Die Induzierung einer Immunantwort ist Grundlage bei der Herstellung von Antikörpern und Impfstoffen. Derzeit wird das Protein (Antigen), gegen das eine Immunantwort erzielt werden soll, rekombinant hergestellt und dann im Kombination mit einem Adjuvans appliziert. Diese Methode ist sehr aufwändig, da eine ausreichende Herstellung des Antigens in seiner natürlichen Proteinstruktur oft schwierig ist. Darüber hinaus ist die Verwendung von atenuierten Bakterien oder Viren als Träger zur Expression heterologer Antigene bekannt. Ein Nachteil dieser Lebendvakzine ist jedoch, dass das als Träger verwendete Pathogen unerwünschte Wirkungen hervorrufen kann.

Die Einführung von DNA-Sequenzen in Säugerzellen und Verwendung von rekombinanten Vektoren auf Basis von Nichtsäuger-DNA-Viren ist bekannt (z. B. WO-A-95/23866 oder W096/09074). Darüber hinaus sind Hüllprotein-modifizierte Nichtsäuger-DNA-Virusvektoren, beispielsweise aus W099/09193 und den US-Patenten 6,183, 993 sowie 6,190, 887 bekannt. Auf die Offenbarung dieser Dokumente bezüglich geeigneter viraler Vektoren bzw. der Hüllprotein-Modifizierung wird ausdrücklich Bezug genommen.

Die vorliegende Anmeldung beschreibt die Erfindung, dass eine unerwartet starke Immunantwort gegen Antigene erzeugt wird, wenn diese auf die

Oberfläche eines Nichtsäuger-DNA-Virus, z. B. dem Baculovirus, gebracht werden. Desweiteren wurde entdeckt, dass die Expression einer heterologen DNA-Sequenz ebenfalls eine starke Immunantwort gegen das Produkt des synthetisierten Proteins zur Folge hat. Eine Kombination aus beiden, die Präsentation eines Antigens oder beliebig vieler Antigene auf der Oberfläche eines Nichtsäuger-DNA-Virus und die Expression einer heterologen DNA-Sequenz, die für weitere Antigene kodiert, erlaubt eine sehr starke humorale (Antikörper) und zelluläre Immunantwort. Mögliche Anwendungen der Erfindung sind zum Beispiel die Herstellung von Antikörpern, die Impfung gegen Pathogene oder Tumore und die Isolierung Immunantwort-induzierender Proteine sowie andere.

Ein erster Aspekt der Erfindung betrifft einen rekombinanten Vektor, umfassend ein Nichtsäuger-DNA-Virus, das mindestens eine heterologe, für ein Antigen kodierende DNA-Sequenz in operativer Verknüpfung mit einer in Säugerzellen aktiven Expressionskontrollsequenz, z. B. Promotor, sowie gegebenenfalls Enhancer, enthält.

Die heterologe DNA-Sequenz kann für ein Produkt, gegen das eine Immunantwort induziert werden soll, oder/und für ein Produkt, das eine (gegen ein anderes Produkt gerichtete) Immunantwort verstärkt, kodieren.

Der DNA-Virus kann gegebenenfalls eine modifizierte Hülle, z. B. wie in einem der vorgenannten Dokumente beschrieben, enthalten. Besonders bevorzugt erfolgt eine Modifizierung der Hülle durch Expression von Antigenen, um die Immunantwort weiter zu verstärken. Zur Expression der heterologen DNA-Sequenz wird ein geeigneter, in Säugerzellen aktiver Promoter, z. B. Rous-Sarcoma Virus LTR (RSV) -Promoter oder Cytomegalovirus (CMV)-Promoter, verwendet.

Ein weiterer Aspekt betrifft einen rekombinanten Vektor, umfassend ein Nichtsäuger-DNA-Virus, das mindestens eine heterologe, für ein Antigen

kodierende DNA-Sequenz, fusioniert mit einer für ein Hüllprotein des Virus kodierenden DNA-Sequenz, enthält.

Als geeignete Hüllproteine, die mit dem Antigen fusioniert werden können, kann das Baculovirus gp64-Protein oder ein entsprechendes Hüllprotein aus einem anderen Virus verwendet werden. Die Fusionierung der heterologen DNA-Sequenz an die für ein Hüllprotein kodierende virale Sequenz kann C- terminal, N-terminal oder/und im Inneren der viralen Sequenz erfolgen.

Noch ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft einen rekombinanten Vektor, umfassend ein Nichtsäuger-DNA-Virus, das mindestens eine heterologe, für ein Antigen kodierende DNA-Sequenz in operativer Verknüpfung mit einer in Säugerzellen aktiven Expressionskontrollsequenz und mindestens eine heterologe, für ein Antigen kodierende DNA-Sequenz, fusioniert mit einer für ein Hüllprotein des Virus kodierenden DNA-Sequenz, enthält.

Bevorzugte Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Vektors sind Gegenstand der Unteransprüche 4 bis 10.

Die Erfindung betrifft außerdem eine pharmazeutische Zusammensetzung, die als Wirkstoff einen erfindungsgemäßen viralen Vektor zusammen mit pharmazeutisch üblichen Träger-, Hilfs-und Verdünnungsmitteln enthält.

Die Zusammensetzung kann weiterhin ein die Immunantwort in einem Säuger verstärkendes Adjuvans, wie etwa Aluminiumhydroxide oder Cytosin/Guanin-reiche Sequenzen, enthalten.

Die Zusammensetzung ist zur Verwendung als Vakzine, zur Induzierung einer Immunantwort in Säugern, zur Herstellung von Antigenen und zur Isolierung von Proteinen, die eine Immunantwort induzieren, geeignet.

Die Verabreichung der Zusammensetzung kann auf beliebigem Wege, z. B. durch Injektion, z. B. subkutane, intramuskuläre oder intraperitoneale Injektion, durch orale Verabreichung, durch Inhalation oder nasale Verabreichung oder durch jede andere geeignete Verabreichungsweise erfolgen.

Die Verabreichung kann in einer oder vorzugsweise in mehreren Dosierungen erfolgen. Die Dosismenge beträgt vorzugsweise 107 bis 109, insbesondere 10'Vektoreinheiten/kg.

Die Herstellung der erfindungsgemäßen viralen Vektoren erfolgt nach üblichen Verfahren, wobei zunächst Plasmide, welche die entsprechenden heterologen DNA-Sequenzen tragen, als Rekombinationsvektoren hergestellt und gemeinsam mit der DNA des Nichtsäuger-Virus in permessiven Zellen transfiziert und durch homologe Rekombination der rekombinante Vektor gewonnen werden.

In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung einen Vektor, der eine spezifische Immunantwort gegen Produkte insertierter Sequenzen in Säugetieren und/oder Säugetierzellen induziert. Anwendungsgebiete sind z. B. die Medizin, die Biotechnologie und die Gentechnik. Der Vektor besteht bevorzugt aus einem Insektenvirus, vorzugsweise einem Vertreter der Baculoviren oder einem nuklearen Polyhedrosis-Virus, welches mindestens eine Komponente enthält, ausgewählt aus (i) einer modifizierten Hülle, (ii) einer heterologen DNA-Sequenz und (iii) einem für die Genexpression geeigneten Promotor.

Weiterhin wird die vorliegende Erfindung durch die nachfolgenden Tabellen und Abbildungen sowie durch die nachfolgenden Ausführungsbeispiele näher erläutert :

Tabelle 1 zeigt den Nachweis der Induktion einer starken Immunantwort durch Expression und/oder Oberflächenpräsentation. Baculoviren, die mittels psCSvac, peCSvac und psCSeCS-vac generiert wurden, wurden in BalbC-Mäuse injiziert und die Immunantwort gegen das Antigen wurde anhand des Antikörpers in einem ELISA-Test (nach 56 Tagen) bestimmt.

Tabelle 2 zeigt das Verhältnis der Immunglobuline G 1 und G2a (IgG1/lgG2a) in Mausserum. Dieses Verhältnis wurde aus den Daten der Abbildungen 9 und 10 erhoben. Cytokine regulieren die Produktion der Klassen und Subklassen von Antikörpern. Daher weist ein niedriges Verhältnis von IgG 1/IgG2a auf eine zelluläre Immunantwort hin. Das niedrige Verhältnis von IgG1/IgG2a nach einer Immunisierung mit dem Baculovirus AcNPVsCS/eCS gibt einen deutlichen Hinweis auf eine zelluläre Immunantwort. Hingegen zeigt die immunisierung mit rekombinantem CS- Protein und Aihydroge) ein hohes IgG1/lgG2a-Verhältnis, das auf keine zelluläre Immunantwort hindeutet.

Abbildung 1 zeigt den Rekombinationsvektor psCSvac. Das Antigen (hier beispielhaft das Circumsporozoite-Protein (CS) von Plasmodium falciparum) wird durch Nutzung dieses Vektors auf der Oberfläche des Virus präsentiert und induziert hauptsächlich eine humorale Immunantwort.

Abbildung 2 zeigt den Rekombinationsvektor peCSvac. Das Antigen (hier beispielhaft das Circumsporozoite-Protein (CS) von Plasmodium falciparum) wird durch Nutzung dieses Vektors in der Zelle exprimiert und induziert hauptsächlich eine zelluläre Immunantwort.

Abbildung 3 zeit den Rekombinationsvektor psCS/eCSvac. Das Antigen (hier beispielhaft das Circumsporozoite-Protein (CS) von Plasmodium falciparum) wird durch Nutzung dieses Vektors auf der Oberfläche des Virus präsentiert und in der Zelle exprimiert und induziert eine starke humorale und zelluläre Immunantwort.

Abbildung 4 zeigt ein Schema der neuen Vektoren. psCS führt zu einem Vektor, der das/die Antigen (e) auf der Oberfläche trägt. peCSvac führt zu einem Vektor, der das/die Antigen (e) in der Zelle exprimiert. psCS/eCSvac führt zu einem Vektor, der das/die Antigen (e) auf der Oberfläche trägt und gleichzeitig das/die Antigene) in der Zelle exprimiert.

Abbildung 5 zeigt den Nachweis der Induktion einer starken Immunantwort.

Ein Baculovirus, das mittels des Vektors psCSvac generiert wurde, wurde in BalbC-Mäuse injiziert und vermittelte eine starke und lang anhaltende Immunantwort gegen das CS-Antigen, die durch mehrmalige Gabe noch gesteigert werden konnte (Boost).

Abbildung 6 zeigt eine Übersicht des Immunisierungsregims und der Tierversuchsbedingungen des Beispiels 2.

Abbildung 7 zeigt die Malaria CS-spezifische Immunglobulin M (IgM)- lmmunantwort.

Abbildung 8 zeigt die Malaria CS-spezifische Gesamt-Immunglobulin G (IgG H + L, schwere und leichte Kette)-Immunantwort.

Abbildung 9 zeigt die Malaria CS-spezifische Immunglobulin G1 (IgG1)- Immunantwort.

Abbildung 10 zeigt die Malaria CS-spezifische Immunglobulin G2a (IgG2a)- lmmunantwort.

Abbildung 11 zeigt die Malaria CS-spezifische zelluläre Immunantwort durch Baculovirus AcNPVsCS/eCS.

Beispiel 1 : Herstellung eines Nichtsäuger-DNA-Virus, das Antigene auf der Oberfläche trägt.

Es wurde eine Sequenz für ein N-terminal modifiziertes Nichtsäuger-DNA- Virus-Hüllprotein (Baculovirus, gp64) unter Kontrolle eines baculoviralen Promoters in einen Rekombinationsvektor in bekannter Weise kloniert. Die Modifizierung wurde durch Insertion von DNA-Sequenzen, die für Antigene von Pathogenen, Viren und/oder Tumoren kodieren, gestaltet. Dabei wird diese Sequenz zwischen die Signalsequenz und die Sequenz des Baculovirus-Hüllproteins gp64 auf DNA-Ebene erreicht. Am Beispiel des Plasmodium falciparum Circumsporozoite-Proteins (CS) soll dies nachfolgend dargestellt werden.

Die Herstellung der Rekombinationsvektoren erfolgte nach Standardmethoden. Die Plasmide sind in Abbildung 1-3 gezeigt und sind beliebig modifizierbar durch Austausch der CS durch weitere Antigene, wie z. B. Tumorantigene oder Virus/Pathogen-Antigene. Die Rekombinationsvektoren werden gemeinsam mit der DNA eines Insektenvirus in Insektenzellen transfiziert und durch homologe Rekombination wird der virale Vektor aus dem Überstand der Insektenzellkultur gewonnen. Das entsprechende Virus (Abbildung 4) wird anschließend in aktiver oder inaktiver Form dazu verwendet, in Säugetieren Antikörper gegen die insertierten Antigene zu gewinnen, zu impfen (therapeutisch oder sterilisierend) oder Immunantwort-indzierende Proteine zu isolieren.

Beispiel 2 : Immunisierungsregime und Tierversuchsbedingungen.

Es wurden folgende Agenzien unter folgenden Bedingungen aufgeteilt in drei Versuchstiergruppen zu je drei Tieren in balb/c-Mäuse injiziert : 1. Jeweils 5x108 pfu Baculovirus (AcNPVsCS/sCS, siehe Abbildung 4), das mittels psCS/eCSvac generiert wurde, und damit das Malaria

Circumsporozoit (CS) -Protein auf der Oberfläche trägt als auch in Zielzellen exprimiert.

2. Jeweils 10, ug rekombinantes Malaria Circumsporozoit (CS)-Protein, das vorher an Alhydrogel° adsorbiert wurde (Alhydrogel-CS).

3. PBS (Mock)-injizierte Tiere dienen als Kontrolle.

Die erste Injektion (Priming) sowie eine weitere Injektion (Boost) nach drei Wochen erfolgte jeweils intramuskulär in allen Versuchstiergruppen in einem Gesamtvolumen von 50//) (Abbi) dung 6). Blut wurde zur Bestimmung des spezifischen CS-Antikörpertiters (Ab) im Serum zu den angegebenen Zeitpunkten retroorbital entnommen (Abbildung 6). Der Antikörpertiter wurde im Serum von immunisierten und geboosteten Mäusen zu den angegebenen Zeitpunkten mittels eines standardisierten ELISA bestimmt. Für diesen ELISA wurde rekombinantes CS-Protein auf 96-Well Platten adsorbiert, anschließend wurden die Platten mit verschiedenen Verdünnungen der Mausseren aus den behandelten Tieren inkubiert und nachfolgend mittels eines Enzym-gekoppelten anti-IgM- (Abbildung 7), anti-IgG- (Abbildung 8), anti-IgG1 (Abbildung 9) und anti IgG2a-(Abbildung 10) spezifischen Antikörpers nach Standardmethoden quantitativ entwickelt.

Der durch das Baculovirus (AcNPVsCS/eCS) induzierte CS-spezifische anti- lgM-Antikörpertiter war deutlich höher als jener in der mit Alhydrogel/CS- behandelten Tiergruppe (Abbildung 7). Des Weiteren führen beide (AcNPVsCS/eCS und Alhydrogel/CS) Immunisierungen im Gegensatz zur mock-Injektion zu einem hohen anti-IgG-Antikörpertiter gegen das Circumsporozoite-Protein (CS-Protein) und zeigen damit eine starke humorale Immunantwort (Abbildung 8). Der durch das Baculovirus (AcNPVsCS/sCS) induzierte CS-spezifische anti-IgG1-Antikörpertiter war hingegen deutlich niedriger als jener in der mit Alhydrogel/CS-behandelten Tiergruppe. Des Weiteren war der durch das Baculovirus (AcNPVsCS/eCS) induzierte CS-spezifische anti-IgG2a-Antikörpertiter deutlich höher als jener

in der mit Alhydrogel/CS-behandelten Tiergruppe (Abbildung 10). Das deutet auf die Induktion einer zusätzlichen Immunantwort durch Baculovirus (AcNPVsCS/eCS) hin (Tabelle 2).

Die Milz wurde nach fünf Wochen zur Bestimmung der spezifischen T- Zellantwort im ELlspot-Assay (ELI) entnommen. Die Methode ELlspot weist die spezifische Sekretion von Interferon-gamma durch T-Zellen aus der Milz von immunisierten Mäusen nach Aktivierung der T-Zellen mit CS-Protein nach. T-Zellen aus mit Baculovirus AcNPVsCS/eCS immunisierten Mäusen zeigen eine deutliche Interferon-gamma-Sekretion im ELlspot (22 spots bei 2 ug CS, 89 spots bei 10 ug CS-Antigen (Abbildung 1 1)). Im Gegensatz dazu konnte bei den mock-infizierten Tieren keine Interferon-gamma- Sekretion festgestellt werden (4-5 spots = Hintergrund der Methode) (Abbildung 11). Concanavalin A aktiviert T-Zellen unspezifisch und dient bei diesem Experiment als Positivkontrolle. Dies zeigt, dass das Baculovirus in der Lage ist, eine starke zelluläre Immunantwort zu induzieren, die notwendig ist, um Menschen vor Pathogenen, wie Plasmodium falciparum, zu schützen.

Die Ergebnisse des präklinischen Immunisierungsexperiments durch AcNPVsCS/eCS sind in den Abbildungen 7-11 und Tabelle 2 gezeigt. Die Quantität und die Qualität der induzierten humoralen und zellulären Immunantwort würde auf den Menschen übertragen zu einem protektiven Schutz gegen eine Malariainfektion führen.