黄色素生成缺陷鞘脂单胞菌及其在结冷胶生产 中的应用

(一 )技术领域

本发明涉及一株黄色素生成缺陷但能生产正常 品质结冷胶的鞘脂单 胞菌菌株 ZD001 ( Sphingomonas sp. ZD001 )及其在微生物发酵制备结冷 胶中的应用。

(二）技术背景

结冷胶 （Gellan Gum)是少动鞘脂单胞菌 （ Sphingomonas paucimobilis )经好氧发酵产生的微生物胞外多糖， 由美国 Kelco公司于 1978年开发成功。 它是继黄原胶之后又一种无毒、 安全、 理化性质优良 的微生物胞外多糖。 日本早在 1988年就准许在食品中使用， 美国于 1992 年获 FDA批准而用于食品， 我国于 1996年批准其作为食品增稠剂、 稳 定剂使用， 另有十多个国家也已批准用作食品添加剂。 近年来， 结冷胶以 其独特的优良特性，被作为新型乳化剂、 悬浮剂、 增稠剂、 稳定剂、 凝胶 剂、緩释剂、成膜材料等日益广泛地应用于食 品、 医药、化工等工业领域， 应用前景广阔。

结冷胶是由 P-l，3-D-葡萄糖， p-l,4-D-葡萄糖醛酸和 a-l，4-L-鼠李糖按 摩尔比 2： 1： 1组成，其以 p-l,3-D-葡萄糖、 P-l,4-D -葡萄糖醛酸、 p_l，3-D- 葡萄糖、 a-l，4-L -鼠李糖的连接顺序构成四糖单元。 在四糖单元聚合形成 的糖长链骨架上连有酰基， 分子量一般为 5x l0 ⁵ - l x lO ⁶ 道尔顿左右。 结冷 胶主要以两种形式存在，即未经脱酰基的高酰 基结冷胶(也称天然结冷胶） 和经物理化学方法人工脱酰基的低酰基结冷胶 。高酰基天然结冷胶中有两 种酰基， 即乙酰基和甘油酰基， 通常乙酰基连接在第一个葡萄糖残基的 C6位上， 而甘油酰基连接在同一个葡萄糖残基的 C2位上， 一般每个四糖 单元中平均含有 1个甘油酰基， 0.5个乙酰基。 低酰基结冷胶则是由高酰基 结冷胶通过脱酰基处理后而基本上不含酰基的 产物， 因此，结冷胶分子因 是否脱酰基和脱酰基程度不同，分子量差异较 大， 目前在食品工业上应用 较多的是分子量相对较低的低酰基结冷胶。

当前生产所用的结冷胶产生菌少动鞘脂单胞菌 在发酵过程中同时会 产生代谢副产物黄色素 （主要是类胡萝卜色素）， 这不仅与结冷胶竟争碳 源， 还使发酵液变黄。在结冷胶制备过程中， 尤其是在高酰基结冷胶的制 备过程中，为了去除胶体中的黄色素，增加了 结冷胶提取脱色中乙醇或异 丙醇的用量（一般用 3倍发酵液体积的乙醇或异丙醇）与操作时间� �使提 取纯化的效率降低、 成本提高。

(三）发明内容 本发明的目的是提供一株黄色素生成缺陷但能 生产正常品质结冷胶 的鞘脂单胞菌菌株 ZD001 ( Sphingomonas sp. ZD001 )。 该 ZDOOl菌株已 保藏于中国典型培养物保藏中心， 保藏中心地址： 中国 武汉 武汉大学， 邮政编码： 430072;保藏日期： 2009年 9月 10日；保藏编号： CCTCC No:

M209198。 故该菌株以下称 ZD001 ( CCTCC NO: M 209198 ) 菌株。

本发明采用的技术方案：

ZD001 ( CCTCC NG:M 209198 )菌株是本申请发明人分离选育所得。 对其 16S rDNA 进行测序与分子比对， 其与少动鞘脂单胞菌 ( Sphingomonas paucimobilis ) 16S rDNA核苷酸亭列同源性为 99%以上， 认定 ZD001 ( CCTCC NO: M 209198 )菌株为已见报道的结冷胶产生菌少 动鞘脂单胞菌的同种变异株。 所述 ZDOOl ( CCTCC NO: M 209198 ) 菌株的 16S rDNA序列如下： AGAGTTTGATCCTGGCTCAGAACGAACGCTGGCGGCATGCCTAACACATGC AAGTCGAACGAGATCCTTCGGGGTCTAGTGGCGCACGGGTGCGTAACGCGTGG

ATGTCGAAAGACCAAAGATTTATCGCCCTGAGATGAGCCCGCGTAGGATTAGCT AGTTGGTGTGGTAAAGGCGCACCAAGGCGACGATCCTTAGCTGGTCTGAGAGG

AGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCAATGCCGCGTGAGT

CGGGAGAATAAGCCCCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGG GGGCTAGCGT GTTCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGTAGGCGGCTTTGTA

GATATTCGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCACTGGACTGGTATTGACGC

TGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACG

CCGTAAACGATGATAACTAGCTGTCCGGGTGCTTGGCACTTGGGTGGCGCAGCT

AATTGACGGGGGCCTGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAAC

CTTCCCTTCGGGGACCTACACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTC

TCATTAAGTTGGGTACTTTAAAGTAACCGCCGGTGATAAGCCGGAGGAAGGTGG

GGATGACGTCAAGTCCTCATGGCCCTTACGCGCTGGGCTACACACGTGCTACAA

TGGCAAGTACAGTGGGCAGCAATCCCGCGAGGGTGAGCTAATCTCCAAAACTT

GTCTCAGTTCGGATTGTTCTCTGCAACTCGAGAGCATGAAGGCGGAATCGCTAG

TAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCAGGCCTTGTACACACCG

CCCGTCACACCATGGGAGTTGGGTTCACCCGAAGGCGTTGCGCTAACTCGTAAG

AGAGGCAGGCGACCACGGTGGGCTTAGCGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGT

AGCCGTAGGGGAACCTGCGGCTGGATCACCTCCTTo 所述 ZD001 ( CCTCC NO:M 209198 ) 菌株特征如下： 为革兰氏阴性 杆菌;无芽孢；直杆状；在营养琼脂平板上菌� �呈乳白色；氧化酶试验阳性； 接触酶试验阳性； 专性需氧； 分解葡萄糖、 果糖、 木糖、 蔗糖； 淀粉水解 试验阳性；不能液化明胶；43°C不生长；菌体� ��小为 1.5~5,0μπιχ0.8-1.0μπι; 不产黄色素。

本发明还涉及所述的 ZD001 (CCTCC NO: M 209198 ) 菌株在微生物 发酵制备结冷胶中的应用。

具体的， 所述应用为： 将所述 ZD001 (CCTCC NO.M 209198 ) 菌株 按常规方法经活化、种子培养后，接种至常规 适用于鞘脂单胞菌的发酵培 养基， 28~32°C、 pH6.8〜7.2摇床培养 32~60h， 获得含有高酰基结冷胶的 发酵液。该发酵液可直接分离纯化得到高酰基 结冷胶，也可进行脱酰基处 理制取低酰基结冷胶。

制备产物为高酰基结冷胶时，方法如下：将所 述含有高酰基结冷胶的 发酵液调 pH值为 5.0~6.0，升温至 50°C~70°C (优选 60 °C )保温 30min~2h (优选 lh )后， 降温至 40。C~50。C , 调 pH为 7.0， 加入溶菌酶和碱性蛋 白酶保温 lh~3h (优选 2h )去除蛋白质； 去除蛋白质后的发酵^ σ入絮 凝剂溶液进行絮凝沉淀 (絮凝剂溶液加入量约为去除蛋白质后发酵液� �积 的 5% ), 再经分离 （加入体积为发酵液体积 30%左右的体积浓度 90%以 上的异丙醇或乙醇， 优选 95%异丙醇， 搅拌， 板框压滤）、 干燥（90°C )， 制得所述高酰基结冷胶， 所述絮凝剂 （浓度通常为 20%, w/v )为下列之 一或其中两种以上的混合： CaCl ₂ 、 MgCl ₂ 、 NaCl、 KC1。

制备产物为低酰基结冷胶时，方法如下：往所 述含有高酰基结冷胶的 发酵液中加入碱金属或碱土金属氯化物溶液（ 浓度通常为 20%, w/v ), 调 pH为 11.0, 固液分离 （板框固液分离）得到纤维料 1， 将纤维料 1与 水按 1： 4〜6体积比混合，调 pH2.5~4.0 (优选 pH3.0 ), 洗涤 15min~lh (优 选 30min )， 压滤得到纤维料 2， 将纤维料 2与水按 1: 9~12体积比混合 均匀 ,升温至 80°C~90°C(优选 83 °C~87°C ),加入碱性试剂调 pH为 9.5~10.5

(优选 pH9.8~10.2 )反应 8min~15min (优选 10min~12min ), 反应结束后 调反应液 pH为中性， 加入助滤剂（添加量为 1~3%, w/v, 优选 2% )， 过 滤，取滤液加入絮凝剂（优选 10%质量浓度，添加体积为滤液体积的 5% ) 进行絮凝沉淀， 再经分离、 干燥， 制得所述低酰基结冷胶； 所述碱金属或 碱土金属氯化物为下列之一或其中两种以上的 混合： CaCl ₂ 、MgCl ₂ 、NaCl、 KC1 (优选 CaCl ₂ ), 所述碱性试剂为下列之一或其中两种以上的混 合： NaOH、 KOH、 Na ₃ P0 ₄ , 所述助滤剂为硅藻土、 珍珠岩或其混合物， 所述 絮凝剂为下列之一或其中两种以上的混合： CaCl ₂ 、 MgCl ₂ 、 NaC KC1

(优选 KC1)。

本发明的有益效果主要体现在：提供了一株黄 色素生成缺陷的鞘脂单 胞菌 ZD001 ( CCTCC NO-.M 209198 ) 菌株， 其发酵液不含黄色素而呈乳 白色，提取时可减少乙醇或异丙醇用量，简化 工序，提高得率，降低成本, 利于工业化生产获得优质的结冷胶。

(四）具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述 ,但本发明的保护范围 并不仅限于此：

实施例 1 : ZD001 ( CCTCC NO: M 209198 ) 菌株的分离及鉴定

1、 无菌采集土壤样品， 稀释涂布于 YM琼脂培养基平板上； 2、 该平板置于 30°C培养 5天；

3、 挑取不同形态的细菌菌落， 于相同培养基平板分别划线纯化分离， 置 于 30°C培养 5天。

YM琼脂培养基终浓度组成为： 0.30%酵母抽提物， 0.30%麦芽抽提物，

0.50、蛋白胨， 1.00%葡萄糖， 琼脂 1.50% ， 溶剂为蒸馏水。

注： 本发明中培养基浓度均指质量体积百分比浓度 ， 某组分浓度 1%表示 lOOmL培养基中含有 lg该物质。

经筛选获得一株黄色素生成缺陷的 ZD001 ( CCTCC NO:M 209198 ) 菌株。 该菌为革兰氏阴性杆菌;无芽孢；直杆状； 在营养琼脂平板上菌落呈 乳白色； 氧化酶试验阳性； 接触酶试验阳性； 专性需氧； 分解葡萄糖、 果 糖、 木糖、 蔗糖； 淀粉水解试验阳性;不能液化明胶； 43°C不生长； 菌体 大小为 1.5-5.0μπι χ 0.8-1. Ομιη; 不产黄色素。 实施例 2: ZD001 ( CCTCC NO: M 209198 )的发酵工艺

1、 纯菌种接种于 YPG培养基斜面上， 30°C培养 72h;

2、 一级种子培养： 将斜面种子接入 50mL—级种子培养基（盛于 250mL 三角瓶）， 于 30°C， 200rpm振荡培养 24h, 即为一级种子液；

3、 二级种子培养： 将一级种子液以 5%体积比的接种量接入 lOOmL二级 种子培养基（盛于 500mL三角瓶）， 于 30°C， 200rpm振荡培养 12h， 即 为二级种子液；

4、 罐上发酵： 将二级种子液以 5%体积比的接种量接入发酵培养基中， 30°C、 pH 6.8 -7.2条件下， 通风 1. 0 m， 转速 300rpm， 培养 48小时；

5、 收集发酵产物： 收集步骤 4培养 48小时的含结冷胶发酵液。

YPG斜面培养基组成与终浓度为： 葡萄糖 2.00%, 蛋白胨 0.50%， 酵母抽提物 0.30%, 琼脂 1.50% , 溶剂为蒸镏水， pH7.2;

一级种子培养基终浓度组成为： 酵母膏 0.20%; 牛肉膏 0.30%; 蛋白 胨 0.50%; 氯化钾 0.10%， 溶剂为蒸馏水， pH7.2;

二级种子培养基： 葡萄糖 1.50%; 酵母膏 .0.50%; 蛋白胨 0.50%; 磷 酸二氢钾 0.06%;磷酸氢二钾 0.06%;硫酸镁 0.06%,溶剂为蒸馏水， pH7.2; 发酵培养基： 葡萄糖 3.00%; 酵母膏 0.05%; 蛋白胨 0.30%; 磷酸二 氢钾 0.06%; 磷酸氢二钾 0.10%; 硫酸镁 0.06%; 溶剂为蒸馏水， pH7.2。 实施例 3: 高酰基结冷胶的制备工艺

1、发酵液预处理：发酵液 100L,用 10%( v/v )的 HC1调 pH6.0,升温至 60°C , 保温 lh;

2、蛋白杂质去除： 降温至 40°C时， 用 10% ( w/v ) NaOH调 pH7.0， 加入 50g 的溶菌酶（20万 U/g, 庞博生物）及 100g的碱性蛋白酶（2万 U/g， 庞博生 物）， 保温 2h;

3、 絮凝沉淀， 分离： 经过预处理及蛋白去杂处理后的发酵液中加入 5L浓 度为 20% ( w/v ) 的 CaCl ₂ 溶液， 搅拌 30min后， 加入 30L异丙醇， 继续搅 拌 lh后， 板框压滤；

4、 干燥、 粉碎： 压滤所得纤维料 90°C干燥 2h后粉碎， 制得高酰基结冷 胶成品， 为乳白色粉末， 含氮量为 0.05~0.30%。 实施例 4: 脱酰结冷胶的制备工艺

1、发酵液预处理： 取成熟发酵液 100L,加入 3L浓度为 20% ( w/v )的 CaCl ₂ 溶液， 搅拌 lOmin^用 10% NaOH调 pH至 11.0, 搅拌 3min^板框压滤， 得 纤维料； 2、洗涤：将步骤 1预处理后的纤维料与水按 1: 5的体积比混合，用 10%HC1 调 pH3.0， 搅拌 30min^板框压滤， 得纤维料。

3、 脱酰基处理： 将步骤 2洗'涤后的纤维料与水按 1: 10的体积比混合， 搅 拌均匀， 升温至 90Ό左右， 使纤维料完全溶解， 维持温度 85°C， 加入 10% NaOH水溶液， 调 pH值 9.5〜10.5, 反应 10min^， 用 10%HC1调 pH6.0;

4、加入盾量为料液体积 2%的硅藻土， 维持温度 80°C以上板框过滤后加入 料液（滤过液）体积 5%的 KC1溶液（质量浓度为 10% ), 板框压榨；

5、 干燥、 粉碎： 压榨所得结冷胶纤维料 90°C干燥 2h^粉碎， 制得低酰基 结冷胶成品。 所得的低酰基结冷胶为乳白色粉末， 强度 > 800 g/cm ² ， 透 光率 > 80%。