[0001] Domaine technique

[0002] L'invention concerne l'association d'au moins une souche bactérienne de l'espèce Enterococcus faecalis et d'un agent anti-inflammatoire, d'une composition les comprenant et de ses utilisations comme médicament, en particulier pour prévenir et/ou traiter les maladies respiratoires.

[0003] Etat de l'art

[0004] Les maladies inflammatoires respiratoires chroniques telles que l'asthme, la bronchopneumopathie chronique obstructive (BPCO), la rhinite allergique, l'arthrite rhumatoïde, mais encore les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin (M ICI ) touchent des millions de personnes dans le monde. Ces maladies chroniques ont un impact fort sur la qualité de vie des patients pour lesquels aucun traitement curatif n'est disponible.

[0005] La prévalence de ces maladies augmente fortement dans les pays occidentaux, ce qui constitue un problème médical, social et économique majeur. Les traitements actuels sont essentiellement symptomatiques et visent à traiter ou éventuellement prévenir les crises qui surviennent par période, permettant d'améliorer la qualité de vie des patients.

[0006] Ces traitements sont notamment basés sur des modulateurs de l'immunité à large spectre, tels que les corticostéroïdes. Ces derniers sont certes, très efficaces en traitement ponctuel, mais peuvent entraîner des effets secondaires délétères lors d'une prise régulière. Par exemple, les corticoïdes inhalés peuvent causer un retard de croissance chez l'enfant, la suppression de l'axe hypothalamique pituitaire surrénalien et un risque accru d'ostéoporose. De plus, certains patients, réfractaires aux corticostéroïdes, reçoivent de fortes doses causant des effets secondaires sévères tels que des désordres métaboliques ou un risque accru de maladies cardiovasculaires (De ludicibus et al. Molecular mechanism of glucocorticoid resistance in inflammatory bowel disease. World J Gastroenterol 2011. 17: 1095-108; Ora et al. Advances with glucocorticoids in the treatment of asthma: state of the art. Expert Opin Pharmacother 2020. 21: 2305-2316).

[0007] Alors que la résistance congénitale aux corticostéroïdes est rare, la résistance acquise est plus fréquente. La résistance congénitale résulte de mutations du gène du récepteur des glucocorticoïdes, alors que la résistance acquise est multifactorielle. Peu importe la forme, la résistance aux glucocorticoïdes est un problème thérapeutique grave limitant la réponse chez les patients atteints de maladies inflammatoires chroniques. La résistance acquise peut être attribuée à des modifications du microenvironnement cellulaire, qui seraient des conséquences d'une inflammation chronique. De multiples facteurs ont ainsi été identifiés, notamment des altérations de la signalisation en aval de l'action des cytokines, le stress oxydatif, l'hypoxie et les facteurs dérivés du sérum.

[0008] Des recherches ont également été menées dans le microbiote. Une souche spécifique d'E. faecalis a ainsi été découverte et isolée pour ses propriétés anti-inflammatoires telle que décrites dans la demande de brevet FR 1650656. Celle-ci possède des propriétés tout à fait avantageuses dans le traitement et/ou la prévention de maladies respiratoires telles que l'asthme.

[0009] Il existe donc un besoin médical fort pour de nouvelles solutions thérapeutiques permettant d'augmenter la réponse des tissus aux glucocorticoïdes et ainsi permettre de diminuer les doses de traitement d'agents anti-inflammatoires nécessaires et/ou d'augmenter leur efficacité.

[0010] Un objectif de la présente invention est donc d'apporter une solution qui soit simple, efficace et économique pour diminuer les doses de traitement anti-inflammatoire nécessaires et/ou pour augmenter leur efficacité et ainsi prévenir et/ou traiter les maladies respiratoires.

[0011] Résumé de l'invention

[0012] Pour répondre à cet objectif, les inventeurs ont identifié que l'association d'un principe actif basé sur des bactéries de l'espèce Enterococcus faecalis (ci-après E. faecalis) et d'un autre principe actif basé sur des agents anti-inflammatoires, préférentiellement des glucocorticoïdes, induit un effet synergique permettant de diminuer les doses de glucocorticoïde utile administrées à un patient, y compris des patients réfractaires aux glucocorticoïdes.

[0013] Les inventeurs ont ainsi observé que les souches seules à une MOI 10 (soit 10 cellules d’E. faecalis pour 1 cellule eucaryote) ou que le budésonide à faible dose (0,lnM) n'induisait pas d'effet, in vitro, sur la libération d'interleukine-8 (IL-8) induite par le Tumor Necrosis Factor (TNF)-a sur des cellules humaines d'origine pulmonaire BEAS-2B.

[0014] En revanche, lors de la co-incubation de la même dose de budésonide (0,lnM) en combinaison avec les souches d’E. faecalis (MOI 10), les inventeurs ont observé un effet synergique correspondant à 32% de l'inhibition de libération de l'IL-8, alors que l'inhibition de libération de l'IL-8 obtenue avec une dose 5 fois supérieure de budésonide seul (soit 0,5 nM) est de 55%. Ainsi, pour obtenir un effet similaire, il est nécessaire d'utiliser des doses extrêmement fortes de budésonide entraînant également de forts effets secondaires.

[0015] L'étude de l'effet potentialisateur d'E. faecalis sur un modèle plus complexe d'explants de poumons de souris axéniques en culture ex vivo a permis de confirmer les résultats in vitro en observant un effet anti-inflammatoire supérieur de la combinaison selon l'invention (budésonide 0, lnM + E. faecalis) à l'effet anti-inflammatoire obtenu avec une dose 50 fois supérieure de budésonide seul (5 nM).

[0016] L'association de glucocorticoïdes et de bactéries E. faecalis est ainsi particulièrement d'intérêt pour réduire la concentration utile de glucocorticoïdes utilisés en première intention. L'invention est donc particulièrement adaptée à des patients souffrant de maladies inflammatoires chroniques et présentant préférentiellement, une résistance aux corticostéroïdes.

[0017] Ainsi, l'invention concerne la combinaison de deux principes actifs, soit au moins une souche bactérienne de l'espèce E. faecalis (i) et un agent anti-inflammatoire (ii) pour son utilisation comme médicament chez l'Homme ou l'animal.

[0018] L'invention vise aussi le surnageant de culture obtenu à partir d'une des souches bactériennes d'E. faecalis et combiné avec un agent anti-inflammatoire.

[0019] Enfin, l'invention se rapporte particulièrement à une composition comprenant la combinaison d'au moins une souche bactérienne de l'espèce E. faecalis (et/ou son surnageant) (i) et d'un agent anti-inflammatoire (ii) et d'au moins un excipient acceptable (iii). Ledit excipient acceptable étant préférentiellement un excipient pharmaceutiquement acceptable lorsqu'il s'agit d'un produit destiné à être utilisé comme médicament pour un usage humain ou un usage vétérinaire. La composition est alors une composition pharmaceutique comprenant une souche d'E. faecalis et d'un agent anti-inflammatoire et d'au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable.

[0020] L'invention est ainsi particulièrement adaptée pour utiliser ladite combinaison ou ladite composition selon l'invention comme médicament. En effet, la présente invention est utile dans la prévention et/ou le traitement des maladies inflammatoires, en particulier des maladies respiratoires, plus particulièrement chroniques telles que l'allergie, l'asthme, la bronchopneumopathie chronique obstructive (BPCO), ou la rhinite allergique.

[0021] D'autres pathologies inflammatoires chroniques sont également d'intérêt telles que l'arthrite rhumatoïde ou les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin (M ICI ), telles que la maladie de Crohn ou la colite ulcéreuse ; l'inflammation excessive secondaire provoquée par une primo-infection, par exemple bactérienne, parasitaire mais également virale telle que la grippe, la bronchiolite du nourrisson, ou les SRAS (Syndrome Aiguë Respiratoire Sévère).

[0022] D'autres caractéristiques et avantages ressortiront de la description détaillée de l'invention, des exemples et des figures qui vont suivre.

[0023] Brève description des Figures

[0024] La Figure 1 représente l'effet-dose du budésonide sur les cellules BEAS-2B. Des cellules BEAS-2B ont été co-incubées avec du TNF-a (lpg/ml) seul ou avec différentes doses de Budésonide (1,5 ; 0,75 ; 0,5 ; 0,1 nM). Après 6h d'incubation, la concentration d'IL-8 a été mesurée dans le surnageant. Les niveaux d'IL-8 sont exprimés en pourcentage du taux d'IL-8 induit par une stimulation de 6h par le TNF-a. Les résultats correspondent à la moyenne + SEM d'au moins 3 expériences, n=6-12 réplicats techniques. * p<0.05 et *** p<0.001 comparé avec le contrôle TNF-a. La condition « medium » correspond au témoin négatif, montrant que les cellules ne produisent pas d'IL- 8 en absence de TNF-a.

[0025] La Figure 2 représente l'effet in vitro de la combinaison E. faecalis et du budésonide sur les cellules BEAS-2B. Des cellules BEAS-2B ont été co-incubées avec du TNF-a (lpg/ml) seul ou avec une souche d’E. faecalis (CNCM 1-4969 ; 1-5701 ; 1-5699) MOI 10:1, et/ou O.lnM de Budésonide, ou 0.5nM de budésonide. Après 6h d'incubation, la concentration d'IL-8 a été mesurée dans le surnageant par ELISA. Les niveaux d'IL-8 sont exprimés en pourcentage du taux d'IL-8 induit par une stimulation de 6h par le TNF-a. Les résultats correspondent à la médiane de 3 expériences, n=9 réplicats techniques. * p<0.05 et *** p<0.001 comparé avec le contrôle TNF-a, par un test non paramétrique Kruskal-Wallis suivi d'un post-test de Dunn.

[0026] La Figure 3 représente l'effet ex vivo de la combinaison E. faecalis CNCM 1-4969 et du budésonide sur les expiants de poumons de souris. Des expiants de poumons de souris ont été mis en culture seuls avec E. faecalis (CNCM 1-4969) 50 CFU, et/ou O.lnM de Budésonide, ou 0.5nM de budésonide. Après 24h d'incubation, la concentration de différentes cytokines a été mesurée dans le surnageant par dosage multiplex à technologie Luminex. Les niveaux de cytokine sont exprimés en pourcentage du taux mesuré dans la condition milieu à 24h. Les résultats correspondent à la moyenne + SEM d'une expérience, n = 3 réplicats biologiques par condition. * p<0.05, ** p<0.01 et *** p<0.001 comparé avec le contrôle milieu.

[0027] Description détaillée de l'invention

[0028] Définition [0029] Par « bactérie » au sens de l'invention, on entend un microorganisme unicellulaire capable de se reproduire par division cellulaire. Les bactéries sont classées par famille, genre, espèce. Chaque espèce bactérienne comprend une diversité de souches bactériennes. La souche bactérienne selon l'invention appartient à la famille Enterococcaceae, au genre Enterococcus et l'espèce faecalis.

[0030] Par « souche bactérienne » ou « souche » au sens de l'invention, on entend donc une souche bactérienne spécifique mais également toutes les bactéries issues de la souche ou obtenues à partir de la souche ou correspondant à la souche bactérienne et ayant les mêmes fonctions métaboliques, par exemple, au moins une bactérie prélevée d'une colonie issue de la souche. Préférentiellement, on entend également par souche bactérienne selon l'invention, une des souches déposées sous le numéro CNCM 1-4969 le 14 avril 2015 à la Collection Nationale des Cultures de Microorganismes (CNCM), 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, France, mais également sous le numéro CNCM 1-5701 et CNCM 1-5699 déposées le 16 juin 2021 à la Collection Nationale des Cultures de Microorganismes (CNCM), 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, France ainsi que les souches dérivées.

[0031] Par « souche dérivée » au sens de l'invention, on entend une souche bactérienne ayant une forte similarité avec l'une des souches bactériennes déposées sous le numéro CNCM I- 4969, ou CNCM 1-5701 ou CNCM 1-5699. Préférentiellement, la souche dérivée comprend une séquence nucléotidique ayant au moins 99% d'identité d'ANI avec la séquence nucléotidique du chromosome d'au moins une des souches CNCM 1-4969, ou CNCM 1-5701 ou CNCM 1-5699, plus préférentiellement, au moins 99,91%, au moins 99,92%, au moins 99,93%, au moins 99,94%, au moins 99,95%, au moins 99,96%, au moins 99,97%, au moins 99,98%, au moins 99,99% d'identité d'ANI avec la séquence nucléotidique du chromosome de l'une des souches CNCM 1-4969, ou CNCM 1-5701 ou CNCM 1-5699.

[0032] Par « ANI », on entend au sens de l'invention le pourcentage d'identité moyen des nucléotides calculé à partir de la comparaison deux-à-deux de toutes les séquences chromosomiques des deux souches bactériennes. Selon les connaissances générales bien connues de l'Homme du métier, à partir de ladite souche d'intérêt, l'ADN génomique peut être extrait à partir d'une culture bactérienne pure issue de ladite souche d'intérêt, suivi du séquençage de l'ADN selon différentes méthodes bien connues, par exemple Sanger, Roche 454, Illumina, Oxford Nanopore puis le génome est séquencé et assemblé par bioinformatique et les séquences obtenues sont analysées. Enfin, les séquences des chromosomes d'intérêt sont comparées deux à deux pour calculer l'ANI.

[0033] Par « surnageant » au sens de l'invention, on entend, le surnageant de culture de la souche bactérienne selon l'invention comprenant éventuellement des composés cellulaires de ladite souche et/ou débris cellulaires de ladite souche, et/ou des métabolites et/ou des molécules sécrétées par ladite souche.

[0034] Par « Homme » au sens de l'invention, on entend un patient humain. Ledit patient humain peut appartenir à n'importe quelle classe d'âge, c'est-à-dire que le patient peut être un nourrisson, un bébé, un enfant, un adolescent ou un adulte. Il est connu que les enfants, les bébés, les nourrissons et les personnes âgées sont plus sensibles aux maladies respiratoires, notamment l'asthme. Préférentiellement, l'Homme est résistant et/ou réfractaire aux traitements par corticostéroïdes, par exemple le budésonide.

[0035] Par « patient résistant et/ou réfractaire aux traitements par corticostéroïdes », on entend au sens de l'invention un patient à qui l'on administre un traitement à base de corticostéroïdes, qui ne répond pas audit traitement, c'est-à-dire que l'on n'observe pas chez le patient une inversion de la progression de l'inflammation ou une inversion ou régression de la progression de la maladie.

[0036] Par « prévention » au sens de l'invention, on entend la réduction à un degré moindre du risque ou de la probabilité d'occurrence d'un phénomène donné, c'est-à-dire, dans le contexte de la présente invention de l'inflammation, préférentiellement des maladies respiratoires, par exemple l'asthme.

[0037] Par « traitement » au sens de l'invention, on entend une diminution de la progression de la maladie, une stabilisation, une inversion ou régression, voire une interruption ou inhibition de la progression de l'inflammation, préférentiellement des maladies respiratoires, par exemple l'asthme. Dans le contexte de l'invention, ces termes s'appliquent également sur un ou plusieurs symptômes desdites maladies de la présente invention.

[0038] Par « maladie respiratoire » au sens de l'invention, on entend ici les maladies de l'appareil respiratoire ou provoquant des troubles de la respiration.

[0039] Par « excipient acceptable » au sens de l'invention on entend tout composé permettant de faciliter la mise en forme de la composition et ne modifiant pas la nature de l'activité biologique du principe actif. Un excipient acceptable peut être un solvant, tampon, solution saline, plastifiant, lubrifiant, milieu de dispersion, agents retardant l'absorption, agent d'écoulement, agent isotonique. Préférentiellement, il s'agit d'excipient pharmaceutiquement acceptable qui sont choisis selon la forme pharmaceutique et le mode d'administration souhaité, parmi les excipients habituels et connus de l'homme du métier et apte à un usage humain et/ou vétérinaire. L'excipient sera ainsi choisi en fonction de la voie d'administration, par exemple approprié pour une administration orale, intraveineuse, intramusculaire, topique etc.

[0040] Par « administration simultanée », on entend aussi bien l'administration sous forme d'une unique formulation pharmaceutique associant les deux principes actifs, E. faecalis et un agent anti-inflammatoire tel qu'un corticostéroïde, que l'administration séparée des deux formulations pharmaceutiques distinctes contenant chacune l'un des deux principes actifs en prise simultanée ou à très faible intervalle (au maximum environ 1 heure).

[0041] Combinaison selon l'invention

[0042] La présente invention consiste donc en un nouveau produit qui combine deux principes actifs, ci-après dénommé la combinaison selon l'invention, d'une part des souches de E. faecalis et d'autre part un agent anti-inflammatoire, en particulier un corticostéroïde, permettant ainsi de potentialiser l'effet anti-inflammatoire du corticoïde et d'en réduire la concentration utile et ainsi réduire les effets indésirables chez les patients.

[0043] La présente invention a donc pour objet une combinaison comprenant au moins une souche bactérienne de l'espèce Enterococcus faecalis (i) et au moins un agent antiinflammatoire (ii) pour son utilisation comme médicament chez l'Homme ou l'animal.

[0044] Les inventeurs ont précédemment découvert et isolé des souches bactériennes d'E. faecalis à partir de poumons de souris, de matières fécales humaines ou de fromages, pour lesquels les inventeurs ont identifié des propriétés anti-inflammatoires.

[0045] E. faecalis est un entérocoque présent naturellement dans le tube digestif des humains et des animaux. Il est notamment responsable d'infections nosocomiales et peut causer des bactériémies, endocardites, ainsi que des infections du tractus urinaire, de la prostate ou de l'épididyme.

[0046] Du fait de la grande diversité génétique au sein de l'espèce E. faecalis. Une méthode de typage génomique multilocus (MLST), basée sur l'analyse de la séquence nucléotidique de 7 loci (~3 kb sur 3,5 Mb) du core génome, a permis de définir plus de 1000 types génomiques (ST pour Sequence type) (Ruiz-Garbajosa 2006 ; Neumann 2019). Les ST possédant alors au moins 6 allèles sur les 7 loci sont considérés comme appartenant à un même Complexe Clonal (CC). Enfin, un séquençage de nouvelle génération a permis de développer une méthode de typage génomique à l'échelle du génome (cgMLST pour core genome multilocus sequence typing) qui, pour E. faecalis, utilise 1972 loci soit plus de la moitié du génome (Neumann 2019), ce qui a permis de confirmer les précédentes données obtenues avec le génotypage MLST.

[0047] En l'espèce, lesdites souches de l'espèce E. faecalis appartiennent préférentiellement au groupe génomique CC40 ou CC21.

[0048] Selon un autre objet préféré, ladite souche présente dans la combinaison selon l'invention comprend une séquence d'ARNr 16S de SEQ ID NO :1.

[0049] Selon un mode de réalisation particulièrement préféré, la souche est choisie parmi la souche déposée sous le numéro CNCM 1-4969, CNCM 1-5701 et CNCM 1-5699.

[0050] La souche CNCM 1-5699 appartient au Complexe Clonal 21, plus particulièrement au types génomiques ST21 et possède un chromosome de 2843733 pb (paire de base). La souche CNCM 1-5701 et la souche CNCM 1-4969 appartiennent toutes deux au Complexe Clonal 40, respectivement au type génomique ST284 et ST40, et leur chromosome possède respectivement 2982831 pb et 3056663 pb.

[0051] La souche bactérienne ou éventuellement le mélange de souches bactériennes présent(e) dans la combinaison selon l'invention peut être sous toute forme produisant les effets escomptés et l'efficacité décrite dans la présente demande. En particulier, la souche peut être sous forme vivante (cultivable ou non), morte, semi-vivante, atténuée ou inactivée.

[0052] Ces formes peuvent être obtenues par différentes techniques bien connues de l'homme du métier. On citera par exemple les techniques suivantes : irradiation, inactivation thermique ou lyophilisation, en particulier par la chaleur, l'exposition à un pH approprié, aux UV, aux rayons gamma, aux rayons X ou à la mise sous haute pression.

[0053] Par « semi-vivante » on entend une bactérie à faible activité physiologique dont la capacité à proliférer est réduite, temporairement ou définitivement. Le terme « inactivé » désigne une bactérie qui n'est plus capable, temporairement ou définitivement, de proliférer. Le terme « morte » désigne une bactérie qui n'est plus capable, définitivement, de proliférer. Les bactéries mortes ou inactivées peuvent avoir les membranes cellulaires intactes ou rompues. Ainsi, le terme « inactivé » désigne également les extraits et lysats de bactéries obtenues. Il est particulièrement avantageux d'utiliser de telles formes dans les compositions pharmaceutiques de l'invention.

[0054] Selon une variante, la combinaison selon l'invention comprend une bactérie d'E. faecalis et/ou le surnageant de culture obtenu à partir d'une des souches bactériennes d'E. faecalis selon l'un des quelconques modes de réalisation décrit précédemment.

[0055] Lorsque la combinaison comprend un surnageant, celui-ci peut être obtenu à partir d'une des souches déposées sous le numéro CNCM 1-4969, CNCM 1-5701 et CNCM 1-5699 ou d'un mélange de plusieurs souches d'E. faecalis, préférentiellement d'un mélange des souches déposées sous le numéro CNCM 1-4969, CNCM 1-5701 et CNCM 1-5699.

[0056] Ainsi, la combinaison selon l'invention comprend au moins une souche bactérienne et/ou un surnageant de culture selon l'un des modes de réalisation précédemment décrits, et un agent anti-inflammatoire.

[0057] L'agent anti-inflammatoire est préférentiellement un agent de type corticostéroïde. Lorsque l'agent anti-inflammatoire est un corticostéroïde, celui-ci est préférentiellement le budésonide.

[0058] Les corticostéroïdes désignent à la fois des hormones synthétisées par les glandes surrénales et des médicaments anti-inflammatoires. Dans le sens de la présente invention le terme se rapporte aux médicaments anti-inflammatoires. Il s'agit d'hormones de synthèse utilisées en thérapie pour leurs propriétés anti-inflammatoires. Elles peuvent être efficaces à court terme, à moyen terme et à plus long terme dans le traitement des maladies inflammatoires et/ou auto-immunes, comme la polyarthrite rhumatoïde, le lupus érythémateux disséminé et certains troubles respiratoires.

[0059] Préférentiellement, la combinaison d'E. faecalis et de l'agent anti-inflammatoire est destinée à être administrée de façon simultanée ou étalée dans le temps en tant que médicament.

[0060] Composition selon l'invention

[0061] La combinaison précédemment décrite est avantageusement administrée dans une composition, préférentiellement une composition pharmaceutique.

[0062] Ainsi, l'invention concerne une composition comprenant la combinaison selon l'invention et au moins un excipient acceptable, préférentiellement un excipient pharmaceutiquement acceptable.

[0063] La composition peut éventuellement comprendre un milieu physiologiquement acceptable, c'est-à-dire un milieu qui est compatible avec le microorganisme mais également l'organisme de l'individu auquel ladite composition doit être administrée. Il peut s'agir, par exemple, d'un solvant non toxique tel que l'eau, de tampon, solutions salines. En particulier, ledit milieu est compatible avec une administration orale. [0064] Ainsi, la composition comprend au moins une souche bactérienne de l'espèce E. faecalis, préférentiellement choisie parmi la souche déposée sous le numéro CNCM 1-4969, CNCM 1-5701, CNCM 1-5699 et leur mélange ; et/ou le surnageant de culture obtenu depuis lesdites souches et au moins un excipient acceptable et/ou un milieu physiologiquement acceptable.

[0065] Eventuellement, la composition selon l'invention peut comprendre en sus de la combinaison selon l'invention, au moins un composé additionnel. Le composé additionnel peut être un ingrédient, une molécule, un troisième principe actif, un microorganisme, une bactérie ou un mélange de bactéries.

[0066] La composition selon l'invention se présente sous toute forme acceptable pour être administrée à un patient, préférentiellement un patient humain ou animal (non-humain). Ainsi, la composition selon l'invention vise également les usages vétérinaires.

[0067] La composition peut se présenter sous toute forme adaptée. Ainsi, la composition selon l'invention peut se présenter sous une forme choisie parmi une poudre, poudre à nébuliser, poudre microencapsulée, poudre microencapsulée à nébuliser, gélule, capsule, comprimé, pastille, granulés, solution, solution à nébuliser, émulsion, émulsion à nébuliser, suspension, suspension à nébuliser, ampoule, suppositoire, inhalateur et un sirop, plus préférentiellement sous une forme d'inhalateur tel qu'un appareil de nébulisation.

[0068] De façon préférée, la composition selon l'invention se présente sous forme solide, liquide ou lyophilisée, plus préférentiellement liquide apte à être nébulisée ou solide sous forme de poudre.

[0069] Lorsque la composition se présente sous forme liquide, elle comprend l'agent antiinflammatoire et au moins une souche bactérienne selon l'invention et/ou souche dérivée et/ou un milieu de culture physiologiquement acceptable pour lesdites bactéries, qui permet de les conserver, comme, par exemple le milieu BHI, ou un milieu équivalent ne contenant pas de produit dérivé d'origine animale.

[0070] Lorsque la composition selon l'invention se présente sous forme solide, l'agent antiinflammatoire et les souches bactériennes selon l'invention et/ou de la souche dérivée peuvent être présentes sous forme lyophilisée, et peuvent comprendre également des excipients tels que par exemple la cellulose microcristalline, le lactose, le saccharose, le fructose, le lévulose, les amidons, le stachyose, le raffinose, l'amylum, le lactate de calcium, le sulfate de magnésium, le citrate de sodium, le calcium stearate, la polyvinylpyrrolidone, la maltodextrine, les galactooligosaccharides, les fructooligosaccharides, les pectines, les béta- glucanes, les lactoglobulines, les isomaltooligosaccharides, les polydextroses, le mannitol, le sorbitol, le glycérol, le dioxide de silice, le stéarate de magnésium, la cystéine, le mannose, le galactose, le glucose anhydre, le monoydrate de glucose et/ou leurs mélange.

[0071] L'homme du métier saura choisir au mieux les voies et modes d'administration de la composition selon l'invention, ainsi que les posologies et formes galéniques optimales, selon les critères généralement pris en compte dans la fabrication d'un médicament ou l'établissement d'un traitement pharmaceutique ou vétérinaire. De préférence, la composition selon l'invention est sous une forme adaptée à une administration par voie orale, nasale, parentérale, rectale, sublinguale, oculaire, auriculaire, intramusculaire, intraveineuse, inhalée ou cutanée, plus préférentiellement par nasale ou voie inhalée à l'aide d'un appareil de nébulisation.

[0072] La composition peut comprendre 0,05 mg à 4 mg par jour, préférentiellement de 0,25 mg à 4 mg par jour. Lorsque le patient est un adulte, la composition peut comprendre de 0,1 mg à 4 mg par jour, préférentiellement de 0,5 mg à 4 mg par jour. Lorsque le patient est un enfant, la composition peut comprendre de 0,05 mg à 2 mg par jour, préférentiellement de 0,25 mg à 2 mg par jour.

[0073] De façon particulièrement préférée, la composition comprend au moins 10 ³ unités formant des colonies (CFU) de bactéries par dose quotidienne de composition à administrer, préférentiellement de 10 ⁴ à 10 ⁹ CFU, plus préférentiellement de 10 ⁵ à 10 ⁷ CFU.

[0074] Préférentiellement cela correspond à une dose quotidienne de bactéries à administrer, quel que soit le poids de la personne ou de l'animal. Ainsi et de façon préférée, cette dose est administrée en une seule fois. La composition utile comprend alors au moins 10 ³ , préférentiellement de 10 ⁴ à 10 ⁹ CFU de bactéries par dose quotidienne à administrer, encore plus préférentiellement de 10 ⁵ à 10 ⁷ CFU.

[0075] Lesdites bactéries sont un mélange de bactéries correspondant ou issues d'une des souches selon l'invention, y compris les souches dérivées.

[0076] Le terme CFU (Colony Forming Unit) ou UFC (Unité Formant Colonie) est une unité permettant de dénombrer le nombre de bactéries capables de donner naissance à une colonie lors de la propagation, c'est-à-dire des bactéries viables. Il faut comprendre que des bactéries non viables peuvent également être présentes dans les compositions et qu'en général, elles ne devraient pas avoir d'effet négatif sur les propriétés des bactéries vivantes de la composition.

[0077] Préférentiellement, la dose quotidienne est mesurée par gramme ou millilitre de la composition selon l'invention finale.

[0078] Selon un autre objet préféré, lorsque la composition selon l'invention comprend un mélange de bactéries vivantes ou non, ledit mélange comprenant au moins des bactéries vivantes, la composition comprend préférentiellement, au moins 1% de bactéries vivantes (en nombre), plus préférentiellement, au moins 10% de bactéries vivantes (en nombre), encore plus préférentiellement au moins 50% de bactéries vivantes (en nombre).

[0079] Les bactéries vivantes sont un mélange de bactéries correspondant à l'une des souches selon l'invention, y compris les souches dérivées, préférentiellement appartenant au Complexe Clonal CC40 ou CC21, plus préférentiellement une souche ayant une séquence d'ARN 16S de SEQ ID NO :l.

[0080] Dans le cas de la mise en oeuvre d'un surnageant de l'une quelconque des souches bactériennes susmentionnées, la composition selon l'invention l'incluant peut notamment en comprendre une teneur comprise entre 0,1 et 99 % en poids, notamment de 5 à 95 % en poids, en particulier de 10 à 90 % en poids et plus particulièrement de 15 à 85 % en poids, par rapport au poids total de la composition.

[0081] Ainsi, une composition selon l'invention peut comprendre une teneur comprise entre 0,1 et 99 % en poids, notamment de 5 à 95 %, en particulier de 10 à 90 % en poids, plus particulièrement de 15 à 85 % en poids, de surnageant par rapport au poids total de la composition.

[0082] Lorsque la composition est destinée à un usage thérapeutique, la composition comprend au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable, la composition selon l'invention est alors une composition pharmaceutique.

[0083] Par « excipient pharmaceutiquement acceptable », on entend ici un excipient dont l'administration à un individu ne s'accompagne pas d'effets délétères significatifs. Les excipients pharmaceutiquement acceptables sont bien connus de l'homme du métier.

[0084] Ainsi, l'invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant le ou les ingrédients inclus dans la composition selon l'invention et selon l'un des quelconques modes de réalisation décrits précédemment. Ladite composition pharmaceutique est un médicament.

[0085] Selon une variante, l'invention porte sur un kit pharmaceutique comprenant au moins une souche E. faecalis, préférentiellement la souche CNCM 1-4969 ou CNCM 1-5701 ou CNCM 1-5699 ou leur mélange et un co rti co stéroïde préférentiellement le budésonide, pour une administration simultanée ou étalée dans le temps.

[0086] Dans le kit pharmaceutique selon l'invention, la souche E. faecalis et le co rti co stéroïde tel que le budésonide peuvent être présents sous la forme d'une unique formulation pharmaceutique associant les deux principes actifs 1) E. faecalis et 2) le corticostéroïde, ou bien de deux formulations distinctes comprenant chacune l'un des principes actifs (permettant alors une administration simultanée ou séquentielle).

[0087] Utilisation

[0088] La composition ou le kit selon l'invention est utile comme médicament pour un usage dans la santé humaine ou vétérinaire.

[0089] Préférentiellement, la composition selon l'invention est destinée à prévenir et/ou traiter l'inflammation et ainsi être utilisée dans le traitement et/ou la prévention des maladies inflammatoires, plus préférentiellement des maladies respiratoires et/ou des maladies inflammatoires de l'intestin et/ou l'arthrite rhumatoïde et/ou des maladies inflammatoires associées à une infection virale, parasitaire ou bactérienne.

[0090] On peut ainsi citer à titre d'exemple l'asthme (léger, modéré ou sévère), par exemple, bronchique, allergique, intrinsèque, extrinsèque, induit par l'exercice, induit par des allergènes, tels la poussière, l'asthme résistant aux stéroïdes ; la bronchite, y compris la bronchite infectieuse et à éosinophiles, d'une maladie pulmonaire obstructive chronique (COPD), comme la BPCO (broncho-pneumopathie chronique obstructive), la fibrose cystique, la fibrose pulmonaire, y compris cryptogénique alvéolite fibrosante, la fibrose pulmonaire idiopathique, pneumopathies interstitielles idiopathiques, la fibrose compliquant une thérapie antinéoplasique et une infection chronique, y compris la tuberculose et l'aspergillose et d'autres infections fongiques; vascularite et troubles thrombotiques du système vasculaire pulmonaire et hypertension artérielle pulmonaire; activité antitussive comprenant le traitement de la toux chronique associée à des affections inflammatoires et sécrétoires des voies respiratoires et la toux iatrogène; rhinite aiguë et chronique, y compris la rhinite médicamenteuse, et la rhinite vasomotrice; per annuelle et saisonnière rhinite allergique y compris la rhinite nerveuse (rhume des foins); polypose nasale; infection aiguë virale, y compris le rhume, et l'infection due au virus respiratoire syncytial (VRS), la grippe, les bronchopathies pulmonaires, les infections aux coronavirus (SRAS notamment) et l'adénovirus, un œdème pulmonaire, embolie pulmonaire, pneumonie, sarcoïdose pulmonaire, la silicose, poumon de fermier et les maladies apparentées; pneumopathie d'hypersensibilité, insuffisance respiratoire, syndrome de détresse respiratoire aiguë, l'emphysème, la bronchite chronique, la tuberculose et le cancer du poumon.

[0091] La composition selon l'invention vise également les pathologies respiratoires ayant des « dérégulations immunitaires » communes avec celles observées dans l'asthme comme l'induction de certaines cytokines (IL-6, TSLP, IL-8, IL-5, IL-13, IL-17) et des dérégulations mucosales (hyper production de mucus) et des modifications de l'épithélium bronchique.

[0092] En particulier, les utilisations de la composition selon la présente invention englobent la prévention et le traitement des maladies respiratoires chroniques, par exemple l'asthme, la BPCO et la rhinite. Encore plus particulièrement, les utilisations de la composition selon la présente invention portent sur la prévention et le traitement de l'asthme. L'utilisation de la souche de l'invention et la composition la comprenant pourront donc être notamment utilisées efficacement pour prévenir l'apparition de l'asthme chez des patients connus pour leur prédisposition pour cette pathologie (par exemple, des patients ayant une prédisposition familiale au développement de l'asthme).

[0093] Etant donné les voies inflammatoires communes, par exemple la production d'interleukine comme IL-8, la composition selon l'invention est également utile dans une maladie choisie parmi la maladie de Crohn, la colite ulcéreuse, la recto-colite ulcéro- hémorragique, la diverticulite, l'cesophagite, la gastrite, la pancréatite, l'ulcère gastro- duodénal et le syndrome du côlon irritable.

[0094] Enfin, la composition selon l'invention est particulièrement d'intérêt lorsque l'Homme ou l'animal est résistant et/ou réfractaire aux corticostéroïdes.

[0095 ] Procédé de préparation d'une composition selon l'invention

[0096] La combinaison ou la composition selon l'invention peut être produite par tout moyen bien connu de l'homme du métier.

[0097] A titre d'exemple, la souche selon l'invention est produite par culture, par exemple, dans un milieu de croissance connu de l'homme du métier (par exemple, un milieu BHI : « Brain-Heart Infusion ») de 8 heures à 3 jours, à une température de 30-37°C, avec ou sans ajustement du pH. Le bouillon de fermentation contenant les cellules bactériennes est recueilli. Le bouillon peut être utilisé tel quel, concentré ou lyophilisé. Avantageusement, les bactéries seront recueillies, par exemple par centrifugation puis remises en suspension dans un tampon approprié, par exemple du PBS (« phosphate buffered saline »). La concentration bactérienne peut être établie en utilisant un cytomètre de flux ou un autre procédé équivalent. [0098] Les bactéries pourront ensuite être nébulisée partir de la forme liquide ou de la forme lyophilisée. Un solvant pourra être ajouté afin de faciliter la nébulisation.

[0099] L'invention est à présent illustrée par des exemples non limitatifs de composition selon l'invention et par des résultats.

[0100] Exemples

[0101] Exemple 1 - Dose minimale du budésonide seul sur les cellules BEAS-2B.

[0102] Le budésonide est un corticostéroïde aux propriétés anti-inflammatoires in vitro et in vivo et utilisé chez l'Homme, notamment dans le traitement de l'asthme.

[0103] Des cellules bronchiques humaines (BEAS-2B) sont mises en culture et une situation pro-inflammatoire est induite via l'ajout dans le milieu de TNF-a. Les cellules BEAS-2B répondent alors par la libération d'IL-8 dans le milieu. Le dosage de l'IL-8 après 6h permet d'estimer l'état d'activation des cellules, qui peut être réduit par l'ajout d'un agent antiinflammatoire.

[0104] Les inventeurs ont ainsi identifié une dose de budésonide qui induit peu ou pas d'effet anti-inflammatoire dans le modèle BEAS-2B, soit 0,1 nM.

[0105] Exemple 2 - Effets anti-inflammatoires in vitro de la combinaison selon l'invention.

[0106] Les inventeurs ont ensuite cherché à tester les effets de la combinaison selon l'invention soit E. faecalis et budésonide sur le modèle BEAS-2B.

[0107] Pour cela, ils ont utilisé 3 souches distinctes : CNCM 1-4969 ; CNCM 1-5701 et CNCM I- 5699. D'après les analyses de génomes, ces trois souches sont phylogénétiquement très proches puisque l'homologie de séquence du gène de l'ARN 16S desdites trois souches est de 100%. Malgré une homologie de séquence de l'ARN 16S, les trois souches présentent notamment des propriétés anti-inflammatoires différentes, en particulier un profil cytokinique différent. Il en résulte une efficacité différente pour chaque souche.

[0108] Les souches sont, dans un premier temps, ajoutées seules. Les 3 souches CNCM 1-4969, CNCM 1-5701 et CNCM 1-5699 à une MOI 10 :1, ne présentent pas d'effet sur la libération d'IL- 8 induite par le TNF-a (Figure 2), à l'instar de la dose O.lnM de budésonide.

[0109] Dans un second temps, lors de la co-incubation des cellules BEAS-2B stimulées au TNF- a avec 0,lnM de budésonide et l'une des souches d'E. faecalis (CNCM 1-4969 ou CNCM 1-5701 ou CNCM 1-5699), les inventeurs ont observé un effet synergique de la combinaison selon l'invention qui induit une inhibition de 32%, 31% et 12% respectivement avec les souches CNCM 1-4969, CNCM 1-5701 et CNCM 1-5699 de libération d'IL-8.

[0110] La souche d'E. faecalis CNCM 1-5699, associée au budésonide 0,lnM tend à réduire l'IL- 8 induite par le TNF-a de 12%.

[0111] L'effet de la combinaison budésonide 0,lnM et CNCM 1-4969 ou CNCM 1-5701 provoque une inhibition de 30%, alors que le budésonide seul et CNCM 1-4969 ou CNCM I- 5701 seules n'ont pas d'effet démontrant ainsi une synergie d'action de la combinaison selon l'invention par rapport au budésonide ou E.faecalis administré seul (Figure 2). L'inhibition avec une dose 5 fois supérieure de budésonide seul, est de 50%.

[0112] Exemple 3 - Essai des effets anti-inflammatoires ex vivo de la combinaison selon l'invention.

[0113] Les inventeurs ont poursuivi leurs travaux sur l'effet potentialisateur d'f. faecalis sur un modèle plus complexe d'explants de poumons de souris axéniques en culture ex vivo. Ces expiants ont une production basale de différentes cytokines, laquelle peut être modifiée par la présence d'éléments immunomodulateurs.

[0114] Les inventeurs ont alors observé que 0,1 nM de budésonide et 50 CFU de CNCM 1-4969 seuls n'avaient pas d'effets, ou des effets modestes sur les cytokines mesurées dans le surnageant des expiants (Figure 3).

[0115] En revanche, lors de la co-incubation avec une combinaison de 0,lnM de budésonide et 50 CFU d’E. faecalis CNCM 1-4969, Les inventeurs ont observé un effet synergique induisant une forte inhibition de la libération des cytokines pro-inflammatoires IL-2, IL-18, IL-13, IFN-y et IL-6.

[0116] La combinaison selon l'invention (budésonide 0,lnM - CNCM 1-4969) permet d'obtenir un effet anti-inflammatoire supérieur à celui obtenu avec une dose 50 fois supérieure de budésonide seul, démontrant là encore l'effet synergique de la combinaison selon l'invention (Figure 3).

[0117] En conclusion, les inventeurs ont pu démontrer que la combinaison associant les souches d’E. faecalis et le budésonide permet d'obtenir un effet synergique anti-inflammatoire. Ainsi, une dose du corticostéroïde qui seul n'a pas d'effet anti-inflammatoire, montre une efficacité significative in vitro et ex vivo lorsqu'elle est associée à une souche d’E. faecalis.