARRPTTFGQGTKVEIKR Nr. 53->H13 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSKISELGRNTSY ADSVKGRFTISRDN SKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDITAFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSTDI QMTQSPSSLSASVG DRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYGASGLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTIS SLQPEDFATYYCQQ SMRMPPTFGQGTKVEIKR Nr. 54->K3 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAIQWSGESTWY ADSVKGRFTISRDN SKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSTSSFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSTDI QMTQSPSSLSASVG DRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASLLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTIS SLQPEDFATYYCQQ RRHTPTTFGQGTKVEIKR Nr. 55->K3 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAIQWSGESTWY ADSVKGRFTISRDN SKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSTSSFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSTDI QMTQSPSSLSASVG DRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASLLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTIS SLQPEDFATYYCQQ RRHTPTTFGQGTKVEIKR Nr. 56->K4 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSGIQFSGQGTRY ADSVKGRFTISRDN SKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKTLSTFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSTDI QITQSPSSLSASVG DRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYRASHLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTIS SLQPEDFATYYCQQ GYRQPTTFGQ GTKVEIKR Nr. 57->K2 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIRPLGSATQY ADSVKGRFTISRDN SKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSNMAFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSTDI QMTQSPSSLSASVG DRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYGASGLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTIS SLQPEDFATYYCQQ TTRPPTTFGQGTKVEIKR Nr. 58->J6 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSDISEQGARTMY ADSVKGRFTISRDN SKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSTPAFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSTDI QMTQSPSSLSASVG DRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYGASGLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTIS SLQPEDFATYYCQQ MNNKPNTFGQGTKVEIKR Nr. 59->E3 <BR> EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSQITGLGSQTRY ADSVKGRFTISRDN SKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGETAFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGDIQMTQSPSSLS ASVGDRVTITCRAS <BR> QSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYGASGLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATY YCQQRQQRPSTFGQ GTKVEIKR Nr. 60->K1 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSNITQMGMTTAY ADSVKGRFTISRDN <BR> SKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGEQTFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSTDI QMTQSPSSLSASVG DRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYGASGLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTIS SLQPEDFATYYCQQ RRTHPQTFGQGTKVEIKR Nr. 61->E5 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISQTGTRTKY ADSVKGRFTISRDN <BR> SKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGSASFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSTDI QMTQSPSSLSASVG DRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYGASGLQSGVPTRFSGSGSGTDFTLTIS SLQPEDFATYYCQQ VTTHPNTFGQGTKVEIKR Nr. 62->K2+ EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYY ADSVKGRFTISRDN SKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARQVKSWTRWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGSALSSE LTQDPAVSVALGQT VRITCRGDSLRSYYASWYQQKPGQAPVLVIYGKNNRPSGIPDRFSGSSSGNTASLTITGA QAEDEADYYCNSRD SSGNHYVFGGGTKLTVLG Nr. 63->K4+ EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYY ADSVKGRFTISRDN SKNTLYLQMDSLRAEDTAVYYCARGRRKQDKSTRWGQGTLVTVSSGEGGSGGGGSGGSAL SSELTQDPAVSVAL <BR> GQTVRITCQGSLRSYYASWYQQKPGQAPVLVIYGKNNRPSGIPDRFSGSSSGNTASLTIT GAQAEDEADYYCNS RDSSGSSSVFGGGTKLTVLG Nr. 64->K4- <BR> EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYY ADSVKGRFTISRDN SKNTLYLQMDSLRAEDTAVYYCARGRRKQDKSTRWGQGTLVTVSGSGGGGSGGSALSSEL TQDPAVSVALGQTV RITCQGDSLRSYYASWYQQKPGQAPVLVIYGKNNRPSGIPDRFSGSSSGNTASLTITGAQ AEDEADYYCNSRDS SGSSSVFGGGTKLTVLG Nr. 65->K9+ EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYEMNWVRQAPGKGLEWVSYISSSGSTIYY ADSVKGRFTISRDN AKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDPFHPWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGSALSSELI QDPAVSVALGQTVR ITCQGDSLRSYYASWYQQKPGQAPVLVIYGKNNRPSGIPDRFSGSSSGNTASLTITGAQA EDEADYYCNSRDSS GTVFGGGTKLTVLG Nr. 66->K1+ <BR> QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCWSGGSISSSNWWSWVRQPPGKGLEWIGEIYHSGSPNYS PSLKSRATISVDK SKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARQDMTQQTSWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGSALQS VLTQPPSASGTPGQ RVTISCSGSSSNIGSNYVYWYQQLPGTAPKLLIYRNNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAI SGLRSEDEADYYCA AWDDSLRNLVFGEGTKLTVLG Nr. 67->K3+ <BR> QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCVVSGGSISSSNWWSWVRQPPGKGLEWIGEIYHSGSPNY SPSLKSRATISVDK SKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARQDMTQQTSWGQGTLVTVSSGEGGSGEGGSGGSALQS VLTQPPSASGTPGQ RVTISCSGSSSNIGSNYVYWYQQLPGTAPKLLIYRNNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAI SGLRSEDEADYYCA AWDDSLRNLVFGEGTKLTVL Nr. 68->ZA4 QVQLQESGPGLVKPSGTLSLTCAVSGGSISSSNWWSWVRQP PGKGLEWIGEIYHSGSTNYNPSLKSRVTISVDKSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDDK GGWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGSALQSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSN TVNWYQQLPGTAPKLLIYSNNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLQSEDEADYYCAAW DDSLRSLVFGGGTKLTVLG Nr. 69->ZA36 QVQLQESGPGLVKPSGTLSLTCAVSGGSISSSNWWSWVRQPPGKGLEWIGEIYH SGSTNYNPSLKSRVTISVDKSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARPSSIWGQGTLVTVSSG GGGSGGGGSGGSALQSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNYVYWYQQLPGTAPK LLIYRNNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCAAWDDSLRSLVFGGGTK LTVLG Nr. 70->ZA14 QVQLQESGPGLVKPSGTLSLTCAVSGGSISSSNWWSWVRQPPGKGLEWIGEIYHS GSTNYNPSLKSRVTISVXKSKNQFSLKLSSVTAXDTAVYYCARPSHHAGTHTWGQGTLVT VSSGGGGSGGGGSGGSALQSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNTVNWYQQLPG TAPKLLIYSNNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLQSEDEADYYCAAWDDSLRALVFG GGTKLTVLG Nr. 71->Z9 QVQLQESGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEINHSGS TNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARKGLNFGPWGQGTLVTVSSG GGGSGGGGSGGSALQSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNVGSNTVNWYQQLPGTAPK LLIYSNNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLQSEDEADYYCAAWDDSLRSYVFGGGTK LTVLG Desweiteren handelt es sich um die Aminosäurensequenzen von Mimikry-Peptiden gegen das TF-Kohlenhydratepitop mit den folgenden Sequenzen Nr. 72 bis 96.

(Die Bezifferung, z. B. S1, entspricht einem bestimmten isolierten Klon) Nr. 72 : T1 CLREGHFASFC Nr. 73 : T14 CGMLTPAWIKC Nr. 74 : T4 CETFSNLAFLC Nr. 75 : T7 CEGPEIPAFVC Nr. 76 : T3 CESMVEPAWVC Nr. 77 : T15 CTNDIMPPWVC Nr. 78 : T2 CDGLLLPIWAC Nr. 79 : Tll CAGEFVPVWAC Nr. 80 : T16 CDLGLKPAWLC Nr. 81 : X3 CGPMCSGSCVPQC Nr. 82 : X9 CDAGCNFFCPWRC Nr. 83 : X2 CGPMCSGSCXPQC Nr. 84 : Y8 VWWWQWS Nr. 85 : Y1 MWRPFWL Nr. 86 : Y4 PPWVXHL Nr. 87 : Y9 LIPQWIV Nr. 88 : W4 CTPADMSGC Nr. 89 : W3 CTPADMSGC Nr. 90 : W16 CPSVWMLDLGPC Nr. 91 : W15 CHGGLTPLC Nr. 92 : W8 CGPMMLWHW Nr. 93 : W5 CTRHIHWGNAHW Nr. 94 : W14 CTPADMSGW Nr. 95 : A1 CFRGGPWWSLC Nr. 96 : A2 CAVRTWVISEC Die Erfindung wird durch Ausführungsbeispiele näher erläutert, soll jedoch auf diese Beispiele nicht beschränkt werden.

Ausführungsbeispiele Beispiel 1 Herstellung der Hybridomzellinie A76-A/C7 und von Antikörpern Balb/c-Mäuse wurden mit einer Suspension lebender menschlicher Mammakarzinomzellen der Zellinie T-47D (Keydar, I., et al., Eur J Cancer, 15 : 659,1979) nach Behandlung mit Neuraminidase (V. cholerae) ohne Adjuvans i. p. immunisiert. Als Fusionszellinie diente X63-Ag8.653 (Kearney, J. F., et al., J Immunol 123 : 1548,1979). Die Hybridomtechnik selbst wurde nach Standardmethoden (z. B. Peters, H. H., et al.,"Monoklonale Antikörper, Herstellung und Charakterisierung", Berlin 1985 ; Friemel, H.,"Immunologische Arbeitsmethoden", 4. Aufl., Jena 1991) durchgeführt. Die Spezifitätsanalyse der von den Hydridomzellinien produzierten monoklonalen Antikörper (mAk) basierte auf Enzymimmunoassays mit natürlichen Glykoproteinen und synthetischen Peptiden und Glykopeptiden, Immunfluoreszenzanalysen mit diversen Zellinien sowie immunhistochemischen Untersuchungen an Gewebsschnitten. Für den mAk A76-A/C7 wurde das epitheliale Muzin, MUC1, als spezifisches Antigen eindeutig bestimmt. Als Isotyp wurde IgGl, k, mit einem kleinen Anteil von IgM der gleichen Spezifität mit Hilfe eines kommerziellen Isotyping Kit (Pharmingen, San Diego, USA) ermittelt. Ein Epitop- Mapping im Rahmen des ISOBM TD-4 International Workshop on Monoclonal Antibodies against MUC1 (Tumor Biol. 19, Suppl. 1,1998) definierte das Epitop als APDTRPAP. Weitere Untersuchungen unter Benutzung synthetischer, glykosylierter und nicht glykosylierter Peptide zeigten, daß das Epitop des mAk A76-A/C7 in starkem Maße durch seine Konformation bestimmt wird : -Der Antikörper bindet nur geringfügig an eine einzelne Einheit (ein Repeat), obgleich diese die Epitopsequenz enthält.

-Die Bindung an nicht glykosylierte Peptide ist von der Länge des Peptids, genau genommen von der Zahl der aneinandergereihten Repeats, abhängig (Abb. la). Aus der Literatur ist bekannt, daß sich die native Konformation des PDTRP-Motivs erst bei einer Peptidlänge von mehr als 3 Repeats ausbildet (Fontenot, J. D., et al., J Biomol Struct Dyn 13 : 245,1995).

-Die Bindung des mAk A76-A/C7 an eine einzelne MUC 1-Einheit (1 Repeat) wird stark erhöht, wenn diese im Bereich des Epitops am Thr mit GalNAc-oder Galßl- 3GalNAc-glykosyliert ist (Abb. lb ; siehe auch Karsten, U., et al., Cancer Res, 58 : 2541,1998).

Der Antikörper wurde mittels Ammoniumsulfatfällung gefolgt von einer Affinitätschromatographie an ProteinA-Sepharose gereinigt.

Gewinnung von humanen rekombinanten Antikörperfragmenten, die das konformationsabhangige Epitop des MUCl imitieren, aus Antikorper-Genbibliotheken mit Hilfe der Phagen-Display-Technik Es wurden zwei verschiedene synthetische Antikörper-Genbibliothek verwendet, die humane single-chain Antikörperfragmente (scFv) darstellen. Die eine Antikörper- Genbibliothek (Griffin 1 Library ; http ://www. mrc-cpe. cam. ac. uk/~phage/) besteht aus mehr als 109 Phagen mit jeweils verschiedenen Kombinationen der variablen Regionen der schweren und leichten Ketten humaner Antikörper mit zum Teil randomisierten hypervariablen Regionen, welche mit einem Peptidstück (Linker) verbunden sind und kovalent an ein Phagenhüllprotein (pIII) gebunden sind. Sie leitet sich aus einer anderen Antikörper-Genbibliothek ab (Griffiths, A. et al., 1994, EMBO J., 13 : 3245-3260). Die zweite, kleinere Genbibliothek besteht aus scFv mit dem gleichen Framework (single- framework library), die durch Bindung an Protein L und Protein A auf aktive Faltung der Antikörperfragmente vorselektioniert wurde (I. Tomlinson, 9th anniverary conference :"Antibody engineering", IBC-Conferences, SanDiego 1998 ; I. Tomlinson, 10th anniverary conference :"Antibody engineering", IBC-Conferences, SanDiego 1999 ; Speaker-Abstract). Die erste Bibliothek stammt aus dem Labor Dr. G. Winter und die zweite aus dem Labor Dr. I. Tomlinson (jeweils MRC Centre for Protein Engineering, Cambridge, UK). Die spezifischen Phagen wurden in 2-3 Runden selektioniert (Phagen-Panning) unter Verwendung der proteolytischen Selektionsmethode mit dem Helferphagen KM13 (Kristensen, P. und Winter, G., Folding & Design, 3 : 321,1998). Als Antigen diente der gereinigte monoklonale Antikörpre A76-A/C7 (35 gg/ml in 4 ml), das in einem Teströhrchen (Immunotube, Nunc, Wiesbaden) über Nacht bei 4°C in PBS immobilisiert wurde. Alternativ wurde A76-A/C7 mit den Phagen inkubiert ; die an die Antikörper gebundenen Phagen wurden durch Magnetbeads mit immobilisierten anti-IgG Antikörpern (Deutsche Dynal, Hamburg) gewonnen. Die in den Selektionsrunden spezifisch gebundenen Phagen (3 h bei RT) wurden nach stringenten Waschschritten (bis zu 20 mal PBS/0.1% Tween20 und darauffolgend 20 mal PBS) durch das in der PDTR mit GaINAc glykosylierte Tandem-Repeat (100 pg/ml ; Biosynthan, Berlin-Buch) eluiert und anschließend mit Trypsin (proteolytische Selektionsmethode) behandelt. Zwischen den Selektionsrunden wurden die eluierten Phagen in den Bakterien mit Helferphagen vermehrt und erneut selektioniert. <BR> <BR> <P>Gewinnung von Mimikry-Peptiden, die das konformationsabhdngige Epitop des MUCI imitieren, aus Peptid-Genbibliotheken mit Hilfe der Phagen-Display-Technik Analog dem Beispiel zur Generierung von antiidiotypischen Antikörpern wurde in mehreren Selektionsrunden aus einer Peptid-Genbibliothek (Genbibliothek erhalten von Dr. H. Gollasch ; Oligino, L., et al., J Biol Chem 272 : 29046,1997), die 107 verschiedene kurze Peptide an das Phagenhüllprotein pIII gekoppelt besitzt, spezifisch bindende Peptide gewonnen. Die exprimierten Peptide sind randomisierte Nonapeptide, die von zwei Cysteinen flankiert (CX9C) und damit zirkularisiert werden, wodurch die Stabilität und die Affinität erhöht werden. Die Selektion und Testung erfolgte wie bei der Generierung der antiidiotypischen Antikörper beschrieben. Analog dazu wurden mit weiteren Peptidbibliotheken zusätzliche lineare und zirkuläre Mimikry-Peptide gewonnen. Dabei handelt es sich um Peptid-Bibliotheken, die analog der oben beschriebenen Peptid- Bibliothek hergestellt wurden. Bei den exprimierten Peptiden handelt es sich um lineare Peptide mit 7 Aminosäuren und um zirkuläre Peptide mit 7 randomisierten Aminosäuren, flankiert von zwei Cysteinen (CX7C), um zirkuläre Peptide mit 10 randomisierten Aminosäuren, flankiert von zwei Cysteinen (CXlOC), und um zirkuläre Peptide mit insgesamt 9 randomisierten Aminosäuren, mit zwei internen und zwei flankierenden Cysteinen (CX3CX3CX3C).

Spezifitatstests der Mimikry-Peptide und der antiidiotypischen Antikorperfragmente Die selektionierten Peptide und Antikörperfragmente wurden in ELISA-Tests auf ihre Bindung an den mAk A76-A/C7 sowie in Form einer Negativ-Kontrolle an andere IgG und IgM-mAk getestet. Außerdem wurden sie in ELISA-Tests auf ihre Bindung an eine Reihe von gut charakterisierten MUC l-spezifischen Antikörpern geprüft, die sich in ihrer Feinspezifität unterscheiden. Für die ELISA-Tests wurde die an Phagen gekoppelte Form der Peptide und Antikörperfragmente verwendet. Die antiidiotypischen svFv und die Mimikry-Peptide lassen sich dabei in Gruppen unterteilen, die : -ausschließlich an A76-A/C7 binden -an A76-A/C7 und an andere MUCI-spezifische Antikörper binden, die entweder nur an das Konformationsepitop (in der PDTR-Region glykosyliertes MUCl-Tandem- Repeat) binden (Typ A) oder deren Bindung durch die PDTR-Glykosylierung des MUC1 Tandem Repeats (Konformationsinduktion) stark erhöht wird (Typ B) -an MUCl-spezifische Antikörper, die neben Typ A und B auch MUCl-spezifische Antikörper binden, die in gleichem Maße glykosylierte und unglykosylierte MUC1- Tandem-Repeats binden (Typ D) -eine starke Bindung an MUCl-spezifische Antikörper haben, die sich bezüglich der Glykosylierung der PDTR-Region des MUC 1-Repeats zu A76-A/C7 umgekehrt verhalten und das glykosylierte MUCl-Peptid nicht oder wesentlich geringer als das nichtglykosylierte MUCl-Peptid binden (Typ C). Dabei können diese Mimikry- Peptide oder antiidiotypischen scFv auch an andere Typen der MUCI-spezifischen Antikörper binden.

Die Mimikry-Peptide und antiidiotypischen Antikörperfragmente wurden außerdem in ELISA-Inhibitionstests daraufhin untersucht, ob sie, in Form der synthetisierten Peptide oder gereinigten scFv (allein oder an Phagen gekoppelt) die Bindung des A76-A/C7 an das glykosylierte MUCl-Peptid (im Epitop PDTR mit GaINAc glykosyliertes Tandem-Repeat) und nichtglykosylierte Oligomere des 20-mer Tandem-Repeats spezifisch und konzentrationsabhängig hemmen. Diese Versuche wurden mit Streptavidin-beschichteten Mikrotestplatten (BioTeZ, Berlin-Buch) und biotinylierten MUCl-Peptiden (Biosynthan, Berlin-Buch ; Abb. lc) sowie mit normalen ELISA-Testplatten, auf denen die MUC1- Peptide durch Antrocknen immobilisiert wurden, durchgeführt.

Inzuchtmäuse des Stammes Balb/c wurden intraperitoneal mit Mimikry-Peptiden und antiidiotypischen Antikörperfragmenten in Form der synthetisierten Peptide oder gereinigten scFv alleine, jeweils gekoppelt an das Protein KLH oder gekoppelt an Bakteriophagen in PBS, gemischt mit inkomplettem Freundschem Adjuvans, immunisiert.

Dabei wurden Mischungen von antiidiotypischen scFv-Phagen beziehungsweise Mimikry- Peptid-Phagen aus jeweils den verschiedenen Gruppen (s. o.) verwendet. Drei Wochen später wurde mit dem gleichen Ansatz jedoch ohne Adjuvans geboostert. Die Boosterung wurde nach 3 Wochen wiederholt und 10 Tage später den Mäusen Blut entnommen. Das Serum wurde in ELISA-Tests auf Antikörper getestet, die spezifisch das konformationsabhängige Epitop des MUC 1 erkennen (Versuchsaufbau wie oben). Die Mischungen der antiidiotypischen scFv sowie der Mimikry-Peptide erzeugen eine starke Reaktion gegen das konformationsabhängige Epitop des MUC 1.

Konstruktion der DNA-Vakzine und Testung an der Maus Die antiidiotypischen scFv wurden direktional in einen DNA-Vakzinierungsvektor kloniert.

Dabei wurden die scFv durch SfiI und NotI aus dem Phagemid Vektor ausgeschnitten und direktional in verschiedene DNA-Vakzinierungsvektoren kloniert die zuvor mit den gleichen Enzymen gespalten wurden. Ein geeigneter Vektor hierbei ist der Vektor pVAC2 (I. Harmer et al., Keystone Symposium"DNA-Vaccines", Snowbird, USA, 1999 ; Poster und Posterabstract), der, nach erfolgter Einfügung des scFv in den DNA-Vakzinierungsvektor, ein Fusionsprotein aus dem antiidiotypischen scFv mit einem Tetanus-Toxoid kodiert. Das Tetanustoxoid hat dabei die Eigenschaft eines Adjuvans und verstärkt die Immunreaktion gegen den fusionierten Proteinanteil C. King et al., 1998, Nat. Medicine 4 : 1281-86).

Die Mimikry-Peptide wurden ebenfalls in verschiedene DNA-Vakzinevektoren kloniert. Die Klonierung erfolgte nach der an sich bekannten Methode der PCR-Klonierung, bei der mit Hilfe synthetischer Primer die Sequenzen die für die Mimikry-Peptide kodieren, in die DNA-Vakzinierungsvektoren eingefügt wurden. Dabei wurden ebenfalls DNA- Vakzinierungsvektoren auf der Basis des pVAC2 hergestellt, die jeweils für ein Fusionsprotein des Mimikry-Peptides mit dem Tetanustoxoid kodieren.

Die DNA der Vakzinierungsvektoren wurde nach an sich bekannten Methoden vermehrt, gereinigt und anschließend Mäusen injiziert. Dabei wurden für die Immunisierung Mischungen von DNA-Vakzinierungsvektoren, die antiidiotypische scFv beziehungsweise Mimikry-Peptide als Fusionsprotein mit dem Tetanustoxoid kodieren, die jeweils aus den verschiedenen Gruppen mit unterschiedlichen Bindungsmustern für MUC l-spezifische Antikörper (s. o.) stammen, verwendet. Als Dosis wurden 50 ug bzw. 200 gg an Gesamt- DNA verwendet und intra muskulär appliziert. Vier Wochen später wurde mit dem gleichen Ansatz geboostert und die Boosterung nach 4 Wochen wiederholt und 10 Tage später den Mäusen Blut entnommen. Das Serum wurde in ELISA-Tests auf Antikörper getestet, die spezifisch das konformationsabhängige Epitop des MUC1 erkennen (Versuchsaufbau wie oben).

Die Immuniserung mit den Mischungen der DNA-Vakzinevektoren, ergab sowohl bei den antiidiotypischen scFv als auch bei den Mimikry-Peptiden die kodierenden DNA-Vektoren eine starke humorale Immunreaktion gegen das konformationsabhängige Epitop des MUC1 sowie eine starke Reaktion gegen das Tetanustoxoid.

Vakzine im Tumor-Challenge Modell Im Maus Tumor-Challenge Modell wurden verschiedene Maustumorzellinien (3T3 und P815) verwendet, die mit der cDNA der Transmembran-Form des humanen MUC1 stabil transfiziert. Die MUC1-positiven Mauszellinien exprimieren das Konformationsepitop des MUC1, das durch Immunbindungsstudien mit dem A76-A/C7 getestet wurde. Für die Studien wurden mehrere Mäusestämme verwendet (Balb/c, DBA/2 und C57BL/6). Nach der Vakzinierung der Mäuse nach dem unten beschriebenen Prime-Boost-Protokoll wurden die Mäuse mit 106 bis 107 Tumorzellen in 200 ul PBS subkutan in der Nähe des Peritoneum injiziiert und das Tumorwachstum (Tumorgröße in mm) über 20-30 Tage gemessen.

Vakzinierungsschema Prime-Boost : Es wurden für die Immuniserungen (Priming) eine Kombination aus DNA- Vakzinierungsvektoren (kodierend für scFv-Tetanustoxoid-bzw. Mimikry-Peptid- Tetanustoxoid-Fusionsprotein) mit jeweils zwei Kandidaten aus den 4 unterschiedlichen Gruppen der antiidiotypischen-scFv bzw. Mimikry-Peptide verwendet. Für die Boosterung wurden die gleichen Kombinationen der antiidiotypischen scFv bzw. Mimikry-Peptide jedoch in ihrer Proteinform in inkomplettem Freundschem Adjuvans verwendet. Hierfür wurden die scFv nach an sich bekannten Verfahren durch eine Nickel-Chelat- Chromatographie gereinigt und die Mimikry-Peptide nach an sich bekannten Vefahren chemisch an KLH gekoppelt. Für die Immunisierung wurden 50-200 llg gesamt-DNA intra muskulär appliziert und für die scFv und Mimikry-Peptide 10-200 pg intraperitoneal. Die zeitlichen Abstände waren 3 Wochen und die Boosterungen erfolgten 2-3 mal.

Als Kontrolle wurden die DNA-Vakzinierungsvektoren für ein scFv mit einer Spezifität gegen ein irrelevantes bakterielles Protein bzw. für ein irrelevantes Peptid (SSGSSSSGS), beziehungsweise deren gereinigte scFv oder der Peptid-KLH Komplex verwendet. Für die verschiedenen Versuchsansätze wurden jeweils 5-10 Tiere untersucht Die Versuche zeigen, dass eine Vakzinierung nach dem Prime-Boost-Protokoll das Wachstum von injiziierten MUCI-positiven Maus-Tumorzellinien verhindert oder auf eine minimale Größe reduziert (0-20 mm2 nach 20 Tagen). Die gleiche Vakzinierung erreicht bei darauffolgender Injektion mit den gleichen Tumorzellen ohne transfiziertes MUC1 eine Tumorgröße von durchschnittlich über 200 mm' (nach 20 Tagen). Auch die Injektion von MUC1-positiven Maus-Tumorzellinien in Mäuse ohne vorherige Vakzinierung ergibt eine starkes Tumorwachstum (>200 mm2 nach 20 Tagen). Eine Immunisierung und Boosterung mit den Proteinen der antiidiotypischen scFv bzw. den Mimikry-Peptiden an KLH gekoppelt ohne DNA-Vakzinierungsvektoren erbgibt eine Immunantwort gegen die MUC1- Tumorzellen, die Tumorprotektion ist jedoch um ein vielfaches geringer als bei dem Prime- Boost Protokoll mit den DNA-Vakzinierungsvektoren.

Die Ergebnisse zeigen, dass eine Vakzinierung mit DNA-Vakzinierungsvektoren, die für antiidiotypische scFv bzw Mimikry-Peptide kodieren, eine ausgezeichnete Tumorprotektion ergibt. Diese Reaktion ist MUC 1 spezifisch. Sie ist um ein Vielfaches besser oder überhaupt möglich im Vergleich zu Vakzinierungsstudien mit den Proteinen der antiidiotypischen scFv bzw. Mimikry-Peptiden ohne vorangegangene Immunisierung mit den entsprechenden DNA-Vakzinierungsvektoren.

Damit ist gezeigt, dass die erfindungsgemäße Vakzine gegen konformationsabhängige Antigene durch DNA-Vakzinierungsvektoren von Mimikry-Strukturen eine erfolgreiche Form der Bekämpfung von Tumoren ist, die diese konformationsabhängigen Antigene tragen.

Beispiel 2 Herstellung der Hybridomzellinien A78-G/A7 und von Antikörpern Balb/c-Mäuse wurden im Fall des A78-G/A7 (siehe auch Karsten, U., et al., Hybridoma 14 : 37,1995), mit 100 jj. g Asialoglykophorin (Sigma, Deisenhofen) in PBS, gemischt mit Freundschem Adjuvans, intraperitoneal immunisiert. Nach 24 h wurde 100 « tg/kg Körpergewicht Cyclophosphamid in PBS i. p. verabreicht. Die Boosterung erfolgte nach 2 Wochen mit 100 pg Asialoglykophorin. Als Fusionszellinie diente jeweils X63-Ag8.653 (Kearney, J. F., et al., J Immunol 123 : 1548,1979). Die Hybridomtechnik wurde nach Standardmethoden (z. B. Peters, H. H., et al.,"Monoklonale Antikörper, Herstellung und Charakterisierung", Berlin 1985 ; Friemel, H.,"Immunologische Arbeitsmethoden", 4. Aufl., Jena 1991) durchgeführt. Die Spezifitätsanalyse der von den Hydridomzellinien produzierten monoklonalen Antikörper basierte auf Enzymimmunoassays mit natürlichen Glykoproteinen, synthetischen Peptiden und Glykopeptiden, Glykolipiden und Neoglykolipiden und synthetischen Polyacrylamid-Kohlenhydrat-Konjugaten, Absorptionsanalysen an synthetischen Kohlenhydratkonjugaten (Synsorb, Chembiomed, Edmonton, Canada), Immunfluoreszenzanalysen mit diversen Zellinien sowie immunhistochemischen Untersuchungen an Gewebsschnitten. Für den A78-G/A7 wurde das tumorassoziierte Kohlenhydratepitop Thomsen-Friedenreich (TF), als spezifisches Antigen eindeutig bestimmt : -A78-G/A7 bindet ausschließlich an das Disaccharid TF in der a-anomeren Konfiguration (TFa ; GalD1-3GalNAcal-O-Ser/Thr) auf natürlichen und synthetischen Strukturen, wie es natürlich nur auf Glykoproteinen in Form einer direkten O-glykosidischen Bindung an Serine oder Threonine vorkommt. TFß, das endständig an Glykanketten von Glykolipiden vorkommen kann, sowie andere Kohlenhydratstrukturen, Peptid-oder Lipidanteile werden dagegen nicht gebunden.

-A78-G/A7 bindet hochspezifisch an verschiedene Karzinomzellinien in Immunfluoreszenzuntersuchungen und an verschiedene Karzinome in histochemischen Untersuchungen. (Cao, Y., et al., Histochem Cell Biol 106 : 197,1996 ; Cao, Y., et al, Cancer 76 : 1700,1995 ; Cao, Y., et al., Virchows Arch 431 : 159,1997 ; Karsten, U., et al., Hybridoma 14 : 37,1995) -Als Isotyp wurde für A78-G/A7 der Isotyp IgM, k, mit Hilfe eines kommerziellen Isotyping Kit (Pharmingen, San Diego, USA) ermittelt.

A78-G/A7 wurde aus Zellkulturüberständen mittels einer Ammoniumsulfatfällung, gefolgt von einer Affinitätschromatographie an einer ProteinG-Affinitätsmatrix zur Abreinigung von ungewünschten IgG Antikörpern aus dem Kälberserum und schließlich mit einer Affinitätschromatographie mittels einer Ziege-anti-Maus-Ig-Affinitätsmatrix (Perzellulose, BioTeZ, Berlin-Buch) gereinigt (Dr. G. Butschak). <BR> <BR> <P>Herstellung von humanen rekombinanten Antikörperfragmenten gegen das Thomsen- Friedenreich Antigen aus Antikorper-Genbibliotheken mit Hilfe der Phagen-Display- Technik Es wurden zwei verschiedene synthetische Antikörper-Genbibliotheken verwendet, die humane single-chain Antikörperfragmente (scFv) darstellen. Die eine Antikörper- Genbibliothek besteht aus mehr als 10'° Phagen mit jeweils verschiedenen Kombinationen der variablen Regionen der schweren und leichten Ketten humaner Antikörper mit zum Teil randomisierten hypervariablen Regionen, welche mit einem Peptidstück (Linker) verbunden sind und kovalent an ein Phagenhiillprotein (pIII) gebunden sind. Sie leitet sich aus einer anderen Antikörper-Genbibliothek ab (Griffiths, A. et al., 1994, EMBO J., 13 : 3245-3260). Die zweite, kleinere Genbibliothek besteht aus scFv, die auf aktive Faltung der Antikörperfragmente vorselektioniert wurden. Die erste Bibliothek stammt aus dem Labor Dr. G. Winter und die zweite aus dem Labor Dr. I. Tomlinson (jeweils MRC Centre for Protein Engineering, Cambridge, UK). Die spezifischen Phagen wurden in 2-3 Runden selektioniert (Phagen-Panning) unter Verwendung der proteolytischen Selektionsmethode mit dem Helferphagen KM13 (Kristensen, P. und Winter, G., Folding & Design, 3 : 321, 1998). Als Antigen diente der gereinigte A78-G/A7 (35 pLg/ml in 4 ml), das in einem Teströhrchen (Immunotube, Nunc, Wiesbaden) über Nacht bei 4°C in PBS immobilisiert wurde. Alternativ wurde der gereinigte Antikörper mit den Phagen inkubiert ; die an den Antikörper gebundenen Phagen durch Magnetbeads mit immobilisierten anti-IgM Antikörpern (Deutsche Dynal, Hamburg) gewonnen. Die in den Selektionsrunden spezifisch gebundenen Phagen (3 h bei RT) wurden nach stringenten Waschschritten (bis zu 20 mal PBS/0.1% Tween20 und darauffolgend 20 mal PBS) durch das das TFa-tragende Glykoprotein Asialoglykophorin (100-165 llg/ml) spezifisch eluiert und teilweise anschließend mit Trypsin (proteolytische Selektionsmethode) behandelt. Zwischen den Selektionsrunden wurden die eluierten Phagen in den Bakterien mit Helferphagen vermehrt und erneut selektioniert. Es wurden 2 bis 3 Selektionsrunden durchgeführt.

Identifizierung von Peptiden mit Hilfe einer Peptid-Genbibliothek, die spezifisch das Thomsen-Friedenreich Antigen imitieren Analog dem Beispiel zur Generierung von antiidiotypischen Antikörpern wurde in mehreren Selektionsrunden aus einer Peptid-Genbibliothek (Oligino, L., et al., J Biol Chem 272 : 29046,1997), die 10'verschiedene kurze Peptide an das Phagenhüllprotein pIII gekoppelt besitzt, spezifisch bindende Peptide gewonnen (in Zusammenarbeit mit Dr. H. Gollasch, Robert-Rössle-Klinik, Berlin-Buch). Die exprimierten Peptide sind randomisierte Nonapeptide, die von zwei Cysteinen flankiert und damit zirkularisiert werden, wodurch die Stabilität und die Affinität erhöht wird. Die Selektion und Testung erfolgte wie in der Generierung der antiidiotypischen Antikörper beschrieben.

Spezifitatstests der Mimikry-Peptide und antiidiotypischen Antikorperfragmenten Die selektionierten Peptide und Antikörperfragmente wurden in ELISA-Tests auf ihre Bindung an TF-spezifische Antikörper und an das Pflanzenlektin PNA (Peanut Agglutinin, Arachis hypogaea Lektin ; Sigma), das auch, wenn auch nicht ausschließlich, das Thomsen- Friedenreich-Antigen bindet, sowie zur Kontrolle an andere IgM und IgG-Antikörper getestet. Hierfür wurden die an Phagen gekoppelte Form der Peptide und Antikörperfragmente verwendet, die zuvor durch eine in 96-Well Platten durchgeführte Polyethylenglykol-Fällung gereinigt wurden. Die potentiellen Mimikry-Peptide und antiidiotypischen Antikörperfragmente wurden in ELISA-Inhibitionstests daraufhin untersucht, ob sie die Bindung des A78-G/A7 und/oder andere TF-erkennender Antikörper und Lektine an das Disaccharid TFa spezifisch hemmen. Dabei wurde das das TFa tragende Glykoprotein Asialoglykophorin auf ELISA-Platten durch Antrocknen immobilisiert, und die Bindung der monoklonalen Antikörper und Lektine durch die Mimikry-Peptide oder antiidiotypischen Antikörperfragmente in Form der synthetisierten Peptide oder gereinigten scFv alleine oder gekoppelt an Phagen konzentrationsabhängig inhibiert (Abb. 2).

Inzuchtmäuse des Stammes Balb/c und des Stammes NMRI wurden intraperitoneal mit Mimikry-Peptiden und antiidiotypischen Antikörperfragmenten in Form der synthetisierten Peptide oder gereinigten scFv alleine, jeweils gekoppelt an das Protein KLH oder gekoppelt an Bakteriophagen in PBS, gemischt mit komplettem Freundschem Adjuvans, immunisiert. Drei Wochen später wurde mit dem gleichen Ansatz jedoch ohne Adjuvans geboostert. Die Boosterung wurde nach 3 Wochen wiederholt und 10 Tage später den Mäusen Blut entnommen. Das Serum wurde in ELISA-Tests auf Antikörperbindungen gegen das Thomsen-Friedenreich-Antigen untersucht.

Vakzinierung mit TF-imitierenden Peptiden im Maus-Tumormodell Zellkultur : Die Maus-Colon-Karzinom-Zellinie C-26 wurde im Medium RPMI 1640 mit Zusatz von 10 % fetalem Kälberserum gehalten.

Tumormodell : In Mäuse des Stammes Balb/c wurden 10 Zellen der syngenen Colon- Karzinom-Zellinie C-26 s. c. transplantiert, und zwar in zwei Varianten : a) unbehandelt und b) mit Neuraminidase aus V. cholerae (Serva, Heidelberg) vorbehandelt (TF-positiv). In wöchentlichen Intervallen wurde die Tumorgröße extern ermittelt. Nach 3 Wochen wurden die Tiere getötet und jeweils die Leber herauspräpariert, um die Zahl der an der Oberfläche der Leber sichtbaren Metastasen zu ermitteln.

Vakzinierung : Die Vakzinierung der Mäuse wurde 6 Wochen vor der Tumortransplantation begonnen. Die Phagenpräparation bzw. die gereinigten scFv (sowie entsprechende Kontrollen) wurden mit inkomplettem Freund-Adjuvans 1 : 1 emulgiert und i. p. injiziert.

Vier Wochen später wurde geboostert (ohne Adjuvans). Nach weiteren 2 Wochen wurde die Tumortransplantation (Tumor-Challenge) mit unbehandelten und Neuraminidase- behandelten C-26-Zellen vorgenommen.

Ergebnis : Die vorliegenden Ergebnisse mit drei der genannten antiidiotypischen scFv zeigten, daß die Angangsrate der Tumoren bei den Neuraminidase-behandelten C-26-Zellen durch die Vakzinierung signifikant erniedrigt werden kann (auf 3-16 % der Kontrolle ; Kontrolle : 100 % Angangsrate). Darüber hinaus entsprach die Zahl der Lebermetastasen bei den vakzinierten Tieren annähernd der der Tiere, die mit unbehandelten (TF-negativen) C- 26-Zellen transplantiert worden waren (rund 2 pro Leber), während die nichtvakzinierten Kontrolltiere mit TF-positiven C-26-Zellen 5-9 Metastasen pro Leber aufwiesen.

Legenden zu den Abbildungen : Abb. 1 c : Inhibition der A76-A/C7 Bindung an das MUCI-Glykopeptid (Biotin-Ahx- APPAHGVTSAPD-Thr (a-D-GalNAc)-RPAPGSTAPPAHGVTSA) durch scFv-Phagen. Das MUCl-Glykopeptid wurde an die Streptavidin-ELISA-Platte immobilisiert (Sng/Well) und anschließend mit 30% FKS in RPMI blockiert. Kulturüberstand des A76-A/C7 (1 : 80 verdünnt) wurde mit den durch eine Polyethylenglykolfallung gereinigten scFv-Phagen in den angegebenen Konzentrationen (Volumenprozentanteil von abgeglichenen Phagenlösungen in PBS) für eine Stunde vorinkubiert und anschließend für 2 Stunden auf die MUCl-Glykopeptidplatte gegeben. Der Nachweis erfolgte über einen anti-Maus-POD- Antikörper (Dako). Die scFv-Phagen Q6, Q7 und Q8 sind Beispiele für antiidiotypische scFv, während Q4 und Q10 Beispiele für Kontrol-scFv sind, die den A78-A/C7 zwar binden, jedoch keine antiidiotypischen scFv sind.

Abb. 2 : Inhibition der A78-G/A7 Bindung an Asialoglykophorin durch scFv-Phagen. Das Asialoglykophorin (A-GP) wurde an die ELISA-Platte durch Antrocknen immobilsiert (25ng/Well) und anschließend mit 30% FKS in RPMI blockiert. Kulturüberstand des A78- G/A7 (1 : 20 verdünnt) wurde mit den durch eine Polyethylenglykolfallung gereinigten scFv- Phagen in den angegebenen Konzentrationen (Volumenprozentanteil von abgeglichenen Phagenlösungen in PBS) für eine Stunde vorinkubiert und anschließend für 2 Stunden auf die A-GP Platte gegeben. Der Nachweis erfolgte über einen anti-Maus-POD-Antikörper (Dako). Die scFv-Phagen P9, P13, P16, P3 und K3 sind Beispiele für antiidiotypische scFv, während P8 und Q1 Beispiele für Kontrol-scFv sind, von denen P8 zwar den A78-G/A7 bindet, jedoch kein antiidiotypischer scFv ist und Q1 ein Phage ist, der nicht den A78-G/A7 bindet.