UVA-UVB CAMPO TÉCNICO

La presente invención se refiere al campo de Ia protección de Ia piel humana frente a los efectos nocivos de las radiaciones UVA (I y II), UVB y visible de Ia luz solar. ANTECEDENTES DE LA TÉCNICA

El sol es nuestra principal fuente de energía que se manifiesta principalmente en forma de luz y calor, emitiendo una radiación electromagnética que viaja a través del espacio en forma de ondas y partículas. Las ondas se describen por su frecuencia (v) o su longitud de onda (λ). La siguiente tabla muestra el espectro electromagnético de Ia radiación solar:

Tabla 1. Espectro electromagnético de Ia radiación solar

No todas las radiaciones solares llegan a Ia tierra, ya que parte de estas radiaciones son reflejadas, absorbidas o dispersadas, debido a que Ia Tierra está protegida por capas de gases atmosféricos que filtran y atenúan Ia radiación solar. Únicamente las radiaciones comprendidas entre los 290 y 1.800 nm (UVB ₁ Ia UVA (I y II), visible e infrarrojo cercano) alcanzan Ia superficie de Ia tierra. De este rango de radiaciones que llegan a Ia tierra, Ia radiación UVB y Ia UVA (I y II) es Ia que menos llega a Ia tierra al ser filtrada por Ia capa de ozono, pero es Ia mas influyente sobre Ia biosfera, incluyendo los seres humanos. Por otra parte, los efectos dañinos de Ia radiación solar adquieren cada vez más atención, en particular por el fenómeno de disminución de Ia capa de ozono que hace que cada vez sea menor Ia radiación solar filtrada por Ia atmósfera (véase Ozone Depletion and Human Health Effects de M. J. Molina y Luisa T. Molina, Environmental Medicine; L. Mδller Ed. Sept 24 (2002) ENVIMED)

La sobreexposición a Ia radiación UVB produce efectos perjudiciales en Ia piel a corto plazo, produciendo los eritemas, que es el conocido proceso inflamatorio con enrojecimiento de Ia piel, sin embargo Ia radiación UVA produce efectos perjudiciales a largo plazo.. En Ia figura 1 se puede observar un gráfico hecho público que representa el espectro de luz solar que incide en Ia tierra según su longitud de onda, el espectro de acción del eritema y su relación entre ambas. Este gráfico demuestra Io mencionado anteriormente, es decir, que el eritema se produce principalmente por Ia incidencia de Ia radiación UVB en Ia piel, sin embargo Ia radiación UVA I y Il (320- 400nm) no produce dicha reacción cutánea pero si otros efectos a largo plazo mucho mas perjudiciales, como es el fotoenvejecimiento y Ia fotocancerogénesis (véase Photocarcinogenesis: UVA vs. UVB Radiation, de Fr. R. de Grujil, Skin Pharmacol. Appl. Physiol. 2002; 15:316-320).

En Ia siguiente tabla se puede observar las principales diferencias entre los efectos perjudiciales de Ia radiación UVB y Ia radiación UVA en Ia piel:

Tabla 2.- Comparativa de los efectos de Ia radiación UVB y UVA La piel tiene cromóforos capaces de absorber Ia radiación UVA, principalmente melanina y ácido urocánico, además de las bases de los ácidos nucleicos y residuos aromáticos de proteínas.

La radiación UVA al penetrar mas en Ia piel afecta mas a largo plazo en Ia degeneración cutánea debido a su acción fotodinámica. La acción fotodinámica que genera Ia radiación UVA es consecuencia de Ia reacción de Ia energía (hv) UVA (I y II) con los fotosensibilizadores de Ia piel o del ambiente, en presencia del oxígeno del aire, que producen especies de oxígeno activo (ROS), que son los conocidos radicales libres y el oxígeno singlete (véase "Sunscreen enhancement of UV-induced reactive oxygen species in the skin",Ferry M.Hanson et al., Fee Radical Biology & Medicine 41 (2006) 1205-1212). Los radicales libres son, por definición, especies químicas reactivas que contienen electrones no apareados en sus respectivos orbitales, y pueden ser neutros, o estar cargados negativa o positivamente. Son altamente inestables por Io que tienden a reaccionar alterando los componentes celulares y por ello se los relaciona con el fotoenvejecimiento, melanoma y cáncer de piel, entre otras enfermedades (véase "Free Radicáis in Cutaneous Biology", J. Invest. Dermatol. 102:671-675, 1994 y "Cutaneous photodamage, oxidative stress and topical antioxidant protection", J. Am. Acad. Dermatol. 2003; 48:1-19, Tedesco AC et al, 1997).

Existen infinidad de estudios sobre filtros químicos y físicos encaminados a evitar estos mencionados efectos perjudiciales en Ia piel como se expone, por ejemplo, en "Photoprotection" de P. Kullavanijaya y H. W. Lim, J. Am. Acad. Dermatol. 2005;

52:937-58 y "Ultraviolet radiaton screening compunds", Biol. Rev. (1999), 74, pag. 311-

345, cuyo objetivo es Ia fotoprotecdón tópica mediante sustancias que absorban y filtren Ia radiación UVB y UVA (filtros químicos), que ¡nactiven o destruyan las especies reactivas de oxígeno (radicales libres y oxígeno singlete) que se generan en Ia piel mediante antioxidantes, y que produzcan Ia reflexión por dispersión de Ia radiación mediante filtros físicos como TiO ₂ o ZnO. De hecho se ha divulgado que extractos vegetales con capacidad antioxidante son capaces de contrarrestar los efectos oxidativos inducidos por TiO ₂ en distintos sistemas biológicos (ver "Plypodium leucotomos extract inhibits trans-urocanic acid photoisomerization and photodecomposition", Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology 82

(2006) 173-179

Por otra parte el efecto de Ia radiación ultravioleta UVB y UVA también tiene su repercusión en las plantas (ver Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology, Volume 76, Issues 1-3, 25 October 2004, Pages 61-68) y las plantas tienen su propios mecanismos de defensa, ya que no solo el hombre genera sustancias fotoprotectoras de manera natural, como es Ia melanina, sino también las plantas generan sus propias defensas, como es el caso de Ia Dβschampsia antartica que es una planta que crece sometida a muy bajas temperaturas y episodios de mucha radiación solar Io que hace que hayan desarrollado un eficaz mecanismo de defensa ante estas condiciones tan severas consiguiendo disipar las especies reactivas de oxígeno (ROS) mediante el desarrollo de una gran capacidad antioxidante, junto con una alta capacidad de procesar de forma no radiativa el exceso de radiación UV en forma de calor en pequeñas cantidades. Esta planta es peculiar por crecer en el continente antartico y tolerar sin problemas las condiciones ambientales extremas de su habitat. Logra mantenerse verde todo el año, incluso en el invierno antartico bajo el hielo y Ia nieve, siendo de las pocas plantas capaces de soportar estas condiciones climáticas extremas. (Véase "The role oí photochemical quenching and antioxidants in photoprotection of Deschampsia antárctica", en Functional Plant Biology, 2004, 31 , 731-741).

Hoy en día existe una gran necesidad por obtener productos que protejan Ia piel, de manera duradera, de los efectos adversos producidos por Ia radiación UVA y UVB, y aunque se sabe que un antioxidante contrarresta los efectos de Ia acción fotodinámica producidos por las especies reactivas de oxígeno (ROS), es necesario detectar que antioxidantes son los adecuados y comprobar su efectos, ya que no todos son beneficiosos puesto que pueden producir una propagación en cadena ("chain propagation") y tener consecuencias peores, así como hay que tener en cuenta diversos factores biológicos como es el tropismo de Ia piel. DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se basa en el uso de las propiedades antioxidantes y de disipación del exceso de radiación UV de un extracto acuoso de una planta perteneciente a la familia de las gramíneas, Ia Deschampsia antárctica (DA), para Ia obtención de un agente fotoprotector que posea dichas características. Se ha observado que un extracto acuoso con estas características, al que a partir de ahora denominaremos como EADA (Extracto Acuoso de Deschampsia antárctica), tiene propiedades fotoprotectoras frente a Ia radiación UVB y UVA (I y II), dado que i) por un lado los antioxidantes que contiene contrarrestan los efectos negativos producidos por Ia formación de radicales libres que se forman principalmente por Ia radiación UVA Il cuando incide sobre Ia piel en presencia de fotosensibilizadores y oxígeno, debido a su acción fotodinámica, ii) y, por otro lado es importante destacar que tanto Ia melanina, el cromóforo cutáneo mas importante, como DA, son capaces de eliminar el exceso de energía radiante aunque por distinto mecanismo. En el caso de melanina, el exceso de energía radiante se elimina en forma de pequeños pulsos de calor ("ultraphase internal conversión") y en el caso de DA se trata de "photo Chemical quenching" que, en todo caso es capaz de bloquear la fotoinhibición biológica.

En este sector técnico del aprovechamiento de las propiedades antioxidantes de determinadas plantas y su posible aplicación para Ia fotoprotección, teniendo en cuenta que no todos los antioxidantes son fotoprotectores, Ia presente invención se refiere a Ia capacidad antioxidante de esta planta y sus propiedades de disipación del exceso de Ia radiación UV, para Ia obtención de un extracto acuoso para su uso como fotoprotector cutáneo.

En Ia obtención del EADA de Ia invención puede emplearse Ia planta obtenida de su entorno nativo o bien Ia planta obtenida en un entorno artificial mediante un método de propagación de Ia misma. Dado que Ia planta crece de forma natural en el continente antartico, que es un territorio sometido a estrictas regulaciones de protección que hacen imposible su explotación y, por tanto, Ia recolección con fines comerciales de Ia Deschampsia antárctica, el uso de Ia misma hace necesaria su obtención por medios artificiales fuera de su entorno de crecimiento natural.

La obtención del extracto de Deschampsia antárctica (EADA) se realiza según un procedimiento previamente establecido por los autores, que recurre a un método acuoso, evitando el uso de disolventes orgánicos que plantean problemas de contaminación y residuos difíciles de eliminar en el extracto. El EADA así obtenido puede ser usado para Ia obtención de un agente de fotoprotección cutánea frente a radiaciones UVA (I y II) y UVB. Dicho agente activo como fotoprotector podrá ser combinado con excipientes y aditivos convencionales para Ia obtención de una formulación en forma de crema, gel, o líquido como lociones, aceites, suspensiones o pomadas de aplicación tópica sobre Ia piel. El EADA obtenido fue sometido a pruebas para establecer sus características físico-químicas y farmacológicas.

A continuación se resumen seguidamente estos ensayos. Cromatografía de placa fina (TLC)

Se llevó a cabo Ia técnica utilizada para Ia separación de compuestos que forman parte de una mezcla mediante TLC (Anexo 1). Los EADA obtenidos son sembrados de forma puntiforme sobre una placa de gel de sílice 60 F ₂₅₄ (MERCK) y como disolvente se empleó:

• n-hexano:acetato de etilo (50:50)

• acetato de etilo:metanol (80:20) • acetato de etilo:ácido fórmico:ácido acético glacial:agua destilada

(67:6,4:6,4:18,2)

Los EADA se sometieron a un análisis en espectro UV-Vis a 200-400 nm para Ia determinación de los picos de absorbancia de los compuestos presentes en los EADA con características absorbentes de UV. Para ello se utilizó el espectrofotómetro SHIMADZU UV-160 y las muestras fueron diluidas en eíanol hasta obtener una lectura visible en el espectro.

Cuantificación de Ia actividad antioxidante de los EADA

Se realizó Ia prueba colorimétrica de Folin para medir Ia cantidad de polifenoles totales en los EADA. Esta reacción es característica de los compuestos que tienen un grupo hidroxilo unido a un anillo de benceno. El reactivo del Folin-Ciocalteau cambia del color amarillo a azul cuando los fenoles están presentes. La intensidad del azul es medida a través de un espectrofotómetro a una longitud de onda de 765 nm (véase anexo 3). A través del método colorimétrico ABTS se evaluó Ia capacidad antioxidante del EADA; este se basa en Ia generación progresiva de un catión radical estable ABTS ⁺ , cuya aparición se detecta por Ia disminución en Ia absorbancia de! sistema a una longitud de onda de 734 nm, longitud de onda a Ia que dicho catión presenta uno de sus máximos de absorbancia y degradación o quelación de dicho catión por interacción con una sustancia antioxidante. Se determinó el índice quercetina de los EADA analizados para obtener un indicador del índice de compuestos fenólicos; ya que este es un flavonoide que posee un doble enlace entre los carbonos 2 y 3, un grupo OH libre en Ia posición 3 y un grupo carbonilo en Ia posición 4, Io cual potencia el poder antioxidante del compuesto. Se procedió realizar una curva de calibración con quercetina desde una concentración de 0,2 mg/ml hasta 0,8 mg/ml; para luego medir Ia absorbancia de los distintos EADAs en un espectro a una longitud de onda de 350 nm y a una concentración de 0,5 mg/ml. Patrón HPLC del EADA acuoso

Para Ia obtención de un patrón de los compuestos que pueden estar presentes en los EADAs obtenidos se realizó un análisis por HPLC con detector UV. E! HPLC utilizado fue un equipo Shimadzu con arreglo de diodos con detector SPD-M10AVP y una columna RP-18,5 μm de 25 cm, como disolvente de corrida se utilizo la mezcla metanol:agua y las muestras fueron corridas en un programa con gradiente con un flujo de 0,7 - 0,8 ml/min

Una vez obtenido el EADA, se realizaron diferentes ensayos en cobayas para comprobar sus efectos fotoprotectores frente a Ia radiación UVB y UVA (I y II) en Ia piel de dichos roedores:

Estudio de Ia viabilidad celular (ciclo celular) del extracto acuoso de Deschampsia antárctica (EADA)

Se realizó un estudio de Ia viabilidad celular (ciclo celular) de un extracto acuoso de Deschampsia antárctica (EADA) a dosis de 10mg/ml, en presencia y ausencia de luz ultravioleta en células HaCaT. La línea de queratinocitos humanos HaCaT se cultiva en medio DMEM con 10% de suero bovino fetal.

Tabla 3.- Extractos utilizados en los ensayos

Para este primer ensayo, se usó un grupo de control (sin adición de EADA) y un grupo (EADA M2) que se irradió a las 4 horas de iniciado el experimento con luz ultravioleta solar simulada a dosis de 9,75 J/cm2 UVA + 0,75 J/cm2 UVB.

La incubación se prolongó durante 24 horas sin aditivos. Posteriormente se despegaron las células con tripsina, se fijaron con etanol 60% y las incubamos en un buffer con ioduro de propidio, Tritón X-100 y RNAsa. El ioduro de propidio se fija al DNA y emite fluorescencia que se mide en un citómetro de flujo. Así se determinó el número de células totales y el porcentaje de las mismas que se encuentran en fase de reposo (G0/G1) en síntesis (S) o en mitosis (M/G2), así como las células en apoptosis (Sub-GO). Este abordaje permite conocer si los EADA son tóxicos o mitógenos y su capacidad para revertir el daño por radiación ultravioleta solar.

Para poder comparar el experimento y obtener valores fácilmente comprensibles, se calculó Ia variación en el número de células con respecto al control sin aditivo. En cada experimento se evaluaron 3000 a 5000 células y se normalizó a 100. Así, si un 41% de las células se encontraba en fase G0/G1 y un 39% en fase G2/S en el control sin aditivos, se indicaron las variaciones que se observaban con el EADA respecto a ese resultado del control.

E! Ia siguiente tabla 4 se muestran los resultados obtenidos, los valores negativos indican una disminución en el número de células respecto al control y los valores positivos indican un aumento en el número de células respecto al control:

Tabla 4.- Resultados del estudio de viabilidad celular-ciclo celular Se observa que M2 estimula Ia proliferación de las células no irradiadas, que se mantiene durante Ia irradiación.

La repetición de este experimento mostró un efecto similar: efecto proliferativo y de resistencia a Ia apoptosls tras Ia radiación UV. Es importante destacar que en este nuevo estudio, Ia células estaban predominantemente en estado reposo, frente a un estado mas proliferativo en el estudio previo (células en G2/S del 5% frente al 39% en el estudio previo). El resultado se puede observar en Ia tabla 5 siguiente:

Tabla 5

Haciendo una media de ambos experimentos, se puede concluir que M2 produjo poca variación en el número de células en fase G2/S y que, tras irradiar con luz UV, hay una disminución del número de células en apoptosis del 7% con M2.

Efecto del extracto acuoso de Deschampsia antárctica (EADA) sobre Ia piel de ratones al aplicar radiación UVB

a) Se realizó un primer ensayo para valorar el efecto de Ia radiación UVB en 3 ratones machos, administrando 0,1 mi de preparado de Deschampsia antárctica en una concentración de 300mg/ml, una vez al día de lunes a viernes. Cada animal fue control de si mismo de manera que Ia zona central se comparó con Ia zona periférica. Tras Ia exposición a UVB (290-350nm) siguiendo el método descrito por Zinder & cois, y otros autores, situando los animales a 8cm de una fuente de luz ultravioleta de 6*40w, de 313nm de emisión fundamental y rango comprendido entre 290 y 350nm, considerada como banda ancha y con un filtro UVC, el eritema formado se evaluó con cruces de una forma subjetiva, distinguiendo Ia zona periférica (no tratada) de Ia central (tratada) y se fotografió a las 24 horas de Ia exposición. Los resultados obtenidos fueron:

Tabla 9

De los resultados se pudo concluir que el EADA a 300 mg/ml reduce Ia intensidad del eritema generado por Ia radiación UVB. b) En un segundo ensayo, se estudió el efecto de un EADA sobre Ia formación de eritema dérmico y Ia aparición de células quemadas, denominadas células "sunburn", debido a Ia exposición de Ia piel de ratón a una fuente de irradiación de 290 - 320 nm, dentro del espectro de Ia luz UVB.

Los resultados obtenidos se compararon con el efecto del ácido ferúlico que actuó como sustancia de referencia y que es un potente antioxidante natural muy extendido en el reino vegetal de muy baja toxicidad y que protege las membranas celulares de Ia oxidación lipídica y al genoma celular de Ia mutagénesis y de los daños oxidativos del ADN (3).

Material y Métodos.

Se utilizaron 40 ratones macho, de peso superior a 20 gramos. Tras su recepción, los animales se aclimataron durante 7 días al lugar donde se realizaron los ensayos, ubicándose en una sala con Ia temperatura controlada (22 ⁰ C) con humedad relativa entre el 50% y el 75%, con recambio de 10 veces por hora aproximadamente de aire fresco filtrado y con ciclos luz/oscuridad de 12h (7,00 -19,00 luz y de 19,00 a 7,00 oscuridad). Durante este periodo y durante el periodo experimental, los animales fueron alimentados ad libitum con dieta estándar para roedores y agua corriente como bebida.

Tabla 10

*disueltos en agua destilada (EDA) o etanol (Ferúlico) y suspendidos en gel inerte de carbopol que actuó como vehículo.

Los animales se distribuyeron aleatoriamente en 4 grupos experimentales de 10 animales cada uno, según Io expuesto en Ia tabla 10. Los productos a probar se utilizaron directamente aplicándolos en forma de gel sobre la piel. La prueba se realizó siguiendo el método descrito por Winder et al. "A study of Pharmacological influences on ultraviolet erythema in guinea pigs". Arch. Int pharmacodyn, 116: 261-292.1958. y otros autores como Wendy, J. et al. "The local antinociceptive and topical antiifnlamatory effects of propyl gállate in rodents.". Br. J. Pharmacol, 58: 573 -581. 1976. y Katiyar, S. K. et al. "Protective Effects of Silymarin Against Photocarcinogenesis in a Mouse Skin Model". J Nati Cáncer Inst 89: 556-65. 1997. con ligeras modificaciones. Seis días antes del ensayo, los animales se depilaron para eliminar todo el rastro de pelo y dejar Ia piel del dorso completamente al descubierto.

El primer día del ensayo, comenzó una pauta de aplicación matutina (100:00h) y vespertina (20:00h) diaria del vehículo, de Ia sustancia a ensayar o del patrón, siguiendo una pauta randomizada y a ciegas que duró 3 días. El tercer día, tras realizar Ia aplicación matutina de los tratamientos correspondientes, los animales se colocaron y se fijaron en Ia plataforma de exposición del equipo. A continuación, los animales se situaron a 8 cm de una fuente de luz ultravioleta de 4*40w, de 313 nm de emisión fundamental y rango comprendido entre 290 y 350 nm aproximadamente y con un filtro anti-UVC. La exposición se mantuvo hasta que todos los animales recibieron una dosis total aproximada de 2,5kJ/m2. La dosis de irradiación aplicada, se determinó mediante un detector de luz ultravioleta, 24 h después de terminar Ia exposición, el dorso de los animales se fotografió y éstos fueron sacrificados por dislocación cervical. La piel del dorso se extirpó y un fragmento de 2x2 situado debajo de donde se aplicó Ia sustancia a ensayar se introdujo en un frasco con de formalina tamponada al 10%, donde se mantuvieron 6h antes de iniciar el proceso de inclusión en parafina y preparación para estudio histológico.

Las preparaciones obtenidas se observaron con microscopio óptico y se fotografió a x100 aumentos el espacio epidérmico-dérmico de 5 lugares distintos de cada preparación. En cada fotografía se hizo un recuento de las células quemadas (sunburn cells), considerando como célula quemada a las células con citoplasma hípereosinofílico con un núcleo denso pequeño oscuro e irregular que se diferencia de sus vecinos.

La evaluación del eritema se realizó mediante un criterio de positivo/negativo, obteniéndose el porcentaje de animales protegidos.

En las preparaciones histológicas, se contó el número de células hipereosinófilas con núcleo picnótico (sunburn) por campo en las fotografías de los cinco sectores diferentes de Ia misma preparación. La suma de los cinco recuentos se consideró como el valor correspondiente al animal. Seguidamente se obtuvo Ia media ±E.S.M. de los resultados individuales de cada grupo experimental y se calculó el porcentaje de modificación del grupo expuesto y tratado con Ia sustancia a ensayar con respecto al grupo control expuesto y de éstos a su vez, con respecto al grupo control no expuesto. Resultados i) El aspecto de Ia piel de los ratones con "blanco vehículo" (grupo 1) que no fueron expuestos a UVB fue completamente normal y sonrosada por Io que se calificó como Eritema Negativo. En Ia preparación histológica se observó Ia estructura de Ia piel normal que consiste en Ia presencia de una capa cornea normal (fina), un estrato granuloso delgado y un estrato espinoso de un par de células, que se apoya sobre una capa de células básales (estrato basal) de keratinocitos funcionantes perfectamente ordenados agrupados en hilera de una célula de altura y que delimita Ia separación entre Ia epidermis y Ia dermis de una forma clara y evidente. En ninguna preparación se observó Ia presencia de células compatibles con Ia definición de "Sunburn". ¡i) A las 24 horas de Ia exposición, todos los animales del "vehículo control positivo" (grupo 2) mostraron un eritema intenso acompañado de evidentes signos inflamatorios, muy intensos en algunas ocasiones con zonas de extravasación hemática variable, que iban desde pequeñas petequias hasta lesiones claramente hemorrágicas. En las m i crofotog rafias de Ia piel se observan alteraciones muy profundas de Ia estructura celular de Ia epidermis, cuya disposición en capas se ha perdido. No se distinguen los estratos granuloso ni espinoso.

El estrato basal fue sustituido por un grupo de células picnóticas, entre las que se haya un número considerable de células "Sunburn" iii) El tratamiento con Acido Ferúlico al 0,5% (grupo 4) protegió de forma eficaz frente al eritema al 70% de los animales en los que Ia piel presentó un aspecto sonrosado compatible con Ia normalidad. A pesar de todo, los animales afectados sólo mostraron pequeños puntos eritematosos y petequias de escasa importancia. La imagen histológica demuestra que el impacto de Ia radiación UVB ha inducido cambios muy pequeños en Ia piel. Se mantiene casi íntegro el estrato basal que separa bien la epidermis de Ia dermis. Los estratos granuloso y espinoso han perdido altura y Ia capa cornea aparece mas gruesa. Aunque el número de células sunburn es reducido, se observan numerosos núcleos picnóticos, que indican cierto daño en Ia estructura epidérmica. iv) De manera similar, el tratamiento con el EADA a razón de 300 mg/mi (grupo 3) se observa un estrato basal normal un espinoso casi normal y un engrasamiento de Ia capa cornea. El número de células sunburn es muy escaso. El dorso de los animales no presenta enrojecimientos por Io que todos los animales del grupo fueron calificados de eritma negativo.

El efecto fotoprotector del EADA a 300 mg/ml y del ácido ferúlico al 0,5% sobre un eritema inducido por irradiación UVB en ratón se muestra en Ia tabla 11. Los resultados están expresados como presencia (+) o ausencia (-) de eritema o sus manifestaciones en Ia zona de tratamiento. El término "protegidos" se refiere a aquellos animales que no muestran signos en el área de exposición y si aparecen son de poca importancia y el término de "supresión" se refiere a Ia reducción de Ia intensidad del eritema y demás manifestaciones con respecto al grupo Vehículo Control Positivo en aquellos en que aparece (criterio subjetivo).

Tabla 11

Tabla 12

La significación estadística de las diferencias se evaluó mediante pruebas no paramétricas como el test de fisher o el test de χ2 (chi cuadrado). La tabla 12 representa Ia presencia de células "Sunburn" inducidas por irradiación UVB en ratón estando los resultados expresados en número de células en las preparaciones histológicas de Ia zona de tratamiento:

En Ia Figura 2, se muestra un espectro comparativo de absorción del EADA a 500μg/ml con el ácido ferúlico a 50μg/ml. El espectro de absorción del EADA muestra una absorción máxima a longitudes inferiores a 240 nm. En Ia banda comprendida entre 250 nm y 350 nm aproximadamente, el EADA ofrece una absorbancia estable entre 0,75 y 1 ,5 UA que bloquea de forma significativa Ia luz UVC, UVB y Ia porción más energética de Ia UVA. Por tanto, parte de sus efectos podrían ser debidos a un efecto pantalla que impide que Ia radiación luminosa incida sobre Ia piel.

Comparativamente el ácido ferúlico muestra tres picos de absorción como puede verse en Ia figura comparativa 2. Los dos primeros están antes de Ia banda UVC y el tercero aparece sobre los 285 nm y abarca casi hasta los 340 nm. Este comportamiento es típico de los polifenoles presentes en numerosos vegetales y proporciona un efecto pantalla eficaz que protege a las plantas de Ia luz solar. Al comparar las concentraciones necesarias para obtener absorbancias similares, se observa que el ácido ferúlico desarrolla su bloqueo con eficacia a 50 μg/ml, en tanto que con el EADA, 500 μg/ml producen un bloqueo equivalente al 50% del visto con 50 μg/ml de ácido ferúlico. Por tanto, para producir bloqueos de intensidad semejante, serían necesarias concentraciones de EADA entre 10 y 50 veces superiores a las de ácido ferúlico.

En conclusión se puede decir que: a) La aplicación tópica del EADA a razón de 300 mg/ml, reduce de forma eficaz del eritema inducido por Ia irradiación UVB. b) El EADA aplicada a 300 mg/ml tópicamente inhibe en un 95,11 % Ia aparición de células quemadas ("Sunburn"). c) La potencia de Ia preparación de Deschampsia preparada en este ensayo es ligeramente superior a Ia que muestra el ácido ferúlico a) 0,5%. d) En relación al ácido ferúlico, Ia concentración de Deschampsia antartica para inducir un bloqueo UV ha de ser entre 10 y 50 veces superior.