VECTOR VIRAL Y SUS APLICACIONES

CAMPO DE LA INVENCIóN

La presente invención se engloba dentro del campo de la ingeniería genética. Concretamente, la invención se refiere a unos vectores virales mutados y a sus aplicaciones, en particular, en la generación in vitro de líneas celulares estables y la producción de proteínas de forma constitutiva.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIóN

Se han desarrollado vectores de expresión de alfavirus a partir de diferentes virus, que incluyen el virus Sindbis (SIN) (34), el virus del Bosque de Semliki (SFV) (18) y el virus de la encefalitis equina venezolana (VEE) (25). Normalmente, los vectores de alfavirus están basados en replicones de ARN en los que los genes estructurales se han sustituido por un gen heterólogo.

El replicón del alfavirus contiene una ORF que codifica la replicasa (Rep) vírica en su extremo 5', que se traduce cuando el ARN se transfecta en células eucariotas. La Rep se expresa como una poliproteína que se procesa, posteriormente, en cuatro subunidades (nsps 1 a 4) (30). La Rep sin procesar puede copiar el vector de ARN en una cadena negativa de ARN, un proceso que sólo tiene lugar durante las primeras 3 a 4 horas tras la transfección o infección. Una vez procesada, la Rep utilizará el ARN de cadena negativa como molde para sintetizar más moléculas del replicón. La Rep procesada también puede reconocer una secuencia interna en el ARN de cadena negativa, o promotor subgenómico, a partir del cual sintetizará un ARN de cadena positiva subgenómico que corresponde al extremo 3' del replicón. Este ARN subgenómico se traducirá para producir la proteína heteróloga en grandes cantidades. El ARN del replicón también se puede empaquetar en partículas víricas mediante la co-transfección de las células con uno o más ARN auxiliares que son capaces de proporcionar las proteínas estructurales víricas en trans (2, 4, 8, 25, 29) o utilizando líneas celulares estables empaquetadoras (24).

La replicación de los vectores de alfavirus es citopática en la mayoría de las células de mamífero debido a mecanismos que todavía no se comprenden del todo (3, 9, 13). El efecto citopático inducido por estos vectores está mediado por apoptosis independiente de p53 y, normalmente, se produce entre las 48-72 horas después de la transfección o infección (14). Se sospecha que la nsp2, uno de los 4 componentes de la replicasa viral, podría tener un papel importante en la inducción de la apoptosis (11, 12).

Los vectores citopáticos de alfavirus se han utilizado en una serie de aplicaciones que incluyen la producción y caracterización de proteínas in vitro (33), así como en estudios sobre vacunación y en terapia génica del cáncer (19, 26). Sin embargo, un inconveniente importante de tales vectores virales de tipo silvestre radica en el hecho de que no se puedan utilizar en aplicaciones en las que se desea una expresión duradera del transgén.

Para solventar ese problema, varios grupos han identificado una serie de mutaciones en la replicasa de los alfavirus que pueden convertir esos vectores virales citopáticos en vectores virales no citopáticos, lo que permite una expresión más duradera de los productos recombinantes expresados por el vector viral. Estos estudios han conducido a la generación de vectores no citopáticos derivados de SIN (7, 22), SFV (20-22) y, más recientemente, de VEE y EEE (virus de la encefalitis equina oriental) (23).

La mayoría de las mutaciones no citopáticas detectadas en los alfavirus se han localizado en la subunidad nsp2 de la Rep. Esta proteína contiene un dominio helicasa en el extremo amino y un dominio proteolítico en el extremo carboxilo, estando éste último implicado en el procesamiento de la Rep en sus cuatro subunidades (30). Se ha demostrado que las mutaciones no citopáticas descritas para nsp2 afectan bien al dominio proteolítico de nsp2 o bien a posiciones próximas a los sitios de escisión entre nspl/2 o nsp2/3, alterando, de este modo, el procesamiento de la Rep.

Un muíante no citopático aislado en SIN, que contenía un sólo cambio de aminoácido (P por L) en la posición 726 en nsp2 (vector de SIN P726L en nsp2), mostró un

hiperprocesamiento de la Rep (7). Este muíante fue capaz de establecer replicación continua en células BHK de manera eficaz. La introducción de diferentes cambios de aminoácidos en la misma posición en este mutante demostró que existe una fuerte correlación positiva entre el nivel de replicación del ARN y la citopatogenicidad del vector. Este vector no citopático de SIN se ha utilizado ampliamente in vitro, ya que es capaz de proporcionar una expresión duradera del transgén con buenos niveles de estabilidad y niveles de expresión que eran aproximadamente el 4% de los obtenidos con el vector de SIN original [wild type (wt)] (1). No obstante, a pesar de que dicho vector no es citopático, carece de capacidad para generar líneas celulares estables con altos niveles de expresión. Efectivamente, en líneas celulares generadas con el vector de SIN P726L que portaba el gen LacZ, la expresión del transgén se perdía en el 45% de las células transfectadas después de 5 pases, y sólo se lograba aumentar la estabilidad de la expresión seleccionando clones individuales (1), lo que retrasa considerablemente la obtención de un número elevado de células capaces de expresar el transgén eficientemente. Aun así, esas líneas mantenían unos niveles de expresión bajos (4% de los niveles obtenidos con el vector SIN wt).

Se ha descrito, además, un vector de SFV no citopático que comprende las mutaciones P718T y R649H (R649H/P718T) en la subunidad nsp2, que expresa el gen pac de resistencia a puromicina aunque no se ha descrito su capacidad para generar líneas celulares estables de alta expresión (Smerdou, C. et al. 2004. Seventh International Symposium on Positive Strand RNA Viruses, S. Francisco, EEUU).

Respecto a los mutantes no citopáticos de SFV descritos por Peni et al. (22), que incluyen los mutantes SF2A (mutación LlOT en nsp2) y SF2C (mutación L713P en nsp2), así como el doble mutante PD (S259P y R650D en nsp2) descrito por Lundstróm et al. (21), es cierto que pueden expresar niveles de proteína similares o incluso superiores a los del virus de tipo silvestre (mutante PD), pero en todos los casos esos mutantes continúan siendo citopáticos (véase el Ejemplo 8 de esta descripción) y no se ha descrito la generación de líneas celulares estables que expresen proteínas heterólogas basadas en dichos vectores virales. Los datos referentes al carácter citopático del vector

SFV-PD están apoyados, además, por resultados publicados posteriormente por

Lundstróm et al. (20) en los que se muestra cómo la expresión de β-gal o GFP en células BHK infectadas con un vector SFV-PD que porta LacZ o GFP como gen marcador alcanza un máximo a las 48 horas para después disminuir drásticamente en los 3-4 días siguientes, lo que indica que se está produciendo un efecto citopático en las células (véase la Figura 2 de la referencia citada).

Por tanto, aunque se han descrito mutantes puntuales en el gen que codifica la proteína nsp2 de los alfavirus SIN y SFV y aunque esos mutantes presentan una disminución en la citopatogenicidad, ninguno de dichos mutantes ha mostrado capacidad para generar líneas celulares estables con altos niveles de expresión.

Por tanto, sigue existiendo la necesidad de desarrollar vectores de alfavirus virales no citopáticos alternativos, útiles para producir líneas celulares estables capaces de producir la proteína heteróloga de forma estable en presencia de selección.

COMPENDIO DE LA INVENCIóN

Los vectores de alfavirus pueden expresar niveles elevados de proteínas recombinantes en diferentes tipos de células. Sin embargo, esta expresión es transitoria debido a la naturaleza citopática de la replicación vírica. Para adaptar estos vectores para estudios a largo plazo, se han aislado mutantes no citopáticos del virus Sindbis (SIN), del virus del Bosque de Semliki (SFV) y del virus de la encefalitis equina venezolana (VEE). La mayoría de estos mutantes contienen cambios en nsp2, una subunidad de la replicasa vírica.

Para generar nuevos vectores de SFV no citopáticos se han introducido las mutaciones descritas para crear un vector de SIN no citopático, en una posición conservada en SFV. Curiosamente, se encontró que un replicón de SFV que contenía la mutación P718T en nsp2 y portaba el gen LacZ como gen heterólogo (SFV-LacZ), a pesar de que aparentemente era incapaz de replicarse en la mayoría de las células, daba lugar a variantes no citopáticas que formaban colonias que expresaban β-galactosidasa (β-gal) sin aplicarles selección. Se emitió la hipótesis de que las variantes no citopáticas se

debían a mutaciones adaptativas secundarias. Para aislar esas variantes, se introdujo el gen de la puromicina N-acetil-transferasa (pac) [gen de selección] en el muíante SFV- P718T y se seleccionaron los clones de las células BHK que eran resistentes a la puromicina. A partir de uno de los clones seleccionados se rescató un replicón no citopático que contenía una segunda mutación en la señal de localización nuclear de nsp2, concretamente, la mutación R649H. Este doble muíante, identificado como SFV- S2-9 en esta descripción, que contenía las mutaciones R649H y P718T en nsp2, se replicaba a unos niveles que eran 60 veces menores que los del vector de SFV de tipo silvestre, hecho que correlacionaba con la ausencia de cilopaíogenicidad en las células íransfectadas con el vector de SFV que contenía la doble mutación R649H/P718T en nsp2. Se observó un nivel similar de expresión de β-gal en células íransfectadas con SFV-S2-9-LacZ y SFV-LacZ a las 24 horas de la íransfección, que esíaba en el rango de 15 pg/célula aproximadamente (Figura 6).

Sorprendentemente, vectores virales no citopáticos basados en dicho doble muíaníe de SFV (SFV-S2-9), que contenían la doble mutación R649H/P718T en nsp2, fueron capaces de generar líneas celulares eslables capaces de expresar β-gal duraníe al menos 10 pases en cullivo (el porceníaje de células que expresaban la β-gal, deíerminado en cada pase medianíe la íinción con X-gal, varió eníre el 70% y el 90% según el pase, pero estaba por encima del 85% en el pase 10, lo que indicó una gran estabilidad de la expresión del íransgén en presencia de la selección, como puede comprobarse en la Figura 7), siendo además la expresión constitutiva pues aumeníó con el íiempo en las células íransfecíadas con SFV-S2-9-LacZ, alcanzando una esíabilización a aproximadamente 30 pg de β-gal/célula a las 48 horas de la transfección. Es decir, medianíe la íransfección con el vector de SFV doble muíanle (R649H/P718T), no cilopálico, se consiguió cuanliíalivamenle el doble de expresión al logrado a las 24 horas de posí-transfección cuando las células eran transfecladas con el vecíor de SFV de tipo silvesíre.

Dicho vector de SFV doble mulante (R649H/P718T), no citopálico, fue también capaz de generar líneas celulares estables capaces de expresar, de forma constitutiva, unas proteínas heterólogas de interés, lales como la cardiolrofina-1 de rala (CTr) y el faclor

de crecimiento humano similar a la insulina (IGF-I), a niveles similares a los obtenidos cuando se utilizaba el vector de SFV de tipo silvestre.

Efectivamente, dicho vector de SFV doble mutante (R649H/P718T) fue capaz de generar líneas celulares estables capaces de expresar, de forma constitutiva, CTr a niveles similares a los obtenidos con el vector de SFV de tipo silvestre, que eran de 4,3 pg/célula aproximadamente (Ejemplo 9). Aunque se observó una alta estabilidad del vector en las líneas celulares analizadas, en aquellas líneas que expresaban CTr y pac a partir de 2 promotores subgenómicos independientes se observó una estabilidad menor que con el gen LacZ, comenzando a disminuir la expresión de CTr a partir del pase 6 para prácticamente desaparecer a pase 11 (Figura 16). Sin embargo, la fusión de los genes CTr y pac utilizando la secuencia nucleotídica que codifica la autoproteasa 2A del virus de la fiebre aftosa (FMDV) como conector permitió generar líneas celulares estables en las que la estabilidad de la expresión de CTr se mantuvo sin variaciones durante al menos 10 pases (Figura 17).

Asimismo, dicho vector de SFV doble mutante (R649H/P718T) fue también capaz de generar líneas celulares estables capaces de expresar el IGF-I a niveles comparables con los obtenidos con el vector de SFV de tipo silvestre (Figura 19), que eran de aproximadamente de 50 pg/célula (Ejemplo 10). Las líneas que expresaban IGF-I y pac a partir de 2 promotores subgenómicos independientes mostraron niveles de expresión de IGF-I algo inferiores al vector de SFV de tipo silvestre (unas 2 veces menos en pase 1) y, además, mostró una estabilidad menor que con el gen LacZ, comenzando a disminuir la expresión a partir del pase 5 y disminuyendo unas 80 veces entre los pases 1 y 10 (Figura 20). La fusión de los genes pac e IGF-I utilizando la secuencia nucleotídica que codifica la autoproteasa 2A del FMDV como conector permitió generar líneas estables en las que la expresión de IGF-I en pase 1 era más próxima a la del vector de SFV de tipo silvestre y en las que la estabilidad de la expresión de IGF-I se mantuvo con pequeñas variaciones hasta el pase 10 (en el pase 10 fue sólo 4 veces inferior a la observada en el pase 1) (Figura 20).

Por otro lado, la presente invención, tal y como se puede comprobar en el Ejemplo 8, rompe un prejuicio establecido en el estado de la técnica al demostrar, que vectores

mutados de SFV presentes en el estado de la técnica y definidos como no citopáticos, mantienen las características de citopatogenicidad.

Tal y como se expresa en la presente invención el término "línea celular estable" se refiere a líneas celulares donde el porcentaje de células que expresan un producto heterólogo (e.g., un péptido o una proteína heteróloga, etc.) en el pase 10 es superior al 85%, pudiendo mantenerse o superarse dicho porcentaje en pases sucesivos o posteriores.

El término "expresión constitutiva", tal como aquí se utiliza, se refiere a la capacidad adicional, que, sorprendentemente, presentan las líneas celulares estables arriba citadas, de expresar el producto heterólogo a un nivel cuantitativamente alto (superior al 50% respecto al conseguido a las 24 horas de post-trasducción cuando las células se transducen con el vector de tipo silvestre).

Asimismo, tal y como se conoce en el estado de la técnica, un "replicón de ARN" es una secuencia de nucleótidos que se replica de forma unitaria utilizando como intermedio un ARN complementario que sirve como molde para producir más moléculas del ARN original. Para ello, generalmente, son necesarias secuencias específicas en los extremos del ARN. El replicón contenido en los vectores virales proporcionados por la presente invención comprende el extremo 5' necesario para la replicación de SFV, la secuencia codificante de la enzima replicasa de SFV con las mutaciones P718T y R649H en la región nsp2, al menos un promotor subgenómico viral de SFV, un polinucleótido que comprende un gen de selección, un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un producto heterólogo de interés, y el extremo 3' necesario para la replicación de SFV que contiene una secuencia terminal de poliadeninas (Poli A). En una realización particular, dicho polinucleótido que comprende el gen de selección, así como dicho polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un producto heterólogo de interés, están colocados cadena abajo de 2 promotores subgenómicos independientes y operativamente unidos a dichos promotores (es decir, uno de dichos polinucleótidos está colocado cadena abajo de, y operativamente unido a, un promotor subgenómico y el

otro polinucleótido está colocado cadena abajo del, y operativamente unido al, otro promotor subgenómico). En otra realización particular, dicho polinucleótido que comprende el gen de selección y dicho polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un producto heterólogo de interés están fusionados entre sí, ventajosamente, a través de un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un sitio de corte proteolítico post-traduccional, ventajosamente, un sitio de corte autoproteolítico post-traduccional, y están colocados cadena debajo de, y operativamente unidos a, un único promotor subgenómico.

Por tanto, en un aspecto, la invención se relaciona con un vector viral (vector viral de la invención) que comprende un replicón del virus del Bosque de Semliki (SFV), en donde dicho replicón comprende (i) la secuencia de nucleótidos que codifica la enzima replicasa de SFV con las mutaciones P718T y R649H en la subunidad nsp2, (ii) un polinucleótido que comprende un gen de selección, y (iii) un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un producto heterólogo de interés.

En otro aspecto, la invención se relaciona con el uso de un vector viral de la invención para la generación in vitro de líneas celulares estables con capacidad de expresar constitutivamente productos heterólogos de interés.

En otro aspecto, la invención se relaciona con una línea celular estable con capacidad de expresar constitutivamente productos heterólogos de interés, caracterizada porque es una línea celular transfectada con un vector viral de la invención.

En otro aspecto, la invención se relaciona con un método para la generación in vitro de dicha línea celular estable con capacidad de expresar constitutivamente productos heterólogos de interés.

En otro aspecto, la invención se relaciona con el uso de dicha línea celular estable para la producción in vitro de productos heterólogos de interés.

En otro aspecto, la invención se relaciona con un método para la producción in vitro de un producto heterólogo de interés que comprende cultivar dicha línea celular estable bajo condiciones que permiten la expresión del producto heterólogo de interés contenido en el vector viral utilizado para generar dicha línea celular estable.

BREVE DESCRIPCIóN DE LA FIGURAS

Figura 1. Evaluación de la citopatogenicidad de los vectores de SFV que llevan mutaciones derivadas de SIN. Los plásmidos pSFV-LacZ que contienen mutaciones P718T (pSFV-S2-LacZ) y P718F (pSFV-S3-LacZ) en nsp2 se construyeron tal y como se describe en los ejemplos. Se transcribió el ARN in vitro a partir de cada uno de estos plásmidos así como del pSFV3-LacZ original y se electroporó en células BHK que se sembraron en placas de 35 mm de diámetro con una confluencia baja y se tiñeron con X-gal después de cultivarse durante los tiempos indicados. En el caso de SFV-S2-LacZ o SFV-S3-LacZ, se dio un pase 1 :5 a las células transfectadas con dichos vectores después de 96 horas en cultivo. Se muestra una representación esquemática del ARN de cada vector encima de cada conjunto de imágenes. Cap: círculo en el extremo izquierdo de los vectores; nsp: proteínas no estructurales; flecha horizontal: promotor subgenómico del SFV; An: poli A.

Figura 2. Células BHK resistentes a puromicina seleccionadas después de ser electroporadas con diferentes ARNs. Las células BHK se electroporaron con los vectores de ARN de SFV indicados o sin ARN (no RNA), se sembraron en placas de 35 mm de diámetro y se dejaron recuperar durante 24 horas antes de añadir la puromicina a 5 μg/ml. Las placas se tiñeron con violeta de metilo en los tiempos indicados después de la transfección.

Figura 3. Localización intracelular de nsp2 en las células transfectadas con ARN del SFV. Las células BHK se electroporaron con los vectores de ARN de SFV o sin ARN (no RNA) y se analizaron mediante inmunofluorescencia a las 24 horas de la transfección. Como anticuerpos primarios se utilizaron anticuerpos monoclonales de ratón específicos de las formas nucleares (αnsp2-n) o citoplásmicas (αnsp2-c) de nsp2, y

como anticuerpo secundario se utilizó un suero policlonal de conejo específico para IgGs de ratón conjugado con FITC. Los núcleos teñidos con dapi de las mismas células se visualizaron con un filtro de UV (Dapi).

Figura 4. Análisis de los ARN de SFV en las células BHK transfectadas. Se extrajo el ARN total de una línea celular estable de BHK obtenida después de la electroporación del replicón SFV-S2-9-pac y de la selección con puromicina (calle 1) o de las células BHK electroporadas con SFV-S2-9-pac (calles 2-4), SFV-pac (calle 5), SFV-LacZ (calle 6) o coelectroporadas con los replicones SFV-S2-9-pac y SFV-pac (calle 7) y se analizó a las 24 horas (calles 2, 5 a 7), 48 horas (calle 3) o 72 horas (calle 4) de la electroporación. La presencia de los ARNs genómico (g) y subgenómico (sg) de SFV se analizó mediante transferencia Northern con un oligonucleótido marcado con ³² P específico del promotor subgenómico de SFV. Los números en la parte inferior de los geles indican la proporción de ARN subgenómico/genómico (sg/g) en cada caso. En la calle 7, se refieren a la proporción sg/g de SFV-S2-9-pac (pac) o de SFV-LacZ (LacZ), respectivamente. La parte izquierda del gel se expuso durante 72 horas mientras que la parte derecha se expuso durante 1 hora.

Figura 5. Expresión in vitro e in vivo de las proteínas no estructurales. A) El ARN de SFV-pac original (tipo silvestre) o los ARN de SFV-pac que contienen las mutaciones indicadas se tradujeron en Usados de reticulocitos de conejo en presencia de [ ³⁵ S]- metionina y [ ³⁵ S]-cisteína, y se analizaron mediante SDS-PAGE en geles al 8% y luego se autorradiografiaron. Dos geles que contenían las mismas muestras se corrieron tiempos diferentes para obtener una mejor separación de las bandas de peso molecular elevado (gel superior, migración más larga) y para detectar los monómeros nspl y 3 de peso molecular más pequeño (gel inferior, migración más corta). B) Análisis de la expresión de la replicasa en las células transfectadas. Los Usados de las células BHK control, de una línea celular estable de BHK obtenida después de la electroporación con el replicón SFV-S2-9-pac y selección con puromicina (S2-9) o de células electroporadas con los ARN de SFV-pac original (tipo silvestre) o del mutante SFV-RHR-pac (RHR) se analizaron mediante inmunotransferencia utilizando un antisuero policlonal de conejo específico contra nsp2 (gel superior) o contra nsp3 (gel del centro). Como control

interno, se analizaron las mismas muestras con un anticuerpo específico contra la β- actina.

Figura 6. Análisis de la expresión de β-gal. Se electroporaron células BHK con los ARNs indicados y se determinó el nivel de expresión de β-gal por célula a los tiempos indicados después de la electroporación. En el eje de abscisas se representa el tiempo post-transfección en horas y en el eje de ordenadas los picogramos de β-gal por célula.

Figura 7. Estabilidad de la expresión de β-gal en las células transfectadas con el vector SFV-S2-9-LacZ-pac. Las células BHK se electroporaron con ARN de SFV-S2-9-LacZ- pac y se seleccionaron en presencia de puromicina a 5 μg/ml. Las células seleccionadas se pasaron cada 2-3 días con o sin puromicina y se determinó el porcentaje de células que expresaban β-gal en cada pase mediante tinción con X-gal. Los datos corresponden a la media de tres experimentos diferentes, mostrándose la desviación estándar. La figura muestra un campo típico de células BHK que contienen el vector SFV-S2-9- LacZ-pac pasadas 10 veces en presencia de puromicina y teñidas con X-gal. En el eje de abscisas se representa el número de pases y en el eje de ordenadas se representa el porcentaje de células teñidas de azul.

Figura 8. Representación esquemática de 3 ejemplos de realizaciones, en forma de ARN, del vector viral para la generación de líneas celulares estables y producción de proteínas estables. El replicón SFV está flanqueado por las secuencias 5' y 3' necesarias para la replicación de SFV, donde la secuencia 3' incorpora una secuencia terminal de poliadeninas (Poli A). Dentro del replicón se incluye la replicasa con las subunidades nspl a nsp4 y el promotor subgenómico de SFV solapado con nsp4 (SGl). Sobre nsp2 se representan las mutaciones R649H y P718T características de la replicasa del vector. El replicón incorpora también un gen de selección (PAC) y un gen de interés (GOI) que codifica la proteína recombinante que interesa producir de forma constitutiva. En los ejemplos A y C el replicón incorpora también un segundo promotor subgenómico (SG2) de manera que la expresión de PAC y GOI está controlada por un promotor SG distinto, indistintamente SGl o SG2 según la construcción A o C elegida. En el ejemplo B la expresión de PAC y GOI está controlada por el mismo promotor SGl, produciendo una

proteína híbrida que es cortada por proteasas en un sitio específico intercalado entre PAC y GOI. cap: estructura cap.

Figura 9. Evaluación del efecto citopático de SFV-LacZ. Se transcribió ARN in vitro a partir del plásmido pSFV-LacZ (vector de tipo silvestre) y se electroporó en células BHK. Las células se distribuyeron en placas de 35 mm a baja confluencia y se fijaron y tiñeron con X-gal a los tiempos indicados (d, día).

Figura 10. Evaluación del efecto citopático de SFV-SF2A-LacZ. Se transcribió ARN in vitro a partir del plásmido pSFV-SF2A-LacZ y se electroporó en células BHK. Las células se distribuyeron en placas de 35 mm a baja confluencia y se fijaron y tiñeron con X-gal a los tiempos indicados (d, día). Las células fueron pasadas 1:5 cuatro días tras la transfección.

Figura 11. Evaluación del efecto citopático de SFV-SF2C-LacZ. Se transcribió ARN in vitro a partir del plásmido pSFV-SF2C-LacZ y se electroporó en células BHK. Las células se distribuyeron en placas de 35 mm a baja confluencia y se fijaron y tiñeron con X-gal a los tiempos indicados (d, día). Las células fueron pasadas 1 :5 cuatro días tras la transfección.

Figura 12. Evaluación del efecto citopático de SFV-PD-LacZ. Se transcribió ARN in vitro a partir del plásmido pSFV-PD-LacZ y se electroporó en células BHK. Las células se distribuyeron en placas de 35 mm a baja confluencia y se fijaron y tiñeron con X-gal a los tiempos indicados (d, día).

Figura 13. Evaluación del efecto citopático de SFV-S2-LacZ. Se transcribió ARN in vitro a partir del plásmido pSFV-S2-LacZ y se electroporó en células BHK. Las células se distribuyeron en placas de 35 mm a baja confluencia y se fijaron y tiñeron con X-gal a los tiempos indicados (d, día). Las células fueron pasadas 1 :5 cuatro días tras la transfección. Este mutante S2 fue capaz de dar lugar a la formación de colonias de células que expresan β-gal.

Figura 14. Evaluación del efecto citopático del vector SFV-S2-9-LacZ que lleva las mutaciones P718T y R649H. Se transcribió ARN in vitro a partir del plásmido pSFV- S2-9-LacZ, pSFV-S2-LacZ o pSFV-LacZ y se electroporó en células BHK. Las células se distribuyeron en placas de 35 mm a baja confluencia y se fijaron y tiñeron con X-gal a los tiempos indicados (d, día).

Figura 15. Análisis de la expresión de cardiotrofina-1 de rata (CTr). A) Esquema de los 2 vectores de SFV no citopáticos que portan el gen pac y el gen de la CTr. Pr sg, promotor subgenómico; 2A, secuencia nucleotídica que codifica la autoproteasa 2A del virus de la fiebre añosa (FMDV). B) Análisis de la expresión de CTr. Se electroporaron células BHK con ARN de SFV-S2-9-CTr-pac (CTr-pac), SFV-S2-9-pac2A-CTr (pac- 2A-CTr) o SFV-S2-9-pac (S2-9-pac) como control negativo y se seleccionaron en presencia de puromicina a 5 μg/ml. Las células seleccionadas se lisaron y se analizó la expresión de CTr mediante inmunotransferencia utilizando un anticuerpo específico para cardiotrofina (gel superior). Como control de cantidad las mismas muestras se analizaron con un anticuerpo frente a actina (gel inferior). wtCT, Usado de células BHK transfectadas con SFV-CTr obtenido a las 24h postransfección y utilizado como control positivo. M, marcadores de peso molecular (kDa).

Figura 16. Análisis de la estabilidad de la expresión de CTr en células BHK a partir del vector SFV-S2-9-CTr-pac. Las células BHK se electroporaron con ARN de SFV-S2-9- CTr-pac y se seleccionaron en presencia de puromicina a 5 μg/ml. Las células seleccionadas se pasaron 1 :5 cada 2-3 días hasta 11 pases consecutivos (pl a pl l) analizándose en cada pase la expresión de CTr en Usados celulares mediante inmunotransferencia con un anticuerpo específico para cardiotrofina (gel superior) y con un anticuerpo específico frente a actina como control de carga (gel inferior). Como control de cantidad se utilizaron varias cantidades de CTr recombinante purificada (recCT). Se muestra un experimento representativo de dos realizados que dieron un resultado similar de expresión y estabilidad. S2-9-pac, control negativo de células electroporadas con el vector SFV-S2-9-pac. M, marcadores de peso molecular (kDa).

Figura 17. Análisis de la estabilidad de la expresión de CTr en células BHK a partir del vector SFV-S2-9-pac2A-CTr. Las células BHK se electroporaron con ARN de SFV-S2- 9-pac2A-CTr y se seleccionaron en presencia de puromicina a 5 μg/ml. Las células seleccionadas se pasaron 1 :5 cada 2-3 días hasta 10 pases (pl a plO) analizándose en cada pase la expresión de CTr en lisados celulares mediante inmunotransferencia con un anticuerpo específico para cardiotrofina (gel superior) y con un anticuerpo específico frente a actina como control de carga (gel inferior). Como control de cantidad se utilizaron varias cantidades de CTr recombinante purificada (recCT). Se muestra un experimento representativo de 4 realizados que dieron el mismo resultado de expresión y estabilidad. S2-9-pac, control negativo de células electroporadas con el vector SFV- S2-9-pac. M, marcadores de peso molecular (kDa).

Figura 18. Esquema de los vectores de SFV no citopáticos que portan el gen pac y el gen del IGF-I. El vector SFV-S2-9-IGF-pac porta el gen pac y el gen de IGF-I bajo el control de promotores subgenómicos virales independientes (Pr sg) donde el gen IGF-I se ha fusionado con el enhancer (potenciador) de traducción de la cápsida de SFV (bl) utilizando la secuencia nucleotídica que codifica la autoproteasa 2A de FMDV (2A) como conector. El vector SFV-S2-9-pac2A-IGF porta el gen pac fusionado con el gen de IGF-I utilizando la secuencia 2A como conector.

Figura 19. Análisis de la expresión de IGF-I. Se electroporaron células BHK con ARN de SFV-S2-9-IGF-ρac, SFV-S2-9-pac2A-IGF o SFV-S2-9-pac (control negativo) y se seleccionaron en presencia de puromicina a 5 μg/ml. Las células seleccionadas se pasaron una vez (pase 1) recogiéndose el sobrenadante a las 24, 48 ó 72 horas tras plaquearlas. La expresión de IGF-I se analizó en cada uno de los sobrenadantes mediante un ELISA específico para IGF-I humano. SFV-IGF-I, sobrenadante de células BHK transfectadas con ARN del vector de tipo silvestre SFV-IGF-I obtenido a las 24h postransfección y utilizado como control positivo.

Figura 20. Análisis de la estabilidad de la expresión de IGF-I en células BHK a partir de distintos vectores. Se electroporaron células BHK con ARN de SFV-S2-9-IGF-pac o SFV-S2-9-pac2A-IGF y se seleccionaron en presencia de puromicina a 5 μg/ml. Las

células seleccionadas se pasaron cada 2-3 días hasta 10 pases consecutivos recogiéndose en cada pase el sobrenadante a las 24 horas de plaquearlas. La expresión de IGF-I se analizó en los sobrenadantes de cada uno de los pases mediante un ELISA específico para IGF-I humano. SFV-IGF-I, sobrenadante de células BHK transfectadas con ARN del vector SFV-IGF-I obtenido a las 24h postransfección y utilizado como control positivo.

DESCRIPCIóN DETALLADA DE LA INVENCIóN

Explicación de la invención

Los vectores de alfavirus presentan varias ventajas, como niveles elevados de expresión del transgén, amplio tropismo y fácil manipulación. La citopatogenicidad que estos vectores producen en la mayoría de las células de vertebrados puede ser ventajosa en algunas aplicaciones, como la vacunación o la terapia génica del cáncer, en la que la apoptosis de las células transducidas puede conducir a la liberación de antígenos que podrían ser captados por las células inmunitarias, lo que favorecería una respuesta inmune contra el antígeno recombinante expresado o contra los antígenos tumorales, respectivamente (19). Sin embargo, el uso de estos vectores en aplicaciones en las que se necesita una expresión duradera del transgén está obstaculizado por su naturaleza citopática.

La posibilidad de adaptar los vectores de alfavirus para expresión a largo plazo ha sido explorada por laboratorios diferentes, lo que ha conducido al aislamiento de variantes no citopáticas de SIN, SFV, VEE y EEE (7, 20-23). En la mayoría de los casos, las mutaciones no citopáticas se han aislado utilizando vectores que llevan un gen heterólogo que codifica una proteína que confiere resistencia a un antibiótico, como la puromicina o el G418. Cuando las células transfectadas con este tipo de vector se incubaron en presencia del antibiótico, sólo se seleccionaron las que albergaban replicones no citopáticos mutantes que expresaban el gen de la resistencia.

Aunque la mayoría de los mutantes de alfavirus que se han descrito llevan mutaciones en nsp2, estas mutaciones alteran diferentes residuos de la proteína en diferentes virus, a pesar de existir un elevado grado de homología de secuencia entre los diferentes alfavirus. Tomando como base esta homología de secuencia, se investigó el efecto de una mutación no citopática bien caracterizada de SIN, que afectaba al residuo 726 de nsp2 en SIN, en el contexto de SFV. Las mutaciones P726L y P726T han sido descritas como no citopáticas por Frolov y col. (7) y Peni y col. (22), respectivamente. En el primer estudio, el residuo 726 también se mutó a todos los otros posibles aminoácidos, lo que generó una colección de mutantes de SIN con diferentes grados de citopatogenicidad. Frolov y col. pudieron establecer una correlación entre el nivel de replicación del ARN y la citopatogenicidad, llegando a la conclusión de que cambios en el residuo 726 de nsp2 que reducían los niveles de ARN a menos del 5% de los niveles observados en el vector de tipo silvestre producían un fenotipo no citopático (7).

Se eligieron dos cambios diferentes, P726T y P726F, que habían sido capaces de reducir los niveles de ARN en SIN al 5,1% y al 1,6% de los niveles silvestres, respectivamente, y se introdujeron las correspondientes mutaciones en la posición 718 de nsp2 de SFV, generándose los mutantes identificados por los inventores como S2 y S3, respectivamente. Ninguno de esos cambios fue capaz de producir un fenotipo no citopático en SFV por sí mismo. Los estudios realizados transfectando células BHK con esos mutantes (S2 y S3) de SFV en los que se había incorporado el gen indicador LacZ demostraron que sólo un pequeño porcentaje de las células transfectadas podían mantener la replicación del vector. El mutante S2 (P718T) parecía ser más estable que el S3 (P718F), y dio lugar a colonias grandes de células que expresaban β-gal en ausencia de selección. Por tanto, se intuyó que estas colonias contenían replicones con mutaciones adaptativas adicionales. Para seleccionar estas colonias e identificar las posibles mutaciones secundarias presentes en los replicones, se clonó el gen de la N- acetil-transferasa (pac) en el mutante S2 de SFV y se aislaron las colonias de las células cultivadas en presencia de puromicina. En uno de los clones analizados, se encontró una segunda mutación en la posición 649 de nsp2 (R649H) que, en combinación con la mutación P718T, fue capaz de proporcionar un fenotipo no citopático para el vector de SFV basado en ese doble mutante de SFV (P718T/R649H). Ese doble mutante de SFV

(P718T/R649H) fue denominado mutante S2-9 por los inventores y aparece en esta descripción como mutante SFV-S2-9 o, simplemente, S2-9, indistintamente.

La mutación R649H afecta a la señal de localización nuclear ⁶⁴⁸ RRR del SFV que se ha descrito que es la responsable del transporte parcial de nsp2 al núcleo de la célula (27). El cambio de Arg por Hys en la posición 649 constituye un cambio muy conservador, que podría explicar el hecho de que no se observara ningún efecto evidente sobre el transporte al núcleo de nsp2 ni en el doble mutante S2-9 (P718T/R649H) ni en el mutante sencillo R649H. Este último mutante (R469H) no mostró ninguna reducción en la citopatogenicidad al compararse con el vector SFV de tipo silvestre, lo que indicó que ambas mutaciones en las posiciones 649 y 718 eran necesarias para eliminar el efecto citopático. Fazakerley y col. habían descrito un cambio más drástico en la posición 649 (R649D), que condujo a la atenuación de la neurovirulencia de SFV en el contexto de un genoma vírico completo (6). En ese caso, la mutación R649D interrumpió completamente el transporte de nsp2 al núcleo, aunque no suprimió el efecto citopático del virus sobre las células BHK. Todos estos datos sugieren que la secuencia ⁶⁴⁸ RRR de nsp2 podría estar implicada en la citopatogenicidad del SFV.

El mutante S2-9, que contenía la doble mutación P718T/R649H, pudo replicarse a niveles que eran aproximadamente 60 veces más bajos que los observados para el vector de SFV de tipo silvestre, lo que podría explicar la ausencia- de citopatogenicidad de dicho mutante S2-9. El nivel del ARN subgenómico en el mutante S2-9 era sólo 30 veces más bajo que el del vector de SFV de tipo silvestre, lo que indicó que la proporción de los ARN subgenómico/genómico había aumentado aproximadamente 2 veces en el mutante S2-9 no citopático. Esta proporción fue incluso mayor al poco tiempo de la transfección, lo que sugiere que la síntesis del ARN genómico en el vector no citopático podría estar retrasada en relación con la del ARN subgenómico. Tanto la disminución de la cantidad de ARN como el aumento de la proporción de los ARNs subgenómico/genómico observados para el mutante S2-9 fueron muy similares a los descritos en los vectores de SIN que contienen mutaciones no citopáticas en la posición

726 de nsp2 (7, 22). Sin embargo, estos resultados se contradecían con los descritos por

Perri y col. para los mutantes de SFV no citopático, en los que la cantidad de los ARNs

mutantes era mayor que la del virus de tipo silvestre, y en el que también disminuyeron las proporciones de los ARN subgenómico/genómico (22), lo que sugiere que en los mutantes de SFV aislados por este grupo podrían estar implicados mecanismos diferentes para el establecimiento de la replicación duradera. El menor nivel de replicación del ARN en el mutante S2-9 no se debía a un efecto en cis de las mutaciones presentes en la secuencia del ARN, ya que una replicasa de tipo silvestre aportada en trans por el vector de SFV de tipo silvestre permitía recuperar los niveles de los ARNs genómico y subgenómico del mutante S2-9 hasta valores próximos a los del vector de SFV de tipo silvestre. Varios estudios realizados con los mutantes de alfavirus han demostrado que las mutaciones no citopáticas en nsp2 pueden alterar la actividad proteolítica de esta proteína, lo que conduce, bien a un hiperprocesamiento de la replicasa (7), o bien a un procesamiento más lento de esta poliproteína (22). En la presente invención no se detectaron diferencias claras en el procesamiento de la replicasa entre el mutante S2-9 y el vector de SFV de tipo silvestre, ni mediante traducción in vitro, ni mediante análisis por inmunotransferencia.

A pesar de los bajos niveles de replicación del mutante S2-9, la cantidad de β- galactosidasa (β-gal) producida por el vector SFV-S2-9-LacZ (un vector viral basado en el mutante S2-9 de SFV) a las 24 horas de la transfección fue muy similar a la obtenida con un vector de SFV de tipo silvestre que expresa el mismo transgén. El nivel de expresión del vector S2-9 aumentó aproximadamente 2 veces a tiempos más tardíos tras la transfección, lo que correlaciona con el aumento observado en los niveles de ARN. El nivel de expresión de la proteína recombinante en otros vectores no citopáticos descritos ha mostrado una gran variabilidad, que oscila desde sólo el 4% de la expresión de tipo silvestre en el caso del mutante de SIN P726L (1) al 1.000% en el caso del doble mutante SFV-PD desarrollado por Lundstrδm et al (21). Sin embargo, el carácter no citopático de este vector quedó cuestionado cuando los mismos autores mostraron que la expresión de β-gal o GFP en células BHK infectadas con un vector SFV-PD que porta LacZ o GFP como gen marcador alcanza un máximo a las 48 horas para después disminuir drásticamente en los 3-4 días subsiguientes (20). En relación con esto, merece la pena añadir que el Ejemplo 8 de esta descripción rompe un prejuicio en el estado de la técnica al demostrar que el vector SFV-PD desarrollado por Lundstróm et al (21) es

citopático. Algunos mutantes adicionales descritos por ese grupo que contienen mutaciones termosensibles también fueron capaces de expresar niveles elevados de proteínas recombinantes, pero solamente a la temperatura permisiva (20, 21). La razón por la que el mutante S2-9 podía expresar mayores cantidades de la proteína recombinante que el vector de SFV de tipo silvestre que tiene unos niveles de ARN mucho más bajos podría estar relacionada con la fuerte inhibición de la síntesis de proteínas inducida por este último vector. Dos publicaciones recientes señalan que la fosforilación de eIF2alfa es el mecanismo mediante el cual los alfavirus inducen una inhibición de la traducción en la célula hospedadora a tiempos tardíos durante la infección (15, 31). Al mismo tiempo, estos autores demuestran que el elemento potenciador de la traducción presente en el extremo 5' del gen de la cápsida permite una traducción eficaz de la poliproteína estructural viral en presencia del eIF2alfa fosforilado. Se ha demostrado que cuando el potenciador de la traducción de la cápsida se fusiona en fase con el extremo amino de una proteína recombinante en el vector de SFV o de SIN, aumenta el nivel de expresión de la proteína recombinante unas 8 veces (10, 28). Este efecto no se observó en el contexto del vector viral derivado del mutante S2-9 de SFV, probablemente porque en las células transfectadas con ese vector no se estaba produciendo inhibición de la traducción por fosforilación de eIF2alfa. La ausencia de inhibición de la síntesis de proteínas en las células transfectadas con el vector viral derivado del mutante S2-9 de SFV podría ser la responsable de que se generen niveles de expresión elevados con unos niveles de ARN más bajos que los alcanzados con el vector de SFV de tipo silvestre.

La eficacia de empaquetamiento del vector viral derivado del mutante S2-9 de SFV era aproximadamente 6 unidades logarítmicas más baja que la del vector de SFV de tipo silvestre que lleva el mismo transgén. Esto se podría deber o bien a los bajos niveles de replicación del ARN o a una deficiencia en el empaquetamiento del doble mutante de

SFV (S2-9). Los experimentos de empaquetamiento en los que se replicó el ARN de dicho vector viral derivado del doble mutante S2-9 de SFV a niveles casi normales mediante la cotransfección de las células con un vector de SFV de tipo silvestre fueron sólo capaces de aumentar unas 15 veces el título de las partículas víricas de S2-9, lo que indicó que los bajos niveles de ARN eran responsables sólo parcialmente de la baja

eficacia de empaquetamiento de este vector. El vector de SFV que contiene sólo la mutación R649H se empaquetó a niveles similares a los del vector de SFV de tipo silvestre, mientras que el vector de SFV que contiene solamente la mutación P718T (SFV-S2) se empaquetó de forma deficiente. Aunque el hecho de que el vector SFV-S2 no sea capaz de replicarse en la mayoría de las células transfectadas podría ser el factor responsable de esta baja eficacia de empaquetamiento, todo indica que esta mutación sola o en combinación con la mutación R649H afecta a la encapsidación del ARN del SFV en partículas víricas. Las señales de empaquetamiento del SFV se han cartografiado en una región del genoma que comprende los nucleótidos 2767 a 2824 (32), y que no se superpone con ninguna de las mutaciones presentes en el mutante S2- 9, localizadas en las posiciones 3643 (R649H) y 3849-51 (P718T). Sin embargo, no se puede descartar que estas mutaciones pudieran afectar a la estructura secundaria del ARN genómico, alterando la accesibilidad de las señales de empaquetamiento. Se necesitan más estudios de mutagénesis para determinar la función precisa de estas secuencias en el empaquetamiento del SFV.

También se ha demostrado que los vectores virales derivados del mutante S2-9 se pueden utilizar eficazmente para generar líneas celulares estables de células BHK que expresen proteínas recombinantes de forma constitutiva, sin necesidad de aislar clones. Para ese propósito, el vector debe contener, además de las mutaciones P718T y R649H, el transgén deseado y un gen de selección (e.g., un gen que codifica una proteína que confiere resistencia a un antibiótico, etc.) útil para la selección de las células que han sido eficazmente transducidas. Utilizando LacZ como el transgén indicador y el gen pac como gen de selección, se generó una línea celular que mostraba una estabilidad muy elevada, expresando β-gal aproximadamente el 85% de las células después de 10 pases en el cultivo, y con unos niveles de expresión que eran similares a los del vector de SFV de tipo silvestre. Esto contrasta con lo que se había observado en una línea celular similar generada con un vector de SIN no citopático que llevaba la mutación P726L en nsp2 y el gen LacZ como gen indicador y que expresaba β-gal a niveles aproximadamente 25 veces más bajos que el vector SIN silvestre (1). En este último caso, la expresión de LacZ se perdió en el 45% de las células después de 5 pases,

aunque se podía alcanzar una mayor estabilidad con este sistema si la línea celular se derivaba de una población clonada de células que expresaban la β-gal.

El vector viral derivado del mutante S2-9 fue capaz de generar líneas celulares estables que expresaban cardiotrofina-1 de rata (CTr) de forma constitutiva. En este caso, la expresión de CTr y pac a partir de un vector que contiene 2 promotores subgenómicos (SFV-S2-9-CTr-pac) dio lugar a la generación de líneas celulares en las que la expresión se mantenía estable durante los 5 primeros pases, perdiéndose gradualmente a partir del pase 5 (Figura 16). Sin embargo, el vector SFV-S2-9-pac2 A-CTr en el que el gen pac y el gen que codifica la CTr están fusionados en fase usando la secuencia nucleotídica que codifica la autoproteasa 2A del FMDV como conector dio lugar a la generación de líneas celulares muy estables que mantuvieron una expresión de CTr elevada, y similar a la obtenida con un vector de SFV de tipo silvestre, durante al menos 10 pases en cultivo (Figura 17).

Asimismo, el vector viral derivado del mutante S2-9 también fue capaz de generar líneas celulares estables que expresaban el factor de crecimiento semejante a la insulina I (IGF-I). En este caso la expresión de IGF-I y pac a partir de un vector que contiene 2 promotores subgenómicos (SFV-S2-9-IGF-pac) dio lugar a la generación de líneas celulares en las que la expresión se mantenía estable durante los 4-5 primeros pases, perdiéndose gradualmente a partir del pase 5 y disminuyendo 80 veces al llegar al pase 10 (Figura 20). Sin embargo el vector SF V-S2-9-pac2 A-IGF en el que el gen pac y el gen que codifica IGF-I están fusionados en fase usando la secuencia nucleotídica que codifica la autoproteasa 2A del FMDV como conector dio lugar a la generación de líneas celulares con mayor estabilidad que mantuvieron una expresión de IGF-I elevada, y similar a la obtenida con un vector de SFV de tipo silvestre, con solo una disminución de unas 4 veces en 10 pases en cultivo (Figura 20). Además, este último vector (SFV- S2-9-pac2A-IGF) mostró niveles de expresión de IGF-I en pases tempranos que fueron aproximadamente 2 veces superiores a los observados con el vector SFV-S2-9-IGF-pac.

El vector SFV-S2-9-pac puede, por tanto, utilizarse para la generación rápida de líneas estables de células de mamífero capaces de producir productos heterólogos de interés, e.g., proteínas recombinantes, en grandes cantidades.

Vector viral de la invención

En un aspecto, la presente invención se relaciona con un vector viral basado en el virus del Bosque de Semliki (SFV), en adelante, vector viral de la invención, que comprende un replicón del virus del Bosque de Semliki (SFV), en donde dicho replicón comprende (i) la secuencia de nucleótidos que codifica la enzima replicasa de SFV con las mutaciones P718T y R649H en la subunidad nsp2, (ii) un polinucleótido que comprende un gen de selección, y (iii) un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un producto heterólogo de interés.

El vector viral de la invención contiene un replicón de SFV que comprende la secuencia de nucleótidos codificante de la replicasa de SFV la cual comprende las mutaciones P718T y R649H en la subunidad nsp2. Cada una de esas mutaciones afecta a un triplete de nucleótidos, situados ambos en la secuencia que codifica la subunidad o proteína no estructural nsp2 de la replicasa viral. La mutación P718T indica que la prolina (P), situada en la posición 718 de la secuencia aminoacídica de la proteína nsp2 codificada por el SFV de tipo silvestre, es sustituida por una treonina (T) en la proteína nsp2 codificada por el vector mutado (vector viral de la invención). Del mismo modo, la mutación R649H indica que la arginina (R) situada en la posición 649 de la secuencia aminoacídica de la subunidad nsp2 codificada por el SFV de tipo silvestre, es sustituida por una histidina (H) en la subunidad nsp2 que codifica el vector mutado (vector viral de la invención). Ambas posiciones 718 y 649 se refieren a la posición del aminoácido sustituido en la secuencia de la subunidad nsp2 ya cortada y procesada.

En una realización concreta de la invención, el replicón de SFV presente en el vector viral de la invención comprende la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 2:

• Ia SEQ ID NO: 1 incluye el extremo 5' necesario para la replicación de SFV, la secuencia codificante de la replicasa de SFV con las mutaciones P718T y R649H en nsp2, y, solapado con la replicasa, un promotor subgenómico viral de SFV; y

• la SEQ ID NO: 2 incluye el extremo 3' necesario para la replicación de SFV que contiene una secuencia terminal de poliadeninas (Poli A).

Estas dos secuencias conjuntamente constituyen el esqueleto del vector y entre ellas se intercalan el polinucleótido que comprende el gen de selección y el polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica un producto heterólogo de interés.

La expresión del polinucleótido que comprende el gen de selección y la expresión del polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica el producto heterólogo de interés puede estar controlada por dos promotores subgenómicos de SFV independientes o bien por un único promotor subgenómico que controla la expresión del polinucleótido que comprende el gen de selección y la expresión del polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica el producto heterólogo de interés en forma de una proteína de fusión.

Por tanto, en una realización particular, el vector viral de la invención comprende:

a) un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica un producto heterólogo de interés, cuya expresión está controlada por un primer promotor subgenómico (SGl) de SFV; y

b) un polinucleótido que comprende un gen de selección, cuya expresión está controlada por un segundo promotor subgenómico (SG2) de SFV.

Dichos primer y segundo promotor subgenómico de SFV pueden ser iguales o diferentes. En una realización concreta, la expresión del gen de selección y la expresión

del producto heterólogo de interés están controladas por dos promotores subgenómicos de SFV independientes, iguales o diferentes.

Como se muestra en la Figura 8, el polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica un producto heterólogo de interés y el polinucleótido que comprende un gen de selección, están situados dentro del replicón de SFV, entre el promotor subgenómico solapado en la replicasa y el extremo 3' necesario para la replicación de SFV.

En una realización particular, el polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica un producto heterólogo de interés (GOI, del inglés "gene of interest" - gen de interés) se sitúa corriente abajo del promotor subgenómico (SGl) solapado en la replicasa y su expresión está controlada por dicho promotor SGl . A continuación, se incorpora otro promotor subgenómico SG2 que controla la expresión del polinucleótido que comprende el gen de selección, que se sitúa corriente abajo de SG2 y su expresión está controlada por dicho promotor SG2 (Figura 8A). Como se ha mencionado previamente, los promotores subgenómicos SGl y SG2 pueden ser iguales o diferentes.

En otra realización particular, el vector viral de la invención se construye también con los mismos 2 promotores subgenómicos (SGl y SG2) pero permutando las posiciones del polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica el producto heterólogo de interés (GOI) y el polinucleótido que comprende el gen de selección, de manera que SGl controla la expresión del polinucleótido que comprende el gen de selección y SG2 la expresión del polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica el producto heterólogo de interés (GOI) (Figura 8C). Como se ha mencionado previamente, los promotores subgenómicos SGl y SG2 pueden ser iguales o diferentes.

En otra realización particular alternativa, el vector viral de la invención comprende, corriente abajo de un promotor subgenómico (e.g., SGl), una construcción que comprende el polinucleótido que comprende el gen de selección y el polinucleótido que

comprende la secuencia de nucleótidos que codifica el producto heterólogo de interés, fusionados en fase mediante un conector (linker) polinucleotídico; ventajosamente, dicho conector es un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica un sitio de corte (auto)proteolítico post-traduccional.

Prácticamente cualquier secuencia de nucleótidos que codifica un sitio de corte (auto)proteolítico post-traduccional, y, en consecuencia, la (auto)proteasa o la secuencia aminoacídica o peptídica codificada por dicha secuencia nucleotídica, puede ser utilizada en el contexto de la presente invención.

En una realización particular, dicho conector es un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica una (auto)proteasa que actúa en cis entre las proteínas resultantes de la traducción del gen de selección y de la secuencia de nucleótidos que codifica el producto heterólogo de interés; es decir, en una realización particular, dicho conector es un polinucleótido que comprende una secuencia nucleotídica que, al traducirse, proporciona un sitio de corte por medio del cual la proteína de fusión o poliproteína expresada es procesada post-traduccionalmente en las proteínas que componen dicha proteína de fusión o poliproteína. Por tanto, en ocasiones, en esta descripción, por simplicidad, se utiliza la expresión "secuencia nucleotídica que codifica una proteasa" como sinónimo de la expresión "secuencia de nucleótidos que codifica un sitio de corte (auto)proteolítico post-traduccional". A modo ilustrativo, no limitativo, dicha secuencia de nucleótidos que codifica una (auto)proteasa que actúa en cis entre las proteínas resultantes de la traducción del gen de selección y de la secuencia de nucleótidos que codifica el producto heterólogo de interés, procede de un virus, por ejemplo, un picornavirus, un alfavirus, etc. En una realización particular, dicho conector comprende la secuencia nucleotídica que codifica la región 2A de la poliproteína del virus de la fiebre añosa (FMDV) o autoproteasa 2A del FMDV. En otra realización particular, dicho conector comprende la secuencia nucleotídica que codifica el dominio carboxi terminal de la cápsida de SFV con actividad proteolítica. Una representación esquemática de esta realización particular alternativa se muestra en la Figura 8B, en la que se muestra que un promotor subgenómico (e.g., SGl) controla la expresión de dicha construcción que comprende el polinucleótido que comprende el gen

de selección y el polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica el producto heterólogo de interés (GOI), fusionados en fase mediante dicho conector. De esta manera se produce la co-traducción (traducción conjunta) de ambos genes (gen de selección y GOI) en una única poliproteína que, después de la traducción, es cortada rápidamente mediante rotura en el sitio de corte (auto)proteolítico produciendo la proteína de selección y el producto heterólogo de interés. La utilización de estos sitios de rotura (auto)proteolítica post-traduccional ha sido descrita previamente en la solicitud de patente europea EP 736099 y también por Ryan y Drew (35), particularmente la utilización de la secuencia codificante de la región 2A de la poliproteína de FMDV (autoproteasa 2 A de FMDV), cuyo contenido se incluye en su integridad por referencia.

Alternativamente, en otra realización particular, dicho conector es un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica un sitio de corte para una proteasa que actúe en trans; en este caso, dicha proteasa podría ser expresada por la célula transfectada con el vector viral de la invención, bien de forma nativa o recombinante, o, alternativamente, dicha proteasa podría ser añadida exógenamente para liberar el producto heterólogo de interés de la proteína de fusión que comprende la proteína de selección y el producto heterólogo de interés. Prácticamente cualquier secuencia de nucleótidos que codifica un sitio de corte para una proteasa que actúe en trans, y, en consecuencia, la secuencia aminoacídica codificada por dicha secuencia, puede ser utilizada en el contexto de la presente invención. A modo ilustrativo, no limitativo, dicha secuencia de nucleótidos que codifica un sitio de corte de una proteasa que actúen en trans puede ser una secuencia nucleotídica que codifica una secuencia aminoacídica susceptible de ser cortada por una endopeptidasa, etc. A modo ilustrativo, no limitativo, dicha secuencia de nucleótidos que codifica un sitio de corte para una proteasa que actúe en trans es una secuencia nucleotídica que codifica un sitio de corte para una proteasa de un virus, por ejemplo, un poti virus, tal como la proteasa del virus del grabado del tabaco (ETV, del inglés Etch Tobacco Virus), etc. y dicha proteasa podría ser expresada por la célula transfectada con el vector viral de la invención (bien de forma nativa o porque haya sido transformada apropiadamente), etc.

Alternativamente, en otra realización particular, dicho conector es un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica un sitio de corte reconocible por un reactivo químico, e.g., bromuro de cianógeno que corta en los residuos de metionina, etc.

En dicha construcción que comprende el polinucleótido que comprende el gen de selección fusionado en fase al polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica el producto heterólogo de interés, el extremo 3' del polinucleótido que comprende el gen de selección puede estar fusionado en fase mediante dicho conector al extremo 5' del polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica el producto heterólogo de interés (GOI). Alternativamente, el extremo 3' del polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica el producto heterólogo de interés (GOI) puede estar fusionado en fase mediante dicho conector al extremo 5' del polinucleótido que comprende el gen de selección.

El gen de selección presente en el vector viral de la invención, cuando es expresado por las células portadoras, permite seleccionar las células portadoras del vector viral de la invención de entre aquellas células que no han sido transfectadas o que lo han perdido. Prácticamente cualquier gen de selección que permite seleccionar las células portadoras del vector viral de la invención puede ser utilizado en la puesta en práctica de la presente invención. A modo ilustrativo, no limitativo, dicho gen de selección puede ser un gen cuya expresión confiere resistencia a un antibiótico, un gen que permite sintetizar un nutriente esencial que sea omitido en el medio de cultivo, un gen que ofrece una ventaja selectiva a las células transfectadas, etc. En una realización particular, dicho gen de selección es un gen cuya expresión confiere resistencia a un antibiótico, por ejemplo, un antibiótico tóxico para células de mamífero, tal como el gen que confiere resistencia a higromicina (hph), el gen que confiere resistencia a neomicina (neoR), el gen que codifica la enzima puromicina N-acetil-transferasa (pac), cuya expresión confiere a las células portadoras del vector viral de la invención resistencia al antibiótico puromicina, etc. El empleo del gen pac permite seleccionar las células portadoras del vector viral de la invención de entre aquellas que no han sido transfectadas o que lo han perdido, añadiendo puromicina al medio.

El producto heterólogo de interés puede ser, prácticamente, cualquier proteína o péptido de interés, e.g., un péptido o una proteína indicadora (β-gal, etc.); o bien un péptido, una proteína, o un anticuerpo (o un fragmento funcional del mismo) con aplicaciones terapéuticas o de diagnóstico; o bien cualquier proteína o péptido recombinante de interés. El término "heterólogo" tal como aquí se utiliza, incluye, además, "recombinante", es decir, que no aparece de forma natural. Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de productos heterólogos de interés incluyen péptidos y proteínas con aplicaciones terapéuticas, e.g., el factor de crecimiento semejante a la insulina I (IGF- I), la cardiotrofina-1 (CTl), la oncostatina M (OSM), el interferón alfa (e.g, IFNa5), la anfiregulina (AR), el factor neurotrófíco derivado de la glía (GDNF), el receptor endotelial de la proteína C/proteína C activada (EPCR), anticuerpos (o fragmentos funcionales de los mismos) de interés o de aplicación terapéutica o en diagnóstico, etc. Por tanto, el polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica el producto heterólogo de interés presente en el vector viral de la invención comprende la secuencia codificante del producto heterólogo de interés.

De esta manera, el conjunto "gen de la replicasa de SFV mutada - GOI - gen de selección", o, alternativamente, el conjunto "gen de la replicasa de SFV mutada - gen de selección - GOI", flanqueado por las secuencias 5' y 3' necesarias para la replicación, forma un replicón de ARN que es capaz de autoamplificarse dentro de la célula.

El vector viral de la invención puede ser utilizado en forma de ARN o también en forma de ADN.

Cuando se utiliza en forma de ARN, el vector viral de la invención se completa con la adición de una estructura de cap en su extremo 5'.

Cuando se utiliza en forma de ADN, el vector completo incluiría un promotor funcional en eucariotas, por ejemplo, un promotor de citomegalovirus (CMV), la secuencia del replicón de SFV en cualquiera de las realizaciones definidas previamente, y una secuencia señal de la terminación de la transcripción, por ejemplo una secuencia señal

derivada de SV40. De esta manera, el vector se transcribe a ARN dentro de las células transfectadas donde se autoamplificará.

Opcionalmente, si se desea, el vector viral de la invención puede contener un potenciador (enhancer) de la transcripción o de la traducción de un gen, es decir una región de ácido nucleico que puede unirse a un activador, e.g., un factor de transcripción, para aumentar el nivel de transcripción o de traducción de un gen; como es conocido, dicho enhancer puede estar adayacente a, o alejado del, gen sobre el que actúa. Tal como se utiliza en esta descripción, el término "enhancer" incluye tanto potenciadores de la transcripción de un gen como potenciadores de la traducción de un gen, entre los que se encuentran las regiones conocidas como IRES (del inglés "Internal Ribosome Entry Site") las cuales, como es conocido, son regiones que promueven el inicio de la traducción. Si se desea, dicho enhancer puede estar formando un cassette junto con un conector polinucleotídico (definido previamente) que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica un sitio de corte (auto)proteolítico post- traduccional. Prácticamente cualquier enhancer de la transcripción o de la traducción de un gen apropiado puede ser utilizado en el contexto de la presente invención. A modo ilustrativo, dicho enhancer puede ser el enhancer mínimo de traducción "bl" de SFV que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica los 34 primeros aminoácidos de la cápsida de SFV. En una realización particular, el vector viral de la invención comprende el polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica el producto heterólogo de interés fusionado en su extremo 5' a un enhancer, o, alternativamente, a un cassette que comprende dicho enhancer y un conector polinucleotídico que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica un sitio de corte (auto)proteolítico post-traduccional (definido previamente). En una realización concreta, el vector viral de la invención comprende la secuencia del precursor de IGF-I humano (IGF-IB) fusionada en su extremo 5' con un cassette que comprende el enhancer mínimo de traducción ("bl") de la cápsida de SFV seguido de la secuencia nucleotídica que codifica la autoproteasa 2A del FMDV (pSFVb 12 A-IGF-IB, Ejemplo 10).

Las construcciones de ARN o ADN para la preparación del vector viral de la invención pueden obtenerse mediante métodos convencionales de biología molecular, recogidos en manuales generales de laboratorio, por ejemplo en "Molecular cloning: a laboratory manual" (Joseph Sambrook, David W. Russel Eds. 2001, 3 ^a ed. CoId Spring Harbor, Nueva York) o en "Current protocols in molecular biology" (F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J. A. Smith, J. G. Seidman y K. Struhl Eds, vol. 2. Greene Publishing Associates y Wiley Interscience, Nueva York, N. Y.. Actualizado hasta Septiembre 2006.

El vector viral de la invención, derivado del doble muíante no citopático aislado en SFV S2-9) (P718T/R649H) muestra unos niveles de expresión muy similares a los del vector de SFV de tipo silvestre.

El vector viral de la invención puede ser utilizado para la generación in vitro de líneas celulares estables con capacidad de expresar constitutivamente productos heterólogos de interés. El uso de dicho vector viral de la invención para la generación in vitro de líneas celulares estables con capacidad de expresar constitutivamente productos heterólogos de interés constituye un aspecto adicional de la presente invención.

Línea celular estable de la invención

El vector viral de la invención puede ser utilizado para la generación in vitro de líneas celulares estables con capacidad de expresar constitutivamente productos heterólogos de interés.

Por tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con una línea celular estable con capacidad de expresar constitutivamente productos heterólogos de interés, en adelante línea celular estable de la invención, caracterizada porque es una línea celular transfectada con un vector viral de la invención, que comprende un replicón del SFV, en donde dicho replicón comprende (i) la secuencia de nucleótidos que codifica la enzima replicasa de SFV con las mutaciones P718T y R649H en la subunidad nsp2, (ii) un polinucleótido que comprende un gen de selección, y (iii) un polinucleótido que

comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un producto heterólogo de interés.

Tal como se ha mencionado previamente, según la presente invención, una línea celular es "estable" cuando el porcentaje de células que expresan el producto heterólogo de interés en el pase 10 es superior al 85%, pudiendo mantenerse o superarse dicho porcentaje en pases sucesivos o posteriores. Asimismo, una expresión es "constitutiva" cuando las líneas celulares estables antes citadas son, además, capaces de expresar el producto heterólogo a un nivel cuantitativamente alto (superior al 50% respecto al conseguido a las 24 horas de post-trasducción cuando las células se transducen con el vector de tipo silvestre).

En una realización particular, la línea celular estable de la invención, es una línea celular estable transfectada con un vector viral de la invención cuyo replicón de SFV comprende las secuencias SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2.

En otra realización particular, la línea celular estable de la invención, es una línea celular estable transfectada con un vector viral de la invención que comprende:

a) un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica un producto heterólogo de interés, cuya expresión está controlada por un primer promotor subgenómico (SGl) de SFV; y

b) un polinucleótido que comprende un gen de selección, cuya expresión está controlada por un segundo promotor subgenómico (SG2) de SFV.

Dichos primer y segundo promotor subgenómico de SFV pueden ser iguales o diferentes.

En otra realización particular, la línea celular estable de la invención, es una línea celular estable transfectada con un vector viral de la invención en el que el polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica un producto

heterólogo de interés se sitúa corriente abajo de un primer promotor subgenómico (SGl) solapado en la replicasa y su expresión está controlada por dicho promotor SGl, y el polinucleótido que comprende el gen de selección se sitúa corriente abajo de un segundo promotor subgenómico (SG2) que controla la expresión de dicho polinucleótido que comprende el gen de selección. Dichos promotores subgenómicos SGl y SG2 pueden ser iguales o diferentes. La posición relativa entre ambos polinucleótidos puede variar según lo mencionado previamente en relación con el vector viral de la invención.

En otra realización particular, la línea celular estable de la invención, es una línea celular estable transfectada con un vector viral de la invención que comprende, corriente abajo de un promotor subgenómico (e.g., SGl), una construcción que comprende el polinucleótido que comprende el gen de selección y el polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica el producto heterólogo de interés, fusionados en fase mediante un conector polinucleotídico; ventajosamente, dicho conector es un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica un sitio de corte (auto)proteolítico post-traduccional. Las características de dicho conector ya se han mencionado previamente en relación con el vector viral de la invención. En una realización particular, dicho conector comprende la secuencia de nucleótidos que codifica una (auto)proteasa que actúa en cis entre las proteínas resultantes de la traducción del gen de selección y de la secuencia de nucleótidos que codifica el producto heterólogo de interés, tal como la secuencia nucleotídica que codifica la región 2A de la poliproteína del virus de la fiebre aftosa (FMDV) o autoproteasa 2A del FMDV, o la secuencia nucleotídica que codifica el dominio carboxi terminal de la cápsida de SFV, etc. En otra realización particular, dicho conector es un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica un sitio de corte para una proteasa que actúe en trans, tal como la secuencia nucleotídica que codifica un sitio de corte para una proteasa viral, por ejemplo, la proteasa del ETV, etc., en este caso, dicha proteasa podría ser expresada por la línea celular de la invención o, alternativamente, dicha proteasa podría ser añadida exógenamente. En otra realización particular, dicho conector es un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica

un sitio de corte reconocible por un reactivo químico, e.g., bromuro de cianógeno que corta en los residuos de metionina, etc., tal como se ha mencionado previamente.

En esta realización particular de la línea celular estable de la invención en la que se utiliza un vector viral de la invención que comprende, corriente abajo de un promotor subgenómico una construcción que comprende el polinucleótido que comprende el gen de selección y el polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica el producto heterólogo de interés, fusionados en fase mediante un conector polinucleotídico, el promotor subgenómico (e.g., SGl) controla la expresión de dicha construcción que comprende el polinucleótido que comprende el gen de selección y el polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica el producto heterólogo de interés, fusionados en fase mediante dicho conector, produciéndose de este modo la co-traducción de ambos genes (gen de selección y gen de interés) en una única poliproteína que, después de la traducción, es cortada rápidamente mediante rotura en el sitio de corte (auto)proteolítico produciendo la proteína de selección y el producto heterólogo de interés. La posición relativa entre ambos polinucleótidos dentro de la construcción antes citada puede variar según lo mencionado previamente en relación con el vector viral de la invención, es decir, en dicha construcción, el extremo 3' del polinucleótido que comprende el gen de selección puede estar fusionado en fase mediante dicho conector al extremo 5' del polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica el producto heterólogo de interés o viceversa, el extremo 3' del polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica el producto heterólogo de interés puede estar fusionado en fase mediante dicho conector al extremo 5' del polinucleótido que comprende el gen de selección. Diversos ensayos realizados por los inventores han puesto de manifiesto que este tipo de vectores virales de la invención, que comprenden, corriente abajo de un promotor subgenómico, una construcción que comprende el polinucleótido que comprende el gen de selección y el polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica el producto heterólogo de interés, fusionados en fase mediante un conector que comprende una secuencia de ADN, generan líneas celulares muy estables que mantienen una expresión del producto heterólogo de interés elevada y similar a la obtenida con un vector de SFV de tipo silvestre.

Tanto las características del gen de selección como del polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica el producto heterólogo de interés han sido mencionadas en relación con el vector viral de la invención.

En una realización particular, el gen de selección presente en el vector viral de la invención utilizado para generar la línea celular estable de la invención es un gen cuya expresión confiere resistencia a un antibiótico, un gen que permite sintetizar un nutriente esencial que sea omitido en el medio de cultivo, un gen que ofrece una ventaja selectiva a las células transfectadas, etc., por ejemplo, el gen que confiere resistencia a higromicina (hph), el gen que confiere resistencia a neomicina (neoR), el gen que codifica la enzima puromicina N-acetil-transferasa (pac), cuya expresión confiere a las células portadoras del vector viral de la invención resistencia al antibiótico puromicina, etc.

Asimismo, en una realización particular, el producto heterólogo de interés expresado por la línea celular estable de la invención es una proteína indicadora (β-gal, etc.); o bien una proteína, péptido o anticuerpo (o fragmento del mismo) con aplicaciones terapéuticas o de diagnóstico; o bien cualquier otra proteína o péptido recombinante de interés; ejemplos ilustrativos, no limitativos, de dichos productos heterólogos de interés incluyen péptidos y proteínas con aplicaciones terapéuticas, e.g., IGF-I, CTl, OSM, IFN, AR, GDNF, EPCR, anticuerpos de interés o aplicación terapéutica o en diagnóstico, etc.

En una realización particular, la línea celular estable de la invención es una línea celular estable que expresa cardiotrofina-1 de rata (CTr) de forma constitutiva. Se generaron dos tipos de líneas celulares mediante el empleo de dos vectores virales de la invención diferentes. En un caso, la expresión de CTr y pac a partir de un vector viral de la invención que contenía 2 promotores subgenómicos (SFV-S2-9-CTr-pac) dio lugar a la generación de líneas celulares en las que la expresión se mantenía estable durante los 5 primeros pases, perdiéndose gradualmente a partir del pase 5 (Figura 16). Sin embargo, en otro caso, cuando se utilizó el vector viral de la invención identificado como SFV-

S2-9-pac2A-CTr, en el que el gen pac y el gen que codifica la CTr están fusionados en fase usando la secuencia nucleotídica que codifica la autoproteasa 2A del FMDV como conector, se generaron líneas celulares muy estables que mantuvieron una expresión de CTr elevada, y similar a la obtenida con un vector de SFV de tipo silvestre, durante al menos 10 pases en cultivo (Figura 17).

En otra realización particular, la línea celular estable de la invención es una línea celular estable que expresa el factor de crecimiento semejante a la insulina I (IGF-I). Se generaron dos tipos de líneas celulares mediante el empleo de dos vectores virales de la invención diferentes. En un caso, la expresión de IGF-I y pac a partir de un vector viral de la invención que contenía 2 promotores subgenómicos (SFV-S2-9-IGF-pac) dio lugar a la generación de líneas celulares en las que la expresión se mantenía estable durante los 4-5 primeros pases, perdiéndose gradualmente a partir del pase 5 y disminuyendo 80 veces al llegar al pase 10 (Figura 20). Sin embargo, cuando se utilizó el vector viral de la invención identificado como SFV-S2-9-pac2A-IGF, en el que el gen pac y el gen que codifica IGF-I están fusionados en fase usando la secuencia nucleotídica que codifica la autoproteasa 2A del FMDV como conector, se generaron líneas celulares con mayor estabilidad que mantuvieron una expresión de IGF-I elevada, y similar a la obtenida con un vector de SFV de tipo silvestre, con solo una disminución de unas 4 veces en 10 pases en cultivo (Figura 20). Además, este último vector (SFV- S2-9-pac2A-IGF) mostró niveles de expresión de IGF-I en pases tempranos que fueron aproximadamente 2 veces superiores a los observados con el vector SFV-S2-9-IGF-pac.

Las líneas celulares estables de la invención pueden obtenerse mediante métodos convencionales de biología molecular, por ejemplo, mediante transfección de células o líneas celulares apropiadas con el vector viral de la invención, etc., recogidos en manuales generales de laboratorio, por ejemplo, en "Molecular cloning: a laboratory manual" (Joseph Sambrook, David W. Russel Eds. 2001, 3 ^a ed. CoId Spring Harbor,

Nueva York) o en "Current protocols in molecular biology" (F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J. A. Smith, J. G. Seidman y K. Struhl Eds, vol. 2. Greene

Publishing Associates y Wiley Interscience, Nueva York, N. Y. Actualizado hasta

Septiembre 2006.

La célula a transfectar puede ser, prácticamente, cualquier célula o línea celular eucariótica que permite la replicación del vector viral de la invención. Dicha célula o línea celular puede ser una línea procedente de un mamífero. En una realización particular, dicha célula o línea celular a transfectar es una línea celular derivada de fibroblastos de riñon de hámster, por ejemplo, la línea celular BHK-21.

La transfección de las células se realiza mediante cualquier procedimiento convencional, físico o químico, que permita la introducción del vector viral de la invención en las células, por ejemplo, por electroporación o por conjugación del material genético con lípidos catiónicos. Estos procedimientos servirían para la transfección del vector viral de la invención bien como ARN o bien como ADN. En una realización particular la transfección se realiza por electroporación ("Current protocols in molecular biology"; Ausubel FM et al.; citado supra).

Método para la generación in vitro de líneas celulares estables de la invención

En otro aspecto adicional, la invención se relaciona con un método para la generación in vitro de una línea celular estable de la invención, con capacidad para expresar constitutivamente productos heterólogos de interés, en adelante método de generación de líneas celulares estables de la invención, que comprende:

I. transfectar células con un vector viral de la invención, el cual comprende un replicón del SFV, en donde dicho replicón comprende (i) la secuencia de nucleótidos que codifica la enzima replicasa de SFV con las mutaciones

P718T y R649H en la subunidad nsp2, (ii) un polinucleótido que comprende un gen de selección, y (iii) un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un producto heterólogo de interés;

II. seleccionar las células estables generadas en el paso I; y

III. crecer y mantener las células estables.

Tal como se ha mencionado previamente, la célula a transfectar puede ser, prácticamente, cualquier célula o línea celular eucariótica que permite la replicación del vector viral de la invención. A modo ilustrativo, no limitativo, dicha célula o línea celular a transfectar puede ser una línea procedente de un mamífero. En una realización particular, dicha célula o línea celular a transfectar es una línea celular derivada de fibroblastos de riñon de hámster, por ejemplo, la línea celular BHK-21.

Las características del vector viral de la invención ya han sido mencionadas previamente. El vector viral de la invención puede ser utilizado en forma de ARN o, alternativamente, en forma de ADN. Cuando se utiliza en forma de ARN, el vector viral de la invención se completa con la adición de una estructura de cap en su extremo 5'.

Cuando se utiliza en forma de ADN, el vector completo incluye un promotor funcional en células eucariotas, por ejemplo, un promotor de citomegalovirus (CMV), la secuencia del replicón de SFV en cualquiera de las realizaciones definidas previamente en relación con el vector viral de la invención, y una secuencia señal de la terminación de la transcripción, por ejemplo, una secuencia señal derivada de SV40.

La transfección de las células se puede realizar por cualquier procedimiento convencional, físico o químico, que permita la introducción del vector viral de la invención en las células, por ejemplo, por electroporación o por conjugación del material genético con lípidos catiónicos. Estos procedimientos servirían para la transfección del vector viral de la invención bien como ARN o bien como ADN. En una realización particular la transfección se realiza por electroporación ("Current protocols in molecular biology"; Ausubel FM et al.; citado supra).

La selección de las células estables se realizará de manera distinta en función del gen de selección incorporado en el vector viral de la invención con el que se transfectan las células. Como ya se ha explicado anteriormente, la expresión del gen de selección confiere a las células transfectadas una ventaja que permite su selección. Bastará con someter a las células a las condiciones selectivas para las células transfectadas. Cuando se utiliza el gen pac como gen de selección, su expresión en las células transfectadas las

hace resistentes a la puromicina. En este caso, bastará con añadir puromicina al medio de cultivo para eliminar las células no transfectadas o que hayan perdido el vector viral de la invención.

Las células estables se crecen y mantienen en medios y condiciones convencionales de cultivo, en función del tipo celular transfectado, y manteniéndolas bajo el estímulo selectivo para las células transfectadas (por ejemplo, en presencia de puromicina). Cuando las células son BHK-21 se crecen en las condiciones ya descritas ("Current protocols in molecular biology"; Ausubel FM et al.; citado supra).

Método para la producción in vitro de productos heterólogos de interés

La línea celular estable de la invención puede ser utilizada para la producción in vitro de productos heterólogos de interés. En consecuencia, el uso de dicha línea celular estable de la invención para la producción in vitro de productos heterólogos de interés constituye un aspecto adicional de la presente invención.

Por tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con un método para la producción in vitro de productos heterólogos de interés que comprende cultivar una línea celular estable de la invención bajo condiciones que permiten la expresión del producto heterólogo de interés contenido en el vector viral de la invención utilizado para generar dicha línea celular estable de la invención.

De forma más concreta, el método para producir in vitro productos heterólogos de interés comprende:

I. transfectar células con un vector viral de la invención, el cual comprende un replicón del SFV, en donde dicho replicón comprende (i) la secuencia de nucleótidos que codifica la enzima replicasa de SFV con las mutaciones P718T y R649H en la subunidad nsp2, (ii) un polinucleótido que comprende un gen de selección, y (iii) un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un producto heterólogo de interés;

II. seleccionar las células estables generadas en el paso I (líneas celulares estables de la invención);

III. crecer y mantener dichas células estables (líneas celulares de la invención)s; y, si se desea,

IV. extraer el producto heterólogo de interés.

Los pasos I, II y III corresponden propiamente a la generación de la línea celular estable de la invención que expresa constitutivamente el producto heterólogo de interés. En este caso, la célula se transfectará con un vector viral de la invención que incluya un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica el producto heterólogo de interés que se desea producir. Como ya se ha indicado anteriormente, dicho polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica el producto heterólogo de interés está insertado en el vector viral de la invención en una posición tal que su expresión está controlada por un promotor subgenómico de SFV.

El producto heterólogo de interés a producir puede ser, como se ha mencionado antes, cualquier proteína o péptido de interés, e.g., una proteína indicadora (β-gal, etc.); o bien una proteína, péptido o anticuerpo (o fragmento del mismo) con aplicaciones terapéuticas o de diagnóstico; o bien cualquier otra proteína o péptido recombinante de interés. Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de productos heterólogos de interés incluyen péptidos y proteínas con aplicaciones terapéuticas, e.g., el factor de crecimiento semejante a la insulina I (IGF-I), la cardiotrofina-1 (CTl), la oncostatina M (OSM), el interferón alfa (e.g, IFNa5), la anfiregulina (AR), el factor neurotrófico derivado de la glía (GDNF), el receptor endotelial de la proteína C/proteína C activada (EPCR), anticuerpos de interés o aplicación terapéutica o en diagnóstico, etc.

Los pasos para la generación de la línea celular estable de la invención se realizarán como se ha descrito anteriormente en el método para la generación de líneas celulares estables de la invención.

En ocasiones, el producto heterólogo de interés puede ser utilizado tal como se encuentra en el medio de cultivo, es decir, sin aislar ni purificar; sin embargo, en ocasiones, puede resultar ventajoso extraer (aislar) y, opcionalmente, purificar el producto heterólogo de interés. En este caso, la extracción del producto heterólogo de interés puede realizarse a partir de un lisado celular cuando el producto heterólogo de interés sea intracelular (no se pueda secretar al medio), o bien a partir del sobrenadante de las células estables cuando se trate de productos heterólogos de interés que pueden ser secretados al medio circundante.

Para la extracción puede utilizarse cualquier procedimiento convencional de extracción y purificación de péptidos y proteínas adecuado para la extracción del producto heterólogo de interés concreto que se desea producir, dependiendo de la naturaleza de dicho producto. Ejemplos ilustrativos, no limitativos de tales procedimientos incluyen procedimientos basados en la separación por tamaño y/o carga eléctrica (precipitación en sulfato amónico, filtración en gel, ultracentrifugación, electroforesis, electroenfoque, etc.), por inmunopurificación (columna de afinidad, inmunoprecipitación, etc.), separación por unión a un ligando específico, etc.

Los siguientes ejemplos tienen el objetivo de ilustrar la invención sin pretender ser limitantes de la misma.

EJEMPLOS DE LA INVENCIóN

Materiales y métodos

Construcciones de plásmidos

Previamente se han descrito los plásmidos pSFV-1 y pSFV3-LacZ, que fueron proporcionados amablemente por el Dr. P. Liljestróm (Instituto Karolinska, Estocolmo) (18). Para construir los plásmidos pSFV-S2 y pSFV-S3, un fragmento de 3,5 kb que contenía el área de la nsp2 a mutagenizar se extrajo de pSFV-1 con Sacl/Xhol y se

subclonó en el plásmido pBluescript SK (Stratagene, La Jolla, EE. UU.) digerido con las misma enzimas, lo que generó el plásmido Blu-nsρ2. Se introdujeron las mutaciones P718T y P718F en la nsp2 en este plásmido mediante PCR de entrecruzamiento. Se combinaron en secuencia los cebadores externos SF3669-VS (SEQ ID NO: 3) y SF4096-RS (SEQ ID NO: 4) con los pares de oligonucleótidos diseñados para introducir las respectivas mutaciones. Para S2, el par de oligonucleótidos internos utilizados fue mutS2-VS (SEQ ID NO: 5) y mutS2-RS (SEQ ID NO: 6) que se solapan en 25 nucleótidos y en los que el codón CCC que codifica la Pro 718 en nsp2 se ha mutado a ACG que codifica Thr (subrayada). Para S3, los oligonucleótidos internos utilizados fueron mutS3-RS (SEQ ID NO: 7) y mutS3-RS (SEQ ID NO: 8) que se solapan en 25 nucleótidos y en los que el codón CCC que codifica la Pro 718 de la nsp2 se ha mutado a TTT que codifica Phe (subrayada). La PCR de entrecruzamiento se realizó con la Pfu y produjo fragmentos de ADN de 430 pb que se digirieron con Eagl/NarI y se clonaron en Blu-nsp2 después de digestión parcial con Eagl y digestión total con NarI, lo que generó los plásmidos Blu-nsp2-S2 o Blu-nsp2-S3, respectivamente. Se confirmó la presencia de las mutaciones S2 o S3 en estos plásmidos por secuenciación. Finalmente, un fragmento Sacl/Xhol de 3,5 kb que contenía la nsp2 mutada se extrajo de Blu-nsp2-S2 o de Blu-nsp2-S3 y se subclonó en pSFV-1 digerido con las mismas enzimas, lo que generó los plásmidos pSFV-S2 y pSFV-S3, respectivamente. Para clonar LacZ en estos plásmidos, un fragmento de ADN de 3,86 kb que contenía este gen se extrajo con Xbal/Xmal de pSFV3-LacZ y se clonó en pSFV-S2 o pSFV-S3 digeridos con las mismas enzimas, lo que generó los plásmidos pSFV-S2-LacZ y pSFV-S3-LacZ, respectivamente.

Para generar el plásmido pSFV-pac, un fragmento de ADN de 0,95 kb que contenía el gen de la puromicina N-acetil-transferasa (pac) se extrajo del plásmido pBSpac (5) (amablemente proporcionado por el Dr. J. Ortin, CNB, Madrid, España) mediante digestión con Notl y Hpal. Después de hacer romo el extremo Notl con Klenow, se clonó este fragmento en pSFV-1 digerido con Smal, lo que generó pSFV-pac. El plásmido pSFV-S2-pac se generó al sustituir el fragmento Sacl/Xhol de 3,5 kb que contenía la mayor parte de la nsp2 en pSFV-pac por el mismo fragmento obtenido de Blu-nsp2-S2, que contiene la mutación S2.

El plásmido pSFV-S2-9-LacZ se generó al sustituir el fragmento RsrII/Xhol de 3,2 kb en pSFV3-LacZ por el mismo fragmento obtenido de pSFV-S2-9-pac que cubre el área de la replicasa que contiene las mutaciones P718T y R649H de nsp2. Para generar el doble vector pSFV-S2-9-LacZ-pac, un cásete de 1,9 kb que contenía el promotor subgenómico de SFV seguido del gen pac se extrajo de pSFV-pac con Mscl/Spel, y se clonó en pSFV-S2-9-LacZ digerido con Smal/Spel.

Para generar pSFV-RHR-pac, primero se introdujo la mutación R649H de nsp2 en BIu- nsp2 por PCR. Brevemente, se obtuvo un fragmento de PCR de 1,67 kb con los oligonucleótidos SF1947-VS (SEQ ID NO: 9) y SF3623-S29-RS (SEQ ID NO: 10) con la Pfu utilizando el pSFV-1 como molde. En el último oligonucleótido se ha sustituido el codón CGC por CAC, lo que conduce a la mutación R649H en nsp2 (subrayada; adviértase que el cebador contiene la secuencia reversa). La secuencia de este oligonucleótido abarca el sitio NarI de nsp2 próximo a la mutación R649H (señalado en cursiva). El fragmento de PCR se digirió con BstEII/NarI, lo que dio lugar a un fragmento de ADN de 1,36 kb que se clonó en Blu-nsp2 digerido con las mismas enzimas, lo que generó, de este modo, Blu-nsp2-RHR. Finalmente, un fragmento

Sacl/Xhol de 3,5 kb que contenía la nsp2 mutada se extrajo del Blu-nsp2-RHR y se subclonó en pSFV-pac digerido con las mismas enzimas, lo que generó el plásmido pSFV-RHR-pac.

Transcripción y transfección del ARN

Los ADN plasmídicos purificados se hicieron lineales mediante digestión con Spel y se transcribieron en presencia de un análogo de cap (New England Biolabs, EE. UU.) utilizando la polimerasa SP6 (Amersham-Pharmacia). Los ARNs sintetizados in vitro se transfectaron en células BHK-21 mediante electroporación tal y como se describió previamente (17).

Empaquetamiento de los replicones

El empaquetamiento del ARN recombinante de SFV en partículas víricas (pv) se realizó mediante la coelectroporación de las células BHK-21 con el ARN recombinante y con ambos ARNs auxiliares SFV helper-S2 y helper-C-S219A tal y como está descrito (29). Las partículas de SFV que llevaban LacZ como gen indicador se titularon por tinción con X-gal de las células BHK-21 infectadas con diluciones seriadas del virus. Para las partículas de SFV que llevaban el gen pac, la titulación se realizó mediante inmunofluorescencia indirecta de las células BHK-21 infectadas con un antisuero policlonal de conejo específico contra la nsp2 de SFV como anticuerpo primario (E. Casales, resultados sin publicar).

Selección y pases de las líneas celulares resistentes a la puromicina

Se prepararé una solución de puromicina (Sigma, St. Louis, EE. UU.) 1 mg/ml en MEM, se filtró, alicuoteó y se guardó a -20 ⁰ C. Después de la transfección de las células BHK con los ARNs recombinantes de SFV que llevaban el gen pac, se permitió que las células se recuperaran durante 24 horas antes de añadir la puromicina a 5 μg/ml. Para seleccionar las células resistentes a la puromicina, se reemplazó el medio cada 2 a 3 días por un medio nuevo que contenía puromicina. Tras la selección, siempre se hacían los pases de las células en presencia de puromicina a la concentración indicada. En el caso de las células transfectadas con SFV-S2-pac, se clonaron focos individuales, se expandieron y se guardaron congelados en nitrógeno líquido. El medio utilizado para crecer las células fue BHK-21 Glasgow MEM (Invitrogene, EE.UU.) suplementado con de suero fetal bovino al 5%, medio triptosa fosfato (Invitrogene, EE.UU.) al 10%, glutamina 2 mM, HEPES 20 mM, estreptomicina a 100 μg/ml y penicilina a 100 IU/ml (medio BHK completo)..

Cartografía de las mutaciones adaptativas

El ARN celular total de las células resistentes a la puromicina obtenidas después de la transfección con el ARN del SFV-S2-pac se aisló con el kit RNeasy (Qiagen,

Alemania). Se utilizaron 5 μg de ARN de cada clon para sintetizar un ADNc con la transcriptasa inversa de M-MLV (Promega, Madison, EE. UU.) utilizando un

oligonucleótido de sentido negativo complementario a los nucleótidos 4977 a 5010 del SFV (SEQ ID NO: 11) como cebador. Después de la transcripción inversa, se amplificaron los ADNc mediante 30 ciclos de PCR con Taq Plus Long (Stratagene, La Jolla, EE. UU.), con el mismo cebador de sentido negativo y un oligonucleótido de sentido positivo complementario a los nucleótidos 1040 a 1074 de SFV (SEQ ID NO: 12). El fragmento resultante de 3971 pb se digirió con BcII (1106) y Bsu36I (4916) y se clonó en los correspondientes sitios de pSFV-pac. El ADN plasmídico derivado de cada clon individual se hizo lineal y se utilizó como molde para sintetizar el ARN in vitro, que se transfectó posteriormente en las células BHK-21 para determinar su capacidad para conferir resistencia a la puromicina. Cuando la subregión comprendida entre las posiciones 1106 a 4916 fue capaz de permitir la supervivencia y la división de las células en presencia de puromicina, como fue el caso del clon S2-9, se secuenció completamente a partir de dos clones plasmídicos independientes.

Análisis del ARN

Se extrajo el ARN total de las células transfectadas o de determinadas líneas celulares utilizando un minikit de RNeasy (Qiagen, Alemania) y se analizó mediante transferencia Northern. Se fraccionaron por tamaño 3 μg de ARN total en un gel de agarosa al 1,2% con formaldehído, se transfirió a una membrana de nitrocelulosa (Hybond-N+, Amersham) y se hibridó con un oligonucleótido marcado con P específico del promotor subgenómico de SFV (SEQ ID NO: 13). Se determinaron las cantidades relativas de los ARNs genómicos y subgenómicos de SFV utilizando un Phosphorlmager (Cyclone, Packard, EE. UU.) y el software Optiquant (versión 4.0, Packard).

Análisis de la expresión y el procesamiento de la replicasa

Para los experimentos de la traducción in vitro, los ARNs de SFV primero se transcribieron in vitro tal y como se describió previamente, se purificaron con el kit

RNeasy (Qiagen, Alemania), se mezclaron con Usados de reticulocitos de conejo tratados con nucleasa (Promega) en presencia de una mezcla de [ ³⁵ S]-metionina y [ ³⁵ S]-

cisteína (Amersham, EE. UU.) y se incubaron durante 90 minutos a 3O ⁰ C según las instrucciones del fabricante. Cada reacción de traducción contenía 2,3 μg de ARN transcrito purificado. Las reacciones de traducción se finalizaron al añadir el tampón de carga de Laemmli y se analizaron por SDS-PAGE en geles de poliacrilamida al 8% seguido de una autorradiografϊa. Para los experimentos de análisis por inmunotransferencia, se obtuvieron lisados de las células BHK-21 transfectadas con los vectores de SFV mediante incubación en un tampón que contenía Igepal al 1 % (Sigma, EE. UU.), Tris HCl a 50 raM, pH 7,6, NaCl a 150 mM, EDTA a 2 mM y PMSF a 1 μg/ml (Sigma, St. Louis, EE. UU), se clarificaron por centrifugación durante 6 minutos a 6000 rpm en una microcentrífuga refrigerada y se cuantificaron mediante un análisis de Bradford. Los lisados se analizaron mediante SDS-PAGE en geles de poliacrilamida al 8%, se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa y se incubaron con antisueros policlonales de conejo específicos contra la nsp2, la nsp3 de SFV (E. Casales, resultados sin publicar) o actina (Sigma, St. Louis, EE. UU.) como anticuerpos primarios, respectivamente. Se utilizó un antisuero de oveja especifico para inmunoglobulinas de conejo conjugado con HRP como anticuerpo secundario. Se visualizaron las proteínas utilizando Western Lightning Chemiluminiscence Reagent Plus (Perkin Elmer Life Sciences, EE. UU.), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para los estudios de localización nuclear, se realizó la inmunofluorescencia indirecta de las células transfectadas utilizando como anticuerpo primario un Acm específico contra la nsp2 citoplásmica de SFV (amablemente proporcionado por W. Bodemer) o un Acm específico contra la nsp2 nuclear de SFV (amablemente proporcionado por el Dr. L. Kaariainen) (16).

Análisis de la expresión de β-gal

Se lisaron las células transfectadas tal y como se describió anteriormente y se midió la actividad total de la β-gal presente en el Usado tal y como está descrito (17), o se tiñeron a los tiempos indicados con X-gal. La cantidad de la proteína producida por cada célula se obtuvo al dividir la cantidad media de β-gal detectada por placa entre la cantidad media de las células transfectadas en cada placa.

EJEMPLO 1

Construcción y caracterización de vectores de SFV que llevan mutaciones no citopáticas derivadas del SIN

Un posible enfoque para generar nuevos vectores no citopáticos de alfavirus es introducir las mutaciones previamente descritas en otros alfavirus, aprovechándose de la homología de secuencia compartida por los diferentes virus de este género. Siguiendo este enfoque, se evaluó el efecto de las mutaciones no citopáticas descritas en el virus SIN en un vector de expresión derivado de SFV. Previamente, se había demostrado que las mutaciones que afectaban el residuo 726 de la subunidad nsp2 de la Rep de SIN reducen considerablemente la citopatogenicidad de este virus, hecho que correlacionaba con un menor nivel de replicación del ARN en los mutantes (7, 22). Dos mutaciones que afectaban a este residuo, P726T y P726F, que se habían descrito como parcialmente citopáticas y no citopáticas para el SIN, respectivamente, se introdujeron en el residuo homólogo de nsp2 en el vector pSFV-1, lo que generó los mutantes pSFV-S2 y pSFV- S3, que llevaban las mutaciones P718T o P718F en nsp2, respectivamente. Para evaluar la citopatogenicidad de estos nuevos vectores, se clonó el gen indicador LacZ a continuación del promotor subgenómico viral, lo que generó los vectores pSFV-S2- LacZ y pSFV-S3-LacZ. Se sintetizó el ARN in vitro para cada uno de estos plásmidos y se electroporó en células BHK-21, que se cultivaron y en las que se analizó la expresión de β-gal mediante tinción con X-gal a diferentes tiempos tras la transfección (figura 1). A diferencia de las células electroporadas con el ARN del SFV-LacZ control en las que, a las 24 horas de la transfección, más del 95% de las células expresaron β-gal y mostraron un fenotipo citopático, sólo un pequeño porcentaje de las células transfectadas con los ARNs de SFV-S2-LacZ o de SFV-S3-LacZ expresaron β-gal a las 24 horas tras la transfección, sin mostrar una morfología citopática. En el caso de SFV- S2-LacZ, el número de células positivas aumentó con el tiempo, siendo capaces de formar grandes colonias de células que expresaban β-gal 5 días después de la electroporación. Este efecto fue mucho más atenuado en SFV-S3-LacZ, con el que nunca se observaron colonias azules a día 5 después de la tinción con X-gal. Estos datos sugieren que las mutaciones P718T y P718F podrían estar bloqueando la replicación

vírica o la expresión del transgén, pero que dan lugar a variantes no citopáticas con una frecuencia relativamente elevada que podrían ser el resultado de mutaciones adaptativas secundarias durante la transcripción in vitro o la replicación del SFV.

EJEMPLO 2

Selección y cartografía de los replicones derivados de SFV-S2 que contienen mutaciones adaptativas nuevas

Para seleccionar las poblaciones de células que contienen replicones no citopáticos de SFV, se sustituyó el gen indicador LacZ en el plásmido pSFV-S2-LacZ por el gen que codifica el marcador de selección dominante puromicina N-acetil-transferasa (pac) que confiere resistencia a la puromicina, lo que generó el plásmido pSFV-S2-pac. Utilizando este plásmido como molde, se sintetizó ARN in vitro y se electroporó en células BHK-21. A las 24 horas de la electroporación, se añadió puromicina a 5 μg/ml, lo que condujo a la selección de colonias resistentes al fármaco que, posteriormente, se expandieron. Para identificar las posibles mutaciones adaptativas en los replicones presentes en las células seleccionadas, se extrajo el ARN total de clones individuales, y se amplificó por RT-PCR con cebadores específicos un fragmento de 3,9 kb de la replicasa de SFV que comprende la secuencia completa de nsp2. Se eligió amplificar la región nsp2 de la replicasa porque en esta región se habían cartografiado la mayoría de las mutaciones no citopáticas descritas en los alfavirus. El fragmento de ADNc rescatado de cada clon se subclonó en el plásmido pSFV-pac original sustituyendo la secuencia de la nsp2 de tipo silvestre. Para comprobar si se habían rescatado mutaciones no citopáticas, se sintetizó ARN in vitro de cada uno de los nuevos plásmidos y se utilizó para electroporar células BHK-21. A las 24 horas de la transfección, se añadió la puromicina a 5 μg/ml y se tiñeron las células con violeta de metilo a diferentes tiempos para comparar su crecimiento con el observado en las células transfectadas con el mutante SFV-S2-pac inicial o con el SFV-pac original. Uno de los clones, el SFV-S2-9- pac, mostró un claro fenotipo no citopático, ya que confirió resistencia a la puromicina a la mayoría de las células transfectadas (figura 2). Otros clones probados mostraron un patrón similar al del SFV-S2 y no se analizaron más en este estudio. Las células transfectadas con el SFV-pac original mostraron un claro efecto citopático y la mayoría

de ellas murieron antes del día 4. La secuenciación del fragmento de nsp2 de pSFV-S2- 9-pac mostró que, además de la mutación original P718T, había una segunda mutación adaptativa en la posición 649 de nsp2 en la que se había sustituido Arg por Hys. Esta nueva mutación afecta la señal de localización nuclear ⁶⁴⁸ RRR (27) de la nsp2 de SFV que, en SFV-S2-9, cambia a ⁶⁴⁸ RHR.

EJEMPLO 3

Efecto de la mutación R649H sobre la citopatogenicidad y sobre la localización nuclear de nsp2

Para comprobar el efecto de la mutación R649H por sí misma sobre la citopatogenicidad de SFV, se introdujo esta mutación en el plásmido pSFV-pac, generándose de esta forma el plásmido pSFV-RHR-pac. Se transcribió el ARN de este plásmido y se electroporó en células BHK-21, que se dejaron recuperar durante 24 horas. Entonces se añadió la puromicina a 5 μg/ml y se analizó el crecimiento de las células a diferentes tiempos tiñendo las células con violeta de metilo tal y como se describió anteriormente (figura 2, columna derecha). El SFV-RHR-pac mostró un patrón muy similar al observado para el vector original SFV-pac, induciendo un fuerte efecto citopático temprano que condujo a la muerte de la mayoría de las células antes del día 4. Estos resultados sugieren que la ausencia de citopatogenicidad del vector SFV-S2-9 se debía a la combinación de las mutaciones P718T y R649H. Para comprobar el efecto de la mutación R649H sobre la localización nuclear de la nsp2, se transfectaron células BHK-21 con el ARN de los vectores que contenían esta mutación (SFV-S2-9-pac y SFV-RHR-pac) o con vectores que no la contenían (SFV-pac y SFV- S2-pac) y se analizaron mediante inmunofluorescencia con anticuerpos monoclonales específicos de la forma nuclear o de la forma citoplásmica de nsp2 de SFV, respectivamente (figura 3), En todos los casos, se detectó nsp2 tanto en el núcleo como en el citoplasma de las células transfectadas, lo que sugiere que la mutación RHR no afectaba el transporte al núcleo de esta proteína.

EJEMPLO 4 Replicación del ARN en las células transfectadas con SFV-S2-9-pac

Para determinar el nivel de replicación del ARN del doble muíante no citopático de SFV, se electroporaron células BHK-21 con ARN de SFV-S2-9-pac, se extrajo el ARN total a las 24, 48 y 72 horas de la electroporación y se analizó mediante transferencia "Northern" con un oligonucleótido marcado con ³² P específico de la secuencia del promotor subgenómico de SFV, que está presente tanto en el ARN genómico como en el ARN subgenómico (figura 4, calles 2 a 4). La cantidad de los ARNs genómico y subgenómico de SFV-S2-9-pac, así como la proporción entre ellos, se comparó con la obtenida en células transfectadas con ARN de SFV-pac a las 24 horas de la electroporación (figura 4, calle 5). Los ARNs genómicos y subgenómicos de SFV-S2-9- pac aumentaron con el tiempo y parecieron alcanzar un pico a las 48 horas de la electroporación. Se observaron unos niveles de ARN similares en una línea celular de BHK resistente a la puromicina obtenida con el vector SFV-S2-9-pac (figura 4, calle 1). En todos los casos, los ARNs de SFV-S2-9 se produjeron en mucha menor cantidad que la obtenida en células transfectadas con ARN del SFV-pac original (obsérvese que la calle 5 estuvo expuesta 72 veces más que las calles 1 a 4). La proporción de los ARNs subgenómico/genómico observada en las células transfectadas con SFV-S2-9-pac y seleccionadas con puromicina fue aproximadamente 1,5 veces mayor que la observada en células transfectadas con SFV-pac (figura 4, números de la parte inferior). Sin embargo, en las células transfectadas con SFV-S2-9-pac no seleccionadas esta proporción fue considerablemente mayor, especialmente a las 24 horas después de la transfección, pero disminuyó con el tiempo, lo que indicó que la síntesis del ARN genómico en el doble mutante podría estar retrasada en relación con la del ARN subgenómico. También se detectaron dos bandas adicionales de ARN con un tamaño intermedio entre los ARNs genómicos y subgenómicos en las células transfectadas con SFV-S2-9-pac (figura 4, calles 1 a 4). Estas bandas no se caracterizaron pero podrían corresponder a ARNs defectivos interferentes que pueden aparecer durante la replicación del doble mutante de SFV. Finalmente, para determinar si se podían recuperar los bajos niveles de replicación del ARN de SFV-S2-9-ρac con una replicasa de tipo silvestre suministrada en trans, se electroporaron las células BHK-21

simultáneamente con los ARNs de SFV-S2-9-pac y de SFV-LacZ (vector silvestre). Después de 24 horas, se extrajo el ARN total de las células coelectroporadas y se analizó mediante transferencia "Northern" (figura 4, calle 7). Los ARNs de las células electroporadas con el SFV-pac original (figura 4, calle 5) y SFV-LacZ (figura 4, calle 6) se analizaron en el mismo gel y se utilizaron como marcadores de tamaño molecular para cada uno de los ARNs genómicos y subgenómicos. Los ARNs genómicos y subgenómicos de SFV-LacZ y SFV-S2-9-pac se detectaron fácilmente en las células coelectroporadas después de exponer el gel durante 1 hora, lo que indicó que la replicasa de tipo silvestre era capaz de, al menos parcialmente, recuperar la replicación del doble mutante. Sin embargo, aunque la cantidad de ambos ARNs subgenómicos era muy similar, el ARN genómico de SFV-LacZ se produjo a unos niveles aproximadamente 2-3 veces mayores que los del mutante SFV-S2-9-pac.

EJEMPLO 5 Procesamiento de la replicasa en el mutante SFV-S2-9

La menor cantidad de ARN detectada en las células transfectadas con el replicón de SFV-S2-9-pac se podría deber a una alteración en el procesamiento de la replicasa. La replicasa de SFV se sintetiza como la poliproteína nspl234 que, con posterioridad, se escinde en sus componentes monoméricos maduros mediante la actividad proteasa presente en el dominio del extremo carboxilo de nsp2 (30), en el que se han cartografiado las mutaciones P718T y R649H. Para examinar el efecto de estas mutaciones sobre el procesamiento de la replicasa, los ARNs de SFV-S2-9-pac, SFV- RHR-pac y SFV-S2-pac sintetizados in vitro se tradujeron mediante incubación con Usados de reticulocitos de conejo en presencia de [ ³⁵ S]-metionina y [ ³⁵ S]-cisteína. Se comparó el patrón de procesamiento de la replicasa en estos mutantes con el obtenido para el ARN SFV-pac original mediante SDS-PAGE seguida de autorradiografía (figura 5A). No se observó ninguna diferencia en el procesamiento de la replicasa entre los tres mutantes analizados y la replicasa de tipo silvestre, lo que dio lugar a una acumulación similar de los monómeros nsp en todos los casos. Para determinar si el procesamiento de la replicasa resultaba afectado in vivo, los Usados de una línea celular BHK-21 resistente a la puromicina portadora del vector SFV-S2-9-pac o de células BHK-21

transfectadas con ARN de SFV-pac original o con ARN de SFV-RHR-pac obtenidos a las 24 horas de la electroporación se analizaron mediante inmunotransferencia con un antisuero de conejo específico contra nsp2 (figura 5B, panel superior) o contra nsp3 (figura 5B, panel central) como anticuerpos primarios, respectivamente. En ambos casos, las muestras derivadas de SFV-pac y de SFV-RHR-pac mostraron un patrón muy similar, pues expresaban cantidades comparables de los monómeros nsp2 y nsp3. La cantidad de nsp2 y nsp3 en la línea celular resistente a puromicina BHK-SFV-S2-9-pac fue aproximadamente 1,5 veces más baja, lo que se podía deber a la menor replicación de este vector. Aunque sólo se detectaron cantidades insignificantes de productos de alto peso molecular en las muestras analizadas, se podían observar algunas bandas diferenciales entre SFV-S2-9 y los otros dos vectores con el antisuero contra nsp2, lo que podría indicar una pequeña alteración del procesamiento de la replicasa de S2-9 in vivo.

EJEMPLO 6

Expresión del transgén y empaquetamiento del replicón SFV-S2-9

Para determinar el nivel de expresión del gen heterólogo en el mutante SFV-S2-9, se clonó el gen indicador Lac-Z a continuación del promotor subgenómico de SFV en este vector, lo que generó el plásmido pSFV-S2-9-Lac-Z. Se sintetizó in vitro ARN a partir de este plásmido y se utilizó para electroporar células BHK-21, en las que se analizó la expresión de β-gal a diferentes tiempos después de la electroporación. Se transfectaron células también con ARN del vector SFV-LacZ original, pero sólo se analizaron a las 24 horas tras la electroporación, debido al efecto citopático inducido por este vector. Se observó un nivel similar de expresión de β-gal en las células transfectadas con SFV-S2- 9-LacZ y SFV-LacZ a las 24 horas de la transfección, siendo éste de aproximadamente 15 pg/célula (figura 6). Este nivel de expresión aumentó con el tiempo en las células transfectadas con SFV-S2-9-LacZ, alcanzando una estabilización a aproximadamente 30 pg de β-gal/célula a las 48 horas de la transfección. Para determinar la eficacia de empaquetamiento del doble mutante SFV-S2-9, se coelectroporaron células BHK-21 con ARN de SFV-S2-9-LacZ y los ARNs auxiliares SFV-helper-S2 y SFV helper-C- S219A tal y como está descrito (29). Se recogieron los sobrenadantes de las células a las

24 horas de la electroporación y se titularon sobre monocapas de células BHK-21 mediante tinción con X-gal. El ARN de SFV-S2-9-LacZ se empaquetó con poca eficacia, lo que proporcionó unos títulos de 7 x 10 ³ pv/ml, que eran mucho más bajos que los obtenidos con el SFV- LacZ original (5 x 10 ⁹ pv/ml). Para comprobar si la presencia de la replicasa de tipo silvestre podría aumentar la eficacia de empaquetamiento del doble mutante S2-9, se coelectroporaron las células BHK-21 con los ARNs de SFV-S2-9-LacZ, SFV-pac y ambos ARNs SFV auxiliares. En este caso, se observó que el vector SFV original era capaz de aumentar con moderación la producción de partículas de SFV-S2-9-LacZ, que alcanzaron un título de 1 x 10 ⁵ pv/ml a las 24 horas de la electroporación, que se determinó mediante la tinción con X-gal de las células BHK infectadas. El empaquetamiento del ARN SFV-pac original disminuyó aproximadamente 5 veces en las células en las que este vector se coelectroporó con SFV-S2-9-LacZ (2,6 x 10 pv/ml), en comparación con los títulos obtenidos cuando el SFV-pac se empaquetó solo (1,2 x 10 ⁹ pv/ml), lo que se determinó mediante inmunofluorescencia indirecta de las células infectadas utilizando un antisuero policlonal de conejo específico contra la nsp2 del SFV como anticuerpo primario. Para determinar el efecto que cada una de las dos mutaciones individuales presentes en SFV- S2-9 tienen sobre el empaquetamiento, se coelectroporaron las células BHK-21 con ambos ARNs auxiliares de SFV y con los ARNs de SFV-RHR-pac o SFV-S2-pac, y se titularon las partículas víricas tal y como se describió anteriormente para SFV-pac. SFV-RHR-pac se empaquetó con títulos elevados (6,5 x 10 ⁸ pv/ml) mientras que SFV- S2-pac mostró una eficacia muy baja de empaquetamiento (2 x 10 ⁴ pv/ml).

EJEMPLO 7 Producción de una línea celular estable que expresa LacZ utilizando el vector

SFV-S2-9

Tal y como se ha demostrado en este estudio, se puede utilizar el vector SFV-S2-9-pac para seleccionar las células que son capaces de mantener el replicón en presencia de puromicina. Para estudiar si era posible utilizar este tipo de vector para generar líneas celulares estables que expresen otros transgenes, se introdujo el gen indicador LacZ en pSFV-S2-9-pac, lo que generó el plásmido pSFV-S2-9-LacZ-pac, en el que los genes

pac y LacZ están colocados cadena abajo de promotores subgenómicos independientes. Se sintetizó in vitro el ARN de este plásmido y se electroporó en las células BHK-21. A las 24 horas de la electroporación, se añadió puromicina a 5 μg/ml y, cuando las células seleccionadas alcanzaron la confluencia, se realizaron diez pases en presencia del antibiótico durante un periodo de 30 días. El porcentaje de células que expresaban β-gal, determinado en cada pase mediante tinción con X-gal, varió entre el 70% y el 90% según el pase, pero estaba por encima del 85% en el pase 10, lo que indicó una gran estabilidad de la expresión del transgén en presencia de selección (figura 7). Cuando las células seleccionadas se pasaron sin puromicina, el porcentaje de las células que expresaban β-gal disminuyó muy rápidamente, estando por debajo del 5% después de 3 pases. El nivel de la expresión de β-gal en las células seleccionadas con puromicina se determinó después de 6 y 8 pases, alcanzando 13 y 18 pg/célula, respectivamente. Estos valores son muy similares a los obtenidos en las células transfectadas con el vector SFV-LacZ original a las 24 horas de la transfección, lo que indica que las líneas celulares generadas con el vector SFV-S2-9 se podían utilizar para expresar proteínas recombinantes en grandes cantidades.

EJEMPLO 8 Evaluación de otros mutantes no citopáticos de SFV previamente definidos

Las mutaciones que habían sido descrito previamente como no citopáticas para SFV se introdujeron en el gen de la subunidad nsp2 de la replicasa de SFV, en el plásmido pSFV-1, que contiene la secuencia del vector. Estas mutaciones incluyeron:

- Ll OT (cambio de TTG por ACC): mutante SF2A (22).

- L713P (cambio de CTA por CCT): mutante SF2C (22).

Además, el plásmido pSFV-PD que contiene la secuencia del vector de SFV con las mutaciones S259P y R65OD en nsp2 fue cedido amablemente por el Dr. K. Lundstrδm (21).

De esta forma se generaron (u obtuvieron) los plásmidos pSFV-SF2A, pSFV-SF2C y pSFV-PD, en los que se clonó el gen LacZ bajo el control del promotor subgenómico viral, obteniéndose los plásmidos: pSFV-SF2A-LacZ, pSFV-SF2C-LacZ y pSFV-PD- LacZ, respectivamente.

Estos plásmidos se utilizaron para sintetizar ARN in vitro, que fue electroporado en células BHK-21. Tras la electroporación las células fueron distribuidas en diferentes placas que se fijaron y tiñeron con X-gal a diferentes tiempos posttransfección. La tinción con X-gal produce una coloración azul en las células que están expresando β-gal a partir del gen LacZ, lo cual nos permite determinar el número de células que portan el vector y que han sobrevivido a diferentes tiempos así como analizar la morfología de las mismas, que es un indicador de citopatogenicidad. En este experimento se utilizó como control negativo células electroporadas con ARN de SFV-LacZ, que es citopático para las células BHK. Asimismo se utilizó como control positivo ARN de SFV-S2-LacZ, que lleva la mutación P718T en nsp2 y da lugar a un fenotipo no citopático en un cierto porcentaje de las células.

Como puede observarse en las figuras 10 y 12 los mutantes SFV-SF2A y SFV-PD mostraron un fenotipo muy similar al del vector silvestre de SFV, induciendo un fuerte efecto citopático en las células transfectadas, que se tradujo en la aparición de numerosos cuerpos apoptóticos a partir del día 3 y en una casi total ausencia de expresión a tiempos largos (7 días). Los datos referentes al carácter citopático del vector SFV-PD están además apoyados por resultados publicados posteriormente por el propio K. Lundstróm en los que se muestra como la expresión de β-gal o GFP en células BHK infectadas con un vector SFV-PD que porta LacZ o GFP como gen marcador alcanza un máximo a las 48 horas para después disminuir drásticamente en los 3-4 días subsiguientes (20, ver figura 2 de esta referencia). El mutante SFV-SF2C mostró un fenotipo algo menos citopático, pero a día 3 aparecen muchos cuerpos apoptóticos y aunque aparentemente a día 4 hay niveles altos de expresión, esta desaparece casi completamente a día 7, indicando que probablemente este mutante permita expresiones algo más prolongadas que el vector silvestre, pero sin dejar de ser citopático. El vector SFV-S2 es el único que no da lugar a la aparición de cuerpos apoptóticos y que permite

mantener la expresión durante al menos 7 días dando lugar a la aparición de colonias. El vector SFV-S2-9 que porta las mutaciones P718T y R649H se seleccionó a partir de una de las colonias obtenidas con SFV-S2 cuando el gen LacZ se sustituyó por el gen pac en dicho vector. En la figura 14 se incluyen fotos de células transfectadas con ARN del vector SFV-S2-9-LacZ y teñidas a diferentes tiempos con X-gal. El vector S2-9 no produjo efecto citopático en las células transfectadas, que fueron capaces dividirse.

EJEMPLO 9

Obtención de líneas celulares estables productoras de cardiotrofina 1 utilizando el vector SFV-S2-9

Se generaron unos plásmidos introduciendo el gen de la cardiotrofina de rata (CTr) en pSFV-S2-9-pac en dos entornos diferentes y se utilizaron para generar líneas celulares que expresaban CTr. A continuación, se analizó tanto la expresión de CTr como la estabilidad de la expresión de CTr, con el fin de identificar líneas celulares estables que expresaban CTr.

9.1 Construcción de plásmidos

Con objeto de generar líneas celulares que expresen cardiotrofina, se generaron plásmidos basados en SFV-S2-9-pac introduciendo el gen de la cardiotrofina de rata (CTr), según dos realizaciones distintas:

el plásmido pSFV-S2-9-CTr-pac, en el que los genes pac y CTr están colocados cadena abajo de promotores subgenómicos independientes (Figura 15A); y

- el plásmido pSFV-S2-9-pac2A-CTr, construido siguiendo la estructura general descrita en la Figura 8B, que contenía el gen pac y el gen CTr fusionados cadena abajo de un único promotor subgenómico (Figura 15A); en esta realización se introdujo entre los dos genes la secuencia de la autoproteasa 2A de FMDV (SEQ

ID NO: 14) (35) para permitir la liberación de la cardiotrofina de la proteína de fusión (Figura 15 A).

Para construir el plásmido pSFV-S2-9-CTr-pac se generó previamente el vector de clonaje pSFV-S2-9-mcs-pac, que contiene la replicasa de SFV-S2-9, un primer promotor subgenómico seguido de un sitio múltiple de clonaje y un segundo promotor subgenómico seguido del gen pac.

Brevemente se hibridaron los oligonucleótidos SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 16, generándose un fragmento de DNA sintético con extremos 5' protuberantes compatibles con BamHI, y cuya secuencia contiene un sitio múltiple de clonaje con dianas para los enzimas Avrll, Apal, NruI y BstBI, tres codones de terminación de la traducción en las tres posibles fases de lectura y la secuencia del promotor subgenómico de SFV. Este fragmento se clonó en el sitio BamH I de pSFV-S2-9-pac generándose el plásmido pSFV-S2-9-mcs-pac.

En una segunda etapa se sintetizó un fragmento de PCR de 645 pb que contenía el gen de la cardiotrofina de rata a partir del plásmido pRSET-CTr (36) utilizando los oligonucleótidos SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 18, que hibridan con el comienzo y el final del gen CTr respectivamente y contienen sitios BamH I en los extremos para facilitar el clonaje. El fragmento de PCR se digirió con BamH I y se clonó en el sitio BamH I de pSFV-S2-9-mcs-pac, obteniéndose el plásmido pSFV-S2-9-CTr-pac. De una manera similar el mismo fragmento de PCR fue clonado en pSFV-1 digerido con BamH I, generándose el plásmido pSFV-CTr.

Para construir el plásmido pSFV-S2-9-pac2A-CTr se generó previamente el vector de clonaje pSFV-S2-9-pac2A, que contiene la secuencia del vector SFV-S2-9-pac en la que el gen pac está fusionado en fase en su extremo 3' con la secuencia nucleotídica que codifica la autoproteasa 2 A del FMDV (35), conteniendo al final de esta secuencia el sitio de clonaje Smal/Xmal. Brevemente, utilizando el plásmido pSFV-S2-9-pac como molde se hizo una PCR cruzada con los oligonucleótidos externos: SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 20, e internos: SEQ ID NO: 21 y SEQ ID NO: 22, generándose un fragmento de ADN de 842 pb que se digirió con BamH I y Xma I y se clonó en pSFV-

S2-9-pac digerido con los mismos enzimas, obteniéndose de esta forma el plásmido

pSFV-S2-9-pac2A. La PCR cruzada se hizo con el doble objetivo de introducir la secuencia 2A-XmaI en el extremo 3 ' del gen pac y simultáneamente eliminar un sitio Xmal presente en el interior de ese gen.

Finalmente para generar el plásmido pSFV-S2-9-pac2A-CTr se sintetizó un fragmento de PCR de 645 pb que contenía el gen de la cardiotrofina de rata a partir del plásmido pRSET-CTr (36), utilizando los oligonucleótidos: SEQ ID NO: 23 y SEQ ID NO: 24, que hibridan con el comienzo y el final del gen de CTr respectivamente y contienen sitios Xma I en los extremos para facilitar el clonaje. El fragmento de PCR se digirió con Xma I y se clonó en el sitio Xma I de pSFV-S2-9-pac2A, obteniéndose el plásmido pSFV-S2-9- pac2A-CTr.

9.2 Obtención de líneas celulares estables productoras de cardiotrofina y análisis de la expresión de cardiotrofina

El ARN de cada plásmido sintetizado in vitro (apartado 9.1) se electroporó en células BHK-21. A las 24 horas de la electroporación, se añadió puromicina a 5 μg/ml y, cuando las células seleccionadas alcanzaron confluencia, se analizó la expresión de cardiotrofina en los lisados celulares mediante inmunotransferencia con un anticuerpo específico para cardiotrofina (Figura 15B).

Para los experimentos de análisis por inmunotransferencia, se obtuvieron lisados de las células BHK-21 transfectadas con los vectores de SFV mediante incubación en un tampón que contenía Igepal al 1% (Sigma, EE. UU.), Tris HCl a 50 mM, pH 7,6, NaCl a 150 mM, EDTA a 2 mM y PMSF a 1 μg/ml (Sigma, St. Louis, EE. UU), se clarificaron por centrifugación durante 6 minutos a 6000 rpm en una microcentrífuga refrigerada y se cuantificaron mediante un análisis de Bradford. Los lisados se analizaron mediante SDS-PAGE en geles de poliacrilamida al 12%, se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa y se incubaron con un antisuero policlonal específico contra cardiotrofina CT-I murina (R&D Systems) o actina (Sigma, St. Louis, EE. UU.) como anticuerpos primarios, respectivamente. Se utilizó un antisuero de cabra u oveja especifico para inmunoglobulinas de rata o conejo, respectivamente, conjugado con HRP como anticuerpo secundario. Las proteínas se visualizaron utilizando Western

Lightning Chemiluminiscence Reagent Plus (Perkin Elmer Life Sciences, EE. UU.), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para cuantificar los niveles de CTr se analizaron por inmunotransferencia diferentes cantidades de usados de las células que expresaban CTr y se compararon con cantidades conocidas de cardiotrofina recombinante, utilizando par ello el programa Imagequant TL (Amersham).

Los niveles de expresión de cardiotrofina en las líneas generadas con cada uno de los vectores eran similares a los obtenidos en células electroporadas con ARN del vector con la replicasa silvestre SFV-CTr (Figura 15B). La expresión de CTr en las líneas seleccionadas era aproximadamente de 4,3 pg/célula. En las líneas generadas con el vector SFV-S2-9-pac2A-CTr se observó que la mayor parte de la CTr se había liberado de la proteína de fusión, aunque había una fracción no digerida que también se detectaba por inmunotransferencia.

Para analizar la estabilidad de estos vectores en las células transfectadas se realizaron diez pases sucesivos de las células que los contenían en presencia de puromicina durante un periodo de unos 20 días y se determinó la expresión de CTr en cada pase en Usados celulares mediante inmunotransferencia. En el caso de las líneas celulares generadas con el vector SFV-S2-9-CTr-pac se observó que la expresión se mantenía hasta el pase 5 a partir del cual comenzaba a disminuir drásticamente para prácticamente desparecer a pase 11 (Figura 16). Esta pérdida de estabilidad, sin embargo, no se produjo en las líneas que contenían el vector SFV-S2-9-pac2A-CTr, en las que la expresión se mantuvo constante durante al menos 10 pases (Figura 17), lo que indica que la fusión en fase del transgén (gen de la CTr) con el gen pac utilizando la secuencia nucleotídica que codifica la autoproteasa 2A del FMDV permite incrementar considerablemente la estabilidad de la expresión de proteínas heterólogas en las líneas generadas a partir del vector SFV-S2-9.

EJEMPLO 10 Obtención de líneas celulares estables productoras del factor de crecimiento humano similar a la insulina (IGF-I) utilizando el vector SFV-S2-9

Se generaron unos plásmidos introduciendo el gen del factor de crecimiento humano similar a la insulina (IGF-I) en pSFV-S2-9-pac en dos entornos diferentes y se utilizaron para generar líneas celulares que expresaban IGF-I. A continuación, se analizó tanto la expresión de IGF-I como la estabilidad de la expresión de IGF-I, con el fin de identificar líneas celulares estables que expresaban IGF-I.

10.1 Construcción de plásmidos

Con objeto de generar líneas celulares que expresen IGF-I, se generaron plásmidos basados en SFV-S2-9-pac introduciendo el gen del IGF-I, según dos realizaciones distintas:

el plásmido pSFV-S2-9-IGF-pac, en el que los genes pac e IGF-I están colocados cadena abajo de promotores subgenómicos independientes (Figura 18); en este plásmido el gen IGF-I se fusionó con el enhancer (potenciador) de traducción de la cápsida de SFV usando como conector la secuencia nucleotídica que codifica la autoproteasa 2A del FMDV, ya que esta estrategia ha permitido aumentar considerablemente los niveles de expresión de proteínas heterólogas en el vector silvestre de SFV (37); y

el plásmido pSFV-S2-9-pac2A-IGF, construido siguiendo la estructura general descrita en la Figura 8B, que contenía el gen pac y el gen IGF-I fusionados cadena abajo de un único promotor subgenómico (Figura 18); en esta realización se introdujo entre los dos genes la secuencia nucleotídica que codifica la autoproteasa 2A del FMDV (SEQ ID NO: 14) (35) para permitir la liberación de la cardiotrofina de la proteína de fusión (Figura 18).

Para construir el plásmido pSFV-S2-9-IGF-pac se digirió el plásmido pSFVbl2A-IGF- IB (38) con BglII+Klenow y Spel obteniéndose un fragmento de 2,3 kb que se ligó con el fragmento de 11,1 kb obtenido a partir de pSFV-S2-9-pac digerido con Bsml+T4pol y Spel. El plásmido pSFVbl2A-IGF-IB contiene la secuencia del precursor de IGF-I humano (IGF-IB) fusionada en su extremo 5' con un cassette que comprende la

secuencia de codifica los 34 primeros aminoácidos de la cápsida de SFV (enhancer mínimo de traducción o "bl") seguido de la secuencia nucleotídica que codifica la autoproteasa 2A del FMDV. El precursor IGF-IB codifica una preproteína de 195 aminoácidos que incluye los dominios II, B, C, A, D, D, E, Ea Eb y 6 del gen de IGF-I. Esta preproteína se procesa a la forma madura de IGF-I que es secretada, perdiendo los dominios aminoterminal II y los dominios carboxiterminales E, Ea, Eb y 6 (39).

Para construir el plásmido pSFV-S2-9-pac2A-IGF se digirió el plásmido pSFVbl2A- IGF-I (38) con Xmal obteniéndose un fragmento de 0,59 kb que contenia la secuencia de IGF-IB que se ligó con pSFV-S2-9-pac2A (cuyas características y obtención se describen en el Ejemplo 9.1, en relación con la construcción del plásmido pSFV-S2-9- pac2A-CTr) digerido previamente con Xmal. Posteriormente se seleccionaron clones en los que el fragmento de 0,59 kb se había introducido en la orientación correcta.

10.2 Obtención de líneas celulares estables productoras de IGF-I y análisis de la expresión de IGF-I

El ARN de cada plásmido sintetizado in vitro (apartado 10.1) se electroporó en células BHK-21. A las 24 horas de la electroporación, se añadió puromicina a 5 μg/ml y, cuando las células seleccionadas alcanzaron confluencia, se analizó la expresión de IGF-I en los sobrenadantes celulares recogidos a diferentes tiempos mediante ELISA específico para IGF-I humano (Figura 19).

La expresión de IGF-I se analizó en sobrenadantes celulares utilizando un kit de ELISA específico para medir IGF-I humano libre (Free IGF-I, ref DSL- 10-9400, Diagnostic

Systems laboratories, Webster, Texas, EEUU). Para cada uno de los pases analizados se sembraron 5x10 ⁵ células por pocilio, se esperaron 4 horas para que las células quedaran adheridas y se cambió el medio añadiendo 1 mi de medio Glasgow-MEM con suero fetal bovino al 5% (37) y puromicina a 5 μg/ml. El sobrenadante se recogió a las 24, 48 ó 72 horas, se centrifugó a 6.000 rpm durante 5 minutos en una microfuga refrigerada para eliminar restos celulares y se congeló a -80 ⁰ C hasta el momento de ser analizado. Con objeto de llevar un control de la cantidad de células presente en cada

muestra se recogieron las células BHK de los mismos pocilios en los que se habían recogido los sobrenadante y se lisaron mediante incubación en un tampón que contenía Igepal al 1% (Sigma, EE. UU.), Tris HCl a 50 mM, pH 7,6, NaCl a 150 mM, EDTA a 2 mM y PMSF a 1 μg/ml (Sigma, St. Louis, EE. UU), se clarificaron por centrifugación durante 6 minutos a 6000 rpm en una microcentrífuga refrigerada y se cuantifϊcaron mediante un análisis de Bradford. Los valores de cantidad de proteína obtenidos por Bradford fueron muy similares en todas las muestras analizadas.

Los resultados obtenidos en relación con la expresión de IGF-I en los sobrenadantes celulares recogidos pusieron de manifiesto que, a las 24 horas, los niveles de expresión de IGF-I en el sobrenadante de las líneas generadas con cada uno de los vectores no citopáticos eran sólo entre 1,5-2 veces inferiores a los obtenidos en células electroporadas con ARN del vector silvestre SFV-IGF-I (Figura 19). Esta expresión fue algo mayor en la línea obtenida con el vector SFV-S2-9-pac2A-IGF (34,5 pg/célula) con respecto a la expresión en la línea seleccionada con SFV-S2-9-IGF-pac (21,3 pg/célula). El análisis de la expresión de IGF-I en sobrenadantes tomados a tiempos más largos demostró que el IGF-I se puede acumular hasta un máximo de 67 y 34 pg/célula en los vectores SFV-S2-9-pac2A-IGF y SFV-S2-9-IGF-pac, respectivamente.

Estos resultados ponen de manifiesto que el IGF-I está siendo secretado al medio extracelular, lo que está indicando un correcto procesamiento de la poliproteína.

Para analizar la estabilidad de estos vectores en las células transfectadas se realizaron 10 pases sucesivos de las células que los contenían en presencia de puromicina durante un periodo de unos 20 días y se determinó la expresión de IGF-I en sobrenadantes celulares recogidos a las 24 horas tras cada uno de los pases mediante ELISA específico para IGF-I humano. En el caso de las líneas generadas con el vector SFV- S2-9-IGF-pac se observó que la expresión se mantenía hasta el pase 4 a partir del cual comenzaba a disminuir drásticamente llegando a niveles 80 veces inferiores en el pase 10 (Figura 20). Esta pérdida de estabilidad, sin embargo, no se produjo de forma tan acentuada en las líneas que contenían el vector SFV-S2-9-pac2A-IGF, en las que la expresión se mantuvo casi constante, disminuyendo solo 4 veces entre los pases 1 y 10 (Figura 20). Este resultado confirma que la fusión en fase del transgén con el gen pac

utilizando la secuencia nucleotídica que codifica la autoproteasa 2A de FMDV permite incrementar considerablemente la estabilidad de la expresión de proteínas heterólogas en las líneas generadas con el vector SFV-S2-9.

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