Die vorliegende Erfindung betrifft rekombinante chimäre Proteine, die eine Nuklein- säuresyntheseaktivität aufweisen, diese enthaltende Komplexe, für diese codierende Nukleinsäuren, diese enthaltende Vektoren und Zellen, einen dagegen gerichteten Antikörper, Verwendungen dieser Proteine, diese enthaltende Kits sowie Verfahren zur Elongation, Amplifikation, reversen Transkription, Sequenzierung und Markierung von Nukleinsäuren.

Viele Proteine liegen in der Zelle nicht als Monomere vor, sondern sind Teil eines funktionellen multimeren Komplexes. Beispiele für solche Komplexe sind in fast allen Bereichen der Zellbiologie beschrieben (z. B. Transkription, Translation, Replikation, Zytoskelett, Signaltransduktion, mRNA processing).

Die Wechselwirkung oder Bindung eines Proteins mit einem oder an ein anderes Protein, hierin im folgenden Donorprotein und Akzeptorprotein genannt, erfolgt über bestimmte Aminosäuren oder Aminosäuresequenzen, die im gefalteten Protein meist an der Oberflache des Proteins liegen und für die spezifische Bindung oder Wech- selwirkung an oder mit dem Partner verantwortlich sind. Diese Aminosäuren bzw. eine solche Aminosäuresequenz wird hierin im folgenden als"Wechselwirkung- bedingende Sequenz"oder Wechselwirkung-vermittelnde Sequenz bezeichnet. Den

Fachleuten ist dabei bekannt, daß die Aminosäuren, die an der Ausbildung einer Wechselwirkung beteiligt sind, nicht notwendigerweise in der primären Aminosäure- sequenz unmittelbar aufeinanderfolgen, sondern ggf. mehr oder weniger stark kon- servierte Positionen innerhalb der Aminosäuresequenz des Proteins oder Peptids dafür verantwortlich zeichnen. Wenn hierin im folgenden von der Ermittlung der Wechselwirkung vermittelnden oder Wechselwirkung bedingenden Sequenz gespro- chen wird, sollen damit beide vorstehend genannten Aspekte verstanden werden. In diesem Zusammenhang sind als Donorproteine solche Proteine zu verstehen, die mit einem weiteren Protein interagieren und gegebenenfalls ein weiteres Protein binden.

Gleichermaßen sind als Akzeptorproteine solche Proteine zu verstehen, die mit ei- nem weiteren Protein interagieren und gegebenenfalls ein weiteres Protein binden Es gibt eine Reihe von Methoden, um die Wechselwirkung-bedingende Sequenz ei- ner Protein-Protein-Interaktionsstelle zu ermitteln. Dazu gehört (i) die Bestimmung der dreidimensionalen Struktur eines Komplexes aus Donor-und/oder Akzeptorpro- tein durch Röntgenstrukturanalyse oder (ii) NMR-Methoden. Eine weitere Methode ist (iii) eine Komplexbindung in vitro mit rekombinanten Proteinen zu rekonstituieren und durch gezielte Veränderung des Donor-oder Akzeptorproteins die Wechselwir- kung-bedingende (n) Sequenz (en) zu ermitteln. Solche gezieiten Veränderungen be- inhalten die Mutation von einzelnen Aminosäuren, zum Beispiel zu Alanin (Alanin- scanning) oder die Deletion von Sequenzen im Protein. Führt die Veränderung oder Deletion einer Aminosäure oder Sequenz zum Verlust der Wechselwirkungs-oder Bindeaktivität, so ist sie Teil der Wechselwirkung-bedingende Sequenz, und umge- kehrt, führt die Veränderung oder Deletion einer Aminosäure oder Sequenz nicht zum Verlust der Wechselwirkungs-oder Bindeaktivität so ist sie nicht Teil der Wech- selwirkung-bedingende Sequenz. Auf diese Art und Weise faßt sich die Wechselwir- kung-bedingende Sequenz definieren.

Eine weitere Methode zur Bestimmung der Wechselwirkung-bedingende Sequenz eines Proteins beruht auf der Verwendung eines Zweihybridsystems, hierin im fol- genden auch als"Y2H"abgekürzt. Y2H Systeme beruhen darauf, daß man ein Pro-

tein mit einer nachweisbaren Aktivität (wie z. B. das Enzym"Dihydrofolatreduktase") als zwei nicht kovalent miteinander verbundene Teile exprimiert. Dieses Protein ist inaktiv, wenn die beiden Teile sich nicht in räumlicher Nähe zu einander befinden.

Die beiden zu untersuchenden Proteine, von denen man weiß, daß oder untersuchen möchte, ob sie miteinander in Wechselwirkung treten und somit einen Komplex aus- bilden können, d. h. Donorprotein und Akzeptorprotein, werden unter Ausbildung je- weils eines Fusionsproteins mit jeweils einem der beiden Teile des Proteins mit der nachweisbaren Aktivität (wie z. B. Dihydrofolatreduktase) fusioniert und exprimiert so daß zwei Fusionsproteine entstehen. Wenn das fusionierte Donorprotein das fusio- nierte Akzeptorprotein bindet, kommen die beiden Hälften des nachweisbaren Pro- teins (wie z. B. Dihydrofolatreduktase) in räumliche Nähe zueinander. Dadurch wird die Aktivität des Proteins wiederhergestellt, die sodann nachgewiesen werden kann.

Als Proteine mit nachweisbarer Aktivität können Enzyme (Dihydrofolatreduktase, beta-Galactosidase) Signaltransduktionsproteine (Cdc25 aus Saccharomyces cere- visiae) oder Transkriptionsaktivatoren (Gal4, LexA-VP16) eingesetzt werden. Die Ermittlung der Bindungsregion mit Hilfe des Zweihybridsystems beruht auf der glei- chen Überlegung wie bei der in-vitro-Rekonstitution der Bindung : Führt die Verände- rung oder Deletion einer Aminosäure oder Sequenz zum Verlust der Bindeaktivität so ist sie Teil der Wechselwirkung-bedingende Sequenz, und umgekehrt, führt die Ver- änderung oder Deletion einer Sequenz nicht zum Verlust der Bindeaktivität so ist sie nicht Teil der Wechselwirkung-bedingende Sequenz.

Zusätzlich dazu kann man die Wechselwirkung-bedingende Sequenz darüber defi- nieren, daß eine Vielzahl von Fragmenten des Proteins bezüglich ihrer Interaktion untersucht und bestimmt wird, welche Teile des Proteins in den interagierenden oder wechselwirkenden Fragmenten immer vorhanden sind. Dieser stets vorhandene Be- reich ist die Wechselwirkung-bedingende Sequenz. Um die in einer Wechselwirkung- bedingende Sequenz für die Wechselwirkung oder Bindung wesentlichen Aminosäu- ren zu identifizieren, kann man durch gezielte Mutationen einzelne Aminosäuren ver- ändern. Verlust oder Erhöhung der Bindeaktivität weisen darauf hin, daß diese Posi- tionen direkt an der Wechselwirkung beteiligt sind.

Unter den für in vitro Anwendungen besonders bevorzugten Komplexen gehören die thermostabilen Komplexe prokaryontischer und eukaryontischer Replikationsappa- rate, die als wichtige Enzymaktivität häufig Polymerasen beinhalten.

Wie eingangs erwähnt spielt die Wechselwirkung zwischen Proteinen in vivo eine große Rolle, so z. B bei der Replikation der Nukleinsäure in biologischen Systemen. So sind hochprozessive Replikationsmechanismen bekannt, wobei es sich dabei zum einen um zelluläre Mechanismen und zum anderen um die bei den Bakteriophagen T4 und 10 T7 auftretetenden Repliaktionsmechanismen handelt.

Der Replikationsapparat umfaßt eine Vielzahl von Komponenten. Dazu gehören, unter anderem, a) Polymeraseaktivität aufweisende Proteine, b) Proteine, die an der Ausbildung einer Klammerstruktur beteiligt sind, wobei der Klammerstruktur unter anderem die Aufgabe zukommt, eine Polymeraseaktivität an ihr Template oder Matri- ze zu binden und die Bindung zu stabilisieren und somit die Dissoziationskonstante des Komplexes aus Polymerase und Nukleinsäure entsprechend zu ändern, c) Pro- teine, welche die Klammer auf das Template laden, d) Proteine, welche das Tem- plate stabilisieren und gegebenenfalls e) Proteine, welche die Polymerase an das 20 Template führen.

Unter Polymeraseaktivität aufweisenden Proteinen werden hierin insbesondere sol- che Proteine verstanden, die ein oder mehrere Nukleotide oder Nukleoside an ein Nukleotid oder Nukleosid oder Polynukleotid oder Polynukleosid zu binden in der La- ge sind. Dabei kann es sich in einem jeden der vorstehenden Fälle um Ribunukleoti- de/Ribunukleoside oder Deoxynukleotide/Deoxynukleoside oder Polymere davon handeln. Zu diesen Proteinen gehören somit neben DNA-Polymerasen auch RNA- Polymerasen, unabhängig davon, ob für die Polymerisationsreaktion des Proteins eine Matrize benötigt wird oder nicht. Diese Polymeraseaktivität aufweisende Protei- 30 ne sind somit auch Nukleinsäuresyntheseaktivität aufweisende Proteine. Zu ihnen gehören auch die als solches im Stand der Technik bekannten Elongationsproteine.

Unter Elongationsprotein soll hierin im übrigen ein Polymeraseaktivität-aufweisendes Protein oder Komplex verstanden werden, das oder der mindestens eine oder mehrere der folgenden Eigenschaften aufweißt : Verwendung von RNA als Template, Verwen- dung von DNA als Template, Synthese von RNA, Synthese von DNA, Exonukleaseak- tivität in 5'-3'Richtung oder Exonukleaseaktivität in 3'-5'Richtung, Strangverdrän- gungsaktivität (engl. strand-displacement activity) und Prozessivität oder Nicht- Prozessivität.

DNA-Polymerasen gehören zu einer Gruppe von Enzymen, die einzelsträngige DNA als Template für die Synthese eines komplementären DNA Stranges verwenden.

Diese Enzyme spielen eine bedeutende Rolle im Nukleinsäurestoffwechsel, ein- schließlich der Prozesse DNA-Replikation, Reparatur und Rekombination. DNA- Polymerasen wurden in allen zellulären Organismen identifiziert, von bakteriellen bis zu menschlichen Zellen, in vielen Viren sowie in Bakteriophagen (Kornberg, A. & Ba- ker, T. A. (1991) DNA Replikation WH Freeman, New York, NY). Man faßt in der Re- gel die Archaebakterien und die Eubakterien zusammen zu der Gruppe der Proka- ryonten, der Organismen ohne echten Zelikern, und stellt ihnen die Eukaryonten, die Organismen mit echtem Zellkern, gegenüber. Gemeinsam sind vielen Polymerasen aus den verschiedensten Organismen oftmals Ahnlichkeiten in der Aminosäurese- quenz sowie Ahnlichkeiten in der Struktur (Wang, J., Sattar, A. K. M. A. ; Wang, C. C., Karam, J. D., Konigsberg, W. H. & Steitz, T. A. (1997) Crystal Structure of pol a familily replication DNA polymerase from bacteriophage RB69. Cell 89,1087-1099). Orga- nismen wie der Mensch besitzen eine Vielzahl von DNA-abhängigen Polymerasen, von denen jedoch nicht alle für die DNA Replikation zuständig sind, sondern einige auch DNA-Reparatur durchführen. Replikative DNA-Polymerasen bestehen in vivo meist aus Proteinkomplexen mit mehreren Einheiten, welche die Chromosomen der zellulären Organismen und Viren replizieren. Eine generelle Eigenschaft dieser repli- zierenden Polymerasen ist im allgemeinen eine hohe Prozessivität, das heißt, deren Fähigkeit, Tausende von Nukleotide zu polymerisieren ohne vom DNA Template ab-

zudissoziieren (Kornberg, A. & Baker, T. A. (1991) DNA Replikation. WH Freeman, New York, NY).

DNA-Polymerasen werden unter anderem durch zwei Eigenschaften charakterisiert, ihre Elongationsrate, das heißt die Anzahl der Nukleotide, die sie pro Sekunde in einen wachsenden DNA-Strang inkorporieren können und ihre Dissoziationskonstante. Wenn die Polymerase nach jedem Inkorporationsschritt eines Nukleotids in die wachsende Kette wieder vom Strang abdissoziiert (d. h. ein Elongationsschritt erfolgt pro Bindungs- ereignis), dann hat die Prozessivität den Wert 1 und die Polymerase ist nicht prozessiv.

Wenn die Polymerase für wiederholte Nukleinsäureinkorporationen mit dem Strang verbunden bleibt, dann wird die Elongation oder der Replikationsmodus und damit auch die Polymerase als prozessiv bezeichnet und kann einen Wert von mehreren Tausend erreichen (siehe hierzu auch : Methods in Enzymology Volume 262, DNA Replication, Edited by J. L. Campbell, Academic press 1995, pp. 270-280).

Die unter b) genannten Proteine bilden Strukturen aus, die entweder offen oder ge- schlossen sind, beispielsweise ringförmige oder halbringförmige Strukturen. Derlei Strukturen können durch eine oder mehrere Spezies von Proteinen ausgebildet wer- den. Dabei ist es möglich, daß eine der besagten Proteinspezies eine Polymerase- aktivität aufweist.

Die für die Ausbildung dieser Strukturen verantwortlichen Proteine werden, sofern sie keine Polymeraseaktivität aufweisen, hierin im folgenden als"Gleitkiammerproteine" oder"Klammerproteine"bezeichnet.

Es ist bekannt, daß der Replikationsapparat in Archaea dem eukaryontischen Replia- tionsapparat ähnlich ist, obwohl die Genomorganisation in Eukaryonten und Archaea gänzlich verschieden ist und die zelluläre Struktur der Eubakterien der der Archaea äh- nelt. (Edgell, D. R. and Doolittle, W. F. (1997). Archaea and the origin (s) of DNA replicati- on proteins. Cell 89,995-998.).

Die Gleitklammer ist häufig über ein oder mehrere weitere Proteine an ein Elongations- protein gebunden, mit anderen Worten an das Elongationsprotein gekoppelt. Ein derar- tiges koppelndes Protein wird hierin im folgenden als Kopplungsprotein bezeichnet, wobei gegebenenfalls die Kopplung über eine Mehrzahl von Kopplungsproteinen erfol- gen kann.

Die dreidimensionale Struktur von verschiedenen Gleitklammerproteinen wurde bereits bestimmt. Die Gesamtstruktur dieser Gleitklammern ist sehr ähnlich ; die Bilder der ringförmig ausgebildeten Proteingesamtstruktur von PCNA, der ß-Untereinheit und gp45 Ringe sind übereinandergelegt deckungsgleich (Kelman, Z. & O'Donnell, M.

(1995) Structural and functional similarities of prokaryotic and eukaryotic sliding clamps.

Nucleid Acids Res. 23,3613-3620). Jeder Ring hat vergleichbare Dimensionen und eine zentrale Öffnung, die groß genug ist, um Duplex-DNA, also einen DNA- Doppelstrang, bestehend aus den zwei komplementären DNA-Strängen, zu umschlie- ßen.

Die Gleitklammer kann sich in vivo nicht selbst um die DNA herum positionieren, son- dern muß um die DNA fixiert werden. In Prokaryonten und Eukaryonten besteht ein derartiger Proteinkomplex aus einer Vielzahl von Untereinheiten. Der Proteinkomplex erkennt das 3'-Ende des Primers eines"Primer-Template-Duplexes", der zu einem län- geren Doppelstrang durch Einbau von Nukleotiden ergänzt werden soll, und positio- niert die Gleitklammer um die DNA.

Im Falle des Bacteriophagen T7 wird das gleiche Ziel, eine prozessive DNA-Synthese, wie unten definiert, mittels eines strukturell anderen Proteinkomplexes erreicht. Der Phage exprimiert eine eigene katalytische Polymerase, die T7-Polymerase, die das Genprodukt des gene 5 und mit einem Protein aus dem Wirt Escherichia coli, dem Thioredoxin, eine Bindung eingeht und als Replikase eine hochprozessive DNA- Replikation ermöglicht. Auch hierbei kommt es zur Ausbildung einer Klammer, jedoch weist diese Klammer nicht die gleiche Struktur auf, wie z. B. im Falle des eukaryonti- schen PCNA.

Oft ist es nötig, wie zum Beispiel im Falle der humanen Polymerase 6, daß Proteine (Kopplungsproteine) die Verbindung zwischen dem katalytisch aktiven Teil der Polyme- rase und einem Prozessivitätsfaktor schaffen. Ein Prozessivitätsfaktor ist eine Verbin- dung oder ein Molekül, das die Prozessivität einer Polymerase beeinflußt, bevorzugter- weise erhöht. Ein Beispiel für einen Prozessivitätsfaktor stellen die Gleitklammerprotei- ne dar. Beim Menschen ist dieses Kopplungsprotein die kleine Untereinheit der §- Polymerase (Zhang, S.-J., Zeng, X.-R., Zhang, P., Toomey, N. L., Chuang, R. Y., Chang, L.-S., and Lee, M. Y. W. T. (1994). A conserved region in the amino terminus of DNA polymerase 5 is involved in proliferating cell nuclear antigen binding. J. Biol.

Chem. 270,7988-7992). Im Falle der T7 Polymerase jedoch bindet der Prozessivitäts- faktor die katalytische Einheit der Polymerase direkt ohne Beteiligung eines Kopp- lungsproteins.

Die in vitro Anwendung von Proteinen mit Nukleinsäuresyntheseaktivität wie Polymera- sen oder Elongationsproteinen ist in der Technik weit verbreitet, so z. B. bei der Polyme- rase-Kettenreaktion (PCR), Sequenzierung von Nukleinsäuren oder reversen Tran- skription. Dabei ist bei den meisten in vitro Anwendungen, wie PCR oder Sequenzie- rungsprozesse, Prozessivität eine wünschenswerte Eigenschaft, die allerdings die bis- lang in diesen Reaktionen eingesetzten thermostabilen Enzyme nach dem Stand der Technik nur in geringem Maße besitzen.

Die U. S. Patente 4,683,195,4,800,195 und 4,683,202 beschreiben die Anwendung solcher thermostabiler DNA-Polymerasen in der Polymerase-Kettenreaktion (PCR). In der PCR wird unter Verwendung von Primern, Template (auch Matrize genannt), Nu- kleotiden, einer DNA-Polymerase, eines entsprechenden Puffers und bei geeigneten Reaktionsbedingungen DNA neu synthetisiert. In dieser PCR wird bevorzugt eine ther- mostabile Polymerase verwendet, die das zyklische thermische Aufschmeizen der DNA-Stränge übersteht. So wird häufig Taq DNA-Polymerase verwendet (U. S. Patent 4,965,188). Die Prozessivität der Taq DNA-Polymerase ist jedoch, wie oben ausgeführt, relativ gering im Vergleich zu derjenigen der T7-Polymerase.

DNA-Polymerasen finden auch bei der DNA-Sequenzbestimmung Anwendung (San- ger et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 74 : 5463-5467 (1997)). Eine der hierbei verwen- deten Polymerasen kann z. B. die oben erwähnte Taq-Polymerase (U. S. Patent 5,075, 216) oder die Polymerase von Thermotoga neapolitana (WO 96/10640) oder andere thermostabile Polymerasen sein. Neuere Verfahren koppeln die exponentielle Amplifi- kation und die Sequenzierung eines DNA Fragmentes in einem Schritt, so daß es mög- lich ist, genomische DNA direkt zu sequenzieren. Eines der Verfahren, das sogenannte DEXAS-Verfahren (Nucleic Acids Res 1997 May 15 ; 25 (10) : 2032-2034 Direct DNA se- quence determination from total genomic DNA. Kilger C, Pääbo S, Biol. Chem. 1997 Feb ; 378 (2) : 99-105 Direct exponential amplification and sequencing (DEXAS) of geno- mic DNA. Kilger C, Pääbo S und DE 19653439.9 sowie DE 19653494.1) verwendet eine Polymerase mit verminderter Diskriminierungsfähigkeit gegenüber Dideoxynukleo- tiden (ddNTPs) im Vergleich zu Deoxynukleotiden (dNTPs) sowie einen Reaktionspuf- fer, zwei Primer, die bevorzugt nicht äquimolar vorliegen, und die oben genannten Nu- kleotide, um dann in mehreren Zyklen eine komplette, sequenzspezifische DNA-Leiter eines Fragmentes zu erhalten, welches von den Primern flankiert ist. Eine Weiterent- wicklung dieses Verfahrens besteht in der Verwendung eines Polymerasegemisches, wobei eine der beiden Polymerase zwischen ddNTPs und dNTPs diskriminiert, wäh- rend die zweite eine verminderte Diskriminierungsfähigkeit aufweist (Nucleic Acids Res 1997 May 15 ; 25 (10) : 2032-2034 Direct DNA sequence determination from total genomic DNA. Kilger C, Pääbo S).

DNA-Polymerasen finden des weiteren Anwendung bei der reversen Transkription von RNA in DNA. Hierbei dient RNA als Template und die Polymerase synthetisiert einen komplementären DNA-Strang. Zur Anwendung kommt hier z. B. die thermostabile DNA- Polymerase aus dem Organismus Thermus thermusphilus (Tth) (U. S. Patent 5,322,770).

Manche Polymerasen besitzen eine'proof-reading'-Aktivität, also eine 3'-5'Exonuklea- seaktivität. Diese Eigenschaft ist insbesondere dann wünschenswert, wenn das zu

synthetisierende Produkt mit einer niedrigen Fehlerrate bei der Nukleotidinkorporation hergestellt werden soll. Ein Beispiel stellen Polymerasen aus dem Organismus Pyro- coccus wosei dar.

Die oben genannten Elongationsproteine, die in den vorstehend genannten Anwen- dungen zum Einsatz kommen, gehören in vivo größtenteils nicht zu den eigentlichen Replikationsenzymen, sondern es sind zumeist Enzyme, von denen man annimmt, daß sie bei der DNA-Reparatur beteiligt sind, weshalb deren Prozessivität relativ gering ist.

Zudem besitzt jeder Organismus eine Vielzahl von Polymerasen die eine Vielzahl von Eigenschaften besitzen.

Solche Elongationsproteine weisen, wie oben ausgeführt, z. B. die folgenden Eigen- schaften auf : Verwendung von RNA als Template, Verwendung von DNA als Template, Synthese von RNA, Synthese von DNA, Exonukleaseaktivität in 5'-3'Richtung und Exonukleaseaktivität in 3'-5'Richtung, Strangverdrängungsaktivität (strand- displacement activity), Prozessivität oder Nicht-Prozessivität oder Thermostabilität oder Thermosensitivität auf. In vivo ist es jedoch häufig so, daß ein Proteinkomplex eine oder mehrere dieser Eigenschaften vereint. Insbesondere liegen in vivo oftmals Repli- kationskomplexe vor, deren Prozessivität, wie oben ausgeführt, durch das Vorhanden- sein eines Gleitklammerproteins gesteigert wird.

Neben den oben genannten Bestandteilen von Replikationsapparaten findet man in vivo häufig auch andere DNA-modifizierende Proteine in größeren Komplexen mit wei- teren Proteinen. In solchen Komplexen kommt es oftmals dazu, daß von einem ersten Protein"eine DNA-modifizierende Aktivität", wie beispielsweise terminale- Transkriptase-Aktivität, vereinigt wird mit einer oder mehreren, durch ein weiteres Pro- tein in den Komplex eingebrachten Aktivität (en), wie beispielsweise Exonukleaseaktivi- tät. Unter DNA-modifizerender Aktivität ist hierin jede enzymatische Aktivität, die zu ei- ner chemischen, physikalischen oder strukturellen Veränderung einer Ausgangs- Nukleinsäure fuhrt, zu verstehen. Es kommt auch vor, daß eine DNA-modifizierende Aktivität erst durch die Interaktion mit mindestens einem weiteren Protein zustande

kommt. Weiter ist es möglich, daß eine DNA-modifizierende Aktivität verringert oder gesteigert wird durch die nteraktion mit mindestes einem weiteren Protein. Somit ent- steht in vivo oftmal's ein Proteinkomplex der z. B. die Summe der Einzelaktivitäten trägt oder dessen Aktivität gegenüber der Einzelaktivität verbessert ist.

Wie sich aus dem Vorstehenden ergibt, weisen in vivo Komplexe, die eine Nukleinsäu- resyntheseaktivität umfassen, oftmals weitere, für die technische, d. h. in vitro Anwen- dung erwünschte Eigenschaften auf, die über die eigentliche Nukleinsäuresyntheseak- tivität hinausgehen und von den weiteren, den Komplex ausbildenden Komponenten beigesteuert werden.

Eine unmittelbare technische Verwendung derartiger in vivo Komplexe z. B. zu Zwek- ken der Durchführung einer Sequenzierung von DNA, Durchführen einer Polyme- raseketten-Reaktion oder Einführen von Markierungen in Nukleinsäuren scheiterte bis- her aus einer Reihe von Gründen. Ein Grund war und ist die fehlende Kenntnis aller an der Ausbildung des interessierenden Komplexes beteiligter Faktoren oder Einzelkom- ponenten. Ein weiterer Grund besteht darin, daß der mehrere Komponenten umfas- sende Komplex neben den erwünschten auch eine oder mehrere unerwünschte Eigen- schaften aufweist.

Ein zur in vitro Verwendung von in vivo Komplexen alternativer Ansatz sieht vor, Kom- ponenten mit verschiedenem Ursprung, die jedoch für sich die erwünschte Eigenschaft besitzen, miteinander zu kombinieren und auf diese Weise den Komplex mit den er- wünschten Eigenschaften auszubilden. Eine derartige Eigenschaft kann bspw. eine höhere Prozessivität sein. Dieser Ansatz scheiterte in der Technik daran, daß die den Komplex ausbildenden Einzelkomponenten, die miteinander in Wechselwirkung treten müßten, dies nicht oder nur schlecht taten und somit dem Komplex ebenfalls nicht die erwünschten Eigenschaften verliehen werden konnten.

Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, Proteine mit einer Nu- kleinsäuresyntheseaktivität bereitzustellen, die eine erhöhte Prozessivität aufweisen.

Es ist weiterhin eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren bereitzu- stellen, das die Konstruktion derartiger Proteine erlaubt.

Schließlich ist es eine Aufgabe der Erfindung, Verfahren zur Amplifikation, insbeson- dere durch PCR, sowie Sequenzierung von Nukleinsäuren bereitzustellen, die die Amplifizierung und/oder Sequenzierung längerer Nukleinsäuren erlauben.

Die Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch ein rekombinantes chimäres Protein umfassend a) eine erste Domäne mit Nucleinsäuresyntheseaktivität, und b) eine Wechselwirkung vermittelnde Sequenz, wobei durch die Wechselwirkung vermittelnde Sequenz ein Komplex aus Nukleinsäure- syntheseaktivität und Gleitklammerprotein gebildet wird und der Komplex verschie- den ist von dem Komplex, den die Nukleinsäuresyntheseaktivität und/oder das Gleit- klammerprotein mit ihren naturlichen Wechselwirkungspartner (n) ausbildet.

In einem weiteren Aspekt der Erfindung wird die Aufgabe gelöst durch ein chimäres Protein umfassend einen Nukleinsäuresyntheseaktivität aufweisenden Anteil, wobei der Anteil aus einem einen Nukieinsäuresyntheseaktivität aufweisenden Anteil und einen Wechselwirkung vermittelnden Anteil umfassenden Basisprotein stammt, und mindestens einen eine Wechselwirkung vermittelnden Anteil, wobei der Wechselwir- kung vermittelnde Anteil verschieden ist von dem Wechselwirkung vermittelnden Anteil des Basisproteins.

In einer Ausführungsform ist dabei vorgesehen, daß das Protein den Wechselwir- kung vermittelnden Anteil des Basisproteins umfaßt.

In einem weiteren Aspekt wird die Aufgabe ge ! öst durch ein chimäres Protein umfas- send einen Nukleinsäuresyntheseaktivität aufweisenden Anteil, wobei der Anteil aus

einem Basisprotein stammt, das einen Nukleinsäuresyntheseaktivität aufweisenden Anteil aber keinen Wechselwirkung vermittelnden Anteil umfaßt, und einen Wechselwirkung vermittelnden Anteil.

Bei den erfindungsgemäßen chimären Proteinen kann vorgesehen sein, daß der Wechselwirkung vermittelnde Anteil eine Bindung zwischen der Nukleinsäuresyntheseaktivität und einem die Syntheseleistung der Nukleinsäuresyntheseaktivität beeinflussenden Faktor vermittelt. In einer bevorzugten Ausführungsform ist dabei vorgesehen, daß der Faktor ein Gleitklammerprotein ist.

In einer Ausführungsform kann vorgesehen sein, daß die Nucleinsäuresyntheseakti- vität eine Konsensuspeptidsequenzen umfa#t, wobei die Sequenz ausgewählt ist aus der Gruppe, die die Sequenzen SEQ ID NO. : 1,2 und 3 umfa#t.

In einer weiteren Ausführungsform kann vorgesehen sein, daß das Gleitklammer- protein eine Konsensuspeptidsequenz umfa#t, wobei die Sequenz ausgewähtt ist aus der Gruppe, die die Sequenzen SEQ ID NO. : 4,5,6 und 7 umfa#t.

In einer noch weiteren Ausführungsform kann vorgesehen sein, daß die Wechselwir- kung vermittelnde Sequenz eine Konsensuspeptidsequenz umfa#t, welche ausge- wählt ist aus der Gruppe, die die Sequenzen SEQ ID NO. : 8,9,10 11 und 12 umfa#t.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist dabei vorgesehen, daß die Wechselwirkung vermittelnde Sequenz eine Konsensuspeptidsequenz gemäß SEQ ID NO. : 8 umfa#t.

In einer anderen Ausführungsform ist vorgesehen, daß die Wechselwirkung vermit- telnde Sequenz am C-terminalen Ende der die Nucleinsäuresyntheseaktivität tragen- den Sequenz liegt.

In einer weiteren Ausführungsform ist vorgesehen, daß zwischen der Wechselwir- kung vermittetnden Sequenz und der die Nukieinsäureaktivität tragenden Sequenz ein Linker angeordnet ist.

Weiterhin kann in einer Ausführungsform der erfindungsgemäßen chimären Proteine das rekombinante chimäre Protein thermostabil sein.

In einer Ausführungsform der erfindungsgemäßen chimären Proteine kann vorgese- hen sein, daß das Protein eine DNA Polymerase-Aktivität aufweist. Dabei ist beson- ders bevorzugt, wenn die Proteine eine 3-5'-Exonukleaseaktivität aufweisen.

In einer weiteren Ausführungsform der erfindungsgemäßen chimären Proteine ist vorgesehen, daß das Protein eine RNA-Polymerase-Aktivität aufweist.

In einer weiteren Ausführungsform der erfindungsgemäßen chimären Proteine ist vorgesehen, daß das Protein eine reverse Transkriptase-Aktivität aufweist.

In einer noch weiteren bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen chimä- ren Proteine ist vorgesehen, daß sich die Einbaurate von dNTPs und ddNTPs durch die Nukleinsäuresyntheseaktivität um einen Faktor von weniger als 5 unterscheidet.

In einem weiteren Aspekt der Erfindung wird die Aufgabe gelost durch einen Kom- plex umfassend a) ein erfindungsgemäßes rekombinantes chimäres Protein und b) ein Gleitklammerprotein.

In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Komplexes ist vor- gesehen, daß das Gleitklammerprotein eine Konsensuspeptidsequenz umfaßt, wel- che ausgewählt ist aus der Gruppe, die die Sequenzen gemäß SEQ ID NO. : 4,5,6 und 7 umfaßt.

In einer weiteren Ausführungsform ist vorgesehen, daß der Komplex weiter eine Nu- kleinsäure umfa#t.

In einem weiteren Aspekt wird die Aufgabe gelöst durch eine Nukleinsäure, die für ein erfindungsgemäßes chimäres Protein, insbesondere rekombinantes Protein co- diert.

In einem noch weiteren Aspekt wird die Aufgabe gelöst durch eine die erfindungs- 10 gemäße Nukleinsäure umfassenden Vektor. In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem Vektor um einen Expressionsvektor.

In einem weiteren Aspekt wird die Aufgabe gelöst durch eine Zelle, die den erfin- dungsgemä#en Vektor umfa#t.

Die Aufgabe wird weiter gelöst durch die Verwendung der erfindungsgemäßen chi- mären Protein zur Elongation von Nukleinsäuren.

Die Aufgabe wird weiter gelöst durch die Verwendung der erfindungsgemäßen chi- 20 mären Protein zur Amplifikation von Nukleinsäuren.

Die Aufgabe wird weiter gelöst durch die Verwendung der erfindungsgemäßen chi- mären Protein zur reversen Transkription von RNA in DNA.

Die Aufgabe wird weiter gelöst durch die Verwendung der erfindungsgemäßen chi- mären Protein zur Sequenzierung von Nukleinsäuren, insbesondere von DNA.

In einem noch weiteren Aspekt wird die Aufgabe gelöst durch einen Kit, insbesonde- 30 re Reagenzien-Kit zur Elongation und/oder Amplifikation und/oder reversen Tran-

skription und/oder Sequenzierung und/oder Markierung von Nukleinsäuren, der in einem oder mehreren getrennten Behältern umfaßt : a) ein erfindungsgemäßes, bevorzugt rekombinantes chimäres und/oder b) einen erfindungsgemäßen Komplex und c) bevorzugterweise gegebenenfalls zumindest einen Primer, Puffer, Nukleotide, Kofaktoren und/oder Pyrophosphatase.

In einer bevorzugten Ausführungsform des Kits ist vorgesehen, daß er zur Amplifikation von Nukleinsäuren neben den Substanzen a) und/oder b), Deoxynukleotide oder/und Derivate davon umfaßt.

In einer weiteren Ausführungsform umfaßt der Kit eine DNA Polymerase mit 3'-5' Exonukleaseaktivität umfaßt.

In einer noch weiteren Ausführungsform enthält der Kit zur Reversen Transkription Substanzen nach a) und/oder b), welche eine Reverse Transkriptase-Aktivität aufweisen, und bevorzugterweise Deoxynukleotide und/oder Derivate davon.

Bei dem erfindungsgemäßen Kit kann vorgesehen sein, daß er zur Sequenzierung neben Deoxynukleotiden oder Ribonukleotiden oder/und deren Derivaten, Dideoxynukleotide oder/und deren Derivate enthalt.

In einem weiteren Aspekt wird die Aufgabe gelöst durch ein Verfahren zur Template- abhängigen Elongation von Nukleinsäuren, wobei die zu elongierende Nukleinsäure oder zumindest ein Strang davon mit mindestens einem Primer unter Hybridisierungsbedingungen versehen wird, wobei der Primer hinreichend komplementär zu einem Teil der oder einem flankierenden Bereich der zu elongierenden Nukleinsäure ist und durch eine Polymerase in Anwesenheit von Nukleotiden eine Primer-Elongation erfolgt, wobei vorgesehen ist, daß als Polymerase ein erfindungsgemäßes chimäres, bevorzugt chimäres Protein verwendet wird und daß bevorzugterweise ein Gleitklammerprotein in der Reaktion vorliegt.

In einem noch weiteren Aspekt wird die Aufgabe gelöst durch ein Verfahren zur Amplifikation einer Nukleinsäure, wobei vorgesehen ist, daß die zu amplifizierende Nukleinsäure mit mindestens zwei Primern unter Hybridisierungsbedingungen vesetzt wird, wobei ein jeder der beiden Primer jeweils komplementär zu einem Teil der oder einem flankierenden Bereich der zu amplifizierenden Nukleinsäure ist und 10 durch eine Polymerase in Anwesenheit von Nukleotiden eine Primer-Elongation erfolgt, wobei als Polymerase ein erfindungsgemäßes chimäres Protein, insbesondere ein rekombinantes, verwendet wird und bevorzugterweise ein Gleitklammerprotein der Reaktion zugesetzt wird.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist dabei vorgesehen, daß eine Polymerase- Ketten-Reaktion durchgeführt wird.

In einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform ist dabei vorgesehen, daßder Reaktionsansatz zwei DNA Polymerasen umfaßt, von denen mindestens eine eine 20 3'-5'Exonukleaseaktivität aufweist, wobei die 3-5'-Exonukleaseaktivität entweder durch das chimäre Protein oder durch eine weitere Polymerase dem Reaktionsansatz zugesetzt wird.

In einer noch weiteren Ausführungsform ist vorgesehen, daß zwei chimäre Proteine, insbesondere rekombinante,, wobei eines der Proteine ein solches ist, das eine DNA-Polymerase-Aktivität aufweist, und das andere ein solches ist, das eine 3'-5'- Exon ukleaseaktivität aufweist.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Template-abhängigen Elongation kann in 30 einer Ausführungsform vorgesehen sein, daß man zur Sequenzierung von Nukleinsäuren ausgehend von einem Primer, der zu einem der zu sequenzierenden Nukleinsäure benachbarten Bereich komplementär ist, eine Template-abhängige Elongation bzw. Reverse-Transkription unter Verwen-dung von Deoxynukleotiden und Dideoxynukleotiden oder deren jeweiligen Derivaten gemäß, der Methode von Sanger durchführt.

In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahren zur Template- abhängigen Elongation kann vorgesehen sein, daß bei der Elongation der Nukleinsäuren mindestens eine Markierungen eingefügt wird.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist dabei vorgesehen, daß ein 10 Agens verwendet wird, das ausgewähit ist aus der Gruppe, die markierte Primer, markierte Deoxynukleotide und Derivate davon, markierte Dideoxynukleotide und Derivate davon und markierte Ribonukleotide und Derivate davon umfaßt.

In einem noch weiteren Aspekt wird die Aufgabe gelöst durch ein Verfahren zur Mar- kierung von Nukleinsäuren durch Erzeugung einzelner Brüche in Phosphodiesterbin- dungen der Nukleinsäurekette und Ersatz eines Nukleotids an den Bruchstellen durch ein markiertes Nukleotid mit Hilfe einer Polymerase, wobei vorgesehen ist, daß als Polymerase ein erfindungsgemäßes chimäres Protein, insbesondere rekombi- nantes chimäres Protein eingesetzt wird.

20 In einem noch weiteren Aspekt wird die Aufgabe gelöst durch ein Verfahren zur Herstellung eines chimären Proteins, das eine Basissequenz und eine heterologe Wehcselwirkung-bedingende Sequenz umfaßt und infolge der Wechselwirkung- bedingenden Sequenz mit einem Wechselwirkungspartner eine Bindung eingeht oder eine solche Bindung verstärkt wird, wobei a) aus einem Wechselwirkungssystem umfassend ein als Donorprotein und ein als Akzeptorprotein bezeichnete Protein diejenige Sequenz des Donorproteins oder 30 Akzeptorproteins ermittelt wird, die die Wechselwirkung zwischen beiden Wechselwirkungspartnern bedingt ; und

b) die Wechselwirkung-bedingende Sequenz in ein vom Donorprotein und Akzeptorprotein verschiedenes aufnehmendes Protein, das die Basis sequenz umfaßt, eingebracht wird.

In einer Ausführungsform ist vorgesehen, daß das Donorprotein und das Akzeptorprotein einen Komplex bilden, der Nukleinsäure bindet.

In einer weiteren Ausführungsform ist vorgesehen, daß das Donorprotein und das Akzeptorprotein einen Komplex bilden, der eine Aktivität aufweist, die ausgewählt ist aus der Gruppe, die Polymeraseaktivität, DNA-Bindungsaktivität, RNA- Bindungsaktivität, 5-3'-Exonukleaseaktivität, 3-5-Exonukleaseaktivität und Ligaseaktivität umfaßt.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist vorgesehen, daß das Donorprotein ausgewählt ist aus der Gruppe, die Elongationsprotein, Gleitklammerproteine, Gleitklammerladerproteins und Kopplungsproteine umfaßt.

In einer weiteren Ausführungsform ist vorgesehen, daß das Akzeptorprotein ausgewählt ist aus der Gruppe, die Elongationsprotein, Gleitklammerproteine, Gleitklammerladerproteins und Kopplungsproteine umfaßt.

In einer noch weiteren Ausführungsform ist vorgesehen, daß das aufnehmende Protein ausgewähit ist aus der Gruppe, die Elongationsprotein, Gleitklammerproteine, Gleitklammerladerproteins und Kopplungsproteine umfaßt.

In einer Ausführungsform des erfindugnsgemäßen Verfahrens kann vorgesehen sein, daß Schritt a) mehrfach wiederholt wird und aus den solchermaßen ermittelten Wechselwirkung-bedingenden Sequenzen eine Konsensussequenz ermittelt wird, die eine Wechselwirkung-bedingende Sequenz darstellt, und im Schritt b) als Wechselwirkung-bedingende Sequenz in ein vom Donorprotein und Akzeptorprotein

verschiedenes aufnehmendes Protein, das eine Basissequenz umfaßt, eingebracht wird.

In einem weiteren Aspekt wird die Aufgabe gelöst durch ein chimäres Protein, das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhältlich ist. In einer bevorzgten Ausführungsform ist die Basissequenz ein Teil der Aminosäuersequenz eines Proteins, das ausgewählt ist aus der Gruppe, die Elongationsproteine, Gleitklammerproteine, Gleitklammerladerproteine und Kopplungsproteine umfaßt.

Schließlich wird die Aufgabe auch gelöst durch einen in vitro-Komplex zur Template- abhängigen Elongation von Nukleinsäure umfassend ein Gleitklammerprotein und ein Elongationsprotein, wobei mindestens eines der Proteine ein erfindungsgemäßes chimäres Protein ist. Besonders bevorzugt ist dabei eine Ausführungsform, bei der der Komplex thermostabil ist.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung gilt, daß ein jedes der erfin- dungsgemäßen chimären Proteine ein rekombinantes chimäres Protein sein kann.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe auch gelöst durch rekombinantes Chimäres Protein umfassend a) eine erste Domäne mit Nukleinsäuresyntheseaktivität, und b) eine Wechselwirkung vermittelnde Sequenz, dadurch gekennzeichnet, daß durch die Wechselwirkung vermittelnde Sequenz ein Komplex aus Nukleinsäuresyntheseakti- vität und Gleitklammerprotein gebildet wird, wobei der Komplex verschieden ist von dem Komplex, den die Nukleinsäuresyntheseaktivität und/oder das Gleitklammer- protein mit ihren natürlichen Wechselwirkungspartner (n) ausbildet.

Es ist somit mittels dem erfindungsgemäßen rekombinanten chimären Protein mög- lich eine Nukleinsäuresyntheseaktivität an ein Gleitklammerprotein zu binden wel- ches jene Nukleinsäuresyntheseaktivität, wie es beispielsweise in der Natur vor-

kommt nicht binden kann. Der natürliche Wechselwirkungspartner ist also ein Partner wie er innerhalb eines Organismus unter normalen physiologischen Bedingungen an der der Nukleinsäuresyntheseaktivität gebunden vorliegen kann.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe gelöst durch ein Chimäres Protein umfassend einen Nukleinsäuresyntheseaktivität aufweisenden Anteil, wobei der Anteil aus einem einen Nukleinsäuresyntheseaktivität aufweisenden Anteil und einen Wechselwirkung vermittelnden Anteil umfassenden Basisprotein stammt, und mindestens einen eine Wechselwirkung vermittelnden Anteil, wobei der Wechselwirkung vermittelnde Anteil verschieden ist von dem Wechselwirkung vermittelnden Anteil des Basisproteins, sowie ein Chimäres Protein umfassend einen Nukleinsäuresyntheseaktivität aufwei- senden Anteil, wobei der Anteil aus einem Basisprotein stammt, das einen Nuklein- säuresyntheseaktivität aufweisenden Anteil aber keinen Wechselwirkung vermitteln- den Anteil umfaßt, und einen Wechselwirkung vermittelnden Anteil.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe weiterhin gelöst durch ein Verfahren zur Tem- plate-abhängigen Elongation von Nukleinsäuren, wobei die zu elongierende Nuklein- saure oder zumindest ein Strang davon mit mindestens einem Primer unter Hybridi- sierungsbedingungen versehen wird, wobei der Primer hinreichend komplementär zu einem Teil der oder einem flankierenden Bereich der zu elongierenden Nukleinsäure ist und durch eine Polymerase in Anwesenheit von Nukleotiden eine Primer- Elongation erfolgt, dadurch gekennzeichnet, daß als Polymerase ein erfindungsge- mäßes rekombinantes chimäres Protein verwendet wird und daß bevorzugterweise ein Gleitklammerprotein in der Reaktion vorliegt.

Im Sinne der vorliegenden Erfindung ist unter"rekombinant"zu verstehen, wenn das chimäre Protein beispielsweise gentechnisch hergestellt wird (siehe"Gentechnolo- gie", Römpp Basislexikon Chemie, Georg Thieme Verlag 1998) oder aber beispiels- weise wenn es chemisch synthetisiert wird.

Weitere Ausführungsformen ergeben sich aus den Unteransprüchen.

Der Erfindung liegt die überraschende Erkenntnis zugrunde, daß es möglich ist aus- gehend von einem eine Nukleinsäuresyntheseaktivität aufweisenden Protein, hierin im folgenden als Basisprotein bezeichnet, die Prozessivität dieses Proteins, genauer der Nukleinsäuresyntheseaktivität dadurch zu erhöhen, daß es mit einem die Pro- zessivität erhöhenden Faktor, wie einem Gleitklammerprotein, in Wechselwirkung tritt, mit dem das Basisprotein als solches nicht in Wechselwirkung treten kann, bzw. für den Fall, daß es in Wechselwirkung treten kann, dies nicht mit einer Erhöhung der Prozessivität verbunden ist. Dies wird dadurch bewerkstelligt, daß das die Nuklein- säuresyntheseaktivität-tragende Protein mit einer Gruppe von mehreren Aminosäu- ren versehen wird, typischerweise in der Form einer konsekutiven Aminosäurese- quenz, die hierin als Wechselwirkung vermittelnde oder Wechselwirkung bedingende Sequenz bezeichnet wird, und damit eine Wechselwirkung zwischen dem besagten Protein und einem die Prozessivität erhöhenden Faktor erst möglich wird. Damit wird das oben geschilderte Problem des Standes der Technik bestehend in einer fehlen- den Kompatibilitat der eigentlich erwünschten Einzelkomponenten eines eine Nu- kteinsäuresyntheseaktivität tragenden Komplexes überwunden.

Ohne darauf beschränkt sein zu wollen, ergeben sich somit zumindest die folgenden drei Möglichkeiten, was die Ausbildung eine derartigen chimären, eine Nukleinsäure- syntheseaktivität tragenden Proteins anbelangt.

Das dem chimären Protein zugrundeliegende Basisprotein kann dabei in zwei grund- sätzlichen Formen vorliegen. In der ersten Form umfaßt das Basisprotein lediglich die Nukleinsäuresyntheseaktivitat, jedoch keine Sequenz (hierin auch als Domäne bezeichnet, die, insbesondere in vivo, eine Wechselwirkung zwischen der Nuklein- säuresyntheseaktivität und einem Prozessivitätsfaktor vermitteln kann oder könnte, insbesondere nicht dergestalt, als daß durch die Wechselwirkung eine Erhöhung der Prozessivität erreicht wird.

In einer zweiten Form umfaßt das Basisprotein eine Nukleinsäuresyntheseaktivität und zusätzlich eine Sequenz, die, insbesondere in vivo, eine Wechselwirkung zwi- schen der Nukleinsäuresyntheseaktivität und einem Prozessivitätsfaktor vermitteln kann oder könnte, insbesondere dergestalt, als daß durch die Wechselwirkung eine Erhöhung der Prozessivität erreicht wird.

Das erfindungsgemäße chimäre Protein kann ausgehend von den verschiedenen Formen des Basisproteins in verschiedenen grundsätzlichen Ausführungsformen vorliegen.

(i) Eine erste Ausführungsform des chimären Proteins sieht vor, daß die erste Form des Basisproteins verwendet wird und daran eine eine Wechselwirkung mit einem die Prozessivität der Nukleinsäuresyntheseaktivität erhöhenden Faktor ver- mittelnde Sequenz angefügt wird. Diese Anfügung erfolgt typischerweise dadurch, da# die Wechselwirkung vermittelnde Sequenz sich der Sequenz der Nukieinsäure- syntheseaktivität, gegebenenfalls getrennt durch einen Linker, anschließt. In dieser ersten Ausführungsform des chimären Proteins wird somit das Basisprotein um eine eine Wechselwirkung vermittelnde Sequenz ergänzt.

(ii) In einer zweiten Ausführungsform des chimären Proteins wird die zweite Form des Basisproteins verwendet. Dabei wird die dem Basisprotein immanente eine Wechselwirkung mit einem die Prozessivität der Nukleinsäuresyntheseaktivität erhö- henden Faktor vermittelnde Sequenz durch eine andere eine Wechselwirkung mit einem die Prozessivität der Nukleinsäuresyntheseaktivität erhöhenden Faktor ver- mittelnde Sequenz ausgetauscht. Diese andere Sequenz kann dabei von einem an- deren Gen des gleichen Organismus, vom gleichen Gen eines anderen Organismus oder von einem anderen Gen eines anderen Organismus stammen und ist somit in einem jeden Fall eines anderen Ursprungs. Infolgedessen wird durch eine derartige Konstruktion, ggf. erstmals, ggf. aber auch nur in verstärktem Maße, eine Wechsel- wirkung zwischen der Nukleinsäuresyntheseaktivität des Basisproteins und einem die Prozessivität der Nukleinsäuresyntheseaktivität erhöhenden Faktor möglich.

(iii) In einer dritten. Ausführungsform des chimären Proteins wird die zweite Form des Basispröteins verwendet. Dabei wird die dem Basisprotein immanente eine Wechselwirkung mit einem die Prozessivität der Nukleinsäuresyntheseaktivität erhö- henden Faktor vermittelnde Sequenz ergänzt durch eine andere eine Wechselwir- kung mit einem die Prozessivität der Nukleinsäuresyntheseaktivität erhöhenden Faktor vermittelnde Sequenz. Diese andere Sequenz kann dabei von einem anderen Gen des gleichen Organismus, vom gleichen Gen eines anderen Organismus oder von einem anderen Gen eines anderen Organismus stammen und ist somit in einem jeden Fall eines anderen Ursprungs. Infolgedessen wird durch eine derartige Kon- struktion, ggf, erstmals, ggf. aber auch nur in verstärktem Maße, eine Wechselwir- kung zwischen der Nukleinsäuresyntheseaktivität des Basisproteins und einem die Prozessivität der Nukteinsäuresyntheseaktivität erhöhenden Faktor möglich.

Für alle der oben geschilderten Ausführungsformen des chimären Proteins kann man feststellen, daß sich typischerweise die (Aminosäure-) Sequenz eines derartigen chi- mären Proteins von der Sequenz des Basisproteins. Unterscheidet. Eine weitere, allerdings nicht obligatorische Folge kann darin gesehen werden, daß der durch das chimäre Protein ausgebildete Komplex aus Nukleinsäuresyntheseaktivität aufwei- sendem Protein und Prozessivität erhöhendem Faktor verschieden ist von dem Komplex aus Basisprotein und Prozessivität erhöhendem Faktor.

Als Basisproteine eignen sich alle in der Einleitung hierin erwähnten Proteine, Poly- merasen und Elongationsproteine, deren Offenbarung hiermit durch Bezugnahme hierin aufgenommen werden. Gleiches gilt für die anderen Komponenten, insbeson- dere derjenigen des Replikationsapparates, wie Prozessivitätsfaktoren, Gleitklam- merproteine und Wechselwirkung-vermittelnde oder Wechselwirkung-bedingende Sequenzen. Schließlich gelten auch für diesen Teil der Offenbarung die in der Ein- leitung gegebenen Definitionen.

Wenngleich die Nukleinsauresyntheseaktivität aus einer Vielzahl von Organismen stammen kann so ist es bevorzugt, wenn sie z. B. aus dem Organismus Carboxydo- thermus hydrogenoformans (European Patent Application EP 0 834 569 A1) oder ei- nem der Organismen wie z. B. Thermus aquaticus, Thermus caldophilus, Thermus chliarophilus, Thermus filiformis, Thermus flavus, Thermus oshimai, Thermus ruber, Thermus scotoductus, Thermus silvanus, Thermus species Z05, Thermus species sp. 17, Thermus thermusphilus, Therotoga maritima, Therotoga neapolitana, Ther- mosipho africanus, Anaerocellum thermophilum, Bacillus caldotenax, oder Bacillus stearothermophilus stammt.

10 Sofern hierin von Sequenz gesprochen wird, wird damit in der Regel Bezug genom- men auf eine Aminosäuresequenz. Nukleinsäuresequenzen werden in der Regel di- rekt als Nukleinsäuresequenzen angesprochen.

Die verschiedenen für die erfindungsgemäßen rekombinanten chimären Proteine codierenden Nukleinsäuren können von den Fachleuten auf dem Gebiet mittels des genetischen Codes leicht ermittelt und sodann synthetisiert werden. Den Fachleuten sind ebenfalle geeignete Vektoren zur Klonierung und Expression der erfindungsge- mäßen rekombinanten chimären Proteine sowie Verfahren zu deren bevorzugterwei- 20 se rekombinanten Produktion bekannt (siehe z. B. Maniatis et al. ; aaO).

Den Fachleuten ebenfalls bekannt sind Verfahren zur Herstellung von Antikörpern, einschließlich monoklonalen Antikörpern, die gegen die erfindungsgemäßen rekom- binanten chimären Proteine gerichtet sind.

Das erfindungsgemäße rekombinante chimäre Protein kann zur Elongation von Nukleinsäuren verwendet werden, z. B. zur Polymerase-Ketten-Reaktion, DNA- Sequenzierung, zur Markierung von Nukleinsäuren und anderen Reaktionen, die die in vitro Synthese von Nukleinsäuren beinhalten.

30 Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein Verfahren zur Template-abhängigen Elongation, wobei die zu elongierende Nukleinsäure oder zumindest ein Strang davon mit mindestens einem Primer unter Hybridisierungsbedingungen versehen wird, wobei der Primer hinreichend komplementär zu einem Teil der oder einem flankierenden Bereich der zu elongierenden Nuk ! einsäure ist und durch eine Polymerase in Anwesenheit von Nukleotiden eine Primer-Elongation erfolgt, wobei als Polymerase ein erfindungsgemäß. es rekombinantes chimäres Protein verwendet wird und in einer bevorzugten Ausführungsform weiterhin ein Gleitklammerprotein in der Reaktion 10 bzw. im Reaktionsansatz vorliegt.

Verfahren zur Template-abhängigen Elongation von Nukleinsäuren, bei denen die Elongation ausgehend von einem Primer erfolgt, der an die Template-Nukleinsäure anhybridisiert wurde und ein freies 3'-OH-Ende für die Elongation zur Verfügung stellt, sind dem Fachmann bekannt. Zur Amplifikation wird insbesondere eine Polymerasekettenreaktion durchgeführt. Hierbei wird üblicherweise von einer doppelsträngigen DNA-Sequenz ausgegangen, von welcher ein bestimmter Zielbereich amplifiziert werden soll. Hierbei werden zwei Primer eingesetzt, welche zu der Zielsequenz flankierenden Bereichen auf jeweils einem Teilstrang des DNA- 20 Doppeistranges komplementär sind. Zur Anhybridisierung der Primer werden allerdings die DNA-Doppelstränge zuerst denaturiert, insbesondere thermisch aufgeschmolzen.

Nach Anhybridisierung der Primer erfolgt eine Elongation mittels der Polymerase, daraufhin wird nochmals denaturiert und damit die neu gebildeten DNA-Stränge von den Template-Strängen getrennt, woraufhin für einen weiteren Elongationszyklus neben den ursprünglichen Templatesträngen auch die im ersten Schritt gebildeten Nukleinsäurestränge als Template zur Verfügung stehen, diese jeweils erneut mit Primern hybridisiert werden und eine erneute Elongation stattfindet. Diese Vorgehensweise wird zyklisch durchgeführt unter jeweils thermischer Denaturierung als Zwischenschritte.

30 Auch möglich ist die Anwendung des erfindungsgemäßen rekombinanten chimäre Proteins in der reversen Transkription, wobei entweder das erfindungsgemäße Protein selbst Reverse-Transkriptase-Aktivität besitzt, oder aber zusätzlich ein geeignetes Enzym hinzugefügt wird, das eine Reverse-Transkriptase-Aktivität aufweist, unabhängig davon ob der thermostabile in vitro Komplex selbst eine Reverse- Transkriptase-Aktivität hat.

Zur erfindungsgemäß bevorzugten reversen Transkription von RNA in DNA wird ebenfalls ein erfindungsgemäßes rekombinantes chimäres Protein eingesetzt, wobei 10 dessen Nukleinsäuresyntheseaktivität selbst eine Reverse Transkriptase-Aktivität aufweist. Diese Reverse Transkriptase-Aktivität kann die einzige Polymeraseaktivität sein, kann aber auch zusätzlich zu einer vorhandenen 5'-3'-DNA-Polymeraseaktivität vorliegen. Eine erfindungsgemäß bevorzugte Ausführungsform des rekombinanten chimären Proteins umfaßt das Elongationsprotein aus dem Organismus Carboxydothermus hydrogenoformans wie offenbart in EP-A 0 834 569 stammt.

Eine weitere bevorzugte Verwendung des erfindungsgemäßen rekombinanten chimären Proteins ist die Sequenzierung von Nukleinsäuren ausgehend von mindestens einem Primer, der zu einem Teil der zu sequenzierenden Nukleinsäure 20 hinreichend komplementär ist, wobei wiederum eine Template-abhängige Elongation oder aber bei Sequenzierung von RNA eine Reverse Transkription unter Verwendung von Deoxynukleotiden und Dideoxynukleotiden gemäß der Methode von Sanger durchgeführt wird. Als Deoxynukleotide oder Dideoxynukleotide werden im Rahmen dieser bevorzugten Ausführungsform auch die oben beschriebenen jeweiligen Derivate als geeignet angesehen. Insbesondere ist es für die erfindungsgemäßen Verfahren zur Elongation von Nukleinsäuren bevorzugt, daß die gebildeten Nukleinsäuren markiert werden. Hierzu ist es möglich, markierte Primer und/oder markierte Deoxynukleotide oder/und markierte Dideoxynukleotide und/oder markierte Ribonukleotide oder jeweils entsprechende Derivate, wie sie oben bereits beispielsweise beschrieben sind, 30 einzusetzen.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Markierung von Nukleinsäuren durch Einfügung einzelner Brüche in Phosphodiesterbindungen der Nukleinsäurekette und Ersatz eines Nukleotids an den Bruchstellen durch ein markiertes Nukleotid mit Hilfe einer Polymerase, wobei als Polymerase ein erfindungsgemäßer thermostabiler in vitro-Komplex eingesetzt wird.

Ein solches Verfahren, allgemein Nick-Translation genannt, ermöglicht eine einfache Markierung von Nukleinsäuren. Alle oben bereits beschriebenen markierten Ribonukleotide oder Deoxyribonukleotide oder Derivate davon sind hierfür geeignet, 10 solange die Polymerase sie als Substrat akzeptiert.

Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele und Figuren weiter erläutert, aus denen sich weitere Vorteile und Ausführungsformen ergeben, dabei zeigt Fig. 1 vier Sequenzalignments von verschiedenen Elongationsportein- domänen ; Fig. 2 eine schematische Darstellung des erfindugnsgemäßen rekombinanten chimären Proteins ; 20 Fig. 3 vier Konsensussequenzen von Gleitklammerproteinen ; Fig. 4 in tabellarischer Form das Ergebnis eines Hefe-Zweihybrid-system ; Fig. 5,5 A-C Alignments mehrerer konservierter Regionen der Wechselwirkung be- dingenden Sequenz ; Fig. 6 A die gesamte Sequenz einer Ausführungsform eines erfindungs- gemäßen rekombinanten chimären Proteins ; Fig. 6 B eine graphische Darstellung des prinzipiellen Aufbaus eines erfin- dungsgemäßen chimären Proteins ; Fig. 7 das Ergebnis einer unter Verwendung eines erfindungsgemäßen chimä- ren Proteins durchgeführten Polymerase-Kettenreaktion ; 30 Fig. 8 A eine Darstellung aller Fragmente von Af0497, die mit dem Gleitklam- merprotein von Archaeoglobus fulgidus (Af0335) wechselwirken ;

Fig. 8 B ein Alignment C-terminaler Sequenzen verschiedener Gene vo nAr- chaeglobus fulgidus ; Fig. 9 das Ergebnis eines Hefe-Zweihybridexperimentes, das die Wechselwir- kung zwischen einem Elongationsprotein und einem Gleitklammerpro- tein darstellt ; und Fig. 10 das Ergebnis der Amplifikation genomischer DNA unter Verwendung eines erfindungsgemäßen rekombinanten chimären Proteins.

Beispiel 1 : Anwendung des Hefe-Zweihybridsystems zur Bestimmung der für die Wechselwirkung zwischen Replikationsfaktoren und Gleitklammerprotein bedeutsamen Aminosäuren Zur Bestimmung der Binderegion von Gleitklammerproteinen (hierin im folgenden als GKP bezeichnet) und Replikationsfaktoren (hierin im folgenden als RF bezeichnet) wird das Hefe-Zweihybridsystem (Fields S., Song O., Nature 1989 Jul 20 ; 340 (6230) : 245-6) verwendet. Die Gene für GKPs und RFs werden in den Vektoren pGBT9 und pGAD424 (CLONTECH Laboratories, Inc.). exprimiert, so daß Fusionsproteine mit der DNA-Bindedomäne bzw. der Aktivierungsdomäne von GAL4 entstehen : DNA wird mittels der bekannten Verfahren aus dem Organismus Archaeoglobus fulgidus (DSM No. 4304) gereinigt. Die Aufzucht der Mikroorganismen geschah hierbei durch die DSM (Deutsche Sammiung für Mikroorganismen). Dann werden die offenen Leseraster der Gene mittels PCR aus genomischer DNA von Archaeoglobus fulgidus amplifiziert. Die solchermaßen erhaltene DNA wird in die Vektoren pGBT9 und pGAD424 kloniert. Andere Vektoren, die im Zweihybridsystem verwendet werden, eignen sich auch für das im Folgenden beschriebene Verfahren (darunter sind zum Beispiel pAD-GAL4-2.1, pBD-GAL4, pBD-GAL4 Cam, pCMV-AD, pCMV-BD, pMyr, pSos, pACT2, pAS2-1, pHISi, pLexA, pM, pHISi-1, pB42AD, pVP16, pGAD10, pGBKT7, pLacZi, p8op-lacZ, pGAD GH, pGilda, pAD GL, pGADT7, pGBDU, pDBLeu, pPC86, pDBTrp, die erhältlich sind von CLONTECH Laboratories,

Inc.). Zusätzlich werden veränderte Klone in die gleichen Vektoren kloniert. Bei den veränderten Klonen handelt es sich um Deletionsmutationen und um Mutationen betreffend einzelne oder mehrere Aminosäuren des GKP und/oder des RF.

Anschließend wird die Fähigkeit der veränderten Klone, im Zweihybridsystem miteinander zu interagieren, gemessen. Dadurch wird es möglich, Domänen oder sogar einzelne Aminosäurereste zu bestimmen, die für die Interaktion wichtig oder essentiel sind.

Es gibt eine Reihe von Methoden, Deletionen in ein Gen einzuführen. Eine Methode zur Herstellung von Deletionen besteht darin, DNA-Fragmente herzustellen, die die Gene für das GKP oder den RF enthalten. Diese Fragmente werden entweder durch PCR oder durch Restriktionsverdau aus einem geeignetem Vektor gewonnen. Des weiteren wird genomische DNA des Organisimus verwendet, aus dem die beiden Proteine stammen. Diese verschiedenen DNA-Fragmente und die genomische DNA werden durch Ultraschallbehandlung zerkleinert und Fragmente, die Längen zwischen der Gesamtlänge der Gene und etwa 100 Basen aufweisen, werden durch präparative Agarosegelelektrophrese gereinigt. Die Enden der Fragmente werden durch Behandlung mit einem geeigneten Enzym (Klenow, Pwo-Polymerase, oder andere) aufgefüllt bzw. abverdaut, so daß beide Stränge die gleiche Länge haben und somit glattendig ("blunt") sind. Diese Fragmente werden nun durch Ligation in einen mit Smal geschnittenen (oder anders linearisierten und blunt gemachten) pGAD424 und pGBT9 Vektor, oder andere geeignete Vektoren, eingebaut. So entstehen Banken von einer Vielzahl von Subfragmenten der Gene für GKP und RF, jeweils in beiden Vektoren des Zweihybridsystems. Die DNA dieser Banken wird nach Transformation in Escherichia coli vermehrt und gereinigt. Im nächsten Schritt werden die beiden Banken in einen für das Zweihybridsystem geeigneten haploiden Hefestamm transformiert, so daß die Fusionen aus GKP bzw. RF mit der GAL4 DNA- Bindedomäne in einem Stamm mit einem anderen Paarungstyp vorliegen als die Fusionen aus RF bzw. GKP der GAL4 Aktivierungsdomäne. Durch Paarung der beiden Stämme werden nun diploide Zellen erzeugt, in denen die Plasmide aus beiden Banken in derselben Zelle vorliegen. Als Stamm eignet sich PJ69-4 (James P,

Halladay J, Craig EA, Genetics 1996 Dec ; 144 (4) : 1425-36) oder jeder andere Stamm mit einem fOr das Zweihybridsystem geeigneten Genotyp. Zellen, in denen die Reportergene aktiviert werden, werden isoliert, und die Plasmid-DNA daraus durch Präparation gewonnen, oder die Inserts durch PCR spezifisch vermehrt. Die Sequenzen der Fusionsfragmente werden durch DNA-Sequenzanalyse ermittelt. Die Bindungsregion (oder die Bindungsregionen) wird (werden) durch Bestimmung jener Bereiche ermittelt, die in allen Klonen (oder die in bestimmten Gruppen von Klonen immer gefunden werden), bei denen es zu einer Wechselwirkung der beiden RF und GKP umfassenden Fusionsproteine kommt. Diese Bestimmung wird für jedes der Gene viermal durchgeführt : einmal mit der Bank im Vektor mit der Aktivierungsdomäne (präferentiell : pGAD424) und einmal mit der Bank im Vektor mit der DNA-Bindedomäne (präferentieli : pGTB9), jeweils einmal mit dem Gesamtlängenklon des Bindepartners und einmal mit der Genbank der Fragmente.

Durch die beschriebenen Versuche ist es möglich, minimale Binderegionen zu definieren, die man für die Konstruktion von rekombinanten chimären Proteinen mit Affinität für GKP nutzen kann. Zur genaueren Charakterisierung der Binderegion werden Aminosäuremutationen eingeführt und deren Wirkung auf die Bindeeigenschaft getestet. Dadurch wird der Bereich weiter eingeengt und die an der Bindung beteiligten Positionen im Protein bestimmt. In einem parallelen Ansatz wird durch das Einführen zufälliger Mutationen in die Binderegion und der Analyse der Wirkung auf die Bindung ebenfalls die an der Bindung beteiligten Positionen bestimmen. In beiden Fällen wird bestimmt, ob die Mutationen das Protein instabil machen und also einen indirekten Effekt haben, oder ob sie keine Auswirkungen auf die Stabilität des Proteins haben und so einen direkten Effekt haben.

Die hierfür nötigen experimentellen Verfahren sind beschrieben in Maniatis et al. (Molecular Cloning (2t7d edition, 3 Volume set) : A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, N. Y. (1989)), in Ausubel et al (Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons (1988)), in Abelson, J. N., and Simon, M. I. (Editoren) 1991 (Methods in Enzymology, Volume 194, Guide to Yeast Genetics and Molecular

Biology, Academic Press,) oder in Adams, A. Gottschling, D. E. Kaiser, CA, and Stearns, T., 1997, (Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbour Laboratory Press).

Die Handhabung'des Zweihybridsystems (two-hybrid system) erfolgte gemäß der Anleitung der Firma Clontech (yeast protocols handbook, PT3024-1.

Beispiel 2 : Weitere Verfahren zur Kartierung der Bindungsregion von GKP und RF Es wurden GKP und RF als rekombinante Proteine gewonnen. Jeweils eines der beiden Proteine wurde an einem Träger immobilisiert, dann wurde das jeweils ande- re Protein in ungebundener Form zugeben, um die Bindung an den immobilisierten Partner erlauben. Freies, d. h. nicht gebundenes Material wurde ausgewaschen, und das gebundene Protein z. B. durch Denaturierung eluiert. Die Menge des gebunde- nen Proteins ist ein Mass für die Bindung (z. B. angewandt in Anderson D, Koch CA, Grey L, Ellis C, Moran MF, Pawson T, Science 1990 Nov 16 ; 250 (4983) : 979-82).

Die Analyse von Deletionsmutanten der Proteine und von Mutanten mit veränderter Aminosäuresequenz erlaubte die Kartierung der Bindungsregion. Deletionen können durch proteolytischen Verdau oder mittels der rekombinanten Expression von dele- tierten Genen erzeugt werden. In gleicher Weise kann man durch Co- lmmunpräzipitation aus Zellextrakten, die deletierte Formen der Proteine enthalten, die Binderegion bestimmen. Die Kompetition der Bindung durch Peptide kann Auf- schluß über die Sequenz der Binderegion geben.

Eine weitere Möglichkeit zur Kartierung der Binderegion besteht darin, Peptide her- zustellen und die Bindung der Peptide an das jeweils andere Protein zu messen. Die Sequenz der Peptide kann zufällig (Songyang Z, Prog Biophys Mol Biol 1999 ; 71 (3- 4) : 359-72) oder auf der Aminosäuresequenz des Proteins beruhen, dessen Bindere- gion identifiziert werden soll (petide scans, Brix J, Rudiger S, Bukau B, Schneider- Mergener J, Pfanner N, J Biol Chem 1999 Jun 4 ; 274 (23) : 16522-30). Solche Peptide können durch chemische Synthese oder durch andere Methoden wie phage display hergestellt und zur Bindung angeboten werden. Ein Beispiel ist in Fig. 3 gezeigt. Hier wurden durch Alignments verschiedene Konsensussequenzen ermittelt, die zur Her- stellung derartiger Peptide geeignet sind.

Ein weiteres Verfahren besteht darin, Antikörper herzustellen gegen Epitope des Proteins, dessen Binderegion identifiziert werden soll. Wenn der Antikörper die Bin- dung inhibiert, so überschneidet sich das Epitop es Antikörpers mit der Binderegion (z. B. Fumagalli S, Totty NF, Hsuan JJ, Courtneidge SA, Nature 1994 Apr 10 28 ; 368 (6474) : 871-4).

Schließlich besteht eine Möglichkeit zur Bestimmung oder Kartierung der Binderegi- on (Wechselwirkung-bedingende Sequenz) darin, die Feinstruktur des Komplexes mit den Methoden der Röntgenstrukturanalyse, der Nuclear Magnetic Resonance oder der Elektronenmikroskopie aufzuklären.

Beispiel 3 : Studium der Wechselwirkung von Proteinen aus Archaeoglobus fulgidus unter Verwendung des Hefe-Zweihybridsystems (Y2H) 20 Die kodierenden Bereiche von Genen aus Archaeoglobus fulgidus, deren Genpro- dukte in vitro als Wechselwirkung-bedingende Sequenz und/oder Nukleinsäure- synthseaktivität verwendet werden können, wurden mittels PCR amplifiziert, in die Vektoren pGBT9 (vertikale Spalten der Fig. 9) und pGAD424 (horizontale Reihen der Fig. 9) kloniert und durch gap-repair in Hefe PJ69-4a (für pGAD424) und PJ69- 4alpha (für pGBT9) als Hybridproteine zur Expression gebracht. Ebenso wurde eine positive Kontrolle mittels PCR amplifiziert, in die Vektoren pGBT9 und pGAD424 (siehe auch horizontale Reihen der Fig. 9) kloniert und durch gap-repair in den He- festamm PJ69-4a (für pGAD424) und PJ694alpha (für pGBT9) als Hybridproteine zur Expression gebracht. Diploide Zellen, die beide Vektoren enthalten, wurden 30 durch Paarung erzeugt. Die Expression von drei unabhängigen Reportern (HIS3,

ADE2 und MEL1) wurde gemessen. Die Expression des HIS3 bzw. ADE2 Gens führt zu einer Histidin-bzw. Adenin-Prototrophie der Zellen. Transkription des MEL1 Ge- nes führt zur Produktion des Beta-Galaktosidase Enzyms, dessen Aktivität sich z. B. über eine Farbreaktion nachweisen läßt. In dem in Fig. 9 gezeigten Experiment wachsen jene Zellen in einem Histidin-und Adenin-Mangelmedium, die beide Vekto- ren tragen und in denen zudem die Expressionsprodukte dieser beiden Vektoren an- einander binden. Die Interaktion der Fusionsproteine bewirkt die Rekonstitution eines funktionellen Transkriptionsfaktors, der die Transkription der Reportergene initiiert.

Die Produktion der auf den Reportergenen codierten Proteine führt zu einer Aufhe- bung der Histidin-und Adenin-Auxotrophie. Dies wird dadurch bedingt, daß in Folge der Bindung der Expressionsprodukte eine Transkription initiiert wird, die dazu führt, daß die Zellen wachsen können.

Alle hier positiven Klone waren auch positiv bezüglich der Expression des MEL1- Gens. Die Handhabung des two-hybrid systems erfolgte gemäß der Anleitung der Firma Clontech (yeast protocols handbook, PT3024-1).

Beispiel 4 : Ermittlung der Wechselwirkung bedingenden Sequenz von Af0497 Zur Ermittlung der Wechselwirkung-bedingenden Sequenz auf dem Protein Af0497 (ein Elongationsprotein), die die Wechselwirkung mit dem Gleitklammerprotein be- dingt, wurde zunächst die DNA des Gens für Af0497 durch Restriktion eines geeig- neten Vektors, welcher eine Elongationsprotein beinhaltete welches eine Wechsel- wirkung-bedingende Sequenz umfaßte gewonnen. Diese DNA wurde dann durch Ultraschall fragmentiert und in die beiden Vektoren pGAD424 und pGBDU ligiert. So entstanden Banken von verschiedenen Fragmenten des Gens in den beiden Vekto- ren. Als nächstes wurde unter Verwendung des Hefe-Zweihybridsystems ermittelt, welches dieser Fragmente eine Wechselwirkung mit Af0335 bedingen kann. Dazu wurden beide Banken in geeignete Hefestämme (pGAD424 : PJ69-4a, PGBDU : PJ69-4alpha) transformiert. Durch Paarung der Hefestämme wurden dann diploide Zellen erzeugt, die sowohl die Banken (Af 0497) als auch das Gleitkiammerproteins in einem für die Verwendung der Zweihybridsystems passenden Vektor enthalten.

Alle Klone, die den HIS2 Reporter (siehe oben) aktivierten, wurden auf Platten ohne Histidin isoliert, und die Inserts wurden durch PCR von der Hefekolonie selektiv am- plifiziert. Die Sequenz der Inserts wurde ermittelt und ihre Position am Gen Af0497 bestimmt. Das Ergebnis ist in Figure 8A graphisch dargestellt : Alle gefunden Klone mit Ausnahme eines Klons beinhalteten das carboxyterminale Ende des Elonagti- onsproteins, welches eine oder mehrere Wechselwirkung-bedingende Sequenz um- faßt. Der kleinste Klon bestand aus 51 Aminosäuren.

10 Um zu ermitteln, ob die Wechselwirkung-bedingende Sequenz des homologen Pro- teins eines anderen Organismus ebenfalls am carboxyterminalen Ende des Proteins beinhaltet ist, wurde das Experiment mit dem Polymeraseprotein und dem Gleit- klammerprotein aus Pyrococcus horikoshi wiederholt. Dazu wurden Banken der gro- ßen Untereinheit der Polymerase aus P. horikosii hergestellt und wie mittels des oben beschriebenen Verfahrens auf Interaktion mit dem Gleitklammerprotein aus P. horikosii getestet. Wieder umfaßten die interagierenden Fragmente das carboxyter- minale Ende des Elonagtionsproteins.

20 Um zu überprüfen, ob die Wechselwirkung zwischen dem carboxyterminalen Ende des Proteins Af0497 und dem Gleitklammerprotein spezifisch ist, wurde getestet, ob das carboxyterminal Proteinfragment von Af0497 mit anderen Proteinen aus Ar- chaeglobus fulgidus und anderen Organismen ebenso wechselwirkt. In keinem Fall konnte eine Wechselwirkung gemessen werden, was zeigt, daß die Bindung sehr spezifisch für das Gleitklammerprotein ist.

So bindet die Polymerase Taq nicht an das GKP (PCNA aus Archaeoglobus fulgi- dus), und es konnte im Hefe-Zweihybridsystem keinerlei Wechselwirkung gemessen werden. Um zu testen, ob das carboxyterminale Ende des Proteins Af0497 eine 30 Wechselwirkung mit einem anderen Protein, an das es fusioniert ist, bedingen kann, wurde ein Fusionsprotein aus Taq und den carboxyterminale 51 Aminosäuren von Af0497 hergestellt. Diese Protein wurde im Hefe-Zweihybridsystem auf Wechselwir- kung getestet ; Wie in Fig. 4 dargestellt, bewirkte die Verpflanzung der Wechselwir- kung-bedingenderi Sequenz von Af0497 an Taq eine spezifische Wechselwirkung von Taq mit dem Gleitklammerprotein Af0335. Die Ergebnisse der entsprechenden Y2H-Experimente sind in Fig. 4 dargestellt.

Das beweist, daß die Eigenschaft dieses Fragments (das carboxyterminale Ende des Elongationsproteins Af0497) eine Wechselwirkung mit dem Gleitklammerprotein Af0335 zu bedingen, auf ein anders Protein, insbesondere auf eine andere Polyme- 10 rase, verpflanzt oder transferiert werden kann, um dort eine Wechselwirkung mit dem eigentlich für AfO497 spezifischen Gleitklammerprotein hervorzurufen.

Es wurde bei sechs Proteinen (siehe auch Fig. 5 und Fig. 5B) aus A. fulgidus eine Interaktion mit PCNA gemessen. Daraus ergibt sich, daß alle diese Proteine ähnlich Wechselwirkung-bedingende Sequenzen beinhalten, die die Wechselwirkung mit PCNA vermitteln. So z. B. die Polymerase delta grosse Untereinheit (Af 0497, TREMBL Nummer : 029753), die Polymerase delta kleine Untereinheit (Af 1790, TREMBL Nummer : 028484), DP2 (Af 1722, TREMBL Nummer : 028552), RPA2 (Replication factor A), RFC2 (Replication factor C) und PCNA (Af 0335, TREMBL 20 Nummer : 029912) Solche Wechselwirkung-bedingende Sequenzen sind in den letzten 50 Aminosäuren des Proteins Af0497 enthalten. Bei einer Untersuchung der Proteine, die mit PCNA interagieren, ergab sich, daß alle ein Motiv enthalten, das knapp vor dem car- boxyterminalen Ende der Aminosäuresequenz angeordnet ist. Eine Aufstellung der verwandten Sequenzen ist in Fig. 8B dargestellt, wobei ein schwarzer Balken den konservierten Bereich kennzeichnet.

Dieses Motiv ist auch in anderen Organismen und Genen konserviert. Fig. 5 zeigt 30 das Ergebnis der Suche nach solchen Wechselwirkung-bedingende Sequenzen so- wie die daraus generierten Konsensussequenzen.

Beispiel 5 : Steigerung der Effizienz einer PCR bei Verwendung von PCNA als GKP und eines erfindungsgemäßen chimären Elongationsproteins Dieses Beispiel zeigt den Einfluß von PCNA auf die Effizienz einer PCR-Reaktion.

In dieser PCR-Reaktion wurde ein 463 bp großes Fragment ausgehend von Plas- mid-DNA amplifiziert. Als Polymerase wurde das Taqfusionsprotein, wie es auch in Fig. 6A dargestellt ist, verwendet. Die Reaktionsbedingungen für die PCR waren wie folgt : 0,4mM jedes dNTP (pH 8,3) und 20 pmol von jedem Primer in einer Reaktion.

Zur Anwendung kam ein erster Primer (SEQ ID NO. : 13) mit der Sequenz 5'- AGGGCGTGGTGCGGAGGGCGGT-3'und ein zweiter Primer (SEQ ID NO. : 14) mit der Sequenz 5'-TCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT-3'.

Es zeigt sich, daß die Fusion einer 50 Aminosäuren großen Domäne an den C- Terminus der nativen Taq DNA Polymerase keinen nachteiligen Einfluß auf die Po- lymerase-Eigenschaften hat, da das Taqfusionsprotein per se schon ein Produkt in einer PCR-Reaktion liefert. Mittels dieser Domäne kann nun das Gleitklammerpro- tein, PCNA aus Archaeoglobus fulgidus, mit dem Taqfusionsprotein interagieren und in seiner Eigenschaft als Prozessivitätsfaktor die Effizienz der PCR-Reaktion erhö- hen, was sich in einer deutlich höheren Ausbeute an PCR Produkt widerspiegelt. Das Ergebnis ist auch in Fig. 7 dargestellt.

Beispiel 6 : Hefe-Zweihybridsystem zum Nachweis der Wechselwirkung zwi- schen dem Elongationsprotein Af 0497 von Archaeoglobus fulgidus und dem Gleitklammerprotein Af 0335 von Archaeoglobus fulgidus Fig. 9 zeigt die Ergebnisse eines Y2H Experimentes, wobei die Reihe A mit Zellen bestückt ist, die den leeren pGAD424 Vektor (Clontech, Palo Alto, USA) tragen, so daß eine Transkriptions-Aktivierungsdomäne exprimiert wird ; die Reihe B mit Zellen

bestückt ist, die den pGAD424 Vektor tragen, von dem das Sacharomyces cereve- siae Gen CDC48 als Fusionsprotein mit der Transkriptions-Aktivierungsdomäne exprimiert wird ; die Reihe C mit Zellen bestückt ist, die den pGAD424 Vektor tragen, von dem das Gleitklammergen aus Archaeoglobus fulgidus als Fusionsprotein mit der Transkriptions-Aktivierungsdomäne exprimiert wird ; die Reihe D nicht mit Zellen bestückt ist und die Reihe E mit Zellen bestückt ist, die den pGAD424 Vektor tragen, von dem das Elongationsproteingen aus Archaeoglobus fulgidus als Fusionsprotein mit der Transkriptions-Aktivierungsdomäne exprimiert wird.

Die Spalte 1 ist mit Zellen bestückt, die den leeren pGBT9 Vektor (Clontech, Palo Alto, USA) tragen ; die Spalte 2 ist bestückt mit Zellen, die den pGBT9 Vektor tragen, von dem das Saccharomyces cerevisiae Gen UFD3 als Fusionsprotein mit der DNA- Bindedomäne exprimiert wird ; die Spalte 3 ist bestückt mit Zellen, die den pGBT9 Vektor tragen, von dem das Gleitklammerprotein aus Archaeoglobus fulgidus als Fu- sionsprotein mit der DNA-Bindedomäne exprimiert wird ; die Spalte 4 ist bestückt mit Zellen, die den pGBT9 Vektor tragen, von dem das Kopplungsprotein aus Archaeo- globus fulgidus als Fusionsprotein mit der DNA-Bindedomäne exprimiert wird, und Spalte 5 ist bestückt mit Zellen, die den pGBT9 Vektor tragen, von dem das Elonga- tionsprotein aus Archaeoglobus fulgidus als Fusionsprotein mit der DNA- Bindedomäne exprimiert wird.

Beispiel 7 : Polymeraseketten-Reaktion von genomischer DNA unter Verwen- dung eines chimären Elongationsproteins Beispiel 7 zeigt den Einfluß des Gleitklammerproteins auf die Effizienz einer PCR- Reaktion an längeren DNA-Fragmenten unter Verwendung des erfindungsgemä- ßen rekombinanten rekombinanten chimären Proteins. In dieser PCR-Reaktion wurde ein 4954bp groles Fragment ausgehend von humaner genomischer DNA amplifiziert. Als Polymerase wurde das erfindungsgemäße rekombinante chimäre

Protein verwendet. Die Bedingungen entsprechen den Standardbedingungen einer PCR-Reaktion : pH jedes dNTP und 20 pmol von jedem Primer in einer Reaktion. Eingesetzt wurde ein erster Primer ((SEQ ID NO. : 15) : 5'- AGGAACAACATATGACGCACTCT-3') und ein zweiter Primer ( (SEQ ID NO. : 16) : (5'-TAGGTGGCCTGCAGTAATGTTAG-3').

Es zeigt sich, daß nur das erfindungsgemäße rekombinante chimäre Protein, in sei- ner Sequenz dargestellt in Fig. 6A, unter Stimulation durch das Gleitklammerproteins PCNA ein eindeutiges und spezifisches PCR-Produkt generieren ließ, während der gleiche Reaktionsansatz mit nativer Taq DNA-Polymerase kein eindeutiges Produkt ergab. Das erklärt sich durch die Interaktion des Gleitklammerproteins mit dem erfin- dungsgemäß rekombinanten chimären Protein und einer damit verbundenen gerin- geren Dissoziation des erfindungsgemäßen rekombinanten chimären Proteins von der Ziel-DNA.

Im folgenden werden die Figuren detaillierter besprochen, auf die in den vorstehen- den Beispielen zum Teil bereits Bezug genommen wurde.

Sämtliche Sequenzalignments, wie sie hierin in den folgenden Figuren offenbart wer- den, wurden mit dem BLAST Algorithmus nach Altschul, S. F., Gish, W. Miller, W., Myers, E. W., and Lipman, D. J., J. Mol. Biol. 215,403-410 (1990) erstellt.

Fig. 1 : Fig. 1 zeigt Sequenzalignments von insgesamt vier verschiedenen Elongations- proteindomänen aus verschiedenen Organismen, so für das Elongationsprotein 1 aus Mensch, Archaeglobus fulgidus, Methanococcus thermoautotrophicusm, PHBT (Pyrococcus horikoshii), und Methanococcus janashii. Direkt unter der Alignierung steht bei den Figuren häufig eine Konsensussequenz in einer Schreibweise, bei der variierende Positionen durch ein einzelnes Zeichen angeben werden. Die in eckigen

Klammern angegeben Aminosäuren stellen jene Aminosäuren, ausgedrückt im Einbuchstabencode, dar, die an der speziellen Position stehen können.

Die Aminosäuren werden hierbei gemäß der Standard-IUPAC-Einbuchstaben- Nomenklatur benannt und gemäß dem Prosite Pattern-Beschreibungsstandard aufgeführt. Dabei sind die folgenden Aminosäuregruppen häufig zusammengefaßt : G, A, V, L, I, M. P, F oder W (Aminosäuren mit nicht polaren Seitenketten), direkt unter der Sequenz oftmals auch als"$"geschrieben, S, T, N, Q, Y, oder C (Aminosäure mit ungeladenen polaren Seitenketten), K, R, H, D oder E (Aminosäure mit geladenen und polaren Seitenketten) direkt unter der Sequenz oftmals auch als"&"geschrieben, au#erdem bedeutet X in den Sequenzen bzw. Sequenzprotokollen jede beliebi- ge Aminosäure oder Insertion oder Deletion Fig. 1 gibt vier verschiedene Konsensussequenzen für verschiedene Bereiche von Elongationsproteinen an, wobei z. B. das Elonagtionsprotein 3 häufig in Eubakterien gefunden werden kann, das Elongationsprotein 4 auch die Taq-Polymerase umfa#t und häufig in Pol I-Typ-Polymerasen gefunden werden kann. Elongationsprotein 3 zeigt somit ein Alignment einer konservierten Regionen des Elongationsproteins aus Eubakterien, sowie die daraus hergeleiteten Konsensussequenzen. Folgende Gene sind gezeigt : DP3A_ECOLI : DNA Pol III, alpha subunit, Escherichia coli, BB0579 : DNA Pol III, alpha subunit, Borrelia burgdorferi, DP3AHELPY : DNA Pol 111, alpha subunit, Helicobacter pylori AA50 : Aquifex aeolicus, section 50 und DP3ASALTY : DNA Pol 111, alpha subunit, Salmonella typhimurium).

Fig. 2 : Fig. 2 zeigt die Skizze einer möglichen Form des erfindungsgemäßen rekombinanten chimären Proteins, wobei die Gleitkammer als die Syntheseaktivität der Polymerase erhöhender Faktor über die Domäne mit Wechselwirkung-bedingender Sequenz an das die Nukleinsäuresynthese-aktivität tragende Elongationsprotein bindet.

Fig. 3 : Fig. 3 zeigt vier Gleitklammerkonsensussequenzen Folgende Gene sind für Gleitklammer Region 1 gezeigt : Humanes PCNA, sowie Orthologe dazu, aus Archaeoglobus fulgidus, aus Methanococcus janashii, aus Py- rococcus horikoschii und aus Methanococcus thermoautothrophicus.

Region 2 zeigt ein Alignment einer zweiten konservierten Regionen der Gleitklammer aus Eukaryonten und Archae, sowie die daraus hergeleiteten Konsensussequenzen.

Das Alignment wurde dabei unter Verwendung einer zweiten Region der oben bei Region 1 bereits verwendeten Gleitklammern erstellt.

Region 3 zeigt ein Alignment einer konservierten Regionen der Gleitklammer aus Eubakterien, sowie die daraus hergeleiteten Konsensussequenzen. Folgende Gene sind gezeigt : AAPOL3B, DP3B_ECOLI, S. TYPHIM, DP3B-PROMI, DP3B_PSEPU und DP3B_STRCO (MPOL3B : Aqufex Aeolicus sektion 93 : DP3B-ECOLI : DNA Pol 111, beta chain, Escherichia coli, S. TYPHIM : DNA Pol III, beta chain, Salmonella ty- phimurium, P3B_PROMI : DNA Pol III, beta chain, Proteus mirabilis DP3B_PSEPU : DNA Pol ! tt, beta chain, Pseudomonas putida DP3BSTRCO : DNA Pol III, beta chain, Streptomyces coelicolor).

Region 4 zeigt ein Alignment einer zweiten konservierten Regionen der Gleitklammer aus Eubakterien (siehe Organismen in Region 3), sowie die daraus hergeleiteten Konsensussequenzen Fig. 4 : Fig. 4 zeigt die Interaktion von chimären Proteinen im Hefe-Zweihybridsystem. Das in Fig. 4 dargestellte Ergebnis beweist, daß die Eigenschaft eine Wechselwirkung mit

dem Gleitklammerprotein Af0335 zu bedingen, auf ein anders Protein, insbesondere auf eine andere Polymerase, verpflanzt werden kann, um dort eine Wechselwirkung mit dem Gleitklammerprotein hervorzurufen. Es ist gezeigt, daß das GKP sich selbst bindet und das GKP eine Taqfusionsprotein bindet, welches eine Wechselwirkung- bedingende Sequenz aus Archaeglobus fulgidus umfaßt.

Fig. 5 : Fig. 5 zeigt drei Alignments konservierter Regionen Wechselwirkung-bedingender Sequenz aus verschiedenen Organismen und für verschiedene Gene : Sequenz 1 (Polymerasegen, Af 0497 Homologe) : Archaeoglobus fulgidus, Pyrodicti- um occultum, Aeropyrum pernix, Pyrococcus glycovorans, Pyrococcus furiosus, Thermococcus gorgonarius, Pyrococcus abyssi, Pyrococcus horikoshii, Thermococ- cus litoralis, Thermococcus fumicolans und Methanococcus jannaschii Sequenz 2 (Polymerasegen, Af 1722 Homologe), Archaeoglobus fulgidus, Methano- coccus jannaschii, Pyrococcus furiosus, Methanobacterium thermoautotrophicum, Pyrococcus horikoshii und Pyrococcus abyssi und Sequenz 3 (Af 1347 Homologe), Archaeoglobus fulgidus, Pyrococcus abyssi, Pyro- coccus horikoshii, Methanobacterium thermoautotrophicum und Aeropyrum pernix.

Die Wechselwirkung-bedingende Sequenzen können in ein erfindungsgemäßes chi- märes Protein eingebracht werden um ein GKP zu binden.

Fig. 5B : Fig. 5B zeigt zwei Alignments konservierter Regionen Wechselwirkung-bedingender Sequenz aus verschiedenen Organismen und für verschiedene Gene :

Sequenz 4 (RNAse-Gen, Af 0621 Homologe) : Archaeoglobus fulgidus, Pyrococcus abyssi, Pyrococcus horikoshii und Arabidopsis thaliana und Sequenz 5 (Polymerase-Gen) : Archaeoglobus fulgidus, Pyrococcus abyssi, Metha- nococcus thermoautotrophicus, Methanococcus janashii, Mus musculus und Homo sapiens.

Die Wechselwirkung-bedingende Sequenzen können in ein erfindungsgemäßes chi- märes Protein eingebracht werden um ein GKP zu binden.

Fig. 5C : Fig. 5C zeigt eine Liste von Charakteren die verwendet werden um ein oder mehrere verschiedene Aminosäuren zu Kennzeichnen, wobei unter"Klasse"die Aminosäure oder die Eigenschaft der Gruppe steht, unter"key"das verwendete Zeichen und un- ter"Rest"die Aminosäuren die in der Gruppe sind.

Fig. 6A : Die Fig. 6A zeigt die Gesamtsequenz einer bevorzugten Ausführungsform des erfin- dungsgemäßen rekombinanten chimären Proteins. Hier stammt das Elongations- protein und damit die Nukleinsäuresyntheseaktivität aus Thermus aquaticus und die Wechselwirkung-bedingende Sequenz aus Archaeglobus fulgidus.

Fig. 6B : Die Fig. 6B zeigt eine graphische Übersicht des Aufbaus einer bevorzugten Ausfüh- rungsform des erfindungsgemäßen rekombinanten chimären Proteins. Hier ist das

Elongationsprotein aus Thermus aquaticus. und die wechselwirkungsbedingende sequenz aus Archaeglobus fulgidus.

Fig. 7 : Fig. 7 zeigt die Verwendung eines erfindungsgemäßen rekombinanten chimären Proteins in der PCR, dessen Sequenz in Fig. 6A abgebildet ist. In allen Spuren die- ses 1 % Agarose Gels ist jeweils eine Bande für das Amplifikat einer PCR-Reaktion ausgehend von Plasmid-DNA (pCR 2.1 Vektor inclusive eines 463bp Fragments ; In- vitrogen, 9704 CH Groningen ; Netherlands), die unter folgenden Bedingungen (95°C 5'Denaturierung ; 30 x {95°C 30"Denaturierung ; 55°C 30"Hybridisierung ; 72°C 40"Elongation} ; 72°C 7 zusätzliche Elongation) durchgeführt wurde, mit einer Größe von 463 bp zu erkennen. Die Reaktionen wurden zu je 20p1 eines 50u Ansatzes auf das Gel aufgetragen. Spur 7 zeigt einen Größenstandard.

In den Spuren 2 (0, 3µg PCNA) und 3 (2, 4µg PCNA) kann man erkennen, daß sich die Intensität der Bande nach Zugabe steigender Mengen Gleitklammerprotein (PCNA) als stimulierendes Agens bei gleichbleibender Mg2+-lonenkonzentration (2,5mM) gegenüber der Spur 1 (PCR-Reaktion ohne PCNA) erhöht. Eine weitere Steigerung der Intensität der Bande und damit verbunden eine erhöhte Ausbeute der PCR-Reaktion kann man bei einer höheren Mg2+-lonenkonzentration (3,5mM) errei- chen, siehe Spur 4 (ohne PCNA) und Spuren 5 (0,3pg PCNA) und 6 (2, zig PCNA) bei zunehmender Menge an PCNA.

Fig. 8A : Graphische Darstellung aller Fragmente von Af0497 (siehe oben), die mit dem Gleit- klammerprotein aus Archaeoglobus fulgidus (Af0335) interagieren. Mit"B"gekenn- zeichnete Pfeile repräsentieren Klone, die als Fusion mit der DNA-Bindedomäne

gefunden wurden, Mit"A"gekennzeichnete Pfeile repräsentieren Klone, die als Fusi- on mit der Aktivierungsdomäne gefunden wurden.

Fig. 8B : Fig. 8B zeigt ein Alignement der C-terminalen Sequenzen der folgenden Gene Af 0497-grUE, Af 1195 Rfc, Af 0264 Rad2-Fen1, Af 0621 RNAseH,, Archaeglobus ful- gidus.

Fig. 9 : Fig. 9 zeigt das Ergebnis eines Hefe-Zweihybridtests und belegt eine Bindung zwi- schen den Hefeproteinen ufd3 und cdc48 (2B ; Positivkontrolle), zwischen dem Elon- gationsprotein und dem Gleitklammerprotein (3E ; und in der umgekehrten Orientie- rung 5C), zwischen dem Gleitklammerprotein und dem Gleitklammerprotein (3C) und zwischen dem Kopplungsprotein und dem Gleitklammerprotein (4C). Die Fusions- proteine werden exprimiert von den Vektoren pGBT9 (Vektor) in Spalte 1, pGBT9 : : ufd3 (Positivkontrolle) in 2, pGBT9 :. PCNA in 3, pGBT9 : : kIUE in 4, pGBT9 : : grUE in 5, pGAD424 (Vektor) in Reihe A, pGAD424 : : cdc48 in B (Positivkon- trolle), pGAD424 : : PCNA in C, leer in D und pGAD : : grUE in E.

Interaktionen von Proteinen aus Archaeoglobus fulgidus wurden mit dem Y2H Sy- stem gezeigt. Die kodierenden Bereiche von Genen aus Archaeoglobus fulgidus, de- ren Genprodukte in vitro verwendeten werden können, wurden mittels PCR amplifi- ziert, in die Vektoren pGBT9 (vertikale Spalten der Fig. 27) und pGAD424 (horizon- tale Reihen der Fig. 9) kloniert und durch gap-repair in Hefe PJ69-4a (für pGAD424) und PJ69-4alpha (für pGBT9) als Hybridproteine zur Expression gebracht. Ebenso wurde eine positive Kontrolle mittels PCR amplifiziert, in die Vektoren pGBT9 (siehe auch vertikale Spalten der Fig. 9) und pGAD424 (siehe auch horizontale Reihen der Fig. 9) kloniert und durch gap-repair in den Hefestamm PJ69-4a (für pGAD424) und

PJ69-4alpha (für pGBT9) als Hybridproteine zur Expression gebracht. Diploide Zel- len, die beide Vektoren enthalten, wurden durch Paarung entsprechend dem ge- zeigten Raster in'Fig. 9 erzeugt. Die Expression von drei unabhängigen Reportern (HIS3, ADE2 und MEL1) wurde gemessen. Gezeigt ist in Fig 9 das Wachstum auf Medium ohne Histidin und Adenin. In diesem Experiment wachsen jene Zellen, die beide Vektoren tragen und zudem die Expressionsprodukte dieser beiden Vektoren einander binden. Was dadurch bedingt wird, daß in Folge der Bindung der Expressi- onsprodukte Transkription initiiert wird, die dazu führt, daß die Histidin und Adenin Auxotrophie aufgehoben wird.

Alle hier positiven Klone waren auch positiv bezüglich der Expression des MEL1 Gens. Die Handhabung des two-hybrid systems erfolgte gemäß der Anleitung der Firma Clonetech (yeast protocols handbook, PT3024-1).

Fig. 10 In allen Spuren dieses 1% Agarose Gels mit Ausnahme von Spur 5, die einen Grö- ßenstandard zeigt, ist das Amplifikat einer PCR-Reaktion ausgehend von humaner genomischer DNA mit einer Größe von 4954 Basenpaaren (Roche Diagnostics, D- 68305 Mannheim), die unter den folgenden Bedingungen : 95°C 5'Denaturierung ; 35 x {95°C 30"Denaturierung ; 47°C 30"Hybridisierung ; 72°C 12'Elongation} ; 72°C 10 zusätzliche Elongation, durchgeführt wurde, zu je 20p1 eines 50nul Ansatzes auf das Gel aufgetragen worden. In Spur 3 (2,4pg PCNA) kann man erkennen, daß man eine Bande nach Zugabe steigender Mengen des Gleitklammerproteins (PCNA aus Ar- chaeoglobus fulgidus) zum erfindungsgemäßen rekombinanten chimären Protein- komplexe als stimulierendes Agens bei gleichbleibender Mg2+-lonenkonzentration (6mM) gegenüber der Spur 1 (PCR-Reaktion ohne PCNA) und Spur 2 (0, zig PCNA) erhält, während sich hingegen bei gleicher Mg2+-lonenkonzentration mit Taq DNA- Polymerase (Spur 4) kein eindeutiges Produkt in der PCR-Reaktion generieren ließ.

Die in der vorliegenden Beschreibung sowie in den Ansprüchen offenbarten Merk- male der Erfindung können sowohl einzeln als auch in beliebiger Kombination für die Verwirklichung der Erfindung in ihren verschiedenen Ausführungsformen wesentlich sein.