Variabler Probenhalter für die korrelative Mikroskopie

Die Erfindung betrifft einen variablen Probenhalter für die korrelative Mikroskopie, bei der die korrelative Mikroskopie für weitere Techniken und Geräte geöffnet werden soll, um zwischen optischer Mikroskopie, Elektronen-, Atomkraft- und Röntgenmikroskopie einschließlich verschie dener Synchrotron- und X-FEL-Strahlenlinien (Free-electron-laser-Strahllinie) und -techniken korrelieren zu können.

Die korrelative Mikroskopie ist bisher vor allem als Korrelation von Licht- und Elektronenmikro skopie bekannt, bei der sie die Vorteile beider Systeme vereint. So werden hochauflösende und strukturelle Information eines Elektronenmikroskops mit den Aufnahmen eines Lichtmikroskops durch Überlagerung der Aufnahmen und Anpassung von Transparenzen verschmolzen. Ein satzbereiche für die korrelative Mikroskopie sind unter anderem die additive Fertigung, die He feforschung, die strukturelle und chemische Analyse von Nanopartikeln und -materialien, sowie Proteinstudien.

Im Stand der Technik verwendet man für die korrelative Mikroskopie einerseits aufwendige Mik roskope, die verschiedene Mikroskopieverfahren durchführen können. Solche Kombinations mikroskope sind insbesondere deshalb aufwendig, weil das optische Mikroskop vollständig in eine Vakuumkammer, die für die T eilchenstrahlmikroskopie benötigt wird, eingebaut werden muss. Zudem muss ein Probetisch vorgesehen werden, der die Probe zwischen beiden Mikro skopen im Vakuum verschiebt. Die Folge sind ein relativ großes Vakuumvolumen und ein hoher Aufwand bei der Fertigung des optischen Mikroskops, das dann in vakuumtauglicher Bauweise erstellt werden muss. Ein weiterer Nachteil ist, dass eine optische Abbildung mit Immersion im Vakuum nicht realisiert werden kann. Verzichtet man bei der Teilchenstrahlmikroskopie auf die Anordnung des Objektes im Vakuum leidet die Abbildungsqualität, da die Elektronen an einer Membran sowie an Luft gestreut werden.

Eine Alternative zur Verwendung solcher Kombinationsmikroskope ist der sequentielle Einsatz von Einzelgeräten. Hierzu werden im Stand der Technik verschiedene Haltersysteme verwen det. Für die optische Mikroskopie werden beispielsweise Objektträger aus Glas mit über die Probe gelegten Deckgläsern verwendet, die einige Zentimeter groß sind. In der Elektronikmikro skopie sind Netze üblich, die einige Millimeter groß sind, oder metallische Probenteller. Um nun ein zu mikroskopierendes Objekt, beispielsweise eine biologische Probe, von der optischen Mik roskopie zur Teilchenstrahlenmikroskopie zu verbringen, muss die Probe von einem Haltersys tem auf das andere transferiert werden. Dies ist zeitaufwendig und bringt die Gefahr der Probenbeschädigung oder Zerstörung mit sich. Außerdem ist die Ortsreferenzierung in den bei den Mikroskopieverfahren schwierig, da die Position eines beispielsweise mit optischer Mikro skopie untersuchten Bereiches für die T eilchenstrahlenmikroskopie erst wieder gefunden werden muss. Auch die Verwendung von Markern im Objekt beziehungsweise auf einer biologi schen Probe hilft hier nicht weiter, da sich beim T ransfer in der Regel auch die Probenstruktur, zum Beispiel durch Verspannungen, ändert.

Ein zeitaufwendiges und mühsames Wiederfinden der bereits zuvor mit dem anderen Verfahren mikroskopierten Objektstelle ist kaum zu vermeiden. Auch die aus der T ransmissionselektro- nenmikroskopie bekannten Finder Grids, also runde Probennetzchen, deren Netzgitterquadran ten markiert beziehungsweise nummeriert sind, lösen dieses Problem nicht, weil es praktisch unmöglich ist, ein Finder Grid beim Wechsel zwischen zwei Mikroskopieplattformen exakt orien tiert zu übertragen. Die positionssichere Wedererkennung eines bestimmten Probenbereiches auf dem Finder Grid mit einer zweiten Mikroskopieplattform ist somit kaum möglich.

Aus der DE 102009020663 ist ein Objektträger-System bekannt, mit dem Objekte nacheinan der mit optischer Mikroskopie und Teilchenstrahlenmikroskopie mikroskopiert werden können. Das System besteht aus einem Halter mit einem Fenster, der sowohl zum Einlegen in ein Teil chenstrahlmikroskop als auch in ein optisches Mikroskop ausgebildet ist und einem über das Fenster des Halters leg baren Objektträgerelement, wobei das Objektträgerelement über dem Fenster fixierbar ist. Zur positionsgenauen Detektion eines bestimmten Probenbereiches beim sequentiellen Einsatz unterschiedlicher Mikroskopieplattformen werden Justiermarken vorge schlagen, die es erlauben, einen bestimmten Objektbereich in eine gewünschte Lage im jeweili gen Mikroskop zu bringen, indem durch die Justiermarken eine Kalibrierung des Objektbereiches bezogen auf die Lage zum Halter bewirkt wird. In der genannten Schrift sind die Justiermarken als Strukturen auf einem intransparenten Halter angeordnet. Der Nachteil be steht dabei darin, dass, wenn die Justiermarken als Strukturen auf dem intransparenten Halter angeordnet sind, die Position der Markierung nur von einer Seite des Halters gesehen werden kann. Eine genaue Positionsbestimmung sowohl von der Ober- als auch von der Unterseite des Halters ist jedoch wichtig, wenn die beiden Mikroskopieverfahren von unterschiedlichen Seiten auf die Probe zugreifen und dennoch derselbe Probenbereich positionsgenau detektiert werden soll.

Nachteilig an den bekannten Probenträgern ist außerdem, dass sie üblicherweise nicht in ver schiedene Geräte, die am Markt verfügbar sind, hineinpassen und insbesondere gerade bei Mikro- und Nanostrahllinien zu groß und zu unflexibel sind.

Es besteht also die Notwendigkeit, standardisierte Verfahren und Probenhalter für die korrela tive Mikroskopie zu finden, insbesondere wenn diese über die optische Mikroskopie und Elekt ronenstrahlmikroskopie hinausgeht. Zudem besteht der Bedarf, interessierende Bereiche einer Probe in einem Mikroskopieverfahren zu markieren, um es in einem anderen schnell und sicher wiederzufinden. Beispielhaft sei dies die Definition von ROI (englisch, region ofinteresf) vor ei ner Röntgenuntersuchung an einer Mikro- oder Nanostrahllinie. Mit derart markierten bezie hungsweise referenziellen Probenbereichen könnten die untersuchenden Wissenschaftler und insbesondere Synchrotronanwender wertvolle Strahlzeit einsparen. Dies ist insbesondere des halb von besonderer Relevanz, weil mit der zunehmenden Brillanz neuerer Röntgenquellen die Röntgenaufnahmen schneller erstellt werden können und damit auch der Probendurchsatz steigt. Da zudem die Strahlzeit kostenintensiv und zeitlich begrenzt ist, muss die Ausrichtung der zu untersuchenden Proben in den jeweiligen Anlagen und Geräten möglichst schnell erfol gen.

Es ist daher die Aufgabe der Erfindung, einen Probenhalter vorzuschlagen, der mit einer Probe in einer Vielzahl mikroskopischer Verfahren für die korrelative Mikroskopie verwendet werden kann, ohne dass ein T ransfer der Probe selbst auf einen anderen Probenträger notwendig ist.

Die Aufgabe der Erfindung wird gelöst durch eine Probenhalter nach Anspruch 1. Weitere be vorzugte Ausgestaltungen der Erfindung ergeben sich aus den übrigen, in den Unteransprü chen genannten Merkmalen.

Ein erfindungsgemäßer variabler Probenhalter für die korrelative Mikroskopie ist mit einem Pro benträger, der ausgebildet ist, eine Probe aufzunehmen und/oder zu halten, einem austausch baren Adapterelement mittels dessen der Probenträger in einer Beobachtungsvorrichtung anzuordnen und/oder fixierbar ist, und mindestens einem Befestigungsmittel zum Verbinden des Probenträgers mit dem Adapterelement gebildet. Dabei weist das Adapterelement mindes- tens eine Aufnahme für das mindestens eine Befestigungsmittel und der Probenträger mindes tens eine dazu korrespondierende Aufnahme oder Durchführung für das mindestens eine Be festigungsmittel auf.

Die korrelative Mikroskopie soll im Sinne der Erfindung vorzugsweise die Lichtmikroskopie, Elektronenstrahlmikroskopie, lonenstrahl-Mikroskopie, Rasterkraftmikroskopie (auch Atomic Force Mikroskopie, AFM) und/oder Röntgenstrahlmikroskopie umfassen. Dabei sollen alle Be obachtungstechniken und Detektionsverfahren, wie Transmission, Beugung, Absorption, Re- flektion, Streuung und/oder Fluoreszenz, umfasst sein. Zu den Mikroskopieverfahren sollen auch spektroskopische Verfahren zählen.

Zu den Mikroskopieverfahren zählen beispielswiese, aber nicht abschließend, die Laserscan- ning-Mikroskopie, die Tomografie, die Röntgenstreuungsmikroskopie, die Röntgenfluoreszenz mikroskopie (XRF), die Röntgenbeugungsmikroskopie, Focused-Ion-Beam-Mikroskopie (auch FIB-Mikroskopie , fokussierte lonenstrahl-Mikroskopie), Sekundärelektronenmikroskopie (SE), Rückstreuelektronenmikroskopie (BSD), die Sekundärionenmassenspektroskopie (SIMS), die Elektronenrückstreubeugung (EBSD), Kathodolumineszenzmikroskopie (CL), die energiedisper- sive Röntgenspektroskopie (EDX), die wellenlängendispersive Röntgenspektroskopie (WDX), Synchrontronstrahlführungen und FEL-Strahlführungen (Freie-Elektronenstrahl-Laser-Strahlfüh- rungen).

Der variable Probenhalter soll für eine Vielzahl der genannten Mikroskopieverfahren, und vor zugsweise für alle Mikroskopieverfahren ersetzbar sein.

Der erfindungsgemäße Probenhalter ist mit einem Probenträger, einem Adapterelement und mindestens einem Befestigungsmittel gebildet. Ein Probenträger ist ein Element oder Bauteil, das eine Probe aufnimmt und/oder hält, das heißt, die Probe wird in oder auf dem Probenträger platziert und/oder an dem Probenträger angeordnet und gehalten. Das Adapterelement ist ein austauschbares Element, das in verschiedenen Formen, Größen und/oder Materialien bereitge stellt sein kann, dabei jedoch in allen Varianten jeweils dazu vorgesehen ist, mit dem Probenträ- ger verbunden zu werden und dann in eine Beobachtungsvorrichtung eingebracht zu werden, um dort die Probe auf dem Probenträger in den Beobachtungsstrahlengang zu platzieren. Je des Adapterelement ist dabei jeweils auf die zu nutzende Beobachtungsvorrichtung bezie hungsweise das zu nutzende Mikroskopieverfahren angepasst. Der Probenträger wird an und/oder auf dem Adapterelement angeordnet, kann dabei also auf einer Oberfläche des Adapterelements aufliegen, an ihr befestigt sein und/oder sich bereichs weise mit dem Adapterelement überlappen und dabei in dem Überlappungsbereich mit diesem verbunden sein. Auch eine Anordnung des Probenträger zumindest teilweise in dem Adap terelement sei damit umfasst.

Die Verbindung des Adapterelements mit dem Probenträger erfolgt mit mindestens einem Be festigungsmittel. Zur Ausbildung dieser Verbindung weist das Adapterelement mindestens eine Aufnahme für das mindestens eine Befestigungselement auf. Der Probenträger ist mit mindes tens einer korrespondierenden Aufnahme oder Durchführung für das mindestens eine Befesti gungsmittel ausgebildet. Korrespondierend bedeutet dabei, dass die Aufnahme des Adapterelements und die Aufnahme oder Durchführung des Probenträgers jeweils so angeord net sind, dass nach dem Positionieren und Ausrichten des Probenträgers an und/oder auf dem Adapterelement das gewählte mindestens eine Befestigungsmittel angebracht beziehungsweise eingebracht werden und das Adapterelement mit dem Probenträger miteinander verbinden kann. Durch die Anordnung des mindestens einen Befestigungsmittels im Bereich der Aufnah men beziehungsweise der Aufnahme und der Durchführung kann das mindestens eine Befesti gungsmittel das Adapterelement und den Probeträger lagesicher miteinander verbinden, da es von den Aufnahmen beziehungsweise der Aufnahme und der Durchführung in seiner Position gehalten wird.

Ein Befestigungsmittel ist vorzugsweise ein lösbares Befestigungsmittel, damit bei einem Wech sel der Beobachtungsvorrichtung das Adapterelement schnell und einfach ausgetauscht werden kann. Ein Befestigungsmittel kann beispielsweise eine Schraube, eine Klemme, ein Klickver- schluss, ein Einhakverschluss oder dergleichen sein. Ist das mindestens eine Befestigungsmit tel beispielsweise Schraube, wird der Probenträger an und/oder auf dem Adapterelement angeordnet und die Schraube durch die Durchführung im Probenträger in die dazu korrespon dierende Aufnahme des Adapterelements geführt und verschraubt.

Ist die Verbindung erfolgt, können das Adapterelement und der Probenträger in einem Mikro skop, einer Strahlführung oder anderweitig gearteten Beobachtungsvorrichtungen angeordnet werden, um dort beobachtet beziehungsweise untersucht zu werden. Die Formulierung Strahl führung soll dabei synonym auch für die Begriffe Strahllinie oder Strahlrohr gelten. Der erfindungsgemäße variable Probenhalter zeichnet sich also dadurch besonders aus, dass eine Probe von einem Probenträger aufgenommen und/oder gehalten wird, und dieser mit ei nem jeweils geeigneten Adapterelement verbunden wird, so dass der Probenhalter durch einen Wechsel des Adapterelements für das jeweils gewünschte Mikroskopieverfahren beziehungs weise die jeweils gewünschte Beobachtung angepasst werden kann. Damit kann die Probe, ohne dass sie auf einen anderen Probenträger transferiert werden muss, mit verschiedenen Be obachtungsverfahren und -techniken beobachtet beziehungsweise untersucht werden. Dies be schleunigt die Vorbereitung von Proben für die Beobachtung und vermeidet Schädigungen, die bei einem T ransfer der Probe auf einen anderen Probenträger häufig auftreten.

In einer ersten Ausgestaltung des Probenhalters ist vorgesehen, dass das Adapterelement je weils mindestens ein Ausrichtelement aufweist, um den Probenträger an und/oder auf dem Adapterelement in einer vorgegebenen Relativposition auszurichten. Durch dieses mindestens eine Ausrichtelement soll sichergestellt werden, dass ein Probenträger immer genau in einer bestimmten, also vorgegebenen Position in Bezug zu dem Adapterelement angeordnet ist, so dass diese Position reproduzierbar eingestellt werden kann. Infolgedessen kann auch ein festes räumliches Bezugssystem für den Probenträger und die Probe bereitgestellt werden, wie noch ausgeführt werden wird. Ein Ausrichtelement kann ein Pin, ein Stift, eine Schiene, eine Kante, eine Ausstülpung und dergleichen sein, der/die so angeordnet und ausgebildet ist, dass sie eine Positionierung beziehungsweise Ausrichtung des Probenträgers beeinflussen.

Vorzugsweise ist der Probenträger mit mindestens einer zu dem mindestens einen Ausrichtele ment des Adapterelements korrespondierenden Aufnahme ausgebildet. Es soll also in oder an dem Probenträger mindestens eine Aufnahme ausgebildet sein, die mit dem mindestens einen Ausrichtelement des Adapterelements korrespondiert, dieses also vorzugsweise aufnimmt oder mit diesem in Eingriff gebracht werden kann. Dabei kann sowohl je Ausrichtelement eine korres pondierende Aufnahme, als auch eine geringere Anzahl von Aufnahmen im Vergleich zur An zahl von Ausrichtelementen vorgesehen sein. Durch die Ausbildung einer oder mehrerer Aufnahmen für das mindestens eine Ausrichtmittel wird das Positionieren und Ausrichten des Probenträgers in Bezug zu dem Adapterelement vereinfacht und die Reproduzierbarkeit der Po sitionierung weiter gewährleistet. Zudem kann eine Ausbildung mit mindestens einer Aufnahme auch eine erste Lagesicherung des Probenträgers an und/oder auf dem Adapterelement bewir ken, bis das mindestens eine Befestigungsmittel an- oder eingebracht ist.

In einer nächsten Ausgestaltung des Probenhalters ist die Probe mittels kleben, klemmen, schrauben und/oder umgreifen von dem Probenträger aufnehmbar und/oder haltbar. Die Probe kann also an den Probenträger geklebt werden, wobei zur Ausbildung der Klebefläche die Probe den Probenträger zumindest teilweise überlappt. Es kann alternativ oder zusätzlich vor gesehen sein, dass die Probe an den Probenträger geklemmt wird, beispielsweise durch einen Clip oder ein Federelement. Ebenfalls alternativ oder zusätzlich kann die Verbindung mittels Verschraubung der Probe mit dem Probenhalter erfolgen. Unter Umgreifen soll eine Ausgestal tung verstanden werden, bei der der Probenträger die Probe zumindest teilweise umgibt oder umhüllt, um sie zu halten beziehungsweise aufzunehmen. Diese Ausgestaltungen sind insbe sondere dann von Vorteil, wenn die Probe ein in sich steifes beziehungsweise starres Objekt ist, das keinen Halt durch eine externe Struktur braucht, wie es beim Aufbringen oder Auflegen auf einen flächigen Probenträger der Fall wäre.

Eine vorteilhafte Ausgestaltung des Adapterelements ist es, wenn es ein Bolzen, ein Pin und/o der eine Basisplatte ist. Die an sich bekannten Elemente zum Positionieren einer Probe sind im Rahmen der Erfindung jedoch, wie bereits erläutert, Bestandteil des variablen Probenhalters und zweckmäßigerweise mit mindestens einem Ausrichtelement ausgebildet, um den Proben träger in Bezug zu dem Adapterelement in vorgegebener Weise zu positionieren.

Eine weitere vorteilhafte Ausgestaltung der Erfindung ist es, wenn auf dem Probenträger eine hierarchische Markerstruktur als lokales Koordinatensystem ausgebildet und/oder angeordnet ist. Eine solche hierarchische Markerstruktur für die korrelative Mikroskopie sollte mit mindes tens einer Markergruppe gebildet sein, wobei eine Markergruppe mindestens drei Hierarchiestu fen mit jeweils mindestens einem Markerelement aufweist. Jede Hierarchiestufe soll mit mindestens einem Mikroskopieverfahren und/oder mindestens einer Vergrößerungsstufe sicht bar und/oder detektierbar sein. Mittels der Markerstruktur ist die Position und/oder die Ausrich tung einer Probe oder eines Bereiches einer Probe zumindest in einer Probenebene in Relation zu der Markerstruktur und/oder eine Fokussierung auf die Probe oder den Bereich der Probe referenzierbar.

Es ist demnach vorgesehen, dass eine oder mehrere Markergruppen eine hierarchische Struk tur bilden, mittels derer ein interessierender Probenbereich referenziert werden kann und/oder mittels derer eine Fokussierung auf einen interessierenden Probenbereich referenziert werden kann. Nachfolgend soll der Vereinfachung halber der Begriff „Probe“ auch für einen Bereich ei ner Probe stehen. Der interessierende Probenbereich soll auch als ROI bezeichnet werden.

Eine Markergruppe der hierarchischen Markerstruktur sollte mindestens drei Hierarchiestufen aufweisen, die mit jeweils mindestens einem Markerelement gebildet sind. Unter Hierarchie soll eine Ordnung verstanden werden, bei der eine Hierarchiestufe eine Teilmenge der vorherigen ist. Die Position der Markerelemente verschiedener Hierarchiestufen untereinander ist erfin dungsgemäß bekannt und erlaubt damit das Auffinden von Markerelementen einer weiteren Hierarchiestufe jeweils ausgehend von der vorherigen.

Ein Markerelement soll dabei eine Markierung, eine Kennzeichnung oder dergleichen sein, die einen Bezugspunkt für eine Ortsreferenzierung bereitstellt und somit auch ein Wiedereinstellen eines interessierenden Probenbereiches für eine Beobachtung der Probe.

Jede der Hierarchiestufen beziehungsweise das mindestens eine jeweils zugehörige Markerele ment soll mit mindestens einer Mikroskopieart und/oder mindestens einer Vergrößerungsstufe sichtbar und/oder detektierbar sein. Dabei sind die Markerelemente derart ausgestaltet, dass sie mit wenigstens einer Mikroskopieart detektierbar und/oder sichtbar sind. Alternativ oder zu sätzlich sollen sie in mindestens einer Vergrößerungsstufe detektierbar und/oder sichtbar sein. Dabei soll unter „detektierbar und/oder sichtbar“ verstanden werden, dass die Markerelement auffindbar sind. Je nach Mikroskopieverfahren beziehungsweise Beobachtungsverfahren, und/oder Vergrößerungsstufe kann ein Markerelement sichtbar sein, und/oder es kann mit dem vorgesehenen Verfahren detektiert werden. Nachfolgend wird für die Formulierung „sichtbar und/oder detektierbar“ gleichbedeutend auch die Formulierung „auffindbar“ verwendet.

Die Mikroskopiearten, auch als Mikroskopieverfahren oder Mikroskopietechniken bezeichnet, für die die Markerelemente auffindbar sein sollen, entsprechen denen, für die der erfindungsge mäße Probenhalter Anwendung finden soll. Grundsätzlich gilt, dass die Markerelemente wahl weise für die gesamte Breite eines Mikroskopieverfahrens sichtbar und/oder detektierbar sein können, oder nur für ausgewählte Bereiche, wie zum Beispiel ausgewählte Wellenlängenberei che und/oder Strahlenergien.

Ist nun also bekannt, mit welchen Methoden eine Probe untersucht werden soll, können die Markerelemente so gewählt und ausgebildet werden, das jeweils immer mindestens ein Marke relement der hierarchischen Markerstruktur und damit jeweils immer mindestens eine Hierar chieebene in der aktuellen Untersuchung der Probe sichtbar ist. Dies kann beispielsweise durch die Auswahl geeigneter Materialien und/oder Größen für die Markerelemente eingestellt werden und wird nachfolgend noch detaillierter ausgeführt.

Vorzugsweise sind die Markerelemente mit mehr als einer Mikroskopieart detektierbar und/oder sichtbar, besonders bevorzugt von allen an einer Probe auszuführenden Mikroskopiearten. In einer derartigen Ausgestaltung, bei der alle Markerelemente mit allen an einer Probe auszufüh renden Mikroskopiearten detektierbar und/oder sichtbar sind, muss vor der Verwendung der Markerstruktur keine Auswahl mehr getroffen werden, sondern es könnten vorgefertigte Ele mente wie beispielsweise Probenträger mit der erfindungsgemäßen Markerstruktur ohne wei tere Auswahl für alle Mikroskopieverfahren verwendet werden.

Alternativ oder zusätzlich sollen die Markerelemente für unterschiedliche Vergrößerungsstufen sichtbar und/oder detektierbar sein. So kann eine erste Hierarchieebene beispielsweise mit ei ner geringeren Vergrößerung sichtbar und/oder detektierbar sein, als eine zweite, die deutlich kleinere Markerelemente aufweist, und diese kann wiederum mit einer geringeren Vergrößerung auffindbar sein als eine dritte mit noch kleineren Markerelementen. Im Umkehrschluss ist dabei ein Markerelement der ersten Hierarchieebene in der zweiten und dritten Hierarchieebene zu mindest hinsichtlich seiner Größe sichtbar und/oder detektierbar.

Ohne darauf beschränkt zu sein, kann eine erste Hierarchieebene beispielsweise eine Sichtbar keit mit bloßen Auge, eine zweite Hierarchieebene mittels Lichtmikroskopie und eine dritte Hie rarchieebene mittels Elektronenstrahlmikroskopie umfassen. Neben der Mikroskopieart wird bei dieser beispielhaften Auswahl der Mikroskopiearten auch jeweils eine unterschiedliche Vergrö ßerungsstufe verwirklicht. Eine vierte, fünfte und weitere Hierarchieebenen, insbesondere mit einem höherem Auflösungsvermögen, liegt dabei ausdrücklich im Sinne der Erfindung.

Ziel der hierarchischen Markerstruktur ist es, eine erste, einfach zu findende Hierarchiestufe be reitzustellen, von der aus die Markerelemente der weiteren Hierarchiestufen einfach und sicher, und insbesondere nach definierten Methoden oder räumlichen Beziehungen zueinander zu fin den sind.

Die Anforderungen aus der geplanten Beobachtung einer Probe definieren die Anforderungen an die Markerelemente hinsichtlich Größe und Sichtbarkeit beziehungsweise Detektierbarkeit, und damit die Art und Weise ihrer Herstellung und/oder des dabei zu verwendenden Materials. Zweckmäßigerweise werden die Markerelemente so gestaltet und hergestellt, dass sie nicht nur für eine Mikroskopieart und/oder eine Vergrößerungsstufe auffindbar sind, sondern insbeson dere für ein Maximum an Mikroskopieverfahren und/oder Vergrößerungsstufen ersetzbar sind.

Mit der hierarchischen Markerstruktur ist die Position und/oder die Ausrichtung einer Probe oder eines Probenbereichs zumindest in einer Probenebene in Relation zu der Markerstruktur refe- renzierbar. Dabei bildet die hierarchische Markerstruktur ein Koordinatensystem auf dem Pro benträger, so dass die Position einer Probe oder eines ROI und ihre Ausrichtung in Bezug auf dieses Koo rd i n ate nsy ste m referenziert werden kann.

Im einfachsten Falle erfolgt die Referenzierung dabei innerhalb einer Probenebene, die um We sentlichen die Flächenausbreitung der Probe umfasst. Sie kann aber alternativ oder zusätzlich eine Referenzierung der Probe in einer Ebene im Wesentlichen senkrecht zur Flächenausbrei tung der Probe umfassen. Damit wird zudem die Referenzierung einer Fokussierung auf die Probe oder den interessierenden Probenbereich ermöglicht.

Eine Ortsreferenzierung in Bezug zu der hierarchischen Markerstruktur kann sowohl hinsichtlich einer Position einer Probe, ihrer Ausrichtung, als auch der Fokussierung verwendet werden, um die interessierende Stelle in einer anderen Untersuchungsvorrichtung schnell und sicher wie derzufinden und zu beobachten. Die Position der Markerelemente unterschiedlicher Hierarchie ebenen zueinander ist bekannt und erlaubt eine Referenzierung über die Hierarchiestufen hinweg in den verschiedenen Mikroskopieverfahren und -einrichtungen. Somit ist bei jeder Un tersuchung einer Probe jeweils mindestens eine Hierarchieebene der Markerstruktur sichtbar und/oder detektierbar, und infolgedessen eine Ausrichtung der Probe oder eines Probenbe reichs und/oder eine Fokussierung nach einen Wechsel der Mikroskopieart und/oder Vergröße rungsstufe schnell und sicher einstellbar. Dies schließt auch eine Wechsel der Beobachtungsvorrichtung und/oder des Ortes der Beobachtung mit ein. Mittels der Markerele mente kann in Kenntnis ihrer Position, Größe und/oder Ausrichtung auch eine Genauigkeit einer Probenträgervorrichtung wie zum Beispiel einem Probentisch bestimmt werden. Ebenso ist eine Skalierung und/oder Kalibrierung möglich.

Der Transfer der Referenzierung kann beispielsweise softwarebasiert erfolgen. Ist ein interes sierender Probenbereich gekennzeichnet und seine Position und/oder Fokuseinstellung in Be zug auf die hierarchische Markerstruktur erfasst, kann diese Referenz an ein anderes Beobachtungsgerät oder einen anderen Beobachtungsort übermittelt werden. Dort kann die Probe durch Bezug zu der Markerstruktur wieder derart ausgerichtet, positioniert und/oder fo kussiertwerden, dass der interessierende Bereich zur Beobachtung eingestellt wird.

Eine bevorzugte Ausgestaltung der hierarchischen Markerstruktur sieht vor, dass diese mindes tens drei Markergruppen aufweist. Die drei Markergruppen bilden dabei feste Referenzpunkte, deren geometrische Beziehung zueinander bekannt sind. Ausgehend davon kann jeder belie- bige Punkt mit Bezug zu den drei Markergruppen eineindeutig bestimmt und beschrieben wer den. Damit kann die Referenzierung von Positionen, Ausrichtungen und/oder Fokussierungen mit größerer Genauigkeit und Sicherheit referenziert und wieder eingestellt werden. Zudem ist durch die Verwendung dreier Markergruppen mit hoher Wahrscheinlichkeit zumindest eine in der Nähe des interessierenden Probenbereiches und kann bei einer manuellen Suche bezie hungsweise Beobachtung der Probe als Orientierungspunkt dienen.

Vorteilhafterweise sind alle Markerelemente aller Hierarchiestufen mit mindestens einem glei chen der Mikroskopieverfahren sichtbar und/oder detektierbar. Somit soll nicht nur jede Hierar chiestufe mit einem Mikroskopieverfahren auffindbar sein, sondern die Markerelemente aller Hierarchiestufen sollen so ausgebildet sein, dass alle Hierarchiestufen mit mindestens einem, nämlich dem gleichen, Mikroskopieverfahren detektierbar und/oder sichtbar sind. Weiter bevor zugt sollen alle Markerelemente aller Hierarchiestufen mit allen für eine zu beobachtende spezi fische Probe zu verwendenden Mikroskopiearten sichtbar und/oder detektierbar sein. Diese Ausgestaltung erlaubt es, die Markerelemente in einem Herstellungsprozess und/oder mit den gleichen Materialien herzustellen, und somit der Herstellungsaufwand und die Kosten zur Her stellung der Markerelemente zu minimieren. Zudem können die Markerelemente in dieser Aus gestaltung in allen Hierarchieebenen mit mindestens einer Mikroskopieart aufgefunden werden, wodurch eine individuelle Anpassung der Markerelemente an verschiedene Mikroskopieverfah renskombinationen entbehrlich werden kann.

Eine besonders bevorzugte Ausgestaltung sieht vor, dass durch die Position, Form und/oder Anordnung von Markerelementen zueinander die Position und/oder die Ausrichtung der Probe oder eines Bereiches der Probe anzeigbar ist. So können beispielsweise die Markerelemente so angeordnet sein, dass die Probe in einem Bereich, der durch imaginäre Verbindungslinien zwischen den Markerelementen begrenzt wird, angeordnet ist. Demnach kann aus der Position der Markerelemente auf die Position der Probe und/oder deren Ausrichtung geschlossen wer den.

Auch die Anordnung der Markerelemente zueinander kann die Position einer Probe relativ zu dem Markerelementen und/oder ihre Ausrichtung anzeigen. So kann durch die Markerelemente beispielsweise ein „L“ aufgespannt werden, wobei durch die Schenkel des L zwei Seiten eines Rechtecks, innerhalb dessen die Probe auffindbar ist, definiert werden. Durch den Bezug zu den Schenkeln des L und deren Schnittpunkt kann dem Beobachter neben einer Position auch eine Ausrichtung einer Probe angezeigt werden. Alternativ oder zusätzlich kann durch die Form der Markerelemente die Position und/oder die Ausrichtung der Probe oder eines Bereiches der Probe und/oder die Position mindestens eines weiteren Markerelements angezeigt werden. So könnte ein Markerelement die Form eines Pfei les oder eines Dreieckes aufweisen, der oder das in die Richtung zeigt, in der die Probe und/o der weitere Markerelemente, insbesondere einer anderen Markergruppe, zu finden sind. Ist eine Probe in Relation zu einem Markerelement ausgerichtet worden, kann durch dessen Form zu einem späteren Zeitpunkt oder während einer Beobachtung mit einer anderen Mikroskopieart wiederum diese Ausrichtung angezeigt werden.

Es lässt sich also sagen, dass die Position, Form und/oder Anordnung von Markerelementen zueinander als Orientierungshilfe während der Beobachtung einer Probe dient. Die Anzeige weiterer Markerelemente durch die Form der Markerelemente erweist sich insbesondere bei den Mikroskopieverfahren als vorteilhaft, bei denen ein spiegelverkehrtes Bild angezeigt wird und/oder eine Vorpositionierung einer Probe in einer Strahlführung mittels eines optischen Mik roskops mit kleinem Sichtfeld erfolgt.

Wie bereits erwähnt, kann ein Markerelement die Form eines L, eines Dreiecks oder eine Pfeils aufweisen. Es kann aber auch jeweils die Form eines Kreises oder einer sich in eine oder zwei Richtungen verjüngenden geometrischen Form aufweisen, wodurch ebenfalls eine Orientie rungshilfe während der Beobachtung einer Probe gegeben ist. Auch eine sternförmige Figur o- der eine an ein Pluszeichen angelehnte Figur, deren Strahlen sich nach außen verjüngen, bilden eine geeignete Form um eine Position und/oder Ausrichtung einer Probe und/oder die Position mindestens eines weiteren Markerelements anzuzeigen.

Die jeweilige Orientierungshilfe kann innerhalb einer Hierarchieebene, insbesondere durch das Zusammenwirken mehrerer Markergruppen und/oder jeweils in mehreren Hierarchieebenen verwirklicht sein und/oder innerhalb einer Markergruppe hierarchieübergreifend.

In einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung ist mindestens eine Markergruppe in der gleichen Ebene wie eine Probenoberfläche angeordnet. Mindestens eine Markergruppe soll also in der gleichen Ebene wie die Probe angeordnet sein, so dass mindestens eine Oberfläche der Probe in der selben Ebene wie die Markerstruktur liegt. Bei einer Ausführung mit mehreren Marker gruppen können eine, mehrere oder alle Markergruppen in einer gleichen Ebene wie eine Pro benoberfläche angeordnet sein. Wenn mindestens eine Markergruppe in einer gleichen Ebene wie eine Probenoberfläche angeordnet ist, wird eine Referenzierung in einer Richtung im We sentlichen senkrecht zur Probenoberfläche, üblicherweise in z-Richtung, vereinfacht, da mit der Position der Markergruppe auch die Oberflächenlage der Probe bekannt ist. Die Markergruppe kann zum Beispiel durch Anordnung auf dem Probenträger in der gleichen Ebene wie die Pro benoberfläche verwirklicht werden.

Zusätzlich kann eine weitere Markergruppe in einer anderen, jedoch zuvor definierten Ebene angeordnet sein, so dass zwei Positionen in einer Richtung im Wesentlichen senkrecht zur Pro benebene definiert sind. Damit kann eine z-Position innerhalb einer Probe und/oder eine Fokus position mit hoher Genauigkeit referenziert und beim Wechsel der Mikroskopieart oder nach der Unterbrechung einer Beobachtung wieder eingestellt werden. Vorteilhafterweise sollte die Markergruppe in einer zweiten Ebene in räumlicher Nähe zu der Markergruppe in der ersten Ebene angeordnet sein. Sie können, aus einer Betrachtungsposition senkrecht zu den Ebenen, nebeneinander und auch zumindest teilweise überlappend angeordnet sein. Die Ausbildung ei ner zweiten Ebene kann beispielsweise mittels einer für die einzusetzenden Mikroskopiearten transparenten Membran, auf die die Markergruppe aufgebracht ist, verwirklicht werden.

Es ist ebenfalls eine vorteilhafte Ausgestaltung, wenn die Sichtbarkeit und/oder Detektierbarkeit der Markerelemente durch Farbe, Kontrast und/oder mindestens eine Höhendifferenz einstell bar ist. Damit die Markerelemente mit verschiedenen Mikroskopiearten auffindbar sind, müssen diese verschiedenen Anforderungen der verschiedenen Mikroskopiearten genügen. So können Markerelemente durch Farbunterschiede im Vergleich zur Probe und/oder untereinander unter schieden werden, so dass sie vor allem in der Lichtmikroskopie sichtbar beziehungsweise de- tektierbar sind. Unterschiedliche Farben können durch die Verwendung verschiedener Materialien beziehungsweise Werkstoffe oder die Zugabe von Farbstoffen erreicht werden.

Durch die Ausbildung der Markerelemente mit verschiedenen Materialien beziehungsweise Werkstoffen werden unterschiedliche Kontraste bewirkt, die damit zu einer Sichtbarkeit und/o der Detektierbarkeit in Verfahren wie der Elektronenstrahlmikroskopie oder der Röntgenstrah lenmikroskopie führen. Die Rasterkraftmikroskopie (AFM) basiert auf der Abtastung einer Oberfläche, daher können Markerelemente erfasst werden, wenn sie mit mindestens einer Hö hendifferenz zu ihrem Untergrund ausgebildet sind. Derartige Höhendifferenzen können zum Beispiel durch eine Auftragsdicke eines Markerelements auf einer Oberfläche oder einen Mate rialabtrag aus einer Oberfläche realisiert werden.

Wie bereits erläutert, soll die mindestens hierarchische Markerstruktur auf dem Probenträger ausgebildet und/oder angeordnet sein. Bei einer Ausbildung oder Anordnung einer Marker gruppe auf dem Probenträger ist diese regelmäßig fest mit dem Probenträger verbunden und damit das durch die mindestens eine Markergruppe gebildete Koordinatensystem fest mit dem Probenträger verknüpft. Wenn der Probenträger derart ausgestaltet ist, dass er in verschiede nen Mikroskopiearten ersetzbar ist, kann die Probe ohne Zwischentransfer mit dem Probenträ ger zwischen den Beobachtungsgeräten bewegt werden, ohne die Maßhaltigkeit des Bezugssystems zu gefährden.

Alternativ oder zusätzlich kann die mindestens eine Markergruppe auf einer Membran ausgebil det und/oder angeordnet sein, die den Probenträger zumindest teilweise bedeckt. Sie kann den Probenträger also bereichsweise oder in Gänze bedecken. Eine solche Membran sollte für die zu verwendenden Mikroskopiearten, insbesondere für Licht und Röntgenstrahlung transparent sein und wird auf den Probenträger aufgebracht. Für Licht und Röntgenstrahlung transparentes Material ist für diese Strahlungsarten durchlässig. Damit wird dem Probenträger ein Bezugs- be ziehungsweise Koordinatensystem zugeordnet, dass dann als Basis für die beschriebenen Re- ferenzierungen dient. Die Membran kann auf einem Probenträger durch Verschweißen, Verkleben, Verklemmen und dergleichen angebracht werden.

Eine für die zu verwendenden Mikroskopiearten transparente Membran ist mit Vorteil mit Silizi umnitrit oder Silizium gebildet. Eine Membran aus einem solchen Material ist daher für den Be obachter der Probe nicht oder kaum sichtbar, so dass im Wesentlichen die darauf platzierte(n) Markergruppe(n) sichtbar und/oder detektierbar sind. Neben Siliziumnitrit und Silizium sind Kap- ton, Beryllium, Zinkoxid, Glas, transparente Kunststoffe und dergleichen als Material bezie hungsweise Werkstoff für eine solche Membran geeignet.

Die Membran kann vorzugsweise auf oder an den Probenträger geklebt, mit ihm verschweißt oder verklemmt werden, wobei das Verklemmen insbesondere durch ein Federelement, einen Clip oder dergleichen erreicht werden kann. Dadurch wird eine lagesichere Befestigung der Membran und damit auch der Markerelemente an beziehungsweise auf dem Probenträger si chergestellt, wodurch das mit der hierarchischen Markerstruktur gebildete Bezugssystem relativ zu dem Probenträger ortsfest und dauerhaft ist.

Die Markerelement können jeweils mit mindestens einem Element aus der Gruppe Scandium, Titan, Vanadium, Chrom, Mangan, Eisen, Cobalt, Nickel, Kupfer, Zinn, Tantal, Wolfram, Rhenium, Osmium, Iridium, Platin, Gold, Quecksilber, Thallium, Blei gebildet sein und/oder zu mindest teilweise mittels eines Materialabtrages aus einer Fläche, die mit mindestens einem Element aus der Gruppe Scandium, Titan, Vanadium, Chrom, Mangan, Eisen, Cobalt, Nickel, Kupfer, Zinn, Tantal, Wolfram, Rhenium, Osmium, Iridium, Platin, Gold, Quecksilber, Thallium, Blei gebildet ist, ausgebildet sein. Dabei liegen Legierungen mit verschiedenen der genannten Elemente ausdrücklich im Rahmen der Erfindung. Die aufgeführten Elemente sind geeignet, da mit ausgebildete Markerelemente mit einer Vielzahl von Mikroskopieverfahren und -arten zu er fassen, beispielsweise auch für Fluoreszenzbeobachtungen mit ausgewählten Röntgenstrahlenenergien. Legierungen erlauben es dabei, einen möglichst großen Energiebe reich abzudecken.

Dabei können die Markerelemente mit mindestens einem Element aus der genannten Gruppe ausgebildet beziehungsweise geformt sein. Die Ausbildung kann unter anderem mittels physi kalischer Dampfphasenabscheidung (PVD), fokussiertem lonenstrahl (FIB), der dann auch als ionenstrahlgestützte Deposition (englisch ion beam assisted deposition, IBAD) bezeichnet wird, fotolithografischen Verfahren oder Atomlagenabscheidung (englisch atomic layer deposition, ALD) ausgebildet werden. Dabei kann ein Markerelement ganz oder teilweise mit einer oder mehreren der genannten Techniken auf eine Oberfläche aufgebracht werden. Die Ausbildung mittels fokussiertem lonenstrahl und/oder Fotolithografie ist dabei besonders bevorzugt, da da mit eine besonders hohe Genauigkeit und Präzision in der Ausbildung der Markerelemente er reicht wird. Folglich kann eine exaktere Detektion der Konturen der Markerelemente und damit eine akkuratere Bestimmung von Referenzen erfolgen, und ROIs genauer angefahren werden. Sofern einer Beobachtung beziehungsweise Untersuchung einer Probe mittels FIB erfolgt, kön nen die Markerelemente auch im Rahmen der Beobachtung aufgebracht werden.

Markerelemente können aber auch ganz oder teilweise im Sinne eines Negativs aus einer Flä che abgetragen sein, die mit mindestens einem der genannten Elemente gebildet ist. Dabei wird zunächst mindestens eine ausreichend große Fläche mit mindestens einem der genannten Elemente auf eine Oberfläche aufgebracht, beispielsweise auf eine Membran oder einen Pro benträger. Der Auftrag kann auch hier mittels physikalischer Dampfphasenabscheidung (PVD), fokussiertem lonenstrahl (FIB), Atomlagenabscheidung oder Fotolithografie ausgebildet wer den. Anschließend wird die Form der Markerelemente mittels eines Fräsverfahrens oder fokus siertem lonenstrahl (FIB) aus dieser Fläche abgetragen. Der Abtrag des aufgebrachten Materials kann über die gesamte Tiefe oder auch nur einen Teil der Tiefe erfolgen, sofern dabei eine Ausreichende Abgrenzung zur Umgebung gewährleistet ist. Die somit ausgebildeten Mar kerelement sind dann als „Negativform“ in der Fläche auffindbar.

Mit der hierarchischen Markerstruktur ist es möglich, ein Bezugssystem für eine Probe in der korrelative Mikroskopie zu schaffen, wobei die korrelative Mikroskopie nicht mehr nur auf die Lichtmikroskopie und die Elektronenstrahlmikroskopie beschränkt ist. Mit der hierarchischen Ausgestaltung können Markerelemente für verschiedene Mikroskopietechniken und/oder Ver größerungsstufen ausgebildet sein, so dass jeweils ein Marker in einer geeigneten Ausgestal tung und Größe auffindbar ist. Die Markerelemente einer folgenden Hierarchiestufe sind jeweils ausgehend von der vorherigen Hierarchiestufe auffindbar und dienen neben dem Übertrag von Koordinateninformationen auch der Ausrichtung und Fokussierung der Probe.

In einem ersten Beobachtungsschritt wird in der Probe ein interessierender Bereich bestimmt und anhand der Markerstruktur seine Koordinaten relativ zu der Markerstruktur ermittelt. In ei nem zweiten Beobachtungsschritt in einem anderen Beobachtungsgerät oder an einem ande ren Ort können nach der Kalibrierung der Probe auf dem Probenträger ohne einen aufwändigen Vorscan der Probe die Koordinaten des interessierenden Bereichs übertragen und eingestellt werden. Im Idealfall ist eine Kalibrierung der Probe auf dem Probenträger nur noch erforderlich, wenn es eine Lageänderung der Probe auf dem Probenträger gegeben hat. Damit wird ein Aus tausch von Proben zwischen verschiedenen Beobachtungsgeräten und Mikroskopiearten, auch über Instituts- und Standortgrenzen hinweg ermöglicht und das Auffinden von interessierenden Probenbereichen deutlich beschleunigt. Im Anschluss können die verschiedenen, mit unter schiedlichen Geräten und Techniken ermittelten Informationen in einzelnen Bildern überlagert oder kombiniert werden, die aussagekräftigen Daten aus den weniger nützlichen Details gefiltert oder spezifische Details aus einer Methode zu den Daten einer anderen Methode hinzugefügt werden.

Zweckmäßigerweise sind in dem Probenträger korrespondierend mit der Markerstruktur, die auf der mindestens einen Membran ausgebildet und/oder angeordnet ist, Öffnungen ausgebildet, so dass die Markerstruktur von beiden Seiten des Probenträgers detektierbar ist. Die mindes tens eine Membran wird dabei über den dafür vorgesehen Öffnungen beziehungsweise Durch brüchen des Probenträgers positioniert, so dass die Markerstruktur über beziehungsweise vor diesen Öffnungen angeordnet sind. Da die mindestens eine Membran vorzugsweise transpa rent ist, kann die Markerstruktur sowohl in Mikroskopieverfahren mit Reflektion als auch mit Transmission oder Fluoreszenz erfasst werden.

Ebenfalls mit Vorteil ist zumindest der Probenträger mit einem leitfähigen Material, insbeson dere mit einer Aluminiumlegierung, gebildet. Damit ist sichergestellt, dass der Probenträger be ziehungsweise der Probenhalter in Mikroskopieverfahren wie der Elektronenstrahlmikroskopie verwendet werden kann. Der Probenträger kann in einer Ausgestaltung mit einem Druckverfahren hergestellt sein. Dies ist eine einfache und kostengünstige Herstellungsmethode, bei der ein solcher Probenträger auch an individuelle Anforderungen, wie die Anzahl und Position von Öffnungen korrespondie rend zu Markerelementen, angepasst werden kann.

Noch eine weitere Ausgestaltung sieht vor, dass der Probenhalter, zumindest jedoch der Pro benträger für die Verwendung im Ultrahochvakuum ausgebildet ist. Dazu muss der Probenhal ter aus einem Material gefertigt sein, das nicht ausgast. Zudem dürfen in dem Probenträger keine verschlossenen Hohlräume beziehungsweise Blasen vorhanden sein.

Der erfindungsgemäßen Probenhalter erlaubt es, dass eine Probe mit verschiedenen Mikrosko pieverfahren beziehungsweise verschiedenen Beobachtungsgeräten untersucht werden kann. Dazu muss bei Bedarf lediglich das Adapterelement ausgetauscht werden, ohne dass die Probe selbst auf einen neuen beziehungsweise anderen Probenträger transferiert werden muss. Der Austausch des Adapterelements ist schnell durchführbar, die Probe wird nicht beschädigt und das Bezugssystem zwischen Probe und Probenträger bleibt ungestört bestehen. In der Folge kann die Probe auch an verschiedenen Orten untersucht werden, beispielsweise bei instituts- übergreifenden Forschungskooperationen.

Um dabei einen sicheren und beschädigungsfreien Transport zu gewährleisten, wird eine Transportbox vorgeschlagen, mit der der erfindungsgemäße Probenhalter transportiert werden kann. In der Transportbox sollte eine Befestigungsbasis vorgesehen sein, die den Probenträger, mindestens ein Adapterelement und die Probe aufnehmen kann. Aufnahmen soll in diesem Zu sammenhang bedeuten, dass diese Elemente des Probenhalters einzeln oder in zusammenge bautem Zustand auf beziehungsweise in der Befestigungsbasis angeordnet und dabei gegen ein Verrutschen, Verschieben und dergleichen gesichert sind. Vorteilhafterweise sind mehrere Aufnahmen für verschiedene Adapterelemente in der Transportbox vorgesehen.

Die Transportbox sollte zweckmäßigerweise ein Druckausgleichselement aufweisen und die Probe vor Licht, T emperaturschwankungen und Erschütterungen schützen. An oder in der Transportbox kann ein RFID-Transponder (Transponder für die Radiofrequenzidentifikation) an gebracht sein, auf dem alle erforderlichen Daten zu der Probe gespeichert oder mittels der Transponder-ID abrufbar sind.

Die verschiedenen in dieser Anmeldung genannten Ausführungsformen der Erfindung sind, so fern im Einzelfall nicht anders ausgeführt, mit Vorteil miteinander kombinierbar. Die Erfindung wird nachfolgend in Ausführungsbeispielen anhand der zugehörigen Zeichnun gen erläutert. Es zeigen:

Figur 1 eine beispielhafte Ausgestaltung eines Probenträgers in einer Draufsicht und einem Schnitt,

Figur 2 eine erste Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Probenhalters,

Figur 3 eine zweite Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Probenhalters,

Figur 4 eine dritte Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Probenhalters,

Figur 5 eine beispielhafte Ausgestaltung einer Markerstruktur mit drei Hierarchieebenen,

Figur 6 eine weitere beispielhafte Ausgestaltung einer Markerstruktur mit vier Hierarchie ebenen,

Figur 7 die Ausgestaltung der Markerstruktur nach Figur 6 mit drei Markergruppen, und

Figur 8 noch eine weitere beispielhafte Ausgestaltung einer Markerstruktur mit vier Hierar chieebenen.

Figur 1 zeigt eine beispielhafte Ausgestaltung eines Probenträgers 30 in einer Draufsicht (Figur 1a) und einem mit A-A gekennzeichneten Schnitt (Figur 1b). Der Probenträger 30 weist eine Durchführung 32 für ein Befestigungselement und eine Aufnahme 34 für ein Ausrichtelement auf. Auf dem Probenträger 30 sind drei Membranen 40 mit jeweils eine Markergruppe 1 einer hierarchischen Markerstruktur angeordnet beziehungsweise auf den Probenträger 30 geklebt. Die Markerstruktur wird in den Figuren 5 bis 8 detailliert beschrieben. Mittels der Markerstruktur wird ein festes Koordinatensystem aufgespannt, anhand dessen interessierende Probenberei che und/oder Fokuspositionen referenziert werden können.

Hinter beziehungsweise unter den Membranen 40 sind jeweils Öffnungen 38 in dem Probenträ ger 30 vorgesehen. Damit können die Markergruppen 1 zumindest teilweise von beiden Seiten erfasst werden. Die Probe wird in einem Überlappungsbereich 36 mit dem Probenträger 30 verklebt. Dabei wird sie von hinten, in Figur 1b also von links, im Überlappungsbereich 36 mit dem Probenträger 30 verklebt, so dass die Oberfläche der Probe auf der gleichen Ebene wie die Markerelemente liegt. Dies wird auch in den Figuren 2b, 3b und 4b deutlich.

In den Figuren 2, 3 und 4 ist der Probenträger 30 aus Figur 1 exemplarisch auf beziehungs weise an verschiedenen Adapterelementen 80 angeordnet. Er ist mit einer Probe 20 verbunden, die im Überlappungsbereich 36 mit dem Probenträger 30 verklebt ist. Dabei wird in den Figuren 2, 3 und 4 jeweils in Figur a eine Draufsicht, b ein Schnitt und c eine perspektivische Ansicht dargestellt. Es werden nur die Unterschiede zu den vorhergehenden Figuren erläutert.

In Figur 2 ist das Adapterelement 80 ein Stud, auf dessen kreisförmiger Oberfläche die mit dem Probenträger 30 verbundene Probe 20 angeordnet ist. Dazu wird der Probenträger 30 mit der Probe 20 auf den Stud 80 gelegt, wobei die Aufnahme 34 des Probenträgers 30 das an dem Stud 80 vorgesehene Ausrichtelement 82 aufnimmt. Damit wird eine erste Positionierung und Ausrichtung vorgenommen. Das Ausrichtelement 82 ist hier ein Bolzen.

Anschließend wird das Befestigungsmittel 70 in Form einer Schraube durch die dafür vorgese hene Durchführung 32 in die dafür vorgesehene Aufnahme 86 des Adapterelements 80 einge bracht. Damit sind der Probenträger 30 und das Adapterelement 80 fest und lagesicher miteinander verbunden. Die Probe kann nun in einer Beobachtungsvorrichtung untersucht wer den. Beim Wechsel in eine andere Beobachtungsvorrichtung wird das Befestigungsmittel 70 ge löst, das Adapterelement 80 entfernt und durch ein anderes, geeignetes Adapterelement 80 ausgetauscht. Die Probe 20 und der Probenträger 30 bleiben unverändert verbunden.

Ein solches anderes Adapterelement 80 ist in Figur 3 zu sehen. Die Probe 20 und der Proben träger 30 können darauf „stehend“ beziehungsweise aufrecht ausgerichtet angeordnet werden. Auch hier wird der Probenträger 30 mittels eines Ausrichtelements 82 an dem Adapterelement 80 positioniert und ausgerichtet und mit einem Verbindungsmittel 70 mit dem Adapterelement 80 verbunden. Da der Probenträger 30 und die Probe 20 bei diesem Wechsel des Adapterele ments 80 verbunden blieben, ist auch ihre Position zueinander und das Koordinatensystem un verändert geblieben. Anhand der Markergruppen 1 auf den Membranen 40 des Probenträgers 30 kann die Probe 20 in einer Beobachtungsvorrichtung kalibriert werden und zuvor festgelegte interessierende Probenbereiche und/oder Fokuspositionen schnell und sicher zur weiteren Be obachtung angefahren werden. Ein drittes beispielhaftes Adapterelement 80 in Form einer Basisplatte ist in Figur 3 gezeigt. Probenträger 30 und Probe 20 sind unverändert.

Figur 5 zeigt eine beispielhafte Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Markerstruktur mit drei Hierarchieebenen 10.1, 10.2 und 10.3. Figur 5a zeigt dabei einen Ausschnitt aus einer Drauf sicht auf einen Probenträger, auf dem eine Fläche 50 aus Kupfer aufgebracht ist. Die Fläche ist herstellungsbedingt ein Vieleck und wird zur Vereinfachung nachfolgend als runde Fläche dar gestellt und bezeichnet. Der Durchmesser der Fläche 50 beträgt 3 Millimeter, wobei dieses Maß, wie auch die im Folgenden genannten, jeweils nur ein beispielhafter Wert ist. Maßanga ben ohne Angabe einer Einheit sind wie in Fachkreisen üblich in Millimetern angegeben.

Auf einer in der Zeichenebene senkrecht zum Mittelpunkt liegenden Linie sind zwei Markerele mente 10.1 in Kreisform ausgebildet. Diese wurden mittels fokussiertem lonenstrahl aus der Fläche 50 abgetragen, da damit die größtmögliche Maßhaltigkeit der Markerelemente 10.1 ge währleistet ist. Der Durchmesser der Kreisflächen 10.1 beträgt in diesem Ausführungsbeispiel jeweils 40 Mikrometer (pm) und sie weisen einen Abstand von 1 ,8 Millimeter voneinander auf. Diese beiden Kreisflächen bilden die erste Hierarchiestufe und sind durchaus noch mit dem Auge sichtbar. Sie dienen einer ersten Fokussierung und Ausrichtung der Probe.

Um den Mittelpunkt der Fläche 50 herum sind weitere Markerelemente 10.2 und 10.3 erkenn bar. Dieser Bereich ist etwas vergrößert in Figur 5b dargestellt. Auf einer Diagonalen, die in etwa mit 45° durch den Mittelpunkt der Kreisfläche 50 verläuft, sind zwei runde Markerelemente 10.2 ausgebildet. In etwa im Bereich des Mittelpunkts der Fläche 50 ist ein Markerelement 10.2 in Form eines L ausgebildet. Die Markerelemente 10.2 bilden die zweite Hierarchieebene. Auch diese Markerelemente 10.2 sind mittels Materialabtrag aus der mit Kupfer ausgebildeten Fläche 50 ausgebildet. Die runden Markerelemente 10.2 haben einen Durchmesser von 20 pm. Das L- förmige Markerelement 10.2 ist in Figur 5c vergrößert dargestellt und weist eine Schenkellänge von 30 pm und eine Schenkeldicke von 5 pm auf. Die Markerelemente 10.2 sind unter anderem mittels lichtmikroskopischer Verfahren sichtbar.

Auf einer Diagonalen von einem Schenkel des L-förmigen Markerelements 10.2 zu dem ande ren Schenkel und darauf in etwa mittig ist ein weiteres L-förmiges Markerelement 10.3 der drit ten Hierarchiestufe ausgebildet, wie zuvor erläutert mittels Materialabtrag aus der Fläche 50.

Die Schenkellänge liegt bei diesem Markerelement 10.3 bei 2 pm und die Dicke der Schenkel bei 100 Nanometern (nm). In dem Bereich, in dem sich die beiden Schenkel treffen, wird an der äußeren Ecke des L der Referenzpunkt 60, auch Point Zero genannt, festgelegt, wobei die Erfassungsgenauigkeit in etwa dem Überschneidungsbereich der Schenkel, einem Quadrat von 100 nm x 100 nm, ent spricht. Der Referenzpunkt 60 bildet die Basis für sämtliche Referenzierungen von Position ei ner Probe, ihrer Ausrichtung und relevanter Fokuspositionen. Das Markerelement 10.3 ist beispielsweise mittels Rasterelektronenmikroskopie (auch Scanning Electron Microscope, SEM) oder Röntgenmikroskopie detektierbar.

Die Markerelemente 10.1, 10.2 und 10.3 bilden eine Markergruppe 1. Da die Markerelemente der Markergruppe 1 jeweils mittels Materialabtrag aus der Fläche 50 abgetragen wurden, kön nen sie sowohl durch einen Farbunterschied, einen Kontrastunterschied und eine Höhendiffe renz bezüglich der Kupferfläche 50 in verschiedenen Mikroskopieverfahren aufgefunden werden, und damit auch hierarchieübergreifend jeweils mit den verschiedenen Mikroskopiever fahren.

Die Form des L wurde gewählt, da die Ecke des L als Bezugspunkt eine hohe Genauigkeit bei der Positionierung einer Probe ermöglicht und gleichzeitig eine Information über die Position der Probe relativ zu dem Markerelement angibt. Die beschriebenen Positionen der Markerelemente 10.1, 10.2 und 10.3 zueinander erlauben deren schnelles auffinden und damit positionieren der Probe, beispielsweise nach dem Wechsel in ein anderes Mikroskop beziehungsweise Beobach tungsgerät.

Durch die Referenzierung der Probe beziehungsweise der interessierenden Probenbereiche in Bezug zu den Markerelementen 10.1, 10.2 und 10.3 können auch die während der Beobach tung oder Untersuchung der Probe erstellten Bildaufnahmen miteinander korreliert und ausge wertet werden. Die Probe (nicht gezeigt), die auf einem Probenträger angeordnet ist, und die Markerelemente 10.1, 10.2 und 10.3 liegen bei dieser Ausgestaltung in der gleichen Ebene.

Figur 6 zeigt eine weitere beispielhafte Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Markerstruktur mit vier Hierarchieebenen. Dabei werden nachfolgend nur die Unterschiede zu Figur 5 beschrie ben.

Die hierarchische Markerstruktur ist auf einer Membran 40, die mit Siliziumnitrit gebildet ist, auf gebracht. Wie in Figur 7 ersichtlich wird, bedeckt die Membran 40 in diesem Ausführungsbei spiel den Probenträger 60 großflächig. Sämtliche Markerelemente 10.1, 10.2, 10.3 und 10.4 in dieser Figur sind mittels ionenstrahlgestützter Deposition (IBAD) auf der Oberfläche der Memb ran ausgebildet. Siliziumnitrit ist für die meisten Mikroskopieverfahren transparent und erlaubt so eine nahezu störungsfreie Erfassung der hierarchischen Markerstruktur von beiden Seiten der Membran 40. Die Membran 40 wird auf den Probenträger (wie in den Figuren 1 bis 4 ge zeigt) aufgebracht und stellt so das Bezugssystem für die Referenzierung von interessierenden Probenbereichen und Fokuspositionen bereit.

Die erste Hierarchieebene wird in Figur 6a gezeigt und durch einen Kreisring 10.1 gebildet, der vergleichbare Abmessungen wie die Kupferfläche 50 aus Figur 5 hat. Dieser Kreisring ist im Wesentlichen mit Chrom gebildet.

Die zweite Hierarchiestufe wird durch die Kreise 10.2 oberhalb und unterhalb des Mittelpunktes des Kreises 10.1 gebildet und entspricht damit der ersten Hierarchiestufe aus Figur 5, mit dem Unterschied, dass die kreisförmigen Markerelemente 10.2 jeweils aus einer Kreisfläche mit ei nem ersten Material und einem darum ausgebildeten Kreisring gebildet sind. Die Kreisfläche ist dabei mit Chrom, der Kreisring mit Platin ausgebildet (nicht separat gezeigt).

Die dritte Hierarchiestufe ist um den Mittelpunkt des Kreises 10.1 angeordnet und in Figur 6b vergrößert dargestellt. Sie entspricht im Wesentlichen der zweiten Hierarchiestufe aus Figur 5. Der Unterschied liegt darin, dass die Kreisflächen 10.3 und das L 10.3 in Figur 6 jeweils mit zwei verschiedenen, benachbart aufgebrachten Materialien ausgebildet sind. Das größere L und jeweils der Kreisring sind mit Platin, das kleinere L und die kleinere Kreisfläche sind mit Chrom ausgebildet.

Als vierte Hierarchiestufe sind zwei, sich an ihren Ecken berührende L 10.4 ausgebildet, wobei ein L mit Platin, das andere mit Chrom ausgebildet ist. Die dritte und vierte Hierarchiestufe sind gemeinsam in Figur 6c gezeigt. In Figur 6d sind exemplarisch mögliche Maße der dritten und vierten Hierarchiestufe benannt.

In Figur 7 ist ein Probenträger 30 gezeigt, auf dem eine Membran wie in Figur 6 beschrieben angeordnet ist. Der Probenträger ist im Bereich der Markerelemente 10.1, 10.2, 10.3 und 10.4 mit Durchbrüchen ausgebildet, so dass die hierarchische Markerstruktur auch in Transmissions verfahren auffindbar sind. Die Probe wird oberhalb der Membran 40 an dem Probenträger 30 befestigt. Alternativ können auch drei einzelne Membranen mit Markerelementen, die jeweils in etwa den Kreisringen 10.1 entsprechen, ausgebildet und auf dem Probenträger 30 angeordnet sein. Auf der Membran 40 sind drei Markergruppen 1a, 1b und 1c ausgebildet, die jeweils wie in Fi gur 6 beschrieben ausgebildet sind. Wie in den Detailauszügen a, b und c der Figur 7 gezeigt, sind sie dabei so angeordnet, dass die L-förmigen Markerelemente 10.3 drei Eckpunkte des gleichen Rechtecks bilden und somit ein eindeutiges Koordinatensystem und eine eindeutige Referenzierung einer Probe oder eines ROI in Bezug zu den Markerelementen 10.1, 10.2, 10.3 und 10.4 ermöglichen.

Figur 8a zeigt eine weitere alternative Ausgestaltung der hierarchischen Markerstruktur. Details sind vergrößert als Figur 8b dargestellt.

Die erste Hierarchieebene 10.1 ist wie in den Figuren 6 und 7 als Kreisring ausgebildet. Der Kreisring 10.1 ist mit Kupfer gebildet. Die zweite Hierarchiestufe 10.2 ist mit einer Vielzahl schmaler, langer Dreiecke, die mit ihren Spitzen auf einen gemeinsamen Mittelpunkt zeigen ge bildet, wobei ein oder zwei der Dreiecke jeweils mit Pfeilspitzen auf die übrigen Markergruppen 1a, 1b und 1c zeigen.

Jeweils im Zentrum der Hierarchieebene 10.2 ist die dritte Hierarchieebene mit einem L-förmi- gen Markerelement 10.3 und in dessen Zentrum die vierte Hierarchieebene mit einem L-förmi- gen Markerelement 10.4 ausgebildet.

Der größeren Maßhaltigkeit beim Aufbringen der Markerelemente 10.1, 10.2, 10.3 und 10.4 we gen wurden sämtliche der Markerelemente 10.1, 10.2, 10.3 und 10.4 mittels ionenstrahlgestütz ter Deposition aufgebracht.

Mit den gezeigten erfindungsgemäß ausgestalteten Markerstrukturen kann jeweils in verschie denen Mikroskopieverfahren und/oder Vergrößerungsstufen mindestens eine der Hierarchie ebenen erfasst werden und als Bezugssystem für die Referenzierungen einer Probe oder eines ROI hinsichtlich Position, Ausrichtung und/oder Fokussierung wirken. Dies ermöglicht es, eine mit einer Mikroskopieart bestimmten interessierenden Bereich in einer anderen Mikroskopieart, in einem anderen Beobachtungsgerät beziehungsweise Mikroskop oder zu einem anderen Zeit punkt schnell und einfach einzustellen. Damit entfällt ein zeitaufwändiger Vorscan der Probe und die Suche nach dem ROI. Die verfügbare Strahlzeit kann besser ausgenutzt werden und ein Austausch von Proben zwischen verschiedenen Geräten und Standorten, beispielsweise in standortübergreifender Projektarbeit, wird deutlich erleichtert. Bezugszeichenliste Markergruppe Markerelement 1. Hierarchieebene Markerelement 2. Hierarchieebene Markerelement 3. Hierarchieebene Markerelement 4. Hierarchieebene Probe Probenträger Durchführung Befestigungselement Aufnahme für Ausrichtelement Überlappungsbereich Öffnung im Probenträger Membran Fläche mit Materialabtrag Referenzpunkt Befestigungsmittel Adapterelement Ausrichtelement Aufnahme in Adapterelement