発明の名称 ：

切断型の変異型〇 3 丨 「 6 1 丨 （： II 丨 丨 11に結合する抗体、 及び骨髄増殖 性腫瘍の診断、 予防又は治療薬

技術分野

[0001 ] 本発明は、 骨髄増殖性腫瘍の診断、 予防及び治療薬に関する。

背景技術

[0002] フィラデルフィア染色体陰性骨髄増殖性腫瘍 （ 11 丨 丨 3〇1 6 1 11 丨 3 、 _

8） 遺伝子の第 9エクソンに、 塩基欠失や挿入が見出される （非特許文献 1 、 2） 。 変異遺伝子から産生される変異型 白質は、 トロ ンボポエチン受容体を恒常的に活性化するこ とで、 単独で骨髄増殖性腫瘍 （

IV! 1\!） を引き起こす腫瘍原性を有していることがす でに明らかにされてい る （非特許文献 3〜 6） 。

[0003] IV! 1\1患者で見出される 0八 !_ [¾遺伝子変異は、 必ず最終エクソンの限局 された場所におけるフレームシフト変異であ り、 フレームシフト変異による アミノ酸の読み枠のずれは、 必ず + 1である。 これらのことから、 変異型〇 八 !_ 蛋白質のカルボキシル末端には、 野生型に存在しない配列が存在し、 特にそのカルボキシル末端の 4 4アミノ酸は、 ほぼすベての変異型 0 蛋白質に共通している。 その例として、 1\/1 ? 1\1患者で見出される〇八!_ [¾遺 伝子変異の中で最も頻度の高い、 5 2塩基欠失型 I 5 2） 、 その次 に頻度が高い、 5塩基揷入型 （ I n s 5） のカルボキシル末端の配列を、 野生型 0八 !_ 蛋白質の当該領域と比較したものを図 1 に示した。

IV! 1\1を引き起こす原因である変異型 0 !_ 蛋白質は、 腫瘍細胞に発現 していることから、 フレームシフト変異により生じた変異型〇八 !_ 蛋白質 に特異的な配列は、 ネオ抗原として、 診断時のマーカーや、 治療標的となる 可能性が示唆されていた （特許文献 1〜 2） 。

先行技術文献

特許文献

[0004] 特許文献 1 :特表 201 6-53701 2号公報

特許文献 2 :国際公開第 201 6/0875 1 4号

非特許文献

[0005] 非特許文献 1 : KLampfL T, Giss Linger H, Harutyunyan AS, et al. Somatic mutations of calreticulin in mye Lopro L i ferat i ve neoplasms. The New En g Land journal of medicine. 2013; 369: 2379-90.

非特許文献 2 : Nangalia J, Massie CE, Baxter EJ, et al. Somatic CALR mu tat i ons in mye Lopro L i ferat i ve neoplasms with nonmutated JAK2. The New Eng Land journal of medicine. 2013; 369: 2391-405.

非特許文献 3 : Araki M, Yang Y, Masubuchi N, et al. Act i vat ion of the t hrombopo i et i n receptor by mutant calreticulin in CALR-mutant mye Lopro L i ferat i ve neoplasms. B Lood. 2016; 127 : 1307-16.

非特許文献 4 : ELf S, Abdelfattah NS, Chen E, et al. Mutant Calreticuli n Requires Both Its Mutant C-termi nus and the Thrombopo i et i n Receptor for Oncogenic Transformat ion. Cancer Discov. 2016; 6: 368-81.

非特許文献 5 : Marty C, Pecquet C, Nivarthi H, et al. Calreticulin muta nts in mice induce an MPL-dependent thrombocytosis with frequent prog ression to myelofibrosis. Blood. 2016; 127 : 1317-24.

非特許文献 6 : Vainchenker W, Kralovics R. Genetic basis and molecular pathophysiology of classical myeloproliferative neoplasms. B Lood. 201 7; 129: 667-79.

発明の概要

発明が解決しようとする課題

[0006] しかし、 前記のフレームシフ ト変異により出現する変異型 0 蛋白質 \¥02020/175689 3 卩（：171?2020/008434

に特異的な配列 （ネオ抗原） を認識する抗体では、 細胞抽出液や細胞表面に おける変異型〇八 1_ 蛋白質を正確に検出できないことが判明した 。

従って、 本発明の課題は、 1\/1 ? 1\1の変異型〇 1_［¾遺伝子及び蛋白質を正 確に検出することができる検出手段、 の診断、 予防又は治療薬、 及び |\/| 1\1治療薬のスクリーニング方法を提供するこ とにある。

課題を解決するための手段

［0007］ 本発明者は、 変異型 0 蛋白質の機能解析をさらに重ねた結果、 発現 させた変異型 0 蛋白質の多くが、 変異型蛋白質に特異的な配列 （図 1 ） の中で切断され、 ネオ抗原と考えられていた配列の大部分が失 われた変異 型〇八 蛋白質が多く発現していることを発見した。 そこで、 ネオ抗原中 の、 切断部位よりアミノ末端側に位置する極めて 短いアミノ酸配列を特異的 に認識する抗体を作成したところ、 培養細胞のみならず、 患者末梢血細胞、 患者血小板においても、 切断された変異型 0 !_ 蛋白質の発現が確認され た。 さらに、 この抗体を用いると、 細胞表面における変異型 0 蛋白質 の検出感度が飛躍的に向上すること、 さらには優れた IV! 1\1治療効果が得ら れることが明らかになった。 これらのことから、 〇八!_［¾遺伝子変異を有す る IV! 1\1患者の診断や治療においては、 全長型 （未切断型） だけでなく、 切 断型を含む変異型 0八 !_ 蛋白質をも検出あるいは標的とすることで、 より 高性能の医薬品が開発できることが明らかに なった。 また、 変異型〇八!_［¾ 蛋白質の切断を阻害することで、 切断で失われる配列を標的とする医薬品の 効果を増強させることが可能であることが強 く示唆され、 本発明を完成した

［0008］ すなわち、 本発明は、 次の ［1］ 〜 ［1 4］ を提供するものである。

［0009］ ［1］ （3） 配列番号 1で表されるアミノ酸配列からなるポリペプ� �ド鎖、 又は （匕） 配列番号 1 において 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、 置換若し くは付加されたアミノ酸配列からなるポリべ プチド鎖中に抗原認識部位を有 する、 切断後の変異型〇 !_ 蛋白質に結合する抗体又はその機能的断片。

［2］ 次の （〇） 、 （〇!） 及び ） から選ばれる、 ［1］ 記載の切断後の \¥02020/175689 4 卩（：171?2020/008434

変異型 0 1_ 蛋白質に結合する抗体又はその機能的断片。

（〇） 免疫グロブリン 〇〇［¾ 2及び〇〇［¾ 3が、 それぞ れ配列番号 1 7、 1 8及び 1 9に示されるアミノ酸配列、 又は配列番号 1 7 、 1 8及び 1 9に示されるアミノ酸配列において 1〜数個のアミノ酸が欠失 、 置換、 若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポ リペプチド、 かつ、 免 疫グロブリン それぞれ配列番 号 2 6、 2 7及び 2 8に示されるアミノ酸配列、 又は配列番号 2 6、 2 7及 び 2 8に示されるアミノ酸配列において 1〜数個のアミノ酸が欠失、 置換、 若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポ リべプチドである抗体。

（¢0 免疫グロブリン 〇〇［¾ 2及び〇〇［¾ 3が、 それぞ れ配列番号 2 0、 2 1及び 2 2に示されるアミノ酸配列、 又は配列番号 2 0 、 2 1及び 2 2に示されるアミノ酸配列において 1〜数個のアミノ酸が欠失 、 置換、 若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポ リペプチド、 かつ、 免 疫グロブリン それぞれ配列番 号 2 9、 3 0及び 3 1 に示されるアミノ酸配列、 又は配列番号 2 9、 3 0及 び 3 1 に示されるアミノ酸配列において 1〜数個のアミノ酸が欠失、 置換、 若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポ リべプチドである抗体。

（㊀） 免疫グロブリン 〇〇［¾ 2及び〇〇［¾ 3が、 それぞ れ配列番号 2 3、 2 4及び 2 5に示されるアミノ酸配列、 又は配列番号 2 3 、 2 4及び 2 5に示されるアミノ酸配列において 1〜数個のアミノ酸が欠失 、 置換、 若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポ リペプチド、 かつ、 免 疫グロブリン それぞれ配列番 号 3 2、 3 3及び 3 4に示されるアミノ酸配列、 又は配列番号 3 2、 3 3及 び 3 4に示されるアミノ酸配列において 1〜数個のアミノ酸が欠失、 置換、 若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポ リべプチドである抗体。

［3］ 次の （〇 、 （0） 及び （巳） から選ばれる ［1］ 又は ［2］ 記載の 切断後の変異型〇 !_ 蛋白質に結合する抗体又はその機能的断片。

（〇） 配列番号 5に示されるアミノ酸配列、 又は配列番号 5に示されるアミ \¥02020/175689 5 卩（：171?2020/008434

ノ酸配列において 1〜数個のアミノ酸が欠失、 置換、 若しくは付加されたア ミノ酸配列からなる免疫グロブリン V 1 ^~ 1鎖、 及び配列番号 8に示されるアミ ノ酸配列、 又は配列番号 8に示されるアミノ酸配列において 1〜数個のアミ ノ酸が欠失、 置換、 若しくは付加されたアミノ酸配列からなる免 疫グロプリ ン !_鎖を有する抗体。

( 0 ) 配列番号 6に示されるアミノ酸配列、 又は配列番号 6に示されるアミ ノ酸配列において 1〜数個のアミノ酸が欠失、 置換、 若しくは付加されたア ミノ酸配列からなる免疫グロブリン V 1 ^~ 1鎖、 及び配列番号 9に示されるアミ ノ酸配列、 又は配列番号 9に示されるアミノ酸配列において 1〜数個のアミ ノ酸が欠失、 置換、 若しくは付加されたアミノ酸配列からなる免 疫グロプリ ン !_鎖を有する抗体。

( º ) 配列番号 7に示されるアミノ酸配列、 又は配列番号 7に示されるアミ ノ酸配列において 1〜数個のアミノ酸が欠失、 置換、 若しくは付加されたア ミノ酸配列からなる免疫グロブリン▽! !鎖、 及び配列番号 1 0に示されるア ミノ酸配列、 又は配列番号 1 0に示されるアミノ酸配列において 1〜数個の アミノ酸が欠失、 置換、 若しくは付加されたアミノ酸配列からなる免 疫グロ ブリン V !_鎖を有する抗体。

［4］ 切断型の変異型〇 !_ 蛋白質中の配列番号 1で表されるアミノ酸配 列部分への結合において、 ［2］ 又は ［3］ の抗体と競合する抗体又はその 機能的断片。

［5］ ［1］ 〜 ［4］ のいずれかに記載の抗体又はその機能的断片 を含有す る医薬組成物。

［6］ 骨髄増殖性腫瘍の診断、 予防又は治療薬である ［5］ 記載の医薬組成 物。

［7］ 生体試料中の次の ( 3 ) 又は (匕) のポリペプチドを検出することを 特徴とする骨髄増殖性腫瘍に関連する変異型 0 !_ 蛋白質の検出方法。

( a ) 配列番号 1で表されるアミノ酸配列からなるポリペプ� �ド

( b ) 配列番号 1 において 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、 置換若しく \¥02020/175689 6 卩（：171?2020/008434

は付加されたアミノ酸配列からなるポリべ プチド

［8］ （3） 又は （13） のポリペプチドの検出が、 ［1］ 〜 ［4］ のいずれ かに記載の抗体又はその機能的断片を用いる 免疫学的検出である ［7］ 記載 の変異型〇 !_ 蛋白質の検出方法。

［9］ 次の （3） 又は （13） のポリペプチドに結合する薬物をスクリーニ ン グすることを特徴とする骨髄増殖性腫瘍治療 薬のスクリーニング方法。

（a） 配列番号 1で表されるアミノ酸配列からなるポリペプ� �ド

（b） 配列番号 1 において 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、 置換若しく は付加されたアミノ酸配列からなるポリべプ チド

［1 0］ 生体試料中の次の （3） 又は （13） のポリペプチドを検出すること を特徴とする骨髄増殖性腫瘍の診断方法。

（a） 配列番号 1で表されるアミノ酸配列からなるポリペプ� �ド

（b） 配列番号 1 において 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、 置換若しく は付加されたアミノ酸配列からなるポリべプ チド

［1 1］ （3） 又は （13） のポリペプチドの検出が、 ［1］ 〜 ［4］ のいず れかに記載の抗体又はその機能的断片を用い る免疫学的検出である ［1 0］ 記載の診断方法。

［1 2］ ［1］ 〜 ［4］ のいずれかに記載の抗体又はその機能的断片 を投与 することを特徴とする骨髄増殖性腫瘍の予防 又は治療方法。

［1 3］ 骨髄増殖性腫瘍の診断に用いるための、 ［1］ 〜 ［4］ のいずれか に記載の抗体又はその機能的断片。

［1 4］ ［1］ 〜 ［4］ のいずれかに記載の抗体又はその機能的断片 の、 骨 髄増殖性腫瘍診断薬製造のための使用。

発明の効果

［0010］ 前記 （3） 又は （匕） のポリペプチド鎖中に抗原認識部位 （エピトープ） を有する抗体を用いれば、 変異型 0 !_ 蛋白質の切断によって生じた変異 型〇八 !_ 蛋白質を検出でき、 細胞表面における変異型 0八 !_ 蛋白質の検 出感度が飛躍的に向上する。 従って、 本発明の IV! 1\1診断薬を用いれば、 IV! P Nの検出感度が飛躍的に向上する。 また、 この抗体を用いれば、 MP Nが 特異的に予防又は治療できる。 また、 （ _a ） 及び （b） のポリペプチドに結 合する薬物をスクリーニングすれば、 MP N治療薬をスクリーニングできる 図面の簡単な説明

[0011] [図 1]変異型 C A L R蛋白質の特徴を示す図である。 骨髄増殖性腫瘍患者の発 症原因である C A L R遺伝子変異は、 + 1 フレームシフト変異であり、 その 結果できる変異型 C A L R蛋白質のカルボキシル末端には、 変異型蛋白質に 共通したアミノ酸配列が見出される。 S P :シグナル配列、 N : N ドメイン 、 P : P ドメイン。 矢印は、 野生型 （WT） と異なるアミノ酸配列が始まる 部分を示している。

[図 2]C A L R蛋白質のアミノ末端側と変異型 C A L R蛋白質のカルボキシル 末端側の配列を認識する抗体を示す図である 。 CAL R蛋白質のアミノ末端 側の配列を認識する抗体は、 変異型 C A L R蛋白質の変異箇所よりアミノ末 端側のアミノ酸配列を認識する市販の抗体 （抗 CAL R抗体） である。 また 、 変異型 C A L R蛋白質のカルボキシル末端の配列を認識す� �抗体は、 C A L R蛋白質のカルボキシル末端側に塩基配列の� �異により新たに形成された アミノ酸配列を認識する市販の抗体 （抗変異型 C A L R抗体） である。

[図 3]U T- 7/T P〇細胞 （Kom a t s u N. e t a I . , B I 〇〇 d, 1 996, 87, 4552-4556） から分泌された蛋白質を、 図 2 の抗体を用いてイムノブロッ ト解析した結果を示す図である。 v e cは、 発 現べクターのみを導入した細胞であることか ら、 U T- 7/T P〇細胞 /C AL R （WT） と同様に内在性の C A L R蛋白質が検出される。 D e l 5 2型と I n s 5型では、 抗変異型 C A L R抗体により検出される全長型の 変異型 C A L R蛋白質よりも分子量の小さな変異型 C A L R蛋白質が、 抗 C A L R抗体でのみ検出される （図中のアスタリスク） 。 なお、 I n s 5型 では、 全長型の変異型 C A L R蛋白質は、 内在性の野生型 C A L R蛋白質と ほぼ同じ位置に泳動されるため、 抗 CAL R抗体で、 特異的に検出すること \¥02020/175689 8 卩（：171?2020/008434

ができない。

［図 4］変異型 0八 1_ 蛋白質の代表的な 0 6 丨 5 2型と 丨 n s 5型のアミ ノ （1\1） 末端とカルボキシル （〇 末端に 1_八〇タグ （ 1_八〇_ I 3 9 ） を融合した蛋白質の模式図を示す。 変異型特異的配列を黒色で、 1_八〇 タグを斜線で図示した。

［図 5］抗 1_ 〇抗体を用いたフローサイ トメ トリー解析により、 細胞表面上 における変異型〇八 1_ 蛋白質の量を測定した結果を示す図である。 切断の 有無によらず、 タグの残存する 1\1末端に 1_ 〇タグを配した変異型〇八1_

8蛋白質を発現する細胞では、 変異型 0 1_ 蛋白質特異的配列内で生じる 切断により <3末端 1_ ◦が切り落とされる細胞に比べて、 強いシグナルが 検出された。 なお、 口 6 丨 5 2型の発現量が丨 n 3 5型よりも低いこと による差が見られる。

［図 6］変異型 蛋白質特異的配列 （黒色） 内で生じる蛋白質の切断部位 よりもアミノ末端側にある、 変異型特異的配列を認識する抗体を示す。

［図 7］図 6の抗体を用いて、 図 3で用いた細胞をフローサイ トメ トリー解析し た結果を示す。 1_ 〇タグの付加した位置による、 認識力の違いが消失し た。 なお、 口 6 丨 5 2型の発現量が丨 n 3 5型よりも低いことによる差 が見られる。

［図 8］骨髄増殖性腫瘍患者細胞における切断型 0 1_ 蛋白質の検出を示す図 である。 変異型〇 1_ 蛋白質特異的配列内で生じる蛋白質の切断部 位より もアミノ末端側にあるアミノ酸配列を認識す る抗体を用いて、 患者細胞より 調製した細胞抽出液をイムノブロッ ト法で解析した。 遺伝子変異を 有する骨髄増殖性腫瘍患者の末梢血単核球細 胞や血小板において、 当該抗体 で認識できる切断型の変異型 0 1_ 蛋白質の発現が検出された。

［図 9］クローン巳 3、 0 6 , ◦ 1抗体いずれも全長型と切断型の変異型 0八 1_ 蛋白質を認識することを示す図である。 リ丁_ 7 /丁 〇細胞から分泌さ れた蛋白質を、 クローン巳 3抗体と、 クローン〇6、 〇 1抗体を用いてイム ノブロッ ト解析した結果を示す図である。 アミノ末端のシグナル配列の下流 \¥02020/175689 9 卩（：171?2020/008434

に 1_八〇タグを付加した 0 6 I 5 2型と l n s 5型の全長型と、 より 低分子量の切断型の両方が、 抗 1_ 〇抗体と同様に、 巳 3、 0 6 , ずれの抗体を用いても検出される。

［図 10］クローン巳 3、 0 6 , ◦ 1抗体いずれも細胞表面の変異型 0 !_［¾蛋 白質を認識することを示す図である。 !_八◦タグを付加した 0 6 I 5 2 型あるいは丨 门 3 5型の変異型 0八 1_ 蛋白質を発現する11丁_ 7 /丁

〇細胞、 発現べクターのみを導入した 11丁_ 7 /丁 〇/ ₆ 〇細胞に対し て、 クローン巳 3抗体と、 クローン〇6、 ◦ 1抗体を用いたフローサイ トメ トリー解析を行い、 細胞表面上における変異型〇 !_ 蛋白質の量を測定し た結果を示す図である。 なお、 丨 5 2型は、 丨 n s 5型よりも、 発 現量が低いために、 変異の型によるシグナル強度の差が見られる 。

［図 1 1］クローン巳 3、 〇6、 蛋白質に対する結合 能の評価結果を示す図である。 クローン巳 3抗体と、 クローン0 6、 体、 コントロールのラッ ト I ◦を用いて、 0 6 I 5 2型の変異型〇八 !_

8蛋白質に対する結合特異性を巳 !_ 丨 3 法により評価した。 クローン巳 3 、 〇6、 〇 1抗体、 いずれも濃度依存的な変異型 0 蛋白質との特異的 な結合が検出された。

［図 12］クローン巳 3抗体と抗体の作成に用いた抗原に対する結� �強度を、 表 面プラズモン共鳴解析法により評価した結果 を示す図である。 クローン巳 3 抗体と抗体の作成に用いた抗原に対する結合 強度を、 表面プラズモン共鳴解 析法により評価した。

［図 13八］イムノブロッ ト法による、 クローン巳 3、 〇6、 ◦ 1抗体の抗原認識 配列の同定結果を示す図である。 〇 ø I 5 2型の変異型〇八 蛋白質に おいて、 図中に記したアミノ酸をアラニン （八） に置換した蛋白質を発現し 、 それぞれの抗体の反応性をイムノブロッ ト法を用いて評価した。 丨 3 〇 1は、 アミノ酸置換をしていない口 6 丨 5 2型の変異型〇八 1_ 蛋白質 を示している。 黒太線で囲まれたアミノ酸は、 抗体の作成に使用した抗原配 列を示している。 \¥02020/175689 10 卩（：171?2020/008434

［図 138］巳 1_ 丨 3八法による、 クローン巳3、 〇6、 〇 1抗体の抗原認識配列 の同定結果を示す図である。 図 1 3八と同じ蛋白質に対するそれぞれの抗体 の反応性を、 巳 !_ 丨 3八法を用いて評価した。 丨 n I 3〇 Iは、 アミノ酸置 換をしていない 丨 5 2型の変異型 0八 !_［¾蛋白質を示している。 黒太 線で囲まれたアミノ酸は、 抗体の作成に使用した抗原配列を示している 。

［図 14］本発明抗体 （巳 3、 0 6 , 0 1） の重鎖可変領域のアミノ酸配列を示 す図である。

［図 15］本発明抗体 （巳 3、 0 6 , 0 1） の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を示 す図である。

［図 16］本発明抗体 （巳 3、 0 6 , 0 1） の重鎖可変領域の塩基配列を示す図 である。

［図 17］本発明抗体 （巳 3、 0 6 , 0 1） の軽鎖可変領域の塩基配列を示す図 である。

［図 18］巳 3マウスキメラ抗体による IV! 1\1モデルマウスに対する治療効果を 示す図である。 〇 ø I 5 2型の変異型 0 蛋白質を発現させた造血幹 細胞を移植して作出した骨髄増殖性腫瘍モデ ルマウス 0 6 I 5 2マウス） 、 あるいはコントロールべクターを導入した造 血幹細胞を移植 して作成したコントロールマウスに、 移植後 9週目から、 毎週、 巳 3キメラ 抗体あるいは、 溶媒 （ 巳3） を投与し、 骨髄増殖性腫瘍モデルマウスに特 徴的な血小板増多の抑制効果を評価した。

発明を実施するための形態

［0012］ 本発明の |\/| に関連する変異型 0 !_ 蛋白質の検出及び診断方法並び に IV! 1\1の予防又は治療の標的として用いられる前 記 （3） 又は （匕） のポ リペプチドは、 変異型〇八 蛋白質に特異的な配列 （図 1中の変異型〇八 !_ 蛋白質に共通する 4 4アミノ酸） 中で切断されて残存するカルボキシル 末端側のポリペプチドである。

野生型 蛋白質は、 図 1 に示すアミノ酸配列 （配列番号 2） を有す る。 また、 遺伝子変異の中で最も頻度の高い 5 2塩基欠失型 \¥02020/175689 11 卩（：171?2020/008434

I 5 2） は、 図 1 に示すアミノ酸配列 （配列番号 3） を有する。 また、 〇 八!_ [¾遺伝子変異の中で、 次に頻度の高い 5塩基揷入型 （ I n s 5） は、 図 1 に示すアミノ酸配列 （配列番号 4） を有する。 また、 図 1中の枠で囲ん だ領域は、 変異型 0 蛋白質に共通するアミノ酸配列である。 切断型の 変異型〇八!_ [¾蛋白質は、 この共通領域のアミノ末端側のわずか 1 3アミノ 酸のみを含む。 この共通領域が切断され切断型の変異型〇 !_ 蛋白質が生 じること、 共通領域の大部分が変異型〇 !_ 蛋白質から失われることは、 本発明者が初めて見出したことである。

[0013] ポリペプチド （3） は、 配列番号 1で表されるアミノ酸配列からなる。 ポ リペプチド （匕） における、 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、 置換若しく は付加されたアミノ酸配列としては、 配列番号 1 において 1〜 4個のアミノ 酸が欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列が好ま しく、 1〜 3個のア ミノ酸が欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列がより 好ましい。 より 具体的には、 配列番号 1のカルボキシ末端側から 3アミノ酸が欠失したアミ ノ酸配列がより好ましい。 また、 ポリペプチド （匕） のアミノ酸配列と配列 番号 1のアミノ酸配列の同一性は、 8 0 %以上が好ましく、 8 5 %以上がよ り好ましく、 9 0 %以上がさらに好ましい。

[0014] 本発明の |\/| に関連する変異型 0 !_ 蛋白質の検出方法及び IV! 1\1診 断、 予防、 治療方法においては、 生体試料中の前記 （3） 又は （匕） のポリ ペプチドに結合する抗体又はその機能的断片 が用いられる。

[0015] 前記抗体としては、 （3） 又は （匕） のポリペプチド鎖中に抗原認識部位 （エピトープ） を有する抗体であればよいが、 切断型の変異型 0 蛋白 質にのみ結合するものであっても、 切断型の変異型 0 !_ 蛋白質と全長型 の変異型〇 !_ 蛋白質の両方に結合するものであってもよく 、 切断型の変 異型 0 !_ 蛋白質と全長型の変異型 0 !_ 蛋白質の両方に結合する 「変 異型 蛋白質」 に特異的な抗体であることが好ましい。 具体例として は、 次の （〇 、 （¢0 及び ） から選ばれる抗体が挙げられる。

（〇） 免疫グロブリン 〇〇 [¾ 2及び〇〇 [¾ 3が、 それぞ \¥0 2020/175689 12 卩（：171? 2020 /008434

れ配列番号 1 7、 1 8及び 1 9に示されるアミノ酸配列、 又は配列番号 1 7 、 1 8及び 1 9に示されるアミノ酸配列において 1〜数個のアミノ酸が欠失 、 置換、 若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポ リペプチド、 かつ、 免 疫グロブ それぞれ配列番 号 2 6、 2 7及び 2 8に示されるアミノ酸配列、 又は配列番号 2 6、 2 7及 び 2 8に示されるアミノ酸配列において 1〜数個のアミノ酸が欠失、 置換、 若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポ リべプチドである抗体。

（¢0 免疫グロブ 〇〇［¾ 2及び〇〇［¾ 3が、 それぞ れ配列番号 2 0、 2 1及び 2 2に示されるアミノ酸配列、 又は配列番号 2 0 、 2 1及び 2 2に示されるアミノ酸配列において 1〜数個のアミノ酸が欠失 、 置換、 若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポ リペプチド、 かつ、 免 疫グロブ それぞれ配列番 号 2 9、 3 0及び 3 1 に示されるアミノ酸配列、 又は配列番号 2 9、 3 0及 び 3 1 に示されるアミノ酸配列において 1〜数個のアミノ酸が欠失、 置換、 若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポ リべプチドである抗体。

（㊀） 免疫グロブリン 〇〇［¾ 2及び〇〇［¾ 3が、 それぞ れ配列番号 2 3、 2 4及び 2 5に示されるアミノ酸配列、 又は配列番号 2 3 、 2 4及び 2 5に示されるアミノ酸配列において 1〜数個のアミノ酸が欠失 、 置換、 若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポ リペプチド、 かつ、 免 疫グロブ それぞれ配列番 号 3 2、 3 3及び 3 4に示されるアミノ酸配列、 又は配列番号 3 2、 3 3及 び 3 4に示されるアミノ酸配列において 1〜数個のアミノ酸が欠失、 置換、 若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポ リべプチドである抗体。

［0016］ 前記配列番号 1 7〜 3 4に示されるアミノ酸配列における、 1〜数個のア ミノ酸が欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列として は、 配列番号 1 7〜 3 4において 1〜 4個のアミノ酸が欠失、 置換若しくは付加されたアミ ノ酸配列が好ましく、 1〜 3個のアミノ酸が欠失、 置換若しくは付加された アミノ酸配列がより好ましく、 1〜 2個のアミノ酸が欠失、 置換若しくは付 \¥02020/175689 13 卩（：171?2020/008434

加されたアミノ酸配列がさらに好ましい。 また、 配列番号 1 7〜 3 4に示さ れるアミノ酸配列と、 1〜数個のアミノ酸が欠失、 置換若しくは付加された アミノ酸配列の同一性は、 8 0 %以上が好ましく、 8 5 %以上がより好まし く、 9 0 %以上がさらに好ましい。

[0017] 前記の （3） 又は （匕） のポリペプチド鎖中に抗原認識部位 （エピトープ ） を有する抗体としては、 さらに次の （〇 、 （0） 及び （巳） から選ばれ る抗体であるのが好ましい。

（〇） 配列番号 5に示されるアミノ酸配列、 又は配列番号 5に示されるアミ ノ酸配列において 1〜数個のアミノ酸が欠失、 置換、 若しくは付加されたア ミノ酸配列からなる免疫グロブリン V 1 ^~ 1鎖、 及び配列番号 8に示されるアミ ノ酸配列、 又は配列番号 8に示されるアミノ酸配列において 1〜数個のアミ ノ酸が欠失、 置換、 若しくは付加されたアミノ酸配列からなる免 疫グロプリ ン !_鎖を有する抗体。

（0） 配列番号 6に示されるアミノ酸配列、 又は配列番号 6に示されるアミ ノ酸配列において 1〜数個のアミノ酸が欠失、 置換、 若しくは付加されたア ミノ酸配列からなる免疫グロブリン V 1 ^~ 1鎖、 及び配列番号 9に示されるアミ ノ酸配列、 又は配列番号 9に示されるアミノ酸配列において 1〜数個のアミ ノ酸が欠失、 置換、 若しくは付加されたアミノ酸配列からなる免 疫グロプリ ン !_鎖を有する抗体。

（º） 配列番号 7に示されるアミノ酸配列、 又は配列番号 7に示されるアミ ノ酸配列において 1〜数個のアミノ酸が欠失、 置換、 若しくは付加されたア ミノ酸配列からなる免疫グロブリン▽! !鎖、 及び配列番号 1 0に示されるア ミノ酸配列、 又は配列番号 1 0に示されるアミノ酸配列において 1〜数個の アミノ酸が欠失、 置換、 若しくは付加されたアミノ酸配列からなる免 疫グロ ブリン V !_鎖を有する抗体。

[0018] 前記配列番号 5〜 1 0に示されるアミノ酸配列における、 1〜数個のアミ ノ酸が欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列として は、 配列番号 5〜 1 0において 1〜 1 0個のアミノ酸が欠失、 置換若しくは付加されたアミノ 酸配列が好ましく、 1〜 8個のアミノ酸が欠失、 置換若しくは付加されたア ミノ酸配列がより好ましく、 1〜 5個のアミノ酸が欠失、 置換若しくは付加 されたアミノ酸配列がさらに好ましい。 また、 配列番号 5〜 1 0に示される アミノ酸配列と、 配列番号 5〜 1 0に示されるアミノ酸配列の 1〜数個が欠 失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列の同一 性は、 80 %以上が好まし く、 85 %以上がより好ましく、 90 %以上がさらに好ましい。

[0019] 本発明の抗体は、 前記 （c） 〜 （e） の各 CD Rの配列、 又は （C） 〜 （

E） の免疫グロプリン V H領域及び V L領域の配列を有するものであって、 これらの領域以外の領域のアミノ酸配列は特 に制限されない。 従って、 本発 明の抗体は、 ヒト抗体のようなラッ ト以外の哺乳動物抗体でもよく、 ヒト化 抗体でもよい。 より具体的には、 ヒト以外の哺乳動物、 例えば、 ラッ ト抗体 の重鎖、 軽鎖の可変領域とヒト抗体の重鎖、 軽鎖の定常領域からなるキメラ 抗体であっても良く、 この様な抗体はラッ ト抗体の可変領域をコードする D NAをヒト抗体の定常領域をコードする DNAと連結し、 これを発現べクタ —に組み込んで宿主に導入し産生させること により得ることができる。 ヒト 化抗体は、 再構成 （ r e s h a p e d） ヒト抗体とも称され、 ヒト以外の晡 乳動物、 たとえばラッ ト抗体の C D Rをヒト抗体の C D Rへ移植したもので あり、 その一般的な遺伝子組換え手法も知られてい る。 具体例として、 ラッ 卜抗体の C D Rとヒト抗体のフレームワーク領域 （f r amewo r k r e g i o n ; F R） を連結するように設計した D N A配列を、 末端部に才一 パーラップする部分を有するように作製した 数個のオリゴヌクレオチドから PCR法により合成する。 得られた DNAをヒト抗体定常領域をコードする DN Aと連結し、 次いで発現べクターに組み込んで、 これを宿主に導入し産 生させることにより得られる （欧州特許出願公開番号 E P 239400、 国 際特許出願公開番号 WO 96/02576参照） 。 CD Rを介して連結され るヒト抗体の F Rは、 CD Rが良好な抗原結合部位を形成するものが選� �さ れる。 必要に応じ、 再構成ヒト抗体の CD Rが適切な抗原結合部位を形成す るように抗体の可変領域の F Rのアミノ酸を置換してもよい （S a t o, K e t a I . , C a n c e r R e s, 1 993, 53, 85 1 — 856

[0020] また、 ヒト抗体の取得方法も知られている。 例えば、 ヒトリンパ球を i n

V I I 「〇で所望の抗原又は所望の抗原を発現する 細胞で感作し、 感作リ ンパ球をヒトミエローマ細胞、 例えば II 266と融合させ、 抗原への結合活 性を有する所望のヒト抗体を得ることもでき る （特公平 1 —59878参照 ） 。 また、 ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有す るトランスジェニッ ク動物を所望の抗原で免疫することで所望の ヒト抗体を取得することができ る （ 093/1 2227, 092/039 1 8, 094/02602 , \^/〇94/25585, \^/〇96/34096, \^/〇96/33735参 照） 。 さらに、 ヒト抗体ライブラリーを用いて、 パンニングによりヒト抗体 を取得する技術も知られている。 例えば、 ヒト抗体の可変領域を ^_ 本鎖抗体 （ 3〇 V） としてファージデイスプレイ法によりファー ジの表面に発現さ せ、 抗原に結合するファージを選択することがで きる。 選択されたファージ の遺伝子を解析すれば、 抗原に結合するヒト抗体の可変領域をコード する口 八配列を決定することができる。 抗原に結合する 3〇 Vの〇 八配列が 明らかになれば、 当該配列を適当な発現べクターを作製し、 ヒト抗体を取得 することができる。 これらの方法は既に周知であり、 \^/〇92/01 047 , 092/2079 1 , 093/062 1 3, 093/1 1 236, \^/〇93/1 9 1 72, 〇 95/01 438, 〇 95/1 5388を参 考にすることができる。

[0021] 抗体のクラスは特に限定されず、 丨 ₉ 〇、 I ₉ 1\/1、 丨 ₉ 八、 丨 ₉ 0あるい は I 9巳等のいずれのアイソタイプを有する抗体� �も包含する。 精製の容易 性等を考慮すると好ましくは I 9◦である。

[0022] 機能的断片としては、 抗体断片 （フラグメント） 等の低分子化抗体や抗体 の修飾物が挙げられる。 抗体断片の具体例としては、 例えば、 3匕、 3 匕， 、 （3匕， ） 2、 、 3。 、 ソなどを挙げること ができる。 \¥02020/175689 16 卩（：171?2020/008434

[0023] また、 本発明の抗体のうち、 前記 （3） 又は （匕） のポリペプチドの検出 に用いる抗体はこれらのポリペプチドに結合 すればよい。 一方、 の予 防又は治療に用いる抗体は、 前記 （ 3） 又は （匕） のポリべプチドに結合し 、 細胞傷害活性を有する抗体が好ましい。

[0024] 切断型の変異型 0 1_ 蛋白質に結合する抗体としては、 配列番号 1で表 される配列を有するポリべプチド鎖に結合す る抗体であればよいが、 切断型 の変異型〇 !_ 蛋白質中の配列番号 1で表されるアミノ酸配列部分への結 合において、 少なくとも前記抗体又はその機能的断片のい ずれか一つと競合 する抗体であることが好ましい。

[0025] ここで、 前記検出に用いられる生体試料としては、 例えば被験者から採取 された生体試料であって、 （3） 又は （匕） のポリペプチドが含まれる試料 が挙げられる。 具体的には、 全血、 血槳、 血清、 リンパ球、 リンパ液、 血小 板、 単核球、 顆粒球、 唾液や尿などの体液、 骨髄生検により得られる組織標 本 （骨髄液、 骨髄組織） などが挙げられる。

[0026] （a） 又は （匕） のポリペプチドの検出手段としては、 液体クロマトグラ フィー質量分析法、 免疫学的法、 特異的結合能を有する低/中分子や核酸あ るいは核酸誘導体を用いた方法等が挙げられ るが、 簡便かつ測定感度が高い 免疫学的方法が好ましい。

[0027] 免疫学的方法としては、 （3） 又は （匕） のポリペプチド鎖中に抗原認識 部位 （エピトープ） を有する抗体又はその機能的断片を用いる免 疫学的方法 が好ましい。 （3） 又は （匕） のポリペプチド鎖中のエピトープとしては、 （a） 又は （匕） のポリペプチド鎖中に存在する配列であれば よく、 （3） 又は （13） のポリペプチド鎖中の連続する 3アミノ酸以上のアミノ酸を有す るペプチドが好ましく、 （3） 又は （匕） のポリペプチド鎖中の連続する 5 アミノ酸以上のアミノ酸を有するぺプチドが より好ましい。

[0028] 免疫学的方法に用いる抗体は、 例えば （3） 又は （匕） のポリペプチド鎖 中の連続する 3アミノ酸以上のアミノ酸を有するぺプチド� �抗原として用い て得られる抗体であればよく、 ポリクローナル抗体であっても、 モノクロー \¥02020/175689 17 卩（：171?2020/008434

ナル抗体であってもよいが、 モノクローナル抗体が好ましい。 ここでモノク 口ーナル抗体は、 例えば （3） 又は （匕） のポリペプチド鎖中の連続する 3 アミノ酸以上のアミノ酸を有するペプチドを 感作することにより得られた抗 体産生細胞と骨髄腫細胞とを細胞融合させて ハイプリ ドーマを作成し、 目的 とする抗体を産生するクローンを選択し、 この細胞を増殖させて製造するこ とができる。

[0029] 免疫学的方法としては、 イムノクロマト法、 酵素標識免疫学的測定法 （巳

I 八） 、 ラジオイムノアッセイ （[¾ 丨 八） 、 凝集法、 比濁法、 フローサイ ト メ トリー法、 組織免疫染色法、 ウェスタンプロッ ト等のイムノブロッ ト法等 のいずれも用いることができる。 ここでイムノブロッ ト法は、 ポリペプチド をメンプレンに転写し、 メンブレン上のポリべプチドを抗体で検出す る方法 である。 抗体の検出には、 酵素標識、 蛍光標識等が用いられる。

[0030] 生体試料中に （3） 又は （匕） のポリペプチドが検出されれば、 当該生体 試料は骨髄増殖性腫瘍患者由来の生体試料で あると判定することができる。

[0031 ] 本発明の 診断薬は、 前記 （3） 又は （匕） のポリペプチド鎖中に抗 原認識部 （エピトープ） を有する抗体を含有する。 この抗体は、 前述の抗体 であるのが好ましい。

また、 本発明の IV! 診断薬には、 前記抗体の他、 緩衝液、 測定実施プロ トコール等が含まれていてもよい。

[0032] 本発明の IV! 1\1予防又は治療薬等の医薬組成物は、 前記の抗体を含有すれ ばよいが、 薬学的に許容しうる担体とともに、 混合、 溶解、 乳化、 カプセル 封入、 凍結乾燥等により、 製剤化して製造することができる。

[0033] 本発明の医薬組成物の予防又は治療対象とな る IV! 1\1は、 変異型 が検出される IV! 1\1であるのが好ましい。

[0034] 経口投与用の好適な製剤は、 本発明抗体を、 水、 生理食塩水のような希釈 剤に有効量溶解させた液剤、 有効量を固体や顆粒として含んでいるカプセ ル 剤、 顆粒剤、 散剤又は錠剤、 適当な分散媒中に有効量を懸濁させた懸濁液 剤 、 有効量を溶解させた溶液を適当な分散媒中に 分散させ乳化させた乳剤等で \¥02020/175689 18 卩（：171?2020/008434

ある。

[0035] 非経口投与用には、 本発明抗体を、 薬学的に許容しうる溶媒、 賦形剤、 結 合剤、 安定化剤、 分散剤等とともに、 注射用溶液、 懸濁液、 乳剤、 クリーム 剤、 軟膏剤、 吸入剤、 坐剤等の剤形に製剤化することができる。 注射用の処 方においては、 本発明の抗体を水性溶液、 好ましくはハンクス溶液、 リンゲ ル溶液、 又は生理的食塩緩衝液等の生理学的に適合性 の緩衝液中に溶解する ことができる。 さらに、 本発明の医薬は、 油性又は水性のべヒクル中で、 懸 濁液、 溶液、 又は乳濁液等の形状をとることができる。 あるいは、 本発明抗 体を粉体の形態で製造し、 使用前に滅菌水等を用いて水溶液又は懸濁液 を調 製してもよい。 吸入による投与用には、 本発明抗体を粉末化し、 ラクトース 又はデンプン等の適当な基剤とともに粉末混 合物とすることができる。 坐剤 処方は、 本発明抗体をカカオバター等の慣用の坐剤基 剤と混合することによ り製造することができる。 さらに、 本発明の治療剤は、 ポリマーマトリクス 等に封入して、 持続放出用製剤として処方することができる 。

[0036] 本発明の IV! 1\1治療薬のスクリーニング法は、 前記 （ ₃ ） 又は （匕） のポ リペプチドを認識する抗体や蛋白質、 低/中分子、 核酸あるいは核酸誘導体 をスクリーニングすることを特徴とする。 具体的には、 （3） 又は （匕） の ポリベプチドを認識する抗体を用いた抗体依 存性細胞傷害活性や補体依存性 細胞傷害活性を有する抗体医薬の開発が挙げ られる。 前記本発明の抗体が、 本発明のスクリーニング法により得られた、 抗体医薬の例である。 この他に も、 （3） 又は ） のポリペプチドに特異的に結合する低分子あ るいは中 分子化合物、 核酸あるいは核酸誘導体、 蛋白質などを作出し、 殺細胞効果を 有する低分子あるいは中分子化合物、 核酸あるいは核酸誘導体、 蛋白質など を腫瘍細胞特異的に送達する抗腫瘍薬の開発 が挙げられる。

実施例

[0037] 次に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説 明するが、 本発明はこれら実 施例に何ら限定されない。

[0038] [試験例 1 ] ( 1 ) 材料及び試験方法

[ 1 ] 抗 C A L R抗体

Ce l l S i g n a l i n g T e c h n o l o g y社製ウサギモノク 口ーナル抗体クローン D 3 E 6 (C a t # 1 2238)

[0039] [2] 抗変異型 CAL R抗体

D i a n〇 V a社製マウスモノクローナル抗体クローン C A L 2 (C a t #D I A-C A L)

[0040] [3] 切断部位よりもアミノ末端側の変異型 C A L R蛋白質を認識する抗体 配列番号 1 に含まれるアミノ酸配列 (R RMMRTKMR) のカルボキシ ル末端あるいはアミノ末端にシステインを付 加したべプチドを合成し、 キヤ リアー蛋白質キーホールリンぺッ トへモシアニン (Ke y h o l e L i m p e t H e mo c y a n i n ; KL H) と結合させてから、 8週齢のメス の WKY/丨 z mラッ トに免疫し、 追加免疫後にリンパ球を回収した。 リン パ球をマウスミエローマ S P 2細胞と P EG法により細胞融合させてから、 選択培地で培養しハイプリ ドーマを取得した。 培養上清中の抗体の特異性を 、 免疫したペプチドや精製蛋白質を用いた E L 丨 S A法によりスクリーニン グすることで、 切断型を含む変異型 C A L R蛋白質に結合する抗体を産生す るハイプリ ドーマ (クローン B3、 C6及び G 1 ) を取得した。 これらのハ イブリ ドーマから産生された抗体を精製し、 試験に用いた (B3抗体、 C6 抗体及び G 1抗体) 。

[0041] [4] 試験方法

ヒト巨核芽球性白血病細胞株 U T_ 7/T P〇に、 D e l 52あるいは I n s 5型の変異型 C A L R蛋白質を発現させることで腫瘍性に増殖す� � U T- 7/T P O/C A L R D e l 52、 U T- 7/T P O/C A L R I n s 5細胞と、 コントロールとして野生型 C A L Rを発現させた U T -7/T PO/CAL R (WT) 、 遺伝子導入に使用したベクターのみを導 入した U T— 7/T P〇/v e c細胞を、 6. 0 X 1 0 ⁵ 個/ m Lの密度で〇 p t i M E M培地 (T h e r mo F i s h e r社 C a t #3 1 98507 \¥02020/175689 20 卩（：171?2020/008434

0） に播種し、 5 %〇〇 ₂ 存在下において 37 °〇で 32時間培養した。 この際 、 \^/丁と11丁一7/丁 〇/ 6〇細胞は、

1 0门 9/|111_ トロンボポエチン （丁 1"1 「〇〇113〇 〇 I ㊀！： I 门 ; 79 〇） を含む培地で培養した。 培養液から細胞を遠心分離 （1 5, 0009 X 1 0分、 4 ^° 〇 により除去した培養上清を取得し、 得られた分画を還元剤存 在下で加熱処理したあと、 303ポリアクリルアミ ド電気泳動法によりゲル 上に展開した上で、 ポリビリニデンジフルオライ ド （ 〇 ） 膜に電気的 に転写し、 5%スキムミルクを含む丁巳 3 -丁溶液 （〇. 1 %Twe e n -

20、 塩化ナトリウム、 50〇11\/1 丁 1^ 1 3 -1 ^~ 1〇 1、 1 ^~ 17.

5） と室温で 1時間反応させてから、 野生型と変異型の両方を認識する抗体

（ウサギモノクローナル抗体口 3巳 6,

31 # 1 2238） あるいは、 変異型のカルボキシル末端配列を認識する市 販の抗体 （マウスモノクローナル抗体〇八 !_ 2,

0 I 八一〇八1_— 250） を含む 5 %巳 3八/丁巳 3—丁溶液と 4 °〇にお いて一晚反応させた。 丁巳 3_丁溶液による洗浄を行なった後、 ペルオキシ ダーゼ標識された抗ウサギ丨 9◦抗体 （S a n t a

〇-2030） あるいはペルオキシダーゼ標識された抗マウ ス 丨 抗体 （

3311 I 3 2005） を含む 5%スキムミルク

/丁巳3_丁溶液中において、 室温で 1時間反応を行なった。 〇 膜を 丁巳3_丁溶液で洗浄した後に、 ペルオキシダーゼ発光試薬 （丁 ₆ 「 〇 I 3（16 「 3〇 I 61^ 1: I 干 I 〇社〇 3 #34094） と反応させ て得られたシグナルを、 II 3 丨 〇 撮像装置 （\/ 丨 丨 匕 6 「一 !_〇リ 「〇1 3 I 社製） を使用して検出した。

[0042] アミノ末端のシグナル配列の下流にヒスチジ ンタグを揷入した口 6 丨 5

2型の変異型 0 1_ 蛋白質を、 1 ^~ 1 293丁細胞内で発現させて、 分泌 された変異型〇 !_ [¾蛋白質を含む培養上清を遠心分離 （1 5, 0009 X 1 〇分、 4°〇 により調製した。 得られた上清を 1 ^~ 1 丨 3丁 「 ₃ カラム （◦ 巳ヘルスケア社〇 31 # 1 753 1 901） にアプライし、 20 1\/1イミダ ゾールを含有する精製バッファー (0. 3M塩化ナトリウム、 25 mM T r i s— HC I、 p H 7. 4) でカラムを洗浄後、 50mMイミダゾールを 含有する精製バッファーを用いて変異型 C A L R蛋白質を精製した。 精製蛋 白質は、 2— n i t r o— 5— t h i o c y a n o b e n z o i c a c i d (NTCB) と反応させることでシステイン残基をシアノ 化した後、 アル カリ性条件下で断片化した後、 マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行 時間型質量分析計を用いて、 蛋白質断片の質量を同定し、 D e I 52型の 変異型 C A L R蛋白質のぺプチド配列情報から、 切断部位を決定した。

[0043] アミノ末端のシグナル配列の下流に F LAGタグで標識、 あるいは、 カル ボキシル末端を F LAGタグで標識した D e 丨 52型あるいは I n s 5 型の変異型 C A L R蛋白質を、 UT— 7/T PO細胞において発現させ、 ウ シ胎児非働化血清 1 〇%を含む丨 s c o v e’ s Mo d i f i e d D u I b e c c o’ s ( I M D M) 培地を用いて、 5 %C〇 ₂ 存在下において 37 で培養した。 増殖期の細胞 1 X 1 0 ⁵ 個を P B S (1 37 m M塩化ナトリウ ム、 27 mM塩化カリウムを含むリン酸緩液) で洗浄後に 2% F BS/P BS溶液中で、 マウス抗 DYKDDDDK t a g抗体 (富士フイルム和光 純薬社 C a t #01 4-22383) あるいは、 切断部位よりもアミノ末端 側を認識するラッ ト抗変異型 C A L R抗体と、 氷上で 30分間反応させた。 反応後、 2%F BS/P BS溶液を用いて細胞を洗浄したあと、 2次抗体と して、 それぞれ抗マウス I g G— A l e x a F l u o r 647 (T h e r mo F i s h e r S c i e n t i f i c社 C a t #A 2 1 235) と 抗ラッ ト I g G— A l e x a F l u o r 647 (T h e r mo F i s h e r S c i e n t i f i c社 C a t #A2 1 247) を 2%F BS/P B S溶液中において氷上で 30分間反応させた。 反応終了後に遠心により回 収した細胞に、 2%パラホルムアルデヒドを含む P B S溶液を、 氷上で 1 5 分反応させた。 最後に、 2%F BS/P BS溶液を加えてから、 遠心分離 ( 400 g X5分、 4 ^° C) し、 上清を廃棄することで細胞を洗浄し、 2 % F B S/P B S溶液を 300 M L加え、 FACS C a l i b u r (B D b i o s c i e n c e s社製） を用いてフローサイ トメ トリー解析により、 シグ ナルを定量した。

[0044] ヒト末梢血単核球細胞は、 凝固防止剤の含まれるスピッツ管に採血され た 末梢血を遠心分離 （500 g X 1 0分、 4 ^° C） して得られる細胞画分を P B S溶液に懸濁した上で、 リンパ球分離液 L ym p h o s e p （MP b i o me d i c a l s社 C a t # 1 1 44481 5） の上に重層し、 遠心分離 （ 1 500 r pmX30分、 室温） することでバフィーコートを取得した。 得 られたバフィーコートに P BS溶液を加え、 再懸濁した後、 遠心分離 （1 5 〇〇 r pmX 1 0分、 室温） し、 上清を除去することで、 末梢血単核球細胞 を取得した。 得られた細胞を R 丨 PA溶液 （1 50mM塩化ナトリウム、 1 mM E DTA、 1 %N P-40、 1 %デオキシコール酸ナトリウム、 2 m Mオルトバナジン （V） 酸ナトリウム、 1 OmM /S-グリセロリン酸、 1 g/mLアプロチニン、 2 g/mL E— 64、 l yLt g/m Lロイぺプ チン、 0. 67 g /m Lベスタチン、 0. 67 g /m Lぺプスタチン、

43. 5 M g/m L PMS F、 20 mM T r i s -HC I、 p H 7. 4 ） に懸濁した後、 超音波破砕してから、 遠心分離 （1 5000 g X l 5分、 4 ^° 〇 して上清を回収し、 細胞抽出液を調製した。 得られた細胞抽出液を還 元剤存在下で加熱処理したあと、 S D Sポリアクリルアミ ド電気泳動法によ りゲル上に展開した上で、 ポリピリニデンジフルオライ ド （ P V D F） 膜に 電気的に転写し、 5%スキムミルクを含む丁巳3_丁溶液と室温で1� ��間反 応させてから、 切断部位よりもアミノ末端側を認識するラッ ト抗変異型 CA L R抗体を含む 5%BS A/T BS— T溶液と 4°Cにおいて一晚反応させた 。 T BS— T溶液による洗浄を行なった後、 ペルオキシダーゼ標識された抗 ラッ ト I g G抗体 （S a n t a C r u z社 C a t # s c— 2006） を含 む 5%スキムミルク/丁巳3_丁溶液と室温で1時間反 応を行なった。 PV D F膜を T BS— T溶液で洗浄した後に、 ペルオキシダーゼ発光試薬と反応 させて得られたシグナルを、 F U S I ON撮像装置を使用して検出した。

[0045] 血小板は、 E DT Aを含むスピッツ管に採血された末梢血を遠� �分離 （ 5 00 g X 1 0分、 4 ^° C） して得られる上清を、 遠心分離 （200 OX g、 1 5分、 4 ^° 〇 して得られた沈殿物を、 血小板洗浄溶液 （1 OmMクエン酸ナ トリウム、 1 50 mM塩化ナトリウム、 1 mM E DTA、 1 %デキストロ —ス、 p H 7. 4） 50 O M Lで 2回リンスすることで調製した。 得られた 血小板を R 丨 P A溶液に懸濁した後、 超音波破砕してから、 遠心分離 （1 5 000 g X l 5分、 4 ^° 〇 して上清を回収し、 細胞抽出液を調製した。 得ら れた細胞抽出液を還元剤存在下で加熱処理し たあと、 S D Sポリアクリルア ミ ド電気泳動法によりゲル上に展開した上で、 ポリビリニデンジフルオライ ド （PVD F） 膜に電気的に転写し、 5%スキムミルクを含む丁巳3_丁溶 液と室温で 1時間反応させてから、 切断部位よりもアミノ末端側を認識する ラッ ト抗変異型 CAL R抗体 （B3抗体） を含む 5%BSA/T BS_ H§ 液と 4 °Cにおいて一晚反応させた。 T B S _ T溶液による洗浄を行なった後 、 ペルオキシダーゼ標識された抗ラッ ト 丨 g G抗体 （S a n t a C r u z 社 C a t # s c— 2006） を含む 5 %スキムミルク/ T B S— T溶液と室 温で 1時間反応を行なった。 P V D F膜を T B S _ T溶液で洗浄した後に、 ペルオキシダーゼ発光試薬と反応させて得ら れたシグナルを、 F US I ON 撮像装置を使用して検出した。

[0046] （2） 結果

ヒト巨核芽球性白血病細胞株 U T_ 7/T P〇に、 D e l 52あるいは I n s 5型の変異型 C A L R蛋白質を発現させることで腫瘍性に増殖す� � U T- 7/T P O/C A L R D e l 52、 U T- 7/T P O/C A L R I n s 5細胞と、 コントロールとして野生型 C A L Rを発現させた U T -7/T PO/CAL R （WT） 、 遺伝子導入に使用したベクターのみを導 入した UT_7/T P〇/v e cの培養上清中に含まれる C A L R蛋白質を 、 野生型と変異型の両方を認識する抗体 （モノクローナル抗体 D3 E 6, C e l l S i g n a l i n g社 C a t # 1 2238） と、 変異型のカルボキ シル末端配列を認識する市販の抗体 （モノクローナル抗体 C A L 2, D i a n o v a社 C a t # D I A-CAL-250） で評価した （図 2） 。 その \¥02020/175689 24 卩（：171?2020/008434

結果、 図 2に示すように、 野生型と変異型 0 蛋白質を認識する抗体 （ 巳3抗体） を用いたイムノブロッ トにおいて、 変異型〇八 1_ 蛋白質を発現 する細胞では、 内在性の の他に、 変異型抗体で認識できないバンド が検出された （図 3） 。

[0047] 1\1丁〇巳を用いてシステイン残基のアミノ末 端側で断片化したペプチド断 片のうち、 変異型 蛋白質 I 5 2型を使用） の切断型にのみ 見出されたペプチド断片の分子量として、 2 5 8 2 7 . 7と 2 5 4 1 8 . 4 を得た。 この数値と、 切断されたシステイン残基の位置から求めた 推定分子 量を比較することで、 〇 ø I 5 2型の変異型 0 蛋白質の切断部位と して、 3 8〇番目のメチオニン残基と 3 8 1番目のアルギニン残基の間と、

3 7 7番目のメチオニン残基と 3 7 8番目のアルギニン残基の間、 を同定し た。

[0048] アミノ末端のシグナル配列の下流に !_八〇タグで標識、 あるいは、 カル ボキシル末端を !_八〇タグで標識した 0 6 丨 5 2型あるいは丨 n s 5 型の変異型 0 蛋白質を、 リ丁ーァ/丁 〇細胞において発現させ、 細 胞表面における、 変異型 0 蛋白質の発現について、 抗 !_ 〇抗体を 用いたフローサイ トメ トリー解析を行うと、 アミノ末端の !_八〇タグを有 する変異型 0 蛋白質を発現する細胞では、 カルボキシル末端を !_八 ◦タグ標識した変異型 0 蛋白質を発現する細胞に比べて、 より強いシ グナルが得られた （図 4、 5） 。 次に、 切断部位よりもアミノ末端側で、 か つ変異型〇 !_ 蛋白質に特異的な配列を含むぺプチドを免疫 して得られた 抗体を用いて、 図 4、 5の解析に用いた細胞株のフローサイ トメ トリー解析 を行うと、 !_八〇タグの付加位置による検出量の違いが� ��失した （図 6、 7） 。 これにより、 変異型〇八 蛋白質に特異的な配列中で切断されて残 存するカルボキシル末端側に抗原認識部位を 設定することが、 より高感度な 検査薬あるいは、 より強力な治療薬の創作に重要であることが 示された。

[0049] 実際に、 切断部位よりもアミノ末端側の変異型 特異的抗体を用い て、 0 !_ 遺伝子変異陽性の患者から得られた末梢血単 核球や血小板の細 胞抽出液をイムノブロッ ト法を用いて解析したところ、 細胞株の場合と同様 に、 切断された変異型 C A L R蛋白質の発現が確認された （図 8） 。 これら のことから、 実際に、 患者細胞でも、 同様の切断が生じていること、 切断さ れて残存するカルボキシル末端側に抗原認識 部位を設定することが、 より高 感度な検査薬あるいは、 より強力な治療薬の創作に重要であることが 示され た。

[0050] [試験例 2 ]

（1） 3種の抗体が、 全長型と切断型の変異型 C A L R蛋白質を認識するこ との確認

アミノ末端のシグナル配列の下流に F LAGタグを揷入した D e 丨 52 型あるいは丨 n s 5型の変異型 C A L R蛋白質を発現する U T_ 7/T P 〇細胞を培養し、 分泌された変異型 C A L R蛋白質を含む培養上清を遠心分 離 （1 , 600 g X5分、 4°〇 により調製した。 得られた培養上清を S D Sと還元剤存在下で加熱処理したあと、 S DSポリアクリルアミ ド電気泳動 法によりゲル上に展開した上で、 ポリピリニデンジフルオライ ド （ P V D F ） 膜に電気的に転写し、 5%スキムミルクを含む丁巳3_丁溶液と室温で1 時間反応させてから、 ラッ トクローン B 3、 C6、 G 1抗体、 あるいはマウ ス抗 DYKDDDDK t a g抗体 （富士フイルム和光純薬社 C a t # 01 4-22383） を含む 5%BS A/T BS— T溶液と 4°Cにおいて一晚反 応させた。 T BS— T溶液による洗浄を行なった後、 それぞれ、 ペルオキシ ダーゼ標識されたヤギ抗ラッ ト I g G抗体 （J a c k s o n I mm u n o R e s e a r c h I n c . 社 C a t # 1 1 2— 035— 003） 、 ある いはペルオキシダーゼ標識されたヤギ抗マウ ス 丨 g G抗体 （J a c k s o n I mm u n o R e s e a r c h I n c. 社 C a t # 1 1 5— 035— 003） を含む 5 %スキムミルク /T BS— T溶液と室温で 1時間反応を行 なった。 PVD F膜を T BS— T溶液で洗浄した後に、 ペルオキシダーゼ発 光試薬と反応させて得られたシグナルを、 F US I ON撮像装置を使用して 検出した。 その結果、 図 9に示すように、 クローン B 3、 C6、 G 1抗体いずれも全 長型と切断型の変異型 C A L R蛋白質を認識することが確認された。

[0051] (2) 3種の抗体が、 細胞表面の変異型 C A L R蛋白質を認識することの確 認

アミノ末端のシグナル配列の下流に F LAGタグで標識した D e 丨 52 型あるいは丨 n s 5型の変異型 C A L R蛋白質を、 UT—7/T PO細胞 において発現させ、 ウシ胎児非働化血清 1 0%を含む丨 M DM培地を用いて 、 5%C〇 2存在下において 37 ^° Cで培養した。 増殖期の細胞 1 X 1 〇 ⁵ 個を P BSで洗浄後に 2% F BS/P BS溶液中で、 マウス抗 DYKDDDD K t a g抗体 (富士フイルム和光純薬社 C a t #01 4— 22383) あ るいは、 ラッ トクローン B 3、 C6、 G 1抗体と、 氷上で 30分間反応させ た。 反応後、 2%F BS/P BS溶液を用いて細胞を洗浄したあと、 2次抗 体として、 それぞれ抗マウス I g G-A l e x a F l u o r 647 (T h e r mo F i s h e r S c i e n t i f i c社 C a t #A 2 1 235 ) と抗ラッ ト l g G ^_ A l e x a F l u o r 647 (T h e r mo F i s h e r S c i e n t i f i c社 C a t #A2 1 247) を 2% F B S/P B S溶液中において氷上で 30分間反応させた。 反応終了後に遠心に より回収した細胞に、 4%パラホルムアルデヒドを含む P B S溶液を、 氷上 で 1 5分反応させた。 最後に、 2%F BS/P BS溶液を加えてから、 遠心 分離 (400 g X5分、 4°C) し、 上清を廃棄することで細胞を洗浄し、 2 %F B S/P B S溶液を 300 M L加え、 FACS C a l i b u r (B D b i o s c i e n c e s社製) を用いてフローサイ トメ トリー解析により 、 シグナルを定量した。

その結果、 図 1 0に示すように、 クローン B 3、 C6、 G 1抗体いずれも 、 細胞表面の変異型 C A L R蛋白質を認識することが確認された。

[0052] [試験例 3]

(抗体の抗原結合力の評価)

(1 ) E L I S Aによる抗原結合力の評価 1 ウエル当たり精製した 1 00 n gの D e 丨 52型の変異型 C A L R蛋 白質、 あるいはコントロールの B S Aを吸着させた E L 丨 S Aプレート （住 友べークライ ト C a t #MS - 8896 F） を、 5 m g/m L BSAを 含む P B Sで室温において 1時間反応させた。 P B Sでウエルを洗浄したの ち、 0、 6. 25、 1 2. 5、 25、 50、 1 00、 200、 400、 80 O n g/mLのクローン B3、 C6、 G 1抗体、 あるいはラッ ト I g G （S a n t a C r u z社 C a t # 2026） と 5 m g/mL BSAを含む P B Sを、 室温で 1時間反応させた。 P B Sでウエルを洗浄したのち、 1 6 n g /m Lのペルオキシダーゼ標識されたヤギ抗ラッ ト I g G抗体 （J a c k s o n I mm u n o R e s e a r c h I n c. 社 C a t # 1 1 2— 0 35— 003） と 5 m g/mL BSAを含む P B Sを、 室温で 1時間反応 させた。 T BS— T溶液でウエルを洗浄したのち、 TMB溶液 （ナカライテ スク C a t # 05298— 80） を添加して、 室温で 1 5分間反応させて から、 1 M硫酸水溶液を添加し、 450 n mと 620 n mの吸光度を測定し 、 吸光度の差を求めた上で、 コントロールの B S Aで得られた値を減じた値 を算出した。

その結果、 図 1 1 に示すように、 本発明の抗体 （B3、 C6、 G 1） は、 いずれも変異型 C A L R蛋白質と低濃度から結合することがわかる� �

[0053] （2） 表面プラズモン共鳴解析による抗原結合力の 評価

表面プラズモン共鳴解析装置 B i a c o r e T 200 （G Eヘルスケア 社） に表面プラズモン共鳴解析用のセンサーチッ プ （GEヘルスケア社 C a t # B R 1 00530） を装填してから、 H BS-E Pバッファー （GEへ ルスケア社 C a t # B R 1 00669） で平衡化した。 Ac e t a t e 5 . 5 （G Eヘルスケア社 C a t # B R 1 00352） で 1 O^g/mLの濃 度に調製したクローン B 3抗体を、 Am i n e c o u p l i n g k i t （G Eヘルスケア社 C a t # B R 1 00050） を用いて、 固定化量が 20 0 R Uとなるよう固定化した。 続いて、 H BS— E Pバッファーにより 20 、 1 0、 5、 2. 5、 1. 25 n Mの濃度に調製した、 配列番号 1 に含まれ るアミノ酸配列 （R RMMRTKMR） のアミノ末端にシステインを付加し たべプチドを用いて、 表面プラズモン共鳴を測定し、 B i a c o r e T 20 0 E v a l u a t i o n S o f t wa r eにより解離定数を取得した。 その結果、 図 1 2に示すように、 本発明の抗体は、 変異型 CAL R蛋白質 と強力に結合することがわかる。

[0054] [試験例 4]

（抗体の抗原認識部位の同定）

クローン B 3、 C6、 G 1抗体が C A L R変異蛋白質上で抗原に用いたア ミノ酸配列を認識することを確認した。 抗原に用いたアミノ酸とその周辺の アミノ酸を 1つずつアラニンに置換した変異型 C A L R蛋白質に対するそれ それの抗体の反応性をイムノブロッ ト法 （図 1 3 A） と E L 丨 S A法 （図 1 3 B） を用いて評価した。

[0055] （1） イムノブロッ ト法

D e l 52型の変異型 C A L R蛋白質の 367番目のスレオニン （T） から 378番目のアルギニン （R） までの領域のアミノ酸を、 1 アミノ酸ず つアラニン （A） に置換した蛋白質、 あるいは置換を行わなかった蛋白質を H E K 293 T細胞内で発現させて、 分泌された変異型 C A L R蛋白質を含 む培養上清を遠心分離 （ 1 , 600 g X5分、 4 ^° 〇 により調製した。 得ら れた蛋白質溶液を、 S DSと還元剤存在下で加熱処理したあと、 S DSポリ アクリルアミ ド電気泳動法によりゲル上に展開した上で、 P V D F膜に電気 的に転写し、 5%スキムミルクを含む丁巳3_丁溶液と室温で1� ��間反応さ せてから、 ペルオキシダーゼ標識したクローン B 3、 C6、 G 1抗体あるい は、 マウス抗 C A L R抗体 （a b c a m社 C a t # a b 22683） を含む 5%BS A/T BS— T溶液と 4°Cにおいて一晚反応させた。 マウス抗 CA L R抗体と反応させた P VD F膜は、 T BS— T溶液による洗浄を行なった 後、 ペルオキシダーゼ標識された抗マウス 丨 g G抗体 （J a c k s o n I mm u n o R e s e a r c h I n c. 社 C a t # 1 1 5— 035— 00 3） を含む 5 %スキムミルク /T BS— T溶液中において、 室温で 1時間反 応を行なった。 続いて、 すべての PVD F膜を T BS— T溶液で洗浄した後 に、 ペルオキシダーゼ発光試薬 (T h e r mo F i s h e r S c i e n t i f i c社 C a t # 34094) と反応させて得られたシグナルを、 F U S I 0 N撮像装置 (V i I b e r-L o u r m a t社製) を使用して検出し た。

その結果、 図 1 3 Aに示すように、 本発明の抗体が、 配列番号 1の 1番目 のアルギニンから 9番目のアルギニンの間を認識していること� �わかる。

[0056] (2) E L I S A法

上記の方法で調製した変異型 C A L R蛋白質を吸着させた E L 丨 SAプレ —卜を、 5 m g/mL B S Aを含む P B Sで室温において 1時間反応させ た。 P B Sでウエルを洗浄したのち、 200 n g/m Lのクローン B 3、 C 6、 G 1抗体、 あるいはマウス抗 C A L R抗体 (S a n t a 〇 「リ å社〇 a t # s c- 373863) と 5 m g/mL BS Aを含む P BSを、 室温 で 1時間反応させた。 P B Sでウエルを洗浄したのち、 1 6 n g/mLのぺ ルオキシダーゼ標識されたヤギ抗ラッ ト I g G抗体 (J a c k s o n I m m u n o R e s e a r c h I n c. 社 C a t # 1 1 2— 035— 003 ) あるいはヤギ抗マウス I g G抗体 (S a n t a C r u z社 C a t # s c — 2005) と 5 m g/mL B S Aを含む P B Sを、 室温で 1時間反応さ せた。 T BS— T溶液でウエルを洗浄したのち、 T MB溶液を添加して、 室 温で 1 5分間反応させてから、 1 M硫酸水溶液を添加し、 450 n mと 62 O n mの吸光度を測定し、 吸光度の差を求めた。

その結果、 図 1 3 Bに示すように、 本発明の抗体が、 配列番号 1の 1番目 のアルギニンから 9番目のアルギニンの間を認識していること� �わかる。

[0057] [試験例 5 ]

(本発明抗体の配列情報の決定)

本発明の抗体 (B3、 C6、 G 1 ) の重鎖及び軽鎖の配列情報を、 抗体を 産生する細胞から、 P u r e L i n c RNA M i n i キッ ト (T h e r mo F i s h e r社 C a t # 1 2 1 83025) を使用して、 m R N Aを調 製した。 得られた mRN Aを錶型に、 重鎖あるいは軽鎖特異的な逆転写ブラ イマーを用いて、 R a p i d am p l i f i c a t i o n o f c DN A e n d s法により c D N Aを合成した後、 プラスミ ドにクローニングし た。 得られたプラスミ ドをサンガーシークエンス解析することで、 重鎖と軽 鎖の c DN Aの全長配列を決定した。

その結果を、 図 1 4〜図 1 7及び配列番号 5〜 34に示す。

[0058] 図 1 4は、 本発明抗体 （B3、 C6、 G 1） の重鎖可変領域のアミノ酸配 列を示す。 図 1 5は、 本発明抗体 （B3、 C6、 G 1） の軽鎖可変領域のア ミノ酸配列を示す。 図 1 6は、 本発明抗体 （B3、 C6、 G 1） の重鎖可変 領域の塩基配列を示す。 図 1 7は、 本発明抗体 （B3、 C6、 G 1） の軽鎖 可変領域の塩基配列を示す。

[0059] 配列番号 5は、 B 3抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列を示す� � 配列番号

6は、 C 6抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列を示す� � 配列番号 7は、 G 1 抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列を示す。 配列番号 8は、 B 3抗体の軽鎖 可変領域のアミノ酸配列を示す。 配列番号 9は、 C 6抗体の軽鎖可変領域の アミノ酸配列を示す。 配列番号 1 0は、 G 1抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸 配列を示す。

配列番号 1 1は、 B 3抗体の重鎖可変領域の塩基配列を示す。 配列番号 1 2は、 C 6抗体の重鎖可変領域の塩基配列を示す。 配列番号 1 3は、 G 1抗 体の重鎖可変領域の塩基配列を示す。 配列番号 1 4は、 B 3抗体の軽鎖可変 領域の塩基配列を示す。 配列番号 1 5は、 C 6抗体の軽鎖可変領域の塩基配 列を示す。 配列番号 1 6は、 G 1抗体の軽鎖可変領域の塩基配列を示す。

[0060] 配列番号 1 7は、 B 3抗体の V Hの C D R 1のアミノ酸配列を示す。 配列 番号 1 8は、 B 3抗体の V Hの C D R 2のアミノ酸配列を示す。 配列番号 1 9は、 B 3抗体の V Hの C D R 3のアミノ酸配列を示す。 配列番号 20は、

C 6抗体の V Hの C D R 1のアミノ酸配列を示す。 配列番号 2 1は、 C6抗 体の V Hの C D R 2のアミノ酸配列を示す。 配列番号 22は、 C6抗体の V Hの C D R 3のアミノ酸配列を示す。 配列番号 23は、 〇 1抗体の 1 ^~ 1の〇 D R 1のアミノ酸配列を示す。 配列番号 24は、 〇 1抗体の 1 ^~ 1の〇〇 [¾ 2 のアミノ酸配列を示す。 配列番号 25は、 G 1抗体の V Hの C D R 3のアミ ノ酸配列を示す。 配列番号 26は、 B 3抗体の VLの CD R 1のアミノ酸配 列を示す。 配列番号 27は、 B 3抗体の V Lの C D R 2のアミノ酸配列を示 す。 配列番号 28は、 B 3抗体の V Lの C D R 3のアミノ酸配列を示す。 配 列番号 29は、 C 6抗体の V Lの C D R 1のアミノ酸配列を示す。 配列番号 30は、 C 6抗体の V Lの C D R 2のアミノ酸配列を示す。 配列番号 3 1は 、 C 6抗体の V Lの C D R 3のアミノ酸配列を示す。 配列番号 32は、 G 1 抗体の VLの CD R 1のアミノ酸配列を示す。 配列番号 33は、 G 1抗体の V Lの C D R 2のアミノ酸配列を示す。 配列番号 34は、 〇 1抗体の 1_の CD R 3のアミノ酸配列を示す。

[0061] [試験例 6]

(治療効果の評価)

クローン B 3抗体の重鎖と軽鎖の可変領域と、 対応するマウス 丨 g G2 a の重鎖と軽鎖の定常領域を融合したキメラ B 3抗体を作成し、 D e l 52 型の C A L R変異遺伝子を発現する造血幹細胞を移植し� �作出した骨髄増殖 性腫瘍モデルマウスに投与し、 キメラ抗体による治療効果を評価した。

クローン B 3抗体の重鎖可変領域とマウス 丨 g G 2 aの定常領域をコード する遺伝子配列あるいは、 クローン B 3抗体の軽鎖可変領域とマウイムノグ ロプリン Kの定常領域をコードする遺伝子配列を連結� �て、 B 3マウスキメ ラ重鎖と軽鎖遺伝子を組み込んだ発現べクタ ーを、 E x p i CHO—S細胞 (T h e r mo F i s h e r社 C a t #A29 1 27) に導入し、 E x p i CH〇 E x p r e s s i o n培地 (T h e r mo F i s h e r社 C a t #

A 29 1 0001 ) を用いて、 5%〇〇 ₂ 存在下において37°〇で、 1 0日培 養した。 遠心分離 (4, 000 g X30分、 4 ^° 〇 により培養上清を回収し てから、 H i T r a p P r o t e i n G H Pカラム (G Eヘルスケア社 C a t # 29048581 ) にキメラ抗体を吸着させたあと、 0. 1 M G l y c i n e-HC I (p H 2. 7) を用いて溶出し、 1 M T r i s -H \¥02020/175689 32 卩（：171?2020/008434

〇 1 （ 1 ^~ 1 9. 0） により中和した溶出画分を、 巳3に透析して巳3マ ウスキメラ抗体を調製した。

巳 3マウスキメラ抗体による治療効果の評価に� �、 骨髄移植モデルマウス を用いた。 8から 1 0週齢の巳 6. 0045. 1 コンジエニックマウス （三 協ラボ） の大腿骨から骨髄細胞を精製し、 ?（3標識抗〇_ !＜ 丨 1抗体で標 識される〇— 1＜ 丨 1:陽性細胞を分取してから、 1 9、 004, 00 8、 0036, 001 1 匕陰性で、 001 1 7と 3 〇 3 1陽性の !_ 3＜細胞を分取し、 0 ø I 52型の変異型

を発現す ベクター、 あるいはコントロール のべクタ—を包含するレトロウイルスを感染 させた。 感染 72時間後に、 1 匹あたり 4000個の !_ 3＜細胞を、 6グレイ X 2回の放射線を照射した 8 から 1 0週齢の〇57巳 !_/6」マウス （オリエンタル酵母） に移植し、 末 梢血中の血小板数を多項目自動血球計数装置 （シスメックス社 Ca t # p 〇〇 1 ^~ 1- 1 00 1 干 †） により経時的に測定し、 移植 2ヶ月目に、 変異型 0 1_ 遺伝子の発現により引き起こされる骨髄増殖 性腫瘍の表現型 である血小板増多を確認してから、 移植後 9週目より毎週、 上記の巳 3マウ スキメラ抗体を 1匹あたり 250 9、 あるいは溶媒 （ 巳3） を投与し、 巳 3マウスキメラ抗体に特異的な血小板増多の� �制効果を評価した。

その結果、 図 1 8に示すように、 本発明抗体は、 に対して優れた治 療効果を示した。