Campo técnico de la invención.

La presente invención está relacionada con el sector agrícola y el sector biotecnológico con aplicación al agro, los cuáles producen insumos y materias primas agrícolas tanto para la producción de alimentos y/o bebidas de consumo humano, como otros productos de uso industrial. Particularmente la presente invención se refiere a moléculas orgánicas volátiles de bajo peso molecular y alta presión de vapor, producidas y emitidas por hongos, las cuáles son capaces de regular el crecimiento vegetal. Dichas moléculas aumentan la biomasa y modifican la estructura radicular de las plantas tratadas con ellas.

Antecedentes de la invención.

Una diversidad de señales químicas que perciben las plantas, desde la germinación hasta la senescencia, están asociadas con las interacciones que tienen con microorganismos. La interacción entre plantas y microorganismos comenzó hace 400-460 millones de años, cuando las plantas colonizaron los ecosistemas terrestres (Remy, Taylor, Hass & Kerp 1994; Redecker 2000; Chagas, Pessotti, Caraballo-Rodríguez & Pupo 2018). De hecho, los hongos, como microorganismos eucariotas, se han diversificado junto con las plantas terrestres (Lutzoni et al. 2018), y el número de especies de hongos alcanza de 2.2 a 3.8 millones (Hawksworth & Lücking 2017).

Los hongos son parte fundamental del microbioma de la planta, colonizando tejidos de plantas por encima y por debajo del suelo, tanto interna como externamente (Wallace, Laforest-Lapointe & Kembel 2018; Toju, Kurokawa & Kenta 2019; Hurtado-McCormick et al. 2019; Comeau, Novinscak, Joly & Filion 2020). En plantas de ecosistemas áridos y semiáridos, también se han estudiado comunidades fúngicas, especialmente en agaves y cactus que representan los principales recursos bióticos en estos entornos (Starmer, Schmedicke & Lachance 2003; Bezerra et al. 2013; Silva-Hughes et al. 2015; Coleman-Derr et al. 2016; Fonseca-García et al. 2016; Citlali, Desgarennes, Flores-Núñez & Partida- Martínez 2018).

Los agaves y los cactus pertenecen a dos familias de plantas taxonómicamente no relacionadas, pero ecológica y económicamente importantes: Asparagaceae y Cactaceae. En la familia Asparagaceae, el género monocotiledóneo Agave tiene aproximadamente 200 especies con 150 especies encontradas en México (García-Mendoza 2002). La extremadamente diversa familia de las dicotiledóneas Cactaceae tiene alrededor de 2,000 especies con 670 de ellas distribuidas en México (Hollis & Scheinvar 2000; Guzmán, Arias & Dávila 2003). Los agaves y los cactus a menudo comparten el mismo hábitat, y ambos han desarrollado adaptaciones morfológicas, fisiológicas y bioquímicas de forma independiente, como el metabolismo ácido de las crasuláceas (CAM, por sus siglas en inglés), que les permite prosperar en las tierras secas (Citlali et al. 2018).

Las comunidades fúngicas asociadas con agaves y cactus están dominadas, como en la mayoría de las plantas, por el phylum Ascomycota (más del 90%) seguido de Basidiomycota (Coleman-Derr et al. 2016; Fonseca-García et al. 2016). Los órdenes de Ascomycota dominantes en estas comunidades fueron Pleosporales, Capnodiales y Dothideales de la clase Dothideomycetes, Sordariales de los Sordariomycetes, Chaetothyriales de los Eurotiomycetes, y de los Basidiomycota los Agaricales e Hymenochaetales, ambos de los Agaricomycetes. Estas comunidades fueron influenciadas por la biogeografía y el compartimento de la planta (Fonseca-García et al. 2016; Citlali et al. 2018).

A pesar de los patrones biogeográficos fúngicos en los suelos y las comunidades asociadas a las plantas, se identificó un microbioma fúngico central compartido entre las cinco especies investigadas: la especie cultivada Agave tequilana, la especie nativa Agave deserti y las especies nativas y simpátricas Agave salmiana, Myrtillocactus geometrizans y Opuntia robusta, localizadas en siete poblaciones desde el sur de los EUA hasta el centro de México (Citlali et al. 2018). El estudio detallado de este microbioma central debería permitir la identificación de las funciones y mecanismos microbianos en la interacción planta- microbiano que afectan la adaptación de la planta a ambientes áridos (Busby et al. 2017). Por su parte, los compuestos orgánicos volátiles microbianos (mCOVs) son moléculas de hasta 20 átomos de carbono, que tienen un bajo peso molecular (<400 Da) y altas presiones de vapor, bajos puntos de ebullición y una cierta naturaleza I ipofílica (Schmidt, Cordovez, de Boer, Raaijmakers & Garbeva 2015).

Los compuestos orgánicos volátiles emitidos por hongos pueden activar las respuestas de defensa en las plantas y prepararlos contra futuros ataques de patógenos (Naznin etal. 2014; Cellini et al. 2018; Quintana-Rodríguez, Rivera-Macias, Adame-Alvarez, Torres & Heil 2018). También pueden promover el crecimiento de plantas cercanas e influir en su tolerancia al estrés abiótico (Minerdi, Bossi, Maffei, Gullino & Garibaldi 2011 ; Bitas et al. 2015; Lee, Yap, Behringer, Hung & Bennett 2016).

Anteriormente, en nuestro grupo de investigación encontramos que los volátiles bacterianos emitidos por miembros del microbioma de agaves y cactus, solos o en mezclas, mostraban efectos benéficos en A. thaliana y mejoraban el crecimiento y el desarrollo de Agave tequilana y Agave salmiana (Camarena-Pozos, Flores-Núñez, López, López-Bucio& Partida- Martínez 2019).

Sin embargo, la diversidad y el papel de los volátiles fúngicos en estas especies de plantas de ambientes áridos seguían siendo desconocidos, hasta ahora.

Con relación a los compuestos volátiles para utilizarse en plantas, se pueden mencionar a continuación los siguientes documentos.

La solicitud de patente MXA2019012961 (no publicada) describe moléculas orgánicas volátiles reguladoras del crecimiento vegetal, composiciones y uso de las mismas, las cuales comprenden compuestos volátiles producidos por bacterias asociadas a agaves y cactus que influyen en el crecimiento y desarrollo de las plantas.

La solicitud de patente CN105884544 describe composiciones fertilizantes para Brassica júncea, las cuales comprenden una mezcla de diversos componentes que al ser fermentados, generan ácidos orgánicos que promueven el crecimiento de la planta, mientras que los volátiles que se encuentran en dicha composición son capaces de inhibir infestaciones por insectos.

La solicitud de patente KR20160045476 describe composiciones que comprenden cepas bacterianas de Trichoderma harzianum MPA 167 para promover el crecimiento de plantas, las cuales expiden sustancias volátiles.

La solicitud de patente WO2012/085255A describe composiciones de compuestos volátiles orgánicos provenientes de antagonistas bacterianos para el control del crecimiento microbiano, los cuales comprenden derivados de metano, formaldehído, alcoholes, cetonas, etc.

La solicitud de patente CN102515898A describe composiciones nutrientes que comprenden licores fermentados de Asplenium antiquum y que incluyen flora fúngica, capaces de estimular el crecimiento de raíces y promover el metabolismo de plantas adultas, prolongando el tiempo de floración y su resistencia al estrés.

La solicitud de patente W02010084230A1 describe novedosos hongos micorríticos arbusculares que establecen simbiosis con la mayoría de las plantas e incrementan la supervivencia, vitalidad y producción de las mismas, particularmente en condiciones de altas concentraciones de metales pesados y otros xenobióticos, reduciendo con ello la aplicación de fertilizantes, pesticidas y productos fitosanitarios.

Finalmente, diversas publicaciones mencionan el posible efecto de compuestos orgánicos volátiles sobre el crecimiento de plantas, por ejemplo el efecto de volátiles producidos por Ralstonia solanacearum TBBS1 y Bacillus subtilis SYST2 para estimular el crecimiento de plantas de tabaco (Tahir y col, 2017), volátiles producidos por Bacillus, Pseudomonas, Arthrobacter, Fusarium y Alternaría que son capaces de estimular el crecimiento de hojas y raíces de plantas (Fincheira y col. 2018), así como volátiles producidos por Microbacterium EC8 que estimulan el incremento de la biomasa de tallos y raíces (Cordovez y col., 2018). De entre los compuestos de origen fúngico identificados que afectan el desarrollo de la arquitectura radicular se encuentra el volátil 6-pentil-2H-piran-2-ona (6-PP), identificado en la cepa Tríchoderma atrovirídae IM 1206040, el cual es uno de los volátiles mayormente identificados en cepas del género Tríchoderma. Este compuesto inhibe el crecimiento de la raíz primaria, induce la formación de raíces laterales en A. thaliana, y modula la expresión de las proteínas de transporte de auxinas PIN de una manera dosis-dependiente (Garnica- Vergara et al. 2016).

Una diversidad de cepas de Fusarium oxysporum, pertenecientes a diferentes formae speciales como cicerís, conglutinans, lycopersici, cúbense, lactucum, entre otras, promueven el crecimiento foliar y radicular de A. thaliana y Nicotiana tabacum según Bitas y col. (Bitas et al. 2015). En este estudio se destaca la producción de sesquiterpenos por parte de los hongos, entre ellos, y solamente en algunas cepas, del p-cariofileno, el cual ya se ha reportado como promotor del crecimiento en lechuga (Minerdi et al. 2011).

Comparado con la gran diversidad de COV identificados en los hongos, es muy poco lo que se conoce sobre el papel funcional de estos compuestos en las plantas. Los sistemas más estudiados, sin contar a Tríchoderma, corresponden a interacciones parásito-huésped.

Debido a lo anterior, sigue existiendo la necesidad de contar con más y mejores soluciones que permitan incrementar de manera sustantiva el crecimiento de plantas, por ejemplo, de plantas de interés comercial utilizando compuestos orgánicos volátiles, por ejemplo prevenientes de hongos, ya sea por sí mismos o en combinación con otros más.

Breve descripción de la invención.

Los hongos representan un grupo importante de microorganismos eucariontes que forman parte de una amplia variedad de hábitats, incluido el microbioma de las plantas. Los hongos producen una amplia gama de metabolites secundarios, incluidos tes compuestos orgánicos volátiles (COVs). Sin embargo, la diversidad y las actividades biológicas de tes COVs fúngicos (fCOVs) emitidos por la microbiota de plantas de ambientes áridos y semiáridos aún no se había explorado.

De acuerdo con la presente invención, analizamos los fCOVs producidos por 22 miembros del microbioma central y no central de agaves y cactus en su interacción con Arabidopsis thaliana. Identificamos la diversidad química de tes fCOVs utilizando SPME-GC-MS y probamos tes efectos de tes compuestos puros en el crecimiento y desarrollo de las plantas modelo y huésped. La presente invención reveló que cinco clases de hongos estuvieron representadas en nuestro análisis, donde cerca del 70% de dichas clases influyeron positivamente en el crecimiento de A. thaliana. Conforme a la invención, Identificamos 94 volátiles fúngicos clasificados en nueve clases químicas, donde tes terpenos mostraron la mayor diversidad química, seguidos por los alcoholes y los compuestos alifáticos. Determinamos que el canfeno y el benzoato de bencilo mejoraron el crecimiento de A. thaliana, Agave tequilana y Agave salmiana. Nuestros estudios sobre tes fCOVs de las plantas del desierto subrayan una diversidad química sin explotar con aplicaciones biotecnológicas prometedoras. Es por ello que en la presente invención se describe el uso del canfeno y el benzoato de bencilo como moléculas con capacidad de aumentar la biomasa y modificar la estructura radicular de las plantas tratadas con ellas.

Breve descripción de las figuras.

Figura 1. Se muestra el análisis filogenético molecular de las cepas de hongos en función de sus secuencias ITS. La historia evolutiva se infirió utilizando el método de máxima verosimilitud basado en el modelo de 2 parámetros de Kimura realizado en MEGA7. Las puntas se colorean según el fenotipo de la planta observado: sin efecto (amarillo), inhibición del crecimiento (rojo) y promoción del crecimiento (verde). Phylum Ascomycota: Dothideomycetes (triángulos), Eurotiomycetes (círculos), Saccharomycetes (cuadrados), Sordariomycetes (diamantes) y Phylum Mucoromycota: Mucoromycetes (estrella).

Figura 2. Se muestra la abundancia relativa de géneros fúngicos en tes datos de secuenciación de amplicones ITS del microbioma de agaves y cactus (Coleman-Derr et al. 2016; Fonseca-Garcia et al. 2016). s-suelo, rz-rizósfera, er-endósfera de raíz, eh-endósfera de hoja p-filósfera.

Figura 3. Se muestra el efecto sobre el crecimiento de A. thaliana en interacción con COVs de cepas de hongos aisladas de agaves y cactus. Se observa a) mapa de calor que muestra los parámetros medidos de la planta por grupo fenotípico y cepa fúngica. Todas las medidas fueron normalizadas versus control. Se muestran diferencias significativas con triángulos negros (HSD Tukey-Kramer [p <0.05, n = 5]). BR: biomasa fresca de raíz, CLO: contenido de clorofila, LRP: longitud de raíz primaria, BF, biomasa fresca foliar, BT: biomasa fresca total, LRL: longitud de raíz lateral, DRL: densidad de raíces laterales y NRL: número de raíces laterales. Phylum Ascomycota: Dothideomycetes (triángulos), Eurotiomycetes (círculos), Saccharomycetes (cuadrados), Sordariomycetes (diamantes) y Phylum Mucoromycota: Mucoromycetes (estrella); b) Se observaron tres fenotipos vegetales distintos: sin efecto (amarillo), inhibición del crecimiento (rojo) y promoción del crecimiento (verde), a. Control de plantas de A. thaliana sin interacción fúngica, y en interacción con b. Fusarium lactis AsSF 4.3.1 , c. Aspergillus hancockü AsM 4.2.4, d. Mucor sp. AsM 4.2.3, e. Beauvería pseudobassiana AsM 3.1.5 y f. Cladosporíum sp. MgSF 3.2.1.

Figura 4. Se muestra el escalamiento multidimensional no métrico de distancias euclidianas del efecto de volátiles fúngicos emitidos por hongos asociados con agaves y cactus sobre el crecimiento de A. thaliana. Valor de estrés: 0.0098. PERMANOVA - Efecto explicado por: Clase fúngica (p = 0.045), riqueza de sesquiterpenos-diterpenos (p = 0.017) y riqueza de alcoholes (p = 0.041).

Figura 5. Se muestran los compuestos orgánicos volátiles fúngicos (fCOVs) producidos por hongos asociados con agaves y cactus en su interacción con A. thaliana conforme a la presente invención. Perfiles de COVs por cepa fúngica y clase química. Las clases químicas se representan como A1 : monoterpenos, A2: sesquiterpenos, A3: diterpenos, B: alcoholes, C: compuestos alifáticos, D: cetonas, E: ásteres, F: aldehidos, G: éteres, H: compuestos que contienen N e I: ácidos orgánicos. Los cuadrados grises y negros representan la ausencia y presencia del compuesto volátil, respectivamente. Tres grupos fenotípicos fueron observados: sin efecto (amarillo), inhibición del crecimiento (rojo) y promoción del crecimiento (verde). Phylum Ascomycota: Dothideomycetes (triángulos), Eurotiomycetes (círculos), Saccharomycetes (cuadrados), Sordariomycetes (diamantes) y Phylum Mucoromycota: Mucoromycetes (estrella).

Figura 6. Se muestra el análisis de COVs producidos por hongos asociados con agaves y cactus conforme a la presente invención. Se observa a) diagrama de Venn de la distribución de fCOVs por clase fúngica. Los números pequeños en azul representan cada COV como se describe en la tabla 3; b) Porcentaje de COVs fúngicos por clase química según se informa en la base de datos de mCOV a partir de mayo de 2020 (Lemfack et al. 2018).

Figura 7. Se muestra la molécula canfeno (CAMP) confirmada con el estándar comercial (Sigma 442505). Se observa a) la estructura química de CAMP que muestra los iones fragmentados (m/z) del espectro de masas de ionización de electrones; cromatograma de iones totales y espectro de masas de b) COVs para Beauvería pseudobassiana AsM 3.1.5 y c) del estándar comercial (Sigma 442505) que indica la presencia de CAMP en el tiempo de retención (RT) de 3.7 min. El CAMP se identificó comparando los espectros de masas en la biblioteca NIST 2008.

Figura 8. Se muestra la molécula 2-etilhexi l-acetato (2EA) confirmado con el estándar comercial (Sigma W514705). Se observa a) la estructura química de 2EA que muestra los iones fragmentados (m/z) del espectro de masas de ionización de electrones; cromatograma de iones totales y espectro de masas de b) COVs para Xylaría sp. ASM 3.1 .8 y c) del estándar comercial (Sigma W514705) que indica la presencia de 2EA en el tiempo de retención (RT) de 13.8 min. 2EA se identificó comparando los espectros de masas en la biblioteca NIST 2008.

Figura 9. Se muestra la molécula benzoato de bencilo (BB) confirmado con el estándar comercial (Sigma 68183). Se observa a) la estructura química de BB que muestra los iones fragmentados (m/z) del espectro de masas de ionización de electrones; cromatograma de iones totales y espectro de masas de b) los COVs de Paraconiothyríum brasiliense MgSF 3.3.1 y c) del estándar comercial (Sigma 68183) que indica la presencia de BB en el tiempo de retención (RT) de 35.8 min. BB se identificó comparando los espectros de masas en la biblioteca NIST 2008.

Figura 10. Se muestran los efectos de compuestos orgánicos volátiles puros seleccionados en el crecimiento de Arabidopsis thaliana. Se observan a) los efectos dosis-respuesta sobre los parámetros de crecimiento evaluados durante un período de 14 días. Las diferencias significativas se muestran con cuadrados (HSD Tukey-Kramer [p <0.05, n = 8]). El color representa el efecto en la planta: verde (positivo) y marrón (negativo). Los experimentos fueron replicados tres veces. BT: biomasa fresca total, BF: biomasa fresca foliar, LRP: longitud de raíz primaria, BR: biomasa fresca de raíz, CLO: contenido de clorofila, LRL: longitud de raíz lateral, DRL: densidad de raíces laterales y NRL: número de raíces laterales. Los volátiles utilizados fueron CAMP: canfeno, 2EA: 2-etilhexil acetato y BB: benzoato de bencilo. En la parte superior, se muestra la estructura química de cada volátil utilizado; b) fenotipo de plántulas de A. thaliana en respuesta a dosis crecientes de CAMP y BB.

Figura 11. Se muestra la respuesta fenotípica de plantas micropropagadas de A. tequilana y A. salmiana nativas expuestas a fCOVs seleccionados. Se observa a) el mapa de calor que muestra el efecto de los volátiles seleccionados sobre los parámetros de crecimiento de A. tequilana y A. salmiana. Se muestran diferencias significativas con triángulos negros (HSD TukeyKramer [p <0.05, n = 6]). GR: grosor de la raíz, LH: longitud de la hoja, TCR: tasa de crecimiento relativa y LR: longitud de la raíz. Los volátiles utilizados fueron CAMP: canfeno y BB: benzoato de bencilo; b) fenotipo de plantas micropropagadas de A. tequilana y A. salmiana expuestas a diferentes dosis de CAMP y BB. Los diferentes tratamientos se aplicaron durante 60 días en condiciones controladas. Las imágenes muestran plantas representativas de cada tratamiento.

Descripción detallada de la invención.

La presente invención, describe compuestos volátiles producidos por hongos capaces de estimular el crecimiento de plantas, por ejemplo, plantas típicas del desierto como por ejemplo Agave y cactus, donde la presente invención representa el primer reporte en describir dichos compuestos derivados de hongos y sus efectos de estimulación de crecimiento en plantas.

En la presente invención, identificamos diversos fCOVs liberados por 22 cepas de hongos del microbioma central y no central derivadas del microbioma de Agave y cactus, donde cerca del 70% de estos volátiles fúngicos influyeron positivamente en el crecimiento y desarrollo de plantas en Arabidopsis.

Conforme a la presente invención, encontramos que los efectos sobre las plantas a través de los volátiles descritos aquí dependían de la clase de hongos.

Los miembros de los Dothideomycetes, la mayoría de los Sordariomycetes y Saccharomycetes estaban vinculados a la promoción del crecimiento, mientras que las cepas fúngicas pertenecientes a los Eurotiomycetes y Mucoromycetes afectaron negativamente el crecimiento y desarrollo de las plantas. Mediante el uso de microextracción en fase sólida acoplado a cromatografía de gases y espectrometría de masas (SPME-GC- MS por sus siglas en inglés), identificamos 94 diferentes volátiles que representan 9 clases químicas que se produjeron en monocultivos de hongos y también durante la interacción de hongos con A. thaliana. Estos volátiles se componían principalmente de terpenoides (mono- , sesqui- y di-terpenos conformando casi el 50% de todos los volátiles detectados), alcoholes y compuestos alifáticos. Al probar los compuestos detectados anteriormente en su estado puro en ensayos de dosis-respuesta, descubrimos que las moléculas canfeno (CAMP) y el benzil-benzoato (BB) (anteriormente no identificadas en su función), junto con el alcohol bencílico ampliamente distribuido y ya probado, el alcohol 2-feniletílico y el 3-metil-1 -butanol, eran capaces de influir en el crecimiento y desarrollo de las plantas en A. thaliana. Estas capacidades se conservaron en plantas micro-propagadas de A. salmiana y A. tequilana. Mediante los resultados de la presente invención se observa que existe una diversidad sin explorar y/o explotar de compuestos volátiles producidos por hongos asociados con Agaves y cactus, y su potencial para regular el crecimiento y desarrollo de las plantas, donde la presente invención aprovecha esta circunstancia para poder ocupar dichos compuestos como tal o formando parte de las composiciones de la invención, para estimular el crecimiento de plantas de interés económico y ecológico.

Colectivamente, nuestros resultados muestran que los COVs producidos por hongos asociados a agaves y cactus representan moléculas prometedoras para mejorar la productividad de las plantas en ambientes áridos. Las moléculas identificadas y sus microorganismos productores ayudarán a aumentar nuestra comprensión de los mecanismos que sustentan la comunicación entre las plantas y los hongos, así como la importancia ecológica de los fCOVs en los ecosistemas.

Otro de los objetivos de la presente invención es proporcionar moléculas orgánicas volátiles de origen fúngico (fCOVs) capaces de regular el crecimiento vegetal, induciendo la formación de biomasa tanto del sistema radicular como del follaje. Se trata de moléculas orgánicas conocidas, pero que su función como promotoras del crecimiento vegetal se desconocía hasta antes de la presente invención.

Es un objeto adicional de la presente invención proporcionar tales compuestos orgánicos cuya explotación contribuirá a lograr una agricultura sustentable, empleando mecanismos naturales que usan las plantas y los microorganismos para comunicarse e interactuar.

La presente invención se refiere a la identificación de dos compuestos volátiles, y su uso en composiciones compatibles con la agricultura, con una actividad promotora de crecimiento vegetal, diferente a lo reportado en el estado de la técnica. Son compuestos que, en las concentraciones aquí especificadas, resultan inocuos para el ser humano y/o animales, y se pueden usar con seguridad para el incremento en la productividad de los cultivos.

Estos y otros objetos se alcanzan mediante la actividad de los dos compuestos volátiles y las composiciones que los contienen. Estas moléculas en concentraciones previamente evaluadas, son capaces por ejemplo, de regular el crecimiento vegetal incrementando la biomasa del sistema radicular y foliar.

Los compuestos descritos aquí son producidos por microorganismos fúngicos de la microbiota de especies vegetales de ambientes áridos y semi-áridos, como es el caso de agaves y cactus. Siendo seleccionados para la presente invención aquellos compuestos con actividad biológica de reguladores del crecimiento vegetal, la cual fue validada mediante el uso de las moléculas puras bajo concentraciones previamente evaluadas en diferentes especies vegetales.

La actividad biológica de los compuestos orgánicos volátiles descritos en la presente invención se encuentran en un rango de 1 a 100 pM, produciéndose incrementos de 1.1 a 2.3 veces más en la biomasa total con respecto a las plantas no tratadas con estos compuestos.

A continuación, se enlistan los compuestos descritos en la presente invención:

1. Canfeno (CAMP) y sus sinónimos: 2,2-dimetil-3-met¡lenenorbomano, 3,3-dimetil-2- metilenenorbornano, 3-3-dimetil-2-met¡lenemorcanfeno, 2,2-dimetil-3-metilenebiciclo [2.2.1] heptano, 2,2-dimetil-3-metilidenebiciclo [2.2.1] heptano, entre otros. El canfeno es un sólido cristalino incoloro a blanco con un olor insípido a alcanfor. Es utilizado como agente aromatizante o adyuvante (Centro de Seguridad Alimentaria y Nutrición Aplicada (CFSAN) de la FDA). Sin preocupaciones de seguridad en los niveles actuales de ingesta cuando se usa como agente saborizante (Comité Mixto FAO / OMS de Expertos en Aditivos Alimentarios (JECFA)). El canfeno se absorbe fácilmente después de la inhalación, ingestión o aplicación tópica (Banco de datos de sustancias peligrosas (HSDB)). De acuerdo con los datos de toxicidad del Instituto Nacional para la Seguridad y Salud Ocupacional (NIOSH) se reportó toxicidad aguda en ratas a una dosis letal LD ₅ o = >5000 mg/kg vía oral, y en conejos LD ₅ o = >2500 mg/kg vía dérmica (Food and Cosmetics Toxicology, 1975). Se han determinado concentraciones tóxicas por inhalación en mamíferos (especies no especificadas) a una dosis de 3.6 mg/m ³ /24H/90d de manera continua produciendo alteración del condicionamiento clásico, pulmón, tórax o respiración, así como estimulación respiratoria. Las dosis de 32.2 mg/m ³ /24H/90d de manera continuada producen degeneración del hígado graso, así como hemorragias. Las concentraciones letales en ratas son de LD ₅ o = 17 1 g/m ³ /4H produciendo disnea.

2. Bencil-benzoato (BB) y sus sinónimos: ascabiol, benilato, escobenol, becil fenilformato, feni l-metil benzoato, ácido benzoico fenil metil ester, vanzoato, entre otros. Se caracteriza por un olor ligero y balsámico que recuerda a la almendra. El benzoato de bencilo es útil en el tratamiento de la sama. También se usa para tratar la infestación de piojos de la cabeza y el cuerpo. La loción de benzoato de bencilo, en una concentración aproximada de 28% p/p, se aplica tópicamente (Banco de datos de sustancias peligrosas (HSDB)). Es usado como agente saborizante y como disolvente de transporte (Comité Mixto FAO / OMS de Expertos en Aditivos Alimentarios (JECFA)). No hay datos disponibles sobre la absorción percutánea de benzoato de bencilo. Algunos estudios anteriores han sugerido cierta absorción percutánea, sin embargo, la cantidad no se cuantificó.

De acuerdo con los datos de toxicidad del Instituto Nacional para la Seguridad y Salud Ocupacional (NIOSH) se reportó toxicidad aguda en gatos a una dosis letal de LD ₅ o = 2.2 g/kg y en conejos LD ₅ o = 1 .6 g/kg vía oral (Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 1945; Food and Cosmetics Toxicology, 1973) provocando temblor, debilidad muscular, cambios en la estructura o función de las glándulas salivarías. Así también se reportó toxicidad aguda en conejos a una dosis letal de LD ₅ o = 4 g/kg (Food and Cosmetics Toxicology, 1973). No hay registros de toxicidad por inhalación.

La tabla 1 incluye a los dos compuestos de la invención, los cuales tienen la capacidad de incrementar la biomasa vegetal. En esta tabla se identifica su estructura molecular y se incluye la función biológica ejercida sobre cultivos de vegetales, donde se puede observar que dichas funciones no han sido descritas en el estado de la técnica.

Tabla 1. Estructura molecular y función biológica de los volátiles de origen fúngico que promueven el crecimiento vegetal.

Para efectos de la presente invención, la actividad biológica de las moléculas orgánicas volátiles descritas aquí se encuentran en un rango de concentración de 1 a 100 pM, observándose incrementos desde 1.1 a 2.3 veces más en la cantidad de biomasa total con respecto a las plantas no tratadas con estos compuestos. Es otro de los objetivos de la presente invención proveer de un método para incrementar la productividad de cultivos de vegetales que comprende los siguientes pasos: a) Administrar a un cultivo una composición que comprende las moléculas orgánicas volátiles descritas aquí, mediante aspersiones a punto de goteo, y/o administrar encapsulados los microorganismos fúngicos productores de dichas moléculas para que produzcan las moléculas orgánicas volátiles aquí descritas al ser usadas en campo. b) Cuantificar el incremento en la biomasa del sistema radicular y foliar de la planta tratada, así como otros posibles indicadores de crecimientos, tales como por ejemplo el aumento en el número de raíces laterales, y/o el aumento en el ancho de la raíz principal. c) Repetir las aspersiones necesarias de las composiciones mencionadas o las aplicaciones de los microorganismos fúngicos encapsulados hasta observar el incremento en biomasa esperado, y d) Determinar cuándo se haya logrado el crecimiento máximo, que puede ser de 1.1 a 2.3 veces más en la biomasa total con respecto a las plantas no tratadas.

Es entonces parte de la presente invención proporcionar composiciones formuladas que comprendan los compuestos volátiles descritos aquí para que puedan ser asperjadas en los cultivos, incluso disueltos en el agua de riego por aspersión a las concentraciones idóneas. El uso de dichas composiciones con los microorganismos identificados como productores de los volátiles descritos aquí, también queda comprendido. La determinación de la distancia y de las composiciones (químicas o biológicas) a la cual deberán ser aplicados los compuestos/microorganismos productores puede variar, y podrá ser determinado por personas expertas en el campo de la invención, buscando aprovechar al máximo los beneficios de los productos con la menor merma posible.

La presente invención podrá utilizarse en la mejora de los rendimientos de los cultivos de manera sostenible, y como una alternativa a los tratamientos agroquímicos convencionales, respondiendo a la demanda de alimentos de la creciente población mundial, así como a la progresiva reducción de las superficies cultivables.

De acuerdo con lo anteriormente descrito, la aplicación de las moléculas orgánicas volátiles de la invención, así como las composiciones que las comprenden, en las especies vegetales y/o las composiciones a base de los microorganismos productores anteriormente descritos, se presentan con fines únicamente ilustrativos, pues un técnico en la materia puede realizar la aplicación en otras especies vegetales. Por consecuencia de lo anterior, la presente invención no se limita únicamente a las especies vegetales ¡lustradas.

Para fines de la presente invención, las composiciones descritas aquí pueden obtenerse mediante métodos convencionales conocidos en el arte; preferentemente los compuestos volátiles de interés pueden mezclarse con soluciones compatibles que permitan su administración, conteniendo opcionalmente adyuvantes que permitan potenciar su efecto. Para su administración en las plantas de interés, se prefiere que las composiciones se encuentren en forma de solución acuosa, ya que esto permite su aplicación foliar por aspersión, utilizando la infraestructura conocida en al arte para ello; sin embargo, cualquier presentación que permita la administración eficiente de tales composiciones también está comprendida en el alcance de la invención.

Las composiciones descritas aquí tienen una utilidad particular como estimulantes del crecimiento vegetal para aplicaciones tópicas y/o sistémicas de cultivos, por ejemplo, de importancia comercial, particularmente los agaves y cactáceas. De manera alternativa, las composiciones de la invención pueden ser formuladas como aerosol, partículas, polvo o algún otro acuoso, atomizado o aerosol para administrarse a la planta de interés.

Independientemente del método de aplicación, la cantidad de los compuestos volátiles se aplica en una cantidad eficaz que permita estimular el crecimiento de la planta, lo que variará dependiendo de factores tales como el medio ambiente específico, la ubicación, las plantas, cultivos o el sitio agrícola a ser tratado, las condiciones ambientales y/o la frecuencia de aplicación.

Las composiciones de la invención pueden obtenerse mediante la combinación de los compuestos volátiles de interés con un vehículo agronómicamente aceptable. Las composiciones podrán ser formuladas previamente a su administración en un medio apropiado tal como un vehículo liofil izado, desecado por I iofil ización o en un vehículo acuoso, medio o disolvente adecuado como solución salina u otro búfer.

Las composiciones pueden ser formuladas en forma de polvo o material granular, o en suspensión de aceite (vegetal o mineral), o agua o emulsiones de aceite/agua, o en forma de polvo mojable, o en combinación con cualquier otro material de soporte adecuado de aplicación agrícola. Los vehículos agrícolas adecuados pueden ser sólidos o líquidos y son bien conocidos en el arte. El término "vehículo agrícola adecuado" comprende todos los adyuvantes, ingredientes inertes, dispersantes, surfactantes, tackficantes, aglutinantes etc., que se usan habitualmente en la tecnología de formulación de composiciones agrícolas y que son bien conocidos para los técnicos en el arte. Las formulaciones pueden ser mezcladas con uno o más sólidos o líquidos y adyuvantes y ser preparadas por diversos medios; por ejemplo, mediante mezcla homogénea, mezcla y/o trituración de la composición con adyuvantes adecuados utilizando técnicas de formulación convencionales.

Como podrá apreciar un especialista en el arte, la concentración de los compuestos volátiles a administrar variará ampliamente dependiendo de la naturaleza de la formulación particular, particularmente si es un concentrado o si es para usarse directamente. Dichos compuestos volátiles estarán presentes en al menos de 0.1 a 300 pg/ml, donde las formulaciones secas y/o líquidas tendrán desde aproximadamente 1 a 95% en peso de dichos compuestos volátiles. Estas formulaciones se administrarán en aproximadamente 50 mg (líquido o sólido) hasta 1 Kg o más por hectárea. Las formulaciones se pueden aplicar, por ejemplo, en el follaje de las plantas.

Las formas secas de las composiciones de la invención pueden ser formuladas para disolverse inmediatamente al mojarse o, de manera alternativa, disolverse mediante liberación controlada, liberación sostenida o cualquier otra manera tiempo dependiente. Dichas composiciones pueden ser aplicadas como tales, estimulando el crecimiento de las plantas de interés.

Cuando se utilizan en forma mojable, granulos o polvo, dichas formas pueden obtenerse mediante la mezcla de los compuestos volátiles de interés con diversos materiales inertes, como minerales inorgánicos (filosilicatos, carbonates, sulfates, fosfatos etc.) o materiales botánicos (mazorcas de maíz en polvo, cáscara de arroz, cáscara de nuez y similares). Las formulaciones pueden incluir adyuvantes difusores de unión, agentes estabilizantes, aditivos pesticidas o tensoactivos. Las formulaciones líquidas pueden tener como base agua o no ser acuosas y ser empleadas como espumas, suspensiones, concentrados emulsionadles o similares.

Los ingredientes pueden incluir agentes Teológicos, tensoactivos, emulsionantes, dispersantes o polímeros.

Las composiciones de la invención, también pueden utilizarse en combinación con otros tratamientos, tales como fertilizantes herbicidas, atrayentes basados en alcohol y metanol, crioprotectores, surfactantes, detergentes, jabones insecticidas, aceites latentes, polímeros y/o formulaciones biodegradables como vehículo de liberación prolongada que permita la administración a largo plazo de un área objetivo después de una única aplicación de la formulación, siempre y cuando sean compatibles con dichas composiciones de la invención. Las composiciones de la invención también pueden ser utilizadas opcionalmente en la aplicación consecutiva o simultánea a un sitio del medio ambiente donde se encuentren las plantas de interés a tratar, por separado o en combinación con uno o más insecticidas, pesticidas, químicos, fertilizantes u otros compuestos adicionales.

Las composiciones de la invención son aplicadas por te general en el follaje de la planta o el cultivo a ser estimulado en su crecimiento, por métodos convencionales, de preferencia por aspersión. La fuerza y duración de su aplicación se establecerán con respecto a las condiciones específicas de la planta a ser tratada y a sus condiciones ambientales particulares. La relación proporcional del ingrediente activo (compuestos volátiles de interés) al vehículo dependerá naturalmente de la naturaleza química, solubilidad y estabilidad de la composición, así como de la formulación concreta prevista. Otras técnicas de aplicación, incluyendo pulverización, riego, remojo del suelo, inyección de la planta y el suelo, revestimiento de las semillas, revestimiento de plántulas, pulverización foliar, aireación, nebulización, atomización, fumigación, aplicación de aerosoles etc., también son factibles y pueden ser necesarias bajo ciertas circunstancias como, por ejemplo, daño causado por agentes patógenos en raíces o tallo, o para la aplicación en vegetación o plantas ornamentales delicadas.

Estos procedimientos de aplicación son también muy conocidos para los expertos en el arte. La concentración de las composiciones de la invención que se utiliza para aplicación ambiental, sistémica, tópica o foliar variará ampliamente dependiendo de la naturaleza de la formulación en particular, los medios de aplicación y las condiciones ambientales. Normalmente, las composiciones estarán presentes en la formulación aplicada a una concentración de aprox. 1 % por peso y puede estar e incluir hasta aprox. 99% por peso. Formulaciones secas de las composiciones de la invención puede ser de aprox. 1 % a aprox. 99% o más en peso, mientras que las formulaciones líquidas en general pueden comprender de aprox. 1 % hasta aprox. 99% o más del ingrediente activo por peso. Como tal, es posible preparar una variedad de formulaciones, incluyendo aquellas formulaciones que comprendan de aprox. 5% a aprox. 95% o más en peso de los compuestos volátiles de interés, incluyendo aquellas formulaciones que comprendan de aprox. 10% a aprox. 90% o más en peso de dichos fragmentos. Naturalmente, se considera que las composiciones que comprenden de aprox. 15% a aprox. 85% o más por peso de los compuestos volátiles de interés y las formulaciones que comprenden de aprox. 20% a aprox. 80% o más por peso de los compuestos volátiles de interés también están incluidas dentro del ámbito de la presente invención.

Las composiciones de la invención pueden ser administradas a una planta en particular o área de destino en una o más aplicaciones según sea necesario, con una tasa de aplicación típica por hectárea que va del orden de alrededor de aprox. 50 g/hectárea hasta aprox. 500 g/hectárea de ingrediente activo o, de manera alternativa, pueden utilizarse alrededor de 500 g/hectárea hasta aprox. 1000 g/hectárea. En ciertas circunstancias, incluso puede ser deseable aplicar la composición a un área objetivo a una tasa de aplicación de aprox. 1000 g/hectárea hasta aprox. 5000 g/hectárea o más del ingrediente activo. A pesar de que dichas cantidades son las que típicamente se utilizan para administrar principios activos a cultivos de interés en fase de producción, cantidades diferentes de las composiciones de la invención pueden ser utilizadas para obtener el efecto de estimulación del crecimiento de las plantas de interés.

Las cepas de hongos aisladas de agaves y cactus corresponden, en mayor medida, al microbioma central y al phylum Ascomycota. Identificamos 22 aislados fúngicos mediante secuenciación de la región ITS. Los aislados con más del 97% de identidad de secuencia con un solo tipo de cepa fúngica se nombraron después de ellos, mientras que el resto se identificó a nivel de género (tabla 2).

21 cepas de hongos utilizadas en la presente invención pertenecen al phylum Ascomycota, incluidos los miembros de las clases Sordariomycetes (9 cepas), Dothideomycetes (8), Eurotiomycetes (3) y Saccharomycetes (1). Solo Mucor sp. AsM 4.2.3 pertenece a la clase Mucoromycetes, phylum Mucoromycota. Un árbol filogenético basado en las secuencias ITS de estas cepas de hongos que utilizan el método de máxima verosimilitud se muestra en la Figura 1.

Aunque los hongos analizados en la presente invención se derivaron principalmente de muestras de la filósfera, las comparaciones de sus secuencias ITS con los datos del microbioma de agaves y cactus sugieren que la mayoría de ellos pertenecen al microbioma central (Tabla 2). Tabla 2. Identificación y origen de hongos asociados a Agave salmiana y M. geometrizans. a. Aislado de As - A. salmiana y Mg - M. geometrizans. b. Poblaciones localizadas al norte (San Felipe) y noreste (Magueyal) del estado de Guanajuato, México (Coleman-Derr et al. 2016; Fonseca-García et al. 2016). c. Compartido en As, Ad (A. deserti), At, Or (O. robusta) y Mg en el compartimento especificado de la planta: s - suelo, rzs- suelo cercano a la raíz, rz - rizósfera, er- endósfera de raíz, eh - endósfera de hoja y p - filósfera .

El género Beauveria se encontró principalmente en la endósfera foliar de A. tequilana, O. robusta y M. geometrizans. Se encontraron géneros fúngicos como Coniochaeta, Fusarium, Penicillium y Preussia en otros compartimentos como la rizósfera y las endósferas de raíces y hojas. Asimismo, Alternaría y Cladosporíum fueron abundantes en la endósfera y la filósfera de la hoja (Figura 2).

Los hongos asociados con agaves y cactus emiten compuestos volátiles que afectan el crecimiento y el desarrollo de las plantas. Seleccionamos las 22 cepas de hongos mencionadas en cocultivo con A. thaliana. Después de 14 días de crecimiento, se identificaron tres grupos diferentes según el fenotipo mostrado por Arabidopsis (Figura 3 a y b). El primer grupo, compuesto por 15 cepas (68.2% del total) y representado con el color verde, mostró un efecto de promoción del crecimiento en las plántulas de A. thaliana. Este efecto positivo se reflejó tanto en las raíces como en los brotes, como lo demuestran Beauvería pseudobassiana AsM 3.1.5 y Cladosporium sp. MgSF 3.2.1 (Figura 3b, V y VI, respectivamente). Un segundo grupo, compuesto por cinco cepas (22.7%) y representado con el color rojo, mostró un efecto de inhibición del crecimiento como en el caso de Aspergillus hancockii AsM 4.2.4 y Mucor sp. AsM 4.2.3 (Figura 3b, III y IV, respectivamente). Un tercer grupo compuesto por dos cepas y representado con el color amarillo, no mostró ningún efecto diferencial con respecto a las plantas de control como en el caso de Fusarium lactis AsSF 4.3.1 (Figura 3b, II).

Cabe destacar que todas las cepas de la clase Dothideomycetes se encontraron dentro del grupo promotor del crecimiento (verde), mientras que las tres cepas que pertenecen a los Eurotiomycetes se agruparon dentro del grupo inhibidor del crecimiento (rojo) (Figura 3a). La mayoría de los miembros de Sordariomycetes pertenecían al grupo verde (6 de 9), pero dos miembros de esta clase constituían el grupo amarillo sin efectos visibles en las plantas. El análisis NMDS y PERMANOVA apoyó estos patrones, ya que la clase de hongos era indicativa del efecto en las plantas (p = 0.045) (Figura 4).

4 cepas, Beauvería pseudobassiana AsM 3.1.5, Xylaria sp. AsM 3.1.8, Clavispora lusitaniae MJ12 y Preussia sp. AsM 3.2.1a, tuvieron los mayores efectos promotores del crecimiento en Arabidopsis, aumentando significativamente todos los parámetros evaluados. Beauvería pseudobassiana AsM 3.1.5 y Xylaria sp. AsM 3.1.8 produjeron en promedio plantas con 2.7 y 5.3 veces más brotes y biomasa fresca de raíz que los controles, respectivamente (Figura 3a). Cladosporium sp. MgSF 3.2.1 y Alternaría sp. AsM 4.1.3 aumentaron hasta 44% la longitud de la raíz primaria (LRP), mientras que los mayores incrementos en número de raíces laterales (NRL) (hasta 3 veces) y longitud de raíces laterales (LRL) (hasta 2.4 veces) se lograron mediante la cocultivación con Cladosporium sp. MgSF 3.2.1 , Neophaeosphaeria agaves MgSF 4.1.3 y Beauvería pseudobassiana AsM 3.1.5. Del grupo rojo, Mucor sp. AsM 4.2.3 (Figura 3b, II) y Penicillium paneum MgSF 3.1.2 fueron las cepas que más redujeron los parámetros de raíz y brote evaluados.

Diversidad química de los volátiles producidos por hongos asociados con agaves y cactus. Para determinar la diversidad química de los volátiles emitidos, realizamos un análisis por microextracción en fase sólida acoplado a cromatografía de gases y espectrometría de masas (SPME-GC-MS) en cada una de las interacciones de Arabidopsis con hongos y los comparamos con sus respectivos controles. Estos ensayos mostraron que estas 22 cepas de hongos producían una gran cantidad y diversidad de compuestos. Identificamos 94 moléculas diferentes que se agrupan en nueve clases químicas, tales como terpenos (mono-, sesqui- y diterpenos), alcoholes, compuestos alifáticos, cetonas, ásteres, aldehidos, éteres, compuestos nitrogenados y ácidos orgánicos (Figura 5, tabla 3).

Los terpenos representaron el 42.5% de los VOC de origen fúngico, siendo la clase química más diversa (12 monoterpenos, 25 sesquiterpenos y 3 diterpenos). Los monoterpenos se distribuyeron en 7 cepas que tuvieron un efecto positivo (4) y negativo (3) sobre Arabidopsis. Moléculas como el canfeno (CAMP (2) (como se describe en la Figura 5 y tabla 3), sabineno (4) y p-ocimeno (8) fueron producidas por cepas fúngicas que promovieron el crecimiento de las plantas, como las dos cepas de B. pseudobassiana 3.1.5 y 3.1.9, Preussia sp. MgSF 3.1.1 y Xylaria sp. AsM 3.1.8, respectivamente. En contraste, las cepas que inhibieron el crecimiento de A. thaliana a través de COVs como A. hancockii AsM 4.2.4 y N. hainanensis AsM 3.1.6 emitieron cinco y cuatro monoterpenos diferentes, respectivamente (Figura 5). El grupo más diverso de terpenos fueron los sesquiterpenos con 25 compuestos (62.5% del total de terpenos y 25.5% del total de COVs). Paraconiothyríum brasiliense MgSF 3.3.1 emitió 10 de estos compuestos, seguido de P. paneum MgSF 3.1 .2 y B. pseudobassiana AsM 3.1.9 (con nueve y ocho sesquiterpenos, respectivamente). Uno de los sesquiterpenos más comúnmente identificados fue (+)-valenceno (26), que es producido por el 27.3% de las cepas de hongos, seguido de germacreno A (20), 2-¡sopropenil-4a,8-d¡-metil-1 , 2, 3, 4, 4a, 5, 6, 7-octahidronaftaleno (23), a-selineno (27) y aromadendreno (29), que fueron producidos por el 18.2% de las cepas de hongos pertenecientes a las clases de Dothideomycetes, Eurotiomycetes y Sordariomycetes (Figura 5 y 6). Tabla 3. Volátiles producidos por hongos asociados a agaves y cactus identificados mediante SPME-GC-MS. Tabla 3 (continúa) Tabla 3 (continúa) Tabla 3 (continúa) a Compuestos en negrita fueron utilizados de manera pura para evaluar sus efectos en A. thaliana. b Compuestos reportados en las bases de datos de mVOCs y EssOilDB (Kumari et al. 2014; Lemfack et al. 2018). Producido por I. bacterias, II. hongos o III. plantas. c Compuestos evaluados en las plantas huésped nativas A. tequilana y A. salmiana. d Reportado con el PubChem ID 89664 en la base de datos de mVOCs. e Reportado con el PubChem ID 88302 en la base de datos de mVOCs. ' Reportado con el PubChem ID 10657 en la base de datos de mVOCs. 8 Reportado con el PubChem ID 28481 en la base de datos de mVOCs. h Reportado con el PubChem ID 442359 en la base de datos de mVOCs. Reportado con el PubChem ID 114679 en la base de datos de mVOCs.

¹ Reportado como 5-cadineno. k Identificado como (-)-fi-elemeno (PubChem ID 6918391), sin embargo se sabe que esto es producto de la reorganización térmica del germacreno A (Yamada et al. 2015).

FM Fórmula molecular; PM Peso molecular; ¿EBP? ¿Efectos bioactivos en plantas?; ¿? Desconocido; TR Tiempo de retención (min); M Match.

Solo se identificaron tres diterpenos, tales como biformeno (38) producido por Xylaría sp. AsM 3.1.8, así como tunbergeno (39) y esclareol (40) producidos por Fusarium lactis AsSF 4.3.1.

Los alcoholes fueron el segundo grupo más diverso con 16 compuestos (17% de los COVs totales), siendo el 2-feniletil alcohol (48) seguido de 3-metil-1 -butanol (42), fenol (43) y alcohol bencílico (46), compuestos producidos con mayor frecuencia por hongos seleccionados. Curiosamente, Mucor sp. AsM 4.2.3 y A. hancockii AsM 4.2.4 que inhibieron el crecimiento de A. thaliana a través de COVs, fueron las cepas con la mayor diversidad de alcoholes identificados (seis moléculas diferentes para cada cepa) (Figura 5). Cabe destacar que solo seis de estos alcoholes (41 , 42, 43, 46, 48 y 50, como se describe en la Tabla 3) también se identificaron en las emisiones volátiles de bacterias asociadas con agaves y cactus (Camarena-Pozos et al. 2019).

También identificamos 14 compuestos alifáticos. Sin embargo, esta diversidad depende en gran medida de A. hancockii AsM 4.2.4, ya que 10 de estos compuestos fueron producidos por esta cepa. Las cetonas se identificaron en los perfiles cromatográficos de P. brasiliense MgSF 3.3.1 , donde se encontraron cuatro de los ocho compuestos diferentes de esta clase química. Solo se identificaron seis ásteres, con metil-benzoato (78) y bencil-benzoato (BB; 83) cada uno producido por dos cepas diferentes. Xylaría sp. AsM 3.1.8 y Neophaeosphaería agaves MgSF 4.1.3 emitieron metil-benzoato, mientras que Preussia sp. MgSF 3.1.1 y P. brasiliense MgSF 3.3.1 emitieron BB. Xylaría sp. AsM 3.1.8 también emitió 2-etilhexil-acetato (2EA; 82). Clavispora lusitaniae MJ12 produjo 2-feniletil-acetato (PO, 81), el único áster que se compartió con los COVs bacteriano (Camarena-Pozos et al. 2019), pero que no mejoró significativamente el crecimiento de las plantas. Todas estas cepas eran parte del grupo verde que promueve el crecimiento.

Aspergillus hancockii AsM 4.2.4 produjo tres de los cuatro aldehidos identificados, uno de los tres éteres y dos de los tres compuestos que contienen N. El ácido 3-metil-pentanoico (94) fue el único ácido orgánico identificado, y esta molécula fue producida por Coniochaeta sp. AsSF 3.3.5 y Subramaniula sp. AsSF 4.2.2. No se identificaron compuestos azufrados. Ninguno de los 94 compuestos identificados en la presente invención se compartió entre todas las diferentes clases de hongos (Figura 6a). Cada clase de hongos mostró sus propios volátiles, siendo los Eurotiomicetos los más diversos con 33 de los 94 volátiles totales, seguidos de los Sordariomycetes con 19 de los 94 y los Dothideomycetes con 16 de los 94. Tanto Saccharomycetes como Mucoromycetes tenían solo un volátil propio (2-feniletil- acetato (PO, 81) y 2-pentanona (70), respectivamente). Es importante tener en cuenta que la mayor parte de la riqueza volátil de la clase Eurotiomycetes fue dada por A. hancockii AsM 4.2.4 (Figura 5). Volátiles como (+)-valenceno (26), 3-metil-1 -butanol (42), fenol (43), cenvil alcohol (46) y 2- feniletil alcohol (48) estuvieron presentes en más del 20% de los perfiles cromatográficos fúngicos (Figura 5). Curiosamente, se encontró 2-feniletil alcohol (48) en aproximadamente el 60% de las cepas evaluadas, pero no en miembros de los Eurotiomycetes (Figuras 5 y 6a).

En general, la riqueza de fCOVs se vio afectada por la clase de hongos, siendo los Eurotiomicetos el grupo que produjo en promedio más volátiles (p = 0.041) (Figura 4). Cabe señalar que casi el 67% de los géneros de hongos incluidos en la presente invención y el 45% de los volátiles identificados aquí no se han informado en la base de datos de mVOC (Lemfack et al.2018) (Figuras 5 y 6b, respectivamente). Estos números subrayan que la microbiota asociada con plantas no modelo de ambientes áridos ha sido menos estudiada y que conforme a la presente invención representa una rica fuente de metabolites novedosos.

Búsqueda de volátiles que afectan el crecimiento de las plantas. Para encontrar estos compuestos, probamos tres volátiles producidos por hongos que promovieron el crecimiento de Arabidopsis y que estaban disponibles comercialmente. Estos compuestos fueron el monoterpeno canfeno (CAMP; 2) emitido por las dos cepas de B. pseudobassiana, los ásteres 2-etilhexil-acetato (2EA; 82) emitidos por Xylaria sp. AsM 3.1.8, y el bencil-benzoato (BB; 83) liberado por Preussia sp. MgSF 3.1.1 y P. brasiliense MgSF 3.3.1 (Figura 5, tabla 3). Se comprobó que la naturaleza química de estos compuestos es la misma que la de los volátiles producidos por hongos (Figuras 7-9).

Como los efectos de los volátiles en las plantas dependen de la dosis (Blom et al. 2011), utilizamos un rango de concentraciones para cada volátil de 0.001 a 100 pM en plántulas de Arabidopsis. De los tres compuestos probados, CAMP aumentó la LRP y LRL a una concentración de 10 pM. A 100 pM, se observó un aumento en el contenido de clorofila de hasta 1.5 veces con respecto a las plantas no tratadas. El áster 2EA no afectó significativamente ninguno de los parámetros evaluados, mientras que BB a 1 , 10 y 100 pM aumentó el NRL, pero disminuyó la LRP, lo que resultó en un aumento de la DRL también (Figura 10).

En la tabla 4 se pueden observar los resultados obtenidos en A. thaliana.

Crecimiento y desarrollo de plantas de A. tequilana y A. salmiana expuestas a volátiles seleccionados. Los compuestos volátiles CAMP y BB fueron expuestos en plantas micropropagadas de A. tequilana y A. salmiana a concentraciones de 1 y 10 pM. Observamos que los tratamientos con CAMP aumentaron el crecimiento de A. tequilana y A. salmiana. Sin embargo, una concentración de 10 pM en A. tequilana mostró efectos más evidentes, aumentando en 32 y 45% la longitud de la raíz principal (LR) y la hoja (LH), respectivamente. Este efecto también se reflejó en la tasa de crecimiento relativo (TCR), que aumentó en un 25% (Figura 11). En el caso de A. salmiana, el efecto positivo se reflejó en ambas concentraciones, aumentando el LR en un 54% y el TCR en un 32% con respecto a las plantas de control.

Por su parte, BB tuvo efectos positivos solo en A. salmiana a una concentración de 10 pM. Este compuesto aumentó LH, LR y TCR en 16, 76% y 56%, respectivamente. No hubo diferencias significativas en el grosor de la raíz (GR), para ninguno de los volátiles en ambas especies de agave.

En las tablas 5 y 6 se pueden observar los resultados obtenidos en A. tequilana y A. salmiana.

Los siguientes ejemplos se presentan únicamente para ilustrar el desempeño de la invención y no son limitativos de la misma.

Ejemplo 1. Materiales y métodos.

Aislamiento y caracterización molecular de cepas fúnqicas. Se aislaron cepas fúngicas de las biomasas microbianas recuperadas de Agave salmiana y Myrtillocactus geometrizans muestreados en 2012 como se describe (Coleman-Derr et al. 2016; Fonseca-García et al. 2016). Solo Clavispora lusitaniae MJ12 se aisló de la rizósfera de A. salmiana (Desgarennes, Garrido, Torres-Gomez, Peña-Cabriales & Partida-Martinez 2014). Estas muestras se conservaron en glicerol al 40% a -80°C.

Tabla 4.

Aplicación de compuestos orgánicos volátiles a plantas de Arabidopsis thaliana por un periodo de 14 días (22°C con fotoperiodo 16 h luz/ 8 h oscuridad). Las plantas fueron crecidas en medio 0.2xMS. La aplicación del volátil se realizó, desde el día 1 , dentro de un vial de color ámbar que fue introducido en la caja Petri por cada experimento. La concentración de volátil en cada tratamiento está en función del volumen de la caja Petri (60 ml).

BB: Bencil-benzoato

INCREMENTO CON RESPECTO AL CONTROL (VECES MAYOR)

CAMP: Canfeno

LRP: Longitud de raíz primaria; NRL: Número de raíces laterales; LRL: Longitud de raíces laterales; DRL: Densidad de raíces laterales; BF: Biomasa de follaje; BT: Biomasa total; BR: Biomasa de raíz; CLO: clorofila total; X: promedio; SD desviación estándar. Los valores indicados en negritas sombreados indican un incremento de al menos el 10% respecto del valor del control. Tabla 5

Aplicación de compuestos orgánicos volátiles a plantas de Agave tequilana por un periodo de 60 días (25°C con fotoperiodo 16 h luz/ 8 h oscuridad). Las plantas fueron crecidas en mezcla general (mezcla de peat moss, vermiculita y perlita 3:1 :1). La aplicación del volátil se realizó, desde el día 2, dentro de un vial de color ámbar que fue introducido en el recipiente por cada experimento. La concentración de volátil en cada tratamiento está en función del volumen del recipiente (4000 mi).

BB: bencil-benzoato; CAM: canfeno; PI: Peso inicial; PF: Peso final; PG: Peso generado; TCR: Tasa de crecimiento relativo; LR: Longitud de raíz; LH: Longitud de hoja; GR: Grosor de raíz; X: Promedio; SD: Desviación estándar. Los valores indicados en negritas sombreados indican un incremento de al menos el 10% respecto del valor del control.

Tabla 6

Aplicación de compuestos orgánicos volátiles a plantas de Agave salmiana por un periodo de 60 días (25°C con fotoperiodo 16 h luz/ 8 h oscuridad). Las plantas fueron crecidas en mezcla general (mezcla de peat moss, vermiculita y perlita 3:1 :1). La aplicación del volátil se realizó, desde el día 2, dentro de un vial de color ámbar que fue introducido en el recipiente por cada experimento. La concentración de volátil en cada tratamiento está en función del volumen del recipiente (4000 mi).

BB: bencil-benzoato; CAM: canfeno; PI: Peso inicial; PF: Peso final; PG: Peso generado; TCR: Tasa de crecimiento relativo; LR: Longitud de raíz; LH: Longitud de hoja; GR: Grosor de raíz; X: Promedio; SD: Desviación estándar. Los valores indicados en negritas sombreados indican un incremento de al menos el 10% respecto del valor del control.

Para el aislamiento, cada muestra líquida se diluyó 10 veces, se colocó en un medio de agar APD (Agar de papa y dextrosa, BD211900, Bioxon) y se incubó a 28°C durante una semana. Los hongos filamentosos y las colonias similares a levaduras se subcultivaron en placas PDA hasta que se obtuvieron cultivos axénicos. En total, se aislaron 22 cepas fúngicas que se utilizaron en la presente invención (tabla 2). Para generar biomasa fúngica para la extracción de ADN, se inocularon micelios en 100 mi de CPD (caldo de papa y dextrosa, 254920, DIFCO™). Los hongos se crecieron durante 2- 4 semanas a 30°C con agitación (150 rpm). La biomasa fúngica se recuperó por centrifugación y se liofilizó. El ADN fúngico se obtuvo de micelios pulverizados siguiendo los protocolos descritos por Nicholson y col. (Nicholson et al. 2001) o por Edwards (Edwards 1998). La calidad y cantidad de ADN se estimaron usando nanodrop y un gel de agarosa.

Las regiones espadadoras transcritas internas (ITS por sus siglas en inglés) del ARNr nuclear se amplificaron utilizando los oligonucleótidos ITS1 e ITS4 (White, Bruns, Lee & Taylor 1990). Las reacciones en cadena de la polimerasa (PCR por sus siglas en inglés) se realizaron en reacciones de 20 pL, que contenían 2 pL de un tampón de PCR 10X (Qiagen), 0.8 pL de MgCI ₂ 25 pM, 0.4 pL de dNTP 10 pM (Qiagen), 0.5 pL de DMSO, 0.8 pL de oligonucleótidos a 5 pM, 1 unidad de ADN polimerasa Taq (Qiagen) y 1 pL de 40 ng/pL de ADN. Los amplicones se purificaron usando el kit de purificación GenAII Expin™ y se secuenciaron en las instalaciones de Servicios Genómicos de la Unidad Genómica Avanzada en CINVESTAV usando la tecnología Sanger. Las secuencias se procesaron con Sequence Scanner v1.0 (Applied Biosystems) y se analizaron con BLASTn (Madden 2013) utilizando la base de datos ITS curada de cepas de tipo fúngico y material de referencia (BioProject PRJNA177353). Para cada secuencia, se recuperaron los 20 primeros resultados de BLASTn para realizar una alineación de secuencia usando MUSCLE (Edgar 2004). Se recortaron las alineaciones y se calculó la identidad de la secuencia utilizando las bases variables contra las cepas de referencia. Se construyó una filogenia utilizando el método de probabilidad basado en el parámetro Kimura 2 en el software MEGA7 (Kumar, Stecher & Tamura 2016). Las secuencias ITS fúngicas de esta invención se depositaron en GenBank con los números de acceso MT279251-MT279271.

Cultivo conjunto de A. thaliana y hongos. Las semillas de A. thaliana (L., Heynh.) Columbia (Col-0) se esterilizaron con etanol al 95% (v/v) durante 5 min y blanqueador comercial al 20% (v/v) 4-6% NaCIO [Cloralex ®] durante 7 min. Después de seis lavados en agua destilada estéril, las semillas se estratificaron 2 días a 4°C en la oscuridad. Se prepararon placas de Petri divididas (100 x 15 mm, Phoenix biomedical No. 372) adicionando medio 0.2xMS (mezcla de sales básales Murashige y Skoog, M5524; Sigma) en uno de los compartimentos y medio ADP en el otro compartimento. Luego se colocaron cinco semillas de A. thaliana en el compartimento con medio MS. Las placas se sellaron con parafilm y se incubaron en una cámara de crecimiento Lumistell ^MR ICP-54 con fotoperíodo de 16 h de luz / 8 h de oscuridad a 22 ± 1°C. Las placas se colocaron verticalmente en un ángulo de 65° para permitir el crecimiento de las raíces a lo largo de la superficie del agar y permitir el crecimiento aéreo de los hipocótilos (López-Bucio et al. 2007). Las plántulas de A. thaliana germinaron durante seis días. Después de este tiempo se utilizó el micelio de cada hongo como inoculo en el compartimento ADP de las placas de Petri divididas. Las placas se sellaron con parafilm y se incubaron de manera aleatoria en la cámara de crecimiento durante ocho días más.

Efecto de los volátiles fúnqieos en el crecimiento y desarrollo de las plantas. Los parámetros morfométricos se registraron ocho días después de la inoculación de hongos: la longitud de la raíz primaria y lateral (LRP y LRL, respectivamente) se midieron usando una regla. El número de raíces laterales (NRL) se cuantificó utilizando un estereoscopio VELAB™ (VE- S5). La densidad de la raíz lateral (DRL) se estimó dividiendo el NRL entre LRP. Se fotografiaron plantas representativas. Los pesos totales, follaje y raíces frescas se cuantificaron (BT, BF y BR, respectivamente) en una escala analítica OHAUS® (PA214). El experimento se realizó por triplicado para cada especie de planta y cepa fúngica. También se midió el contenido de clorofila (CLÓ). Los brotes se cortaron y se colocaron en una placa de cultivo de tejidos de 12 pozos (Falcon®). Se incubaron durante la noche en 2 mi de etanol al 96% a 4°C en la oscuridad. Se realizaron lecturas de absorbencia a 665 y 649 nm utilizando el espectrofotómetro de microplacas xMark™ (BIORAD). La concentración total de clorofila (clorofila a y b) se determinó utilizando la ecuación: (6.1*A665 + 20.4*A649) * V / 1000 * W, donde V = volumen (ml) y W = peso fresco (mg) (Wintermans & De Mots 1965). Se realizaron tres réplicas por tratamiento.

Análisis de compuestos orgánicos volátiles por microextracción en fase sólida SPME-CG- MS. Los compuestos volátiles emitidos por bacterias y hongos con/sin interacción con plantas de A. thaliana fueron analizados mediante la técnica de microextracción en fase sólida (SPME, por sus siglas en inglés). Para ello se utilizaron fibras con un recubrimiento de 50/30 pm de Divinilbenceno/Carboxeno/Polidimetilsiloxano (DVB/CAR/PDMS; Supelco 57348-U; Sigma-Aldrich Chemical Co., St. Louis, MO, EUA). Cada fibra fue introducida dentro del espacio aéreo del sistema montado en la caja Petri, a través de un orificio previamente realizado en las paredes laterales de la caja, y expuesta por un tiempo de 20 h. Posteriormente, cada fibra fue transportada dentro de un desecador con silica gel deshidratada, para evitar el contacto con compuestos volátiles del ambiente, hasta su desorción. La desorción se llevó a cabo a 230°C por 30 s en el puerto inyector del cromatógrafo de gases (Agilent 5890 Series II; Agilent, Santa Clara, CA, EUA) equipado con un detector de masas (HP5972) y el software Chemstation (Hewlett-Packard Co., Palo Alto, CA, EUA) para la adquisición y procesamiento de datos. Se utilizó una columna capilar libre de ácidos grasos (HP-FFAP; Agilent, Santa Clara, CA, EUA) de 25 m x 0.32 mm con un espesor de película de 0.50 pm. Se utilizó helio como gas acarreador con un flujo de 1 mL min-1 , y una temperatura en el detector de 260°C. La columna fue mantenida por 2 min a 40°C, para después seguir el programa siguiente:

- Rampa de 5°C min-1 hasta 100°C, manteniendo esa temperatura por 1 min.

- Rampa de 10°C min-1 hasta 200°C, manteniendo esa temperatura por 1 min.

- Rampa de 15°C min-1 hasta 260°C, manteniendo esa temperatura por 10 min.

Las masas de los fragmentos fueron analizadas mediante la ionización de impacto electrónico a 70 eV y una velocidad de escaneo de 1.9 sean s’ ¹ . Los compuestos fueron identificados por la comparación de los espectros de masa con la base de datos del NIST 08 (por sus siglas en inglés, Instituto Nacional de Estándares y Tecnología) y AMDIS (por sus siglas en inglés, Sistema Automatizado de Deconvolución e Identificación de Espectros de Masas). Solo los compuestos con el parámetro “Match” > 700 fueron tomados en cuenta. Este parámetro a diferencia del porcentaje de probabilidad se reduce si hay valores m/z en el espectro de la muestra que no están en el espectro de la biblioteca y viceversa, en tanto que el porcentaje de probabilidad únicamente tiene que ver con la similitud de espectros de la muestra con la biblioteca. Los valores “Match” por arriba de 700 son considerados como aceptables en la identificación de un compuesto. Los perfiles cromatográficos fueron generados y analizados tomando en cuenta las plantas de A. thaliana con/sin interacción con la bacteria, así como la bacteria por sí sola, y los medios de cultivo. Se realizaron tres mediciones por cada tratamiento. Los resultados de los volátiles identificados se pueden observar en la tabla 3.

Ensayos con compuestos puros en plántulas de A. thaliana. Los experimentos se realizaron en una placa de Petri de 9 cm en la que se cultivaron diez semillas de A. thaliana Col-0 en medio 0.2xMS. Para investigar los efectos de los COVs, se seleccionaron seis concentraciones (0.001 , 0.01 , 0.1 , 1 , 10 y 100 pM) de tres compuestos disponibles comercialmente identificados en los ensayos de COV fúngicos (tabla 3, los compuestos se indican en negrita): canfeno (CAMP; Sigma 442505), 2-etilhexil-acetato (2EA; Sigma W514705) y bencil-benzoato (BB; Sigma 68183). Estos compuestos eran de la misma naturaleza química que los producidos por las cepas fúngicas seleccionadas (Figuras 7-9). Se prepararon soluciones madre de volátiles individuales disolviendo compuestos puros en etanol (CAMP) y agua (2EA y BB). Se colocó un vial ámbar de 2 ml (Agilent Technologies 5183-4429) con el volátil dentro de la placa de Petri cortando un trozo de agar en condiciones axénicas. El volumen de la solución madre aplicada al vial se determinó considerando la concentración deseada del volátil en la placa de Petri (volumen total 60 mi). Se usaron etanol y agua para las condiciones de control. Las placas de Petri se sellaron e incubaron a 22 ± 1 °C y se colocaron verticalmente en un ángulo de 65°. El crecimiento y desarrollo de las plantas se midieron después de 14 días. El experimento se repitió tres veces.

Ensayos con compuestos puros en plantas de agave. Seis plantas micropropagadas de tgave salmiana Otto ex Salm subsp. crassispina (Trel.) Gentry 1982 y Agave tequilana F.A.C. Weber 1902 se trasplantaron individualmente a recipientes estériles de poliestireno cerrados (4 L) llenos de 700 g de turba, vermiculita y perlita [3:1 :1], en los que se colocó un vial ámbar de 2 ml (Agilent Technologies 5183-4429) para aplicar los volátiles a la concentración final deseada en el recipiente. Se probaron dos concentraciones (1 y 10 pM) de CAMP y BB. Se usó etanol puro y agua para los tratamientos de control, respectivamente. Después de 30 días, se aplicó una segunda dosis de volátiles a la misma concentración. Las plantas de agave se pesaron al comienzo del experimento usando una balanza OHAUS® (YS202). Una vez que se colocó un volátil en el vial de color ámbar, los envases se sellaron con parafilm y cinta adhesiva para evitar fugas del compuesto y se incubaron en una cámara de crecimiento de plantas con un fotoperíodo de 16 horas de luz / 8 horas de oscuridad a 25 ± 1°C durante 60 días. Al final de este período, las plantas fueron retiradas de los contenedores, lavadas y fotografiadas. La longitud de la raíz (LR, cm), la longitud de la hoja principal (LH, cm) y el grosor de la raíz (GR, mm) de cada planta se midieron usando un calibrador electrónico Starrett® (IP67). La tasa de crecimiento relativa (TCR) se calculó utilizando la siguiente ecuación:

(tasa de crecimiento relativa, g g" ¹ d" ¹ ) = (In(w2) - In(w1))/(t2-t1) donde w2 y w1 representan el peso final y el peso inicial de cada planta de agave, respectivamente, y t2-t1 representan la duración (en días) del tratamiento con el volátil.

Análisis de los datos. Los datos se analizaron con el programa JMP®13.0.0 de SAS (Cary, NC). Se utilizó un análisis multivariado con la prueba post hoc de Tukey para probar las diferencias frente a las plantas de control en todas las variables: LRP, NRL, LRL, DRL, BF, BR, BT, GR, LR, LH, TCR y CLO. Los mapas de calor se generaron usando el software estadístico R (versión 3.3.2 Sincere Pumpkin Patch) (R Core Team 2019). Los triángulos negros en los mapas de calor indican parámetros que difieren significativamente entre los tratamientos (p < 0.05). La influencia de la taxonomía y la riqueza volátil en las diferencias en el fenotipo de la planta y la producción de volátiles de las cepas fúngicas se evaluaron con un escalado multidimensional no métrico (NMDS) y un análisis de varianza multivariado permutacional (PERMANOVA). Tanto PERMANOVA como NMDS se realizaron con el paquete "vegano" (Oksanen etal. 2019), utilizando distancias euclidianas para el fenotipo de la planta y distancias binarías de Bray-Curtis para la producción de volátiles. Las NMDS se trazaron utilizando el paquete "ggplot2" (Wickham 2016). El microbioma fúngico central y la abundancia relativa de los géneros de cepas fúngicas se evaluaron utilizando los datos de microbioma de agave y cactus (Coleman-Derr et al. 2016; Fonseca-García et al. 2016; Citlali et al. 2018) con código interno usando el paquete "phyloseq" y trazando el resultado con "ggplot2".

Ejemplo 2. Los volátiles producidos por hongos asociados con agaves y cactus influyen en el crecimiento y desarrollo de las plantas. Los resultados obtenidos en la presente invención destacan que aproximadamente el 70% de los miembros fúngicos centrales y no centrales del microbioma de agaves y cactus promueven el crecimiento de A. thaliana a través de COVs, afectando tanto el follaje como las raíces de las plantas (Figura 3). Curiosamente, determinamos que las clases fúngicas probadas estaban relacionadas con los efectos observados en las plantas (Figura 4). En la presente invención, todos los miembros de Dothideomycetes (8) y Saccharomycetes (1) influyeron positivamente en el crecimiento de las plantas, mientras que por el contrarío, todos los miembros de Eurotiomycetes (3) y Mucoromycetes (1) redujeron el crecimiento de las plantas. Los miembros de Sordariomycetes (9) fueron los únicos cuyos volátiles promovieron principalmente el crecimiento (6), fueron neutrales (2) o ligeramente perjudiciales para las plantas (1). Estos resultados deben tomarse con precaución, ya que los estudios que evalúan los efectos de los volátiles en plantas que emplean varias especies y cepas de los mismos géneros, como Tríchoderma, han revelado una gama de respuestas, desde la inhibición hasta la promoción del crecimiento (Lee et al. 2016). Sin embargo, los volátiles fúngicos se reconocen como características suplementarias que se pueden usar en la quimio-taxonomía (Pennerman, AL-Maliki, Lee & Bennett 2016). Por lo tanto, algunos volátiles pueden ser específicos o característicos de ciertos taxones fúngicos y pueden desencadenar respuestas positivas en las plantas. La presente invención respalda aún más que las plantas responden a los volátiles producidos por diferentes especies de hongos, teniendo un papel fundamental en el crecimiento y desarrollo de las plantas (Bitas, Kim, Bennett & Kang 201320; Piechulla, Lemfack & Kai 2017).

Ejemplo 3. Existe una alta diversidad química de COVs producidos por hongos asociados con agaves y cactus. El análisis de los COVs liberados por las 22 cepas fúngicas centrales y no centrales del microbioma asociadas con agaves y cactus usando SPME-CG-MS condujo a la identificación de 94 volátiles diferentes agrupados en 9 clases químicas. Esta diversidad química es 4.27 veces mayor que la observada en bacterias del mismo nicho ecológico (Camarena-Pozos etal. 2019). Al comparar los volátiles liberados por bacterias y hongos asociados con agaves y cactus, notamos que solo seis alcoholes y un éster se compartían entre los dos grupos microbianos. Estos son: 2-metil-1 -butanol (41), 3- metil-1 -butanol (MB, 42), fenol (43), alcohol bencílico (BA, 46), 2-feniletil alcohol (PA, 47), 1- octen-3-ol (50) y 2-feniletil acetato (PO, 81). En ambos conjuntos de datos, PA y BA fueron los volátiles producidos con mayor frecuencia, lo que sugiere que estas moléculas podrían tomarse como "firmas" de comunidades microbianas asociadas a plantas CAM. Además, se sabe que PA, BA, MB y algunas de sus mezclas, promueven el crecimiento de las plantas en Arabidopsis y en agaves (Camarena-Pozos et al. 2019). En la presente invención, una gran proporción de los volátiles identificados (45%) aún no se han reportado como volátiles microbianos en la base de datos del mVOC (Lemfack et al. 2018). Esto posiblemente se explica por el hecho de que en la mayoría de los hongos caracterizados aquí no se habían caracterizado su perfil de volátiles. Además, solo a 9 de los 94 volátiles identificados se les ha atribuido una función biológica en las plantas (tabla 3). La mayor parte de la diversidad química encontrada en los agaves y los hongos asociados a los cactus está representada por terpenos (Figura 5 y 6, tabla 3). Los terpenos son moléculas que se han encontrado en todos los seres vivos, y actualmente se conocen aproximadamente 80,000 compuestos (Karunanithi & Zerbe 2019). En las plantas, los terpenos desempeñan papeles cruciales en el crecimiento y el desarrollo, pero también median interacciones químicas especializadas y protección en respuesta a estresores bióticos y abióticos (Tholl 2015). En los hongos, la producción de terpenos también es común y está relacionada con procesos biológicos importantes (Dickschat 2017). Los terpenos fúngicos pueden actuar como mediadores de la comunicación entre hongos y bacterias (Schmidt et al. 2017) o atraer animales para facilitar la diseminación de esporas (Faldt, Jonsell, Nordlander & Borg-Karlson 1999). Sin embargo, solo unos pocos de ellos se han caracterizado por ser capaces de promover el crecimiento de las plantas. Este es el caso del p-cariofileno producido por el hongo Talaromyces wortmannii. Este sesquiterpeno mejoró el crecimiento de Brassica campestris L. var. pervirtáis y resistencia inducida al hongo Colletotríchum higginsianum (Yamagiwa et al. 2011). Interesantemente, en la presente invención el cariofileno (21) fue emitido por Cladosporium sp. AsSF 4.3.3, Paraconiothyrium brasiliense MgSF 3.3.1 y Penicillium paneum MgSF 3.1.2. Cladosporium sp. AsSF 4.3.3 solo produjo cariofileno, mientras que Paraconiothyrium brasiliense MgSF 3.3.1 y Penicillium paneum MgSF 3.1.2 emitieron la mayor diversidad de terpenos, con diez y nueve moléculas respectivamente (Figura 5). El monoterpeno p-ocimeno (8) también se detectó en Xylaria sp. AsM 3.1.8, mientras que el germacreno A (20), nombrado como p-elemeno en varios estudios, estaba presente en los perfiles cromatográficos de las dos cepas de Beauvería pseudobassiana, Penicillium corylophilum MgSF 4.2.3 y Preussia sp. MgSF 3.1.1. Por otro lado, se detectó el sesquiterpeno p-chamigreno (25) en Preussia sp. MgSF 3.1.1 , Penicillium corylophilum MgSF 4.2.3 y Paraconiothyrium brasiliense MgSF 3.3.1. Este volátil se ha reportado que es emitido por el hongo Phoma sp., un endófito y patógeno de Larrea tridentata (arbusto de creosota o comúnmente conocido en México como "Gobernadora") que crece en los desiertos de América del Norte. Los volátiles de Phoma sp. mostraron actividad antifúngica contra Verticillum dahliae, Sclerotinia sclerotiorum, Cercospora beticola, Fusarium sotaní, Phytium ultimum y Ceratocystis ulmi (Strobel et al. 2011). El diterpeno esclaerol (40), que representaba aproximadamente el 80% de la abundancia relativa de los volátiles en Fusarium lactis AsSF 4.3.1 , se considera un diterpeno bioactivo obtenido originalmente de la planta Salvia sclarea, y luego se informó en otras especies de plantas, incluida Nicotiana. glutinosa, Cistus creticus y Cleome spinosa (Caniard et al. 2012; Caissard et al. 2012). Se ha demostrado que el esclaerol tiene actividad antimicrobiana contra patógenos bacterianos y fúngicos, lo que sugiere que está involucrado en respuestas defensivas ante el estrés biótico en plantas (Kouzi, Dowd & McChesney 1996; Campbell et al. 2003; Fujimoto, Mizukubo, Abe & Seo 2015). Recientemente, este diterpeno ha sido identificado en el hongo endofítico Arthhnium sp., aislado de Zingiber cassumunar (Pansanit & Pripdeevech 2018).

En resumen, los hongos asociados con Agaves y cactus representan una fuente rica de compuestos volátiles novedosos y diversos, para los cuales sus funciones biológicas permanecen desconocidas.

Ejemplo 4. Los volátiles fúngicos presentados en esta invención modulan el crecimiento en A. thaliana y agaves. Poco se sabe sobre la actividad biológica de los volátiles fúngicos en el crecimiento de las plantas. Una de las principales limitaciones para su estudio es su falta de disponibilidad. A pesar de esto, evaluamos el monoterpeno canfeno (CAMP, 2) producido por Beauvería pseudobassiana AsM 3.1 .5 y Beauvería pseudobassiana AsM 3.1.9 (Figura 3). CAMP se ha identificado en perfiles de volátiles de F. culmorum y A. fumigatus, entre otros, y se ha sugerido un papel en la disminución de la motilidad de la bacteria Serratia plymuthica PRI-2C (Heddergott, Calvo & Latgé 2014). Recientemente se ha demostrado la actividad insecticida del canfeno contra Helicoverpa armígera o gusano del ejército, una plaga en el algodón, el maíz, la alfalfa y el tabaco (Benelli et al. 2018). Del mismo modo, los herbívoros inducen el canfeno en plantas del género Populus, que tienen un papel de defensa contra los patógenos que causan infecciones secundarias después de la lesión de la raíz (Lackus, Lackner, Gershenzon, Unsicker & Kóllner 2018). Conforme a la presente invención, en nuestros ensayos de dosis-respuesta con A. thaliana, el canfeno aumentó la longitud de las raíces primarias y laterales a una concentración de 10 pM (Figura 10). Este efecto es notable, ya que la mayoría de los volátiles que evaluamos anteriormente, como BA, PA y MB, aumentaron el número de raíces laterales, y solo el isoamil-acetato (IA) aumentó su longitud (Camarena Pozos et al. 2019). Sin embargo, ninguno de estos compuestos tuvo un efecto positivo en la longitud de la raíz primaria (LRP). En la presente invención, este efecto se conservó en las plantas de A. salmiana y A. thaliana mantenidas en condiciones controladas (Figura 11). Nuestros resultados sugieren que se podrían lograr efectos sinérgicos de promoción del crecimiento en las plantas combinando, por ejemplo, CAMP con BA. De hecho, esta combinación ocurre naturalmente en el ramo lanzado por Beauvería pseudobassiana AsM 3.1.5 que promovió el crecimiento de Arabidopsis (Figura 3). Por otro lado, el bencil-benzoato (BB, 83) ha sido descrito en aceites esenciales como el de Cinnamomum zeylanicum (también conocido como canela) (Nath, Pathak & Baruah 1996). Además, BB se produce industrialmente mediante la reacción de benzoato de sodio con alcohol bencílico, o mediante la transesterification de benzoato de metilo y alcohol bencílico. BB se usa para el tratamiento de enfermedades de la piel como la sarna, así como acaricida y pediculicida (Brühne & Wright 2000). BB también se ha identificado en el hongo endofítico Emehcella qaudhlineata, aislado del helécho Pterís pellucida, que muestra actividad antibacteriana (Goutam, Kharwar, Vinod Kumar, Amrita & Shweta 2016). En la presente invención, BB fue producido por Paraconiothyríum brasilense MgSF 3.3.1 y Preussia sp. MgSF 3.1.1. En los ensayos de dosis-respuesta con A. thaliana, BB tuvo un efecto positivo sobre el NRL a una concentración de 1 pM. Sin embargo, también hay una inhibición en LRP, que depende de la concentración. La exposición de las plantas de A. salmiana a BB aumentó la longitud de la raíz (LR) y la tasa de crecimiento relativo (TCR) a una concentración de 10 pM. Cabe señalar que de acuerdo con la red de datos toxicológicos (https://toxnet.nlm.nih.gov/), las concentraciones bioactivas de CAMP y BA utilizadas aquí no son perjudiciales para la salud humana. Por lo tanto, su uso en la agricultura es factible y seguro. Con base a estos resultados, identificamos volátiles fúngicos asociados con cactus y agaves, que además de tener un efecto positivo en A. thaliana también tienen un efecto bioactivo en el crecimiento y desarrollo de A. salmiana y A. tequilana. Estudios centrados en la biosíntesis de volátiles en microorganismos, combinados con la manipulación genética dirigida, podrán ayudar a confirmar la implicación de estas moléculas en el crecimiento de las plantas. Asimismo, la gran diversidad de compuestos orgánicos volátiles identificados en la presente invención abre la posibilidad de explorar la evolución de metabolites secundarios, como terpenos y alcoholes, en bacterias, hongos y plantas. Finalmente, la presente invención en el primer reporte en abordar la diversidad química de volátiles asociados con la microbiota vegetal (fúngica, por ejemplo) de ambientes áridos, por lo que se espera que este conocimiento ayude a entender el papel ecológico de los volátiles microbianos dentro de sus complejas comunidades microbianas, sus plantas anfitrionas y su entorno natural.

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