CONSORCIO DE BACTERIAS RESISTENTES A TIODICARB (CARBAMATO) Y A BIFENTRINA (PIRETROIDE) Y SU USO EN ABONOS LÍQUIDOS

A) DESCRIPCION

1. ANTECEDENTES DE LA INVENCION

Dado que el ESTADO DE LA TÉCNICA sobre la investigación científica y aplicación tecnológica enfocados a inducir el crecimiento, repoblación y desarrollo de un consorcio de microorganismos benéficos que toleren trazas químicas que quedan en los suelos y en los residuos orgánicos, y que además resistan a nuevas generaciones de sustancias que van desplazando a los agroquímicos convencionales (y que son prohibidos en la agricultura) , está principalmente determinada en la PATENTE No. PA/2006/003777 , otorgada por el IMPI (27 de abril de 2017) donde se aislaron consorcios de microorganismos resistentes a compuestos organoclorados y organofosforados , en esta nueva solicitud se plasma la ACTIVIDAD INVENTIVA de desarrollar, cultivar y seleccionar consorcios aerobios de microorganismos resistentes a compuestos químicos de nueva generación de plaguicidas y de biocontrol como lo son los compuestos piretroides y

carbamatos que son en teoría de uso controlado por los efectos secundarios que generan contaminación de suelo, mantos acuíferos, y que afectan al desarrollo agrícola.

En este documento parte de la NOVEDAD consiste en desarrollar un consorcio con especies bacterianas específicas, adaptadas para que resistan, toleren y mineralicen la materia orgánica contaminada con carbamatos como el tiodicarb y piretroides como la bifentrina, compuestos que son utilizados actualmente en la industria agrícola, pecuaria y presentes en los residuos orgánicos. Con estos residuos orgánicos (por ejemplo, equinaza, cachaza, lácteos, enzimas pancreáticas, carbohidratos, etc) , se producen BioAbonos líquidos; este consorcio microbiano, los enriquece y se obtiene un producto con una microcarga bacteriana que al aplicarlos a los cultivos, captan nitrógeno atmosférico y lo hacen disponible a las plantas, solubilizan el fósforo presente en suelos como P2O4 adicionándole un O para convertirlo en P2O5 asimilable por las plantas, contiene microorganismos antagonistas de algunos patógenos, y repuebla el suelo con bacterias benéficas. Es importante anotar que los microorganismos que conforman nuestros consorcios NO ESTÁN GENÉTICAMENTE MODIFICADOS ni son patógenos para los humanos, ni para animales, ni para las plantas.

Con la prohibición del uso de los compuestos órgano-clorados y órgano-fosforados como insecticidas en la segunda mitad del siglo XX, los compuestos carbamatos y piretroides se consolidan como una alternativa de uso. Los carbamatos son sustancias insecticidas conformadas por un átomo de N unido a un grupo lábil, el ácido carbámico; su característica principal es su alta toxicidad, su baja estabilidad química y su nula acumulación en tejidos; y los piretroides, son moléculas con actividad insecticida, permanecen más tiempo en el medio ambiente ya que la modificación química de su fórmula los hace más estables a la luz solar y al calor. Estos productos se usan en forma indiscriminada en la industria agrícola y pecuaria, generando residualidad.

Esta investigación se enmarca en los lineamientos del Programa 21 de Naciones Unidas (Capítulos 10, 11 ,12 y 14 respectivamente) , sobre la desertificación y la sequía; la agricultura y el desarrollo sostenible. Se estima que la degradación de la tierra a escala mundial se extiende a más de 2000 millones de hectáreas, poniendo en peligro los medios de subsistencia de más de 1000 millones de personas. Se calcula que aproximadamente las 2/5 partes de la superficie de la tierra son terrenos áridos, con un limitado suministro

de agua dulce, y un alto porcentaje de éstas se encuentran degradadas. Aproximadamente el 65% de la tierra cultivable ya ha perdido alguna función biológica y/o física.

En Latinoamérica, el uso indiscriminado de agroquímicos utilizados en la agricultura durante décadas, han dejado una residualidad, generando la contaminación de suelos, aguas superficiales y subterráneas. "Los plaguicidas están diseñados para matar, reducir o repeler los insectos, hierbas, roedores, hongos y otros organismos que puedan amenazar la salud pública y las economías de las naciones . Cuando estos productos químicos se manejan o depositan inadecuadamente pueden afectar la salud humana." "Los riesgos principales ligados a la salud humana de la exposición crónica a bajas dosis se relacionan con la aparición de cáncer, defectos de nacimiento, afecciones del sistema nervioso y del funcionamiento del sistema endocrino". Aseveraciones tomadas de: Childhood Pesticides Poisoning: Information for Advocacy and Action", UNEP Chemicals, May 2004. En el desarrollo de nuestra investigación científica, hemos encontrado suelos que presentan ausencia de micro carga por el excesivo uso de agroquímicos a los que han sido sometidos.

Ejemplo: Cultivo de arroz en zonas de Ibagué (Colombia) . Cultivo de jitomate en Sinaloa (México. Cultivo de Soja en Provincia de Santa Fe (Argentina, entre otros casos.

La conciencia ambiental, el conocimiento ecológico, las actitudes y valores hacia el medio ambiente han ido ganando espacio en nuestras comunidades. El problema de los residuos sólidos municipales, domiciliarios, agrícolas y pecuarios continua aumentando y su producción es excesiva, la falta de separación en la fuente, la mala disposición, la falta de áreas para su manejo y la falta de tratamiento o aprovechamiento. Dentro de los problemas más relevantes que se causan esta la producción de gases contaminantes de la atmósfera, los lixiviados contaminantes de suelos, aguas subterráneas, aguas superficiales y además la generación de focos de enfermedades o vectores transmisores de ellas. Los residuos sólidos orgánicos actuales de cualquier fuente, son muy diferentes a los producidos hace 20 años debido a la acumulación de trazas químicas, esta toxicidad esta directamente relacionada con la evolución de los plaguicidas, herbicidas y acaricidas entre otros.

Los Organismos Internacionales, como la FAO (Organización para la Agricultura y Alimentación) y la OMS (Organización

Mundial de la Salud) , han establecido los niveles máximos

admisibles respecto a la ingestión de plaguicidas, sin embargo las autoridades nacionales de cada país son las encargadas de establecer una legislación apropiada y vigilar cuidadosamente el uso de éstos y la cantidad de residuos mediante controles analíticos adecuados.

El presente es un desarrollo científico con bacterias aerobias, solubilizadoras de fósforo y antagonistas de patógenos del banco de cepas del laboratorio del Dr. Luis Orlando Castro Cabrera, cabe mencionar que los microorganismos utilizados en estas investigaciones fueron inicialmente aislados por el grupo del Dr. Luis Orlando Castro Cabrera conforme lo descrito en la patente 11851 de Colombia, dichas cepas se han trabajado desde 1984.

Las cepas se someten a varias etapas de estrés mediante cambios inducidos, adicionando trazas para lograr quimio resistencia al piretroide sintético bifentrina (2- metilbifenil-3-ilmetil (2) - (1RS, 3RS) -3- (2-cloro 3, 3, 3- trifluroprop-enil ) -2, 2-dimetilciclopropanocarboxilato;

código alfanumérico CA DPR Chem Code 2300. CAS 82657-04-3. CIPAC 415. FMC 54800. PC Code 128825) y al carbamato tiodicarb (C10H18N4O4S3 ) .

Es importante indicar que los consorcios de microorganismos aquí descritos han sido depositados ante el INIFAP en el Centro Nacional de Recursos Genéticos bajo el Número de accesión atribuido por la AUTORIDAD INTERNACIONAL DE DEPOSITO: CM-CNRG TB46 (Se anexan los certificados depósito) . Con la utilización de estos consorcios, en la producción de fertilizantes líquidos, estamos poniendo al servicio del agro un producto seguro y efectivo para el control de plagas, como una alternativa al uso de insecticidas y pesticidas de origen químico.

El siguiente protocolo de aislamiento de cepas resistentes y la conformación del consorcio microbiano indica que cada una de las cepas mencionadas fue evolucionada hacia una resistencia adquirida SIN LA MANIPULACION DEL GENOMA de cada organismo. Por otro lado cada cepa fue aislada y seleccionada independientemente mediante cultivos en etapas sucesivas con incrementos en la concentración de piretroides sintéticos como la bifentrina y carbamatos como el tiodicarb.

Los porcentajes de cada microorganismo perteneciente al consorcio oscilan entre 20-30% de UFC de cada una de las

cepas. La variabilidad de la cantidad de cada cepa dependerá de las características del sustrato al que se enfrentará el consorcio .

DESCRIPCION DEL PROCEDIMIENTO

Se establece la logística para desarrollar cada una de las etapas de la investigación con los dos (2) grupos de ingredientes (tiodicarb y bifentrina) de la siguiente manera:

MATERIALES Y METODOS

Cepas de bacterias, nitrificantes, solubilizadores de fósforo y antagonistas de algunos patógenos:

a) Azotobacter vínelandii

b) Bacillus megaterium

c) Bacillus subtillis

d) Bacillus thurinqiensis

e) Clostridium pasteuranium

f) Rhizobium

Preparación para desarrollo de etapas

1. Se realiza la esterilización del material de vidrio en autoclave .

2. Se prepara la cantidad requerida del medio de cultivo Agar SPC, Agar Malta (AM) y (PDA) para disponer de colonias viables.

3. Se determina la dosis letal (DL) de aplicación a una hectárea tanto de tiodicarb como de bifentrina, Se preparan 10 cajas de Petri con 0.1 DL de tiodicarb o bifentrina. Las cajas se incuban inicialmente a temperatura de 25°C por 72 horas y con luz fría.

Metodología a . Las cajas Petri se colocan en la campana de flujo laminar junto con las muestras diluidas, para las siembra de microorganismos en las placas se toma una muestra de las cepas en un mi con la pipeta

automatizada y se realizan diluciones 10 ^_1 y 10 ² y cada dilución se homogeniza.

b . Teniendo las cajas de Petri con el medio de cultivo estéril y enfriado, se homogeniza mediante 6 movimientos de derecha a izquierda, 6 en el sentido de las manecillas del reloj, 6 en sentido contrario y

6 de atrás a adelante, sobre una superficie lisa y

horizontal hasta lograr la completa incorporación del inoculo en el medio, se deja reposar para que solidifique y se coloca parafilm a cada una de las cajas con agar para evitar contaminación durante el tiempo de incubación. c . Las cajas con tiodicarb o Biofentrina se llevan a la incubadora a temperatura de 25°C por 72 horas con iluminación a partir de lámpara de luz fría. d . Las cajas inoculadas se incuban por 72 hrs y se registra el crecimiento bacteriano, se determina el efecto de las concentraciones de los productos sobre el crecimiento en placa (12 horas de incubación). e . El efecto residual del producto se evalúa a los 7 dias en medio agar malta y Agar PDA. f . Si no hay un crecimiento por encima del 10% se repite el procedimiento hasta obtener mortalidad menor de 90%. g· Se determina el diámetro de las colonias con regla graduada, los datos se registrarán descontándose el diámetro del disco sembrado, a partir del cual se determinará el efecto sobre el crecimiento micelial

con relación al testigo (DM no envenenado, a lo que se le denomina porcentaje de inhibición del crecimiento radial (PICR) . h. Diariamente se registra el avance pero a los 7 dias se analiza y si existe un cubrimiento aceptable, si aún no se tiene, se repite el procedimiento cuantas veces sea necesario. i. De las 10 cajas de Petri, de cada microorganismo, la que menor mortalidad nos arroje, es la que continúa para el siguiente ensayo. j. Realizamos nuevamente el ensayo con este porcentaje hasta tener un recubrimiento superior y asi sucesivamente, se va alternando la adición de tiodicarb y bifentrina con las DL en intervalos de 0.1 DL, todos estos experimentos han sido diseñados con las cepas experimentales y un testigo. k. Con los datos obtenidos del crecimiento bacteriano, se calcula el porcentaje de inhibición del crecimiento radial, los datos para su análisis son transformados a través de la expresión 2 are sen. Se aplica un análisis de varianza de clasificación doble y a

posterior! se realiza la prueba de Tukey, al 5% de probabilidad.

REGISTROS Durante todas las etapas se registraron las características de este procedimiento mediante los indicadores: a. Velocidad de crecimiento

b. Porcentaje de Inhibición medido en Número de UFC/mm c. Resistencia a envenenamiento en porcentaje

ETAPAS REALIZADAS EN CADA MICROORGANISMO

Para cada especie se realizaron etapas analizando los tiempos que requería para el cubrimiento total del campo. Una vez determinado este tiempo, se dejaron en reposo por un periodo de 10 días y posteriormente se someten al siguiente protocolo : Azotobacter vinelandíi

Es un bacilo Gram negativo, aerobia facultativa, crecen en concentraciones de oxigeno bajo, su hábitat natural es el

suelo, suelo pantanoso y agua; son quimio-organótrofas . Tienen una pared celular compleja, que consiste en una membrana externa y una capa interna de petidoglicano que contiene ácido murámico y mureina, por lo cual la hace una bacteria fijadora de N que capta de la atmósfera y la acumula en su capa de mureina. El desarrollo óptimo se presenta en un rango de 30 a 37 °C de temperatura.

ETAPAS REALIZADAS EN EL LABORATORIO CON Azotobacter

vinelandii

Se inicia con las condiciones de su hábitat Humedad: 90% Temperatura: 30 a 37°C. pH: 7.0 a 7.5. Estas condiciones son nuestro punto de partida para ir adaptando la cepa a los nuevos contaminantes: tiodicarb y bifentrina.

En la adaptación de este microorganismo se realizaron 40 etapas iniciando los procesos con el medio de cultivo convencional. Durante las etapas E-l y E-2 (Etapa 1 y Etapa

2) al medio de cultivo se le adiciona 0.1 DL de tiodicarb

(0.0000175 gr) . Luego de la incubación se registra un

crecimiento lento hasta las 72 horas. Hasta el día 45 de incubación se tiene una mortalidad del 72 a 70%. El 28% restante se mantiene por 10 días en observación diaria, para continuar con la adaptación del microorganismo. Se mantiene la humedad y la temperatura del hábitat. (En la etapa 2 se utiliza la misma concentración de tiodicarb para reforzar el crecimiento de cepas resistentes) . Las cepas resistentes son transferidas a medios de cultivo sólidos con 0.2 DL (0.000035 gr) de tiodicarb (E-3 y E-4, nuevamente en la E-4 se utiliza la misma concentración de tiodicarb para reforzar el crecimiento de las cepas resistentes) presentando mortalidades entre 66 a 62%. Al finalizar la etapa E-4 se han seleccionado los organismos por 164 días.

Las Etapas E-5 y E-6 se les someten a una primera adición de bifentrina; el medio de cultivo se adiciona con 0.1 DL de bifentrina (0.00000006 gr) , presentando mortalidad de 62 a 61% (de la misma manera que el caso anterior, la E-6 se utiliza para reforzar el crecimiento de las cepas resistentes) . Las Etapas E-7 y E-8 se aumenta al 0.2 DL de bifentrina (0.00000012 gr) presentando mortalidades de 60%. Al finalizar la E-8 (etapa de reforzamiento del crecimiento de las cepas resistentes) el proceso de adaptación llega a

359 dias.

En las Etapas E-9 y E-10 se agrega 0.3 DL (0.000053 gr) de tiodicarb, presentando mortalidad del 55 a 54%. (Al igual que en las etapas anteriores la E-10 es para reforzamiento de crecimiento de cepas resistentes) . En las etapas E-ll y E- 12 se les adiciona 0.4 DL (0.000070 gr) de tiodicarb, presentando mortalidad de 52 a 48%. Al finalizar la etapa E-12 (etapa de reforzamiento del crecimiento de las cepas resistentes) se alcanzan 525 dias de proceso de selección.

En las etapas E-13 y E-14 se adiciona 0.3 DL (0.00000018 gr) de bifentrina, presentando mortalidad de 52 a 48% (Al igual que en las etapas anteriores la E-14 es para reforzamiento de crecimiento de cepas resistentes) . En las etapas E-15 y E-16 se aumenta a 0.4 DL (0.00000024 gr) presentando mortalidades de 45%. Al finalizar la etapa 16 (etapa de reforzamiento del crecimiento de las cepas resistentes) se alcanzan 678 dias de proceso de selección.

En las etapas E-17 y E-18 se agrega 0.5 DL (0.000087 gr) de tiodicarb, presentando mortalidad de 42 a 40% (Al igual que en las etapas anteriores la E-18 es para reforzamiento de crecimiento de cepas resistentes) . Para la etapa E-19 y E-20 se les adiciona 0.6 DL (0.00011 gr) de tiodicarb, presentando

mortalidades de 35 a 32%. Al finalizar la E-20 (etapa de reforzamiento del crecimiento de las cepas resistentes) se contabilizan 816 dias de selección.

Para las E-21 y E-22 se adiciona se agrega 0.5 DL (0.00000030 gr) de? bifentrina, presentando mortalidad de 30 a 28% (Al igual que en las etapas anteriores la E-22 es para reforzamiento de crecimiento de cepas resistentes) . Para las E-23 y E-24 se aumenta a 0.6 DL de bifentrina (0.00000036 gr) presentando mortalidades entre 25 a 23%. Al finalizar la E- 24 (etapa de reforzamiento del crecimiento de las cepas resistentes) llevamos 934 días de trabajo.

En las etapas E-25 y E-26 se agrega 0.7 DL (0.00012 gr) de tiodicarb, presentando mortalidad del 25 a 22% (Al igual que en las etapas anteriores la E-26 es para reforzamiento de crecimiento de cepas resistentes) . En E-27 y E-28 se les adiciona 0.8 DL (0.00014 gr) de tiodicarb, presentando mortalidades de 20 a 18%. Al finalizar la E-28 (etapa de reforzamiento del crecimiento de las cepas resistentes) se alcanzan los 1039 días de adaptación.

Para las E-29 y E-30 se adiciona el 0.7 DL de bifentrina (0.00000036 gr) presentando mortalidad del 18 a 16% (Al igual

que en las etapas anteriores la E-30 es para reforzamiento de crecimiento de cepas resistentes) . En las E-31 y E-32 se aumenta al 0.8 DL de bifentrina (0.00000042 gr) presentando mortalidad del 13 a 10%. Al finalizar la E-32 (etapa de reforzamiento del crecimiento de las cepas resistentes) se alcanzan 1131 dias de trabajo.

En las etapas E-33 y E-34 el 0.9 DL (0.00016 gr) de tiodicarb, presentando mortalidad del 10% (Al igual que en las etapas anteriores la E-34 es para reforzamiento de crecimiento de cepas resistentes) . En las etapas E-35 y E-36 se les adiciona 1 DL (0.00018 gr) de tiodicarb, presentando mortalidades de 9 al 8%. Al finalizar la E-36 (etapa de reforzamiento del crecimiento de las cepas resistentes) llevamos 1208 dias de adaptación.

Las E-37 y E-38 se adiciona 0.9 DL de bifentrina (0.00000042 gr) ; presentando mortalidad del 10% en las 2 etapas, (Al igual que en las etapas anteriores la E-38 es para reforzamiento de crecimiento de cepas resistentes). Las E- 39 y E-40 se aumenta a 1 DL de bifentrina (0.00000048 gr) presentando una mortalidad en 8 a7% Al finalizar la 40 etapa llevamos 1278 días de trabajo.

En esta etapa el microorganismo ya es resistente a trazas de 1 DL de bifentrina y a 1DL de tiodicarb y se puede utilizar en la agricultura tanto en abonos líquidos como aplicación directa en sistemas de riego o por aspersión. Tabla No.l. Cuadro Comparativo Características Iniciales y Finales

Bacillus meqaterium

Es un bacilo Gram positivo, formador de esporas, aerobio o anaerobio facultativo; su tamaño inicial es de 1.5 pm de ancho x 5 qm de largo en promedio, su temperatura óptima de

crecimiento oscila entre 3 a 45°C y su actividad se desarrolla dentro de un pH de 3 a 5.5, con una humedad de 60%. Las esporas que produce le permiten a éste resistir ambientes hostiles, ya sea por calor o sequía. El medio de cultivo que se utiliza para el B. megateríum es un medio nutritivo, que consistía en peptona, agua destilada, extracto de levadura y NaCl .

ETAPAS REALIZADAS EN EL LABORATORIO CON Bacillus megateríum Se inicia la investigación científica con las condiciones de hábitat logradas en la adaptación del Bacillus megateríum a compuestos de organofosforados , organoclorados y mercuriales del microorganismo en el E-43 pH: 7.2, Humedad: 28%, Temperatura: Termoresistente . Aerobio. Estas condiciones son nuestro punto de partida para ir adaptando la cepa a los nuevos contaminantes: tiodicarb (carbamato) y bifentrina

(piretroide) . Durante todas las etapas estamos utilizando lámpara de luz fría para ir adaptando al microorganismo a luz solar .

En la adaptación de este microorganismo se realizaron 40 etapas iniciando los procesos con el medio de cultivo convencional. Durante las etapas E-l y E-2 (Etapa 1 y Etapa

2) al medio de cultivo se le adiciona 0.1 DL de tiodicarb (0.0000175 gr) manteniendo una humedad del 32%, presentando mortalidades entre 70 a 68% (En la etapa 2 se utiliza la misma concentración de tiodicarb para reforzar el crecimiento de cepas resistentes). Las cepas resistentes son transferidas a medios de cultivo sólidos con 0.2 DL (0.000035 gr) de tiodicarb (E-3 y E-4, nuevamente en la E-4 se utiliza la misma concentración de tiodicarb para reforzar el crecimiento de las cepas resistentes) presentando mortalidad de 65%. Al finalizar la etapa E-4 se han seleccionado los organismos por 207 dias.

Las Etapas E-5 y E-6 se les someten a una primera adición de bifentrina; el medio de cultivo se adiciona con 0.1 DL de bifentrina (0.00000006 gr) , presentando mortalidad de 66 a 63% (de la misma manera que el caso anterior, la E-6 se utiliza para reforzar el crecimiento de las cepas resistentes) . Las Etapas E-7 y E-8 se aumenta al 0.2 DL de bifentrina (0.00000012 gr) presentando mortalidad de 60 a 59%. Al finalizar la E-8 (etapa de reforzamiento del crecimiento de las cepas resistentes) el proceso de adaptación llega a 420 dias.

En las Etapas E-9 y E-10 se agrega 0.3 DL (0.000053 gr) de tiodicarb, presentando mortalidad de 55 a 54% (Al igual que en las etapas anteriores la E-10 es para reforzamiento de crecimiento de cepas resistentes) . En las etapas E-ll y E- 12 se les adiciona 0.4 DL (0.000070 gr) de tiodicarb, presentando mortalidad de 53 a 51%. Al finalizar la etapa E-12 (etapa de reforzamiento del crecimiento de las cepas resistentes) se alcanzan 618 dias de proceso de selección.

En las etapas E-13 y E-14 se adiciona 0.3 DL (0.00000018 gr) de bifentrina, presentando mortalidad de 49 a 45% (Al igual que en las etapas anteriores la E-14 es para reforzamiento de crecimiento de cepas resistentes) . En las etapas E-15 y E-16 se aumenta a 0.4 DL (0.00000024 gr) presentando mortalidad de 45 a 40%. Al finalizar la etapa 16 (etapa de reforzamiento del crecimiento de las cepas resistentes) se alcanzan 794 dias de proceso de selección.

En las etapas E-17 y E-18 se agrega 0.5 DL (0.000087 gr) de tiodicarb, presentando mortalidad de 40 a 38% (Al igual que en las etapas anteriores la E-18 es para reforzamiento de crecimiento de cepas resistentes) . Para la etapa E-19 y E-20 se les adiciona 0.6 DL (0.00011 gr) de tiodicarb, presentando mortalidad de 35 a 33%. Al finalizar la E-20 (etapa de

reforzamiento del crecimiento de las cepas resistentes) se contabilizan 935 dias de selección.

Para las E-21 y E-22 se adiciona se agrega 0.5 DL (0.00000030 gr) de bifentrina, presentando mortalidad de 35 a 33% (Al igual que en las etapas anteriores la E-22 es para reforzamiento de crecimiento de cepas resistentes) . Para las E-23 y E-24 se aumenta a 0.6 DL de bifentrina (0.00000036 gr) presentando mortalidad de 30 a 28%. Al finalizar la E-24 (etapa de reforzamiento del crecimiento de las cepas resistentes) llevamos 1050 dias de trabajo.

En las etapas E-25 y E-26 se agrega 0.7 DL (0.00012 gr) de tiodicarb, presentando mortalidad de 25 a 24% (Al igual que en las etapas anteriores la E-26 es para reforzamiento de crecimiento de cepas resistentes). En E-27 y E-28 se les adiciona 0.8 DL (0.00014 gr) de tiodicarb, presentando mortalidad de 22 a 20%. Al finalizar la E-28 (etapa de reforzamiento del crecimiento de las cepas resistentes) se alcanzan los 1155 dias de adaptación.

Para las E-29 y E-30 se adiciona el 0.7 DL de bifentrina (0.00000036 gr) presentando mortalidad de 20 a 18% (Al igual que en las etapas anteriores la E-30 es para reforzamiento

de crecimiento de cepas resistentes). En las E-31 y E-32 se aumenta al 0.8 DL de bifentrina (0.00000042 gr) presentando mortalidad de 17 a 15%. Al finalizar la E-32 (etapa de reforzamiento del crecimiento de las cepas resistentes) se alcanzan 1254 días de trabajo.

En las etapas E-33 y E-34 el 0.9 DL (0.00016 gr) de tiodicarb, presentando mortalidad de 13 a 11% (Al igual que en las etapas anteriores la E-34 es para reforzamiento de crecimiento de cepas resistentes) . En las etapas E-35 y E-36 se les adiciona 1 DL (0.00018 gr) de tiodicarb, presentando mortalidad de 10 a 8%. Al finalizar la E-36 (etapa de reforzamiento del crecimiento de las cepas resistentes) llevamos 1327 días de adaptación.

Las E-37 y E-38 se adiciona 0.9 DL de bifentrina (0.00000042 gr) ; presentando mortalidad de 8 a 6% (Al igual que en las etapas anteriores la E-38 es para reforzamiento de crecimiento de cepas resistentes) . Las E-39 y E-40 se aumenta a 1 DL de bifentrina (0.00000048 gr) disminuyendo la mortalidad a 5% Al finalizar la 40 etapa llevamos 1389 días de trabajo.

Tabla No. 2 Cuadro Comparativo Características Iniciales y

Finales

Bacillus subtillis Es un bacilo Gram positivo, esporógeno, aerobio estricto, con una capa gruesa de mureína, su tamaño inicial es en promedio de 0.75 mp\ de grosor x 0.9 pm de largo; su temperatura ambiente de crecimiento oscila entre 15 a 55°C, dado que el hábitat natural de B. subtilis es el suelo, el cual está sometido a grandes fluctuaciones de temperatura.

Sin embargo las células de este microorganismo sufren un

cambio fenotipico cuando se modifica la temperatura de 30°C a 45°C o a 80°C. Su actividad se desarrolla dentro de un pH de 4.7 a 5.5, una humedad de 70 a 80% y acepta unos niveles de concentración tóxica mínima, representadas en trazas.

Es utilizado para la producción de un antibiótico denominado bacitracina, que actúa contra Gram negativas deteriorando su membrana celular e inhibiendo la formación de la pared. Además en la producción de enzimas como la amilasa bacteriana útil en la industria del papel y textil, y enzima aplicada para curtir pieles, quitar manchas y ablandar carne.

Para el aislamiento de los microorganismos se utilizó el Modelo Microcosmos (Kabir y cois, 1995) . Las cepas se clasificaron mediante métodos tradicionales (Taxonomía numérica) e inmunoquímicos ( inmunofluorescencía indirecta- IFI , según Llewot y Stead, 1991) . Se utilizaron cepas puras procedentes de diferentes sectores. El medio de cultivo que se utiliza para el B. subtillís es un medio nutritivo, con 5% de agar-soya manteniendo los parámetros de pH, niveles mínimos de oxígeno, humedad y temperatura de su estado original .

ETAPAS REALIZADAS EN EL LABORATORIO CON B. subtillis

Se inicia con las condiciones de hábitat logradas en la adaptación a compuestos de organofosforados, órgano clorados y mercuriales del microorganismo en la E-38 pH: 7.2, Humedad: 36%, termoresistente y aerobio. Estas condiciones son nuestro punto de partida para ir adaptando la cepa a tiodicarb y bifentrina.

En la adaptación de este microorganismo se realizaron 40 etapas iniciando los procesos con el medio de cultivo convencional. Durante las etapas E-l y E-2 (Etapa 1 y Etapa 2) al medio de cultivo se le adiciona 0.1 DL de tiodicarb (0.0000175 gr) . Luego de la incubación se registra un crecimiento lento hasta las 72 horas. Hasta el dia 68 de incubación se tiene una mortalidad de 82% y en la E-2 del 80%. El 20% restante se mantiene por 10 días en observación diaria, para continuar con la adaptación del microorganismo. Se mantiene la humedad y la temperatura del hábitat. (En la etapa 2 se utiliza la misma concentración de tiodicarb para reforzar el crecimiento de cepas resistentes) . Las cepas resistentes son transferidas a medios de cultivo sólidos con 0.2 DL (0.000035 gr) de tiodicarb ( E—3 y E-4, nuevamente en la E-4 se utiliza la misma concentración de tiodicarb para

reforzar el crecimiento de las cepas resistentes) presentando mortalidad de 75 a 72%. Al finalizar la etapa E-4 se han seleccionado los organismos por 294 dias.

Las Etapas E-5 y E-6 se les someten a una primera adición de bifentrina; el medio de cultivo se adiciona con 0.1 DL de bifentrina (0.00000006 gr) , presentando mortalidad de 72 a 71% (de la misma manera que el caso anterior, la E-6 se utiliza para reforzar el crecimiento de las cepas resistentes) . Las Etapas E-7 y E-8 se aumenta al 0.2 DL de bifentrina (0.00000012 gr) presentando mortalidades entre 70 a 68%. Al finalizar la E-8 (etapa de reforzamiento del crecimiento de las cepas resistentes) el proceso de adaptación llega a 570 dias.

En las Etapas E-9 y E-10 se agrega 0.3 DL (0.000053 gr) de tiodicarb, presentando mortalidad de 66 a 63% (Al igual que en las etapas anteriores la E-10 es para reforzamiento de crecimiento de cepas resistentes) . En las etapas E-ll y E- 12 se les adiciona 0.4 DL (0.000070 gr) de tiodicarb, presentando mortalidad de 64 a 62%. Al finalizar la etapa E-12 (etapa de reforzamiento del crecimiento de las cepas resistentes) se alcanzan 827 dias de proceso de selección.

En las etapas E-13 y E-14 se adiciona 0.3 DL (0.00000018 gr) de bifentrina, presentando mortalidad de 63 y en la siguiente etapa aumenta a 65% (Al igual que en las etapas anteriores la E-14 es para reforzamiento de crecimiento de cepas resistentes) . En las etapas E-15 y E-16 se aumenta a 0.4 DL (0.00000024 gr) presentando mortalidad de 64 a 60%. Al finalizar la etapa 16 (etapa de reforzamiento del crecimiento de las cepas resistentes) se alcanzan 1071 dias de proceso de selección.

En las etapas E-17 y E-18 se agrega 0.5 DL (0.000087 gr) de tiodicarb, presentando mortalidad de 59 a 54% (Al igual que en las etapas anteriores la E-18 es para reforzamiento de crecimiento de cepas resistentes) . Para la etapa E-19 y E-20 se les adiciona 0.6 DL (0.00011 gr) de tiodicarb, presentando mortalidad de 52 a 50%. Al finalizar la E-20 (etapa de reforzamiento del crecimiento de las cepas resistentes) se contabilizan 1283 dias de selección.

Para las E-21 y E-22 se adiciona se agrega 0.5 DL (0.00000030 gr) de bifentrina, presentando mortalidad de 47 a 45% (Al igual que en las etapas anteriores la E-22 es para reforzamiento de crecimiento de cepas resistentes). Para las E-23 y E-24 se aumenta a 0.6 DL de bifentrina (0.00000036 gr)

presentando menor mortalidad de 40 a 35%. Ά1 finalizar la E-24 (etapa de reforzamiento del crecimiento de las cepas resistentes) llevamos 1458 días de trabajo.

En las etapas E-25 y E-26 se agrega 0.7 DL (0.00012 gr) de tiodicarb, presentando mortalidad de 35 a 30% (Al igual que en las etapas anteriores la E-26 es para reforzamiento de crecimiento de cepas resistentes) . En E-27 y E-28 se les adiciona 0.8 DL (0.00014 gr) de tiodicarb, presentando mortalidad de 28 a 25%. Al finalizar la E-28 (etapa de reforzamiento del crecimiento de las cepas resistentes) se alcanzan los 1581 días de adaptación.

Para las E-29 y E-30 se adiciona el 0.7 DL de bifentrina (0.00000036 gr) presentando mortalidad de 25 a 23% (Al igual que en las etapas anteriores la E-30 es para reforzamiento de crecimiento de cepas resistentes) . En las E-31 y E-32 se aumenta al 0.8 DL de bifentrina (0.00000042 gr) presentando mortalidad de 20 a 18%. Al finalizar la E-32 (etapa de reforzamiento del crecimiento de las cepas resistentes) se alcanzan 1704 días de trabajo.

En las etapas E-33 y E-34 el 0.9 DL (0.00016 gr) de tiodicarb, presentando mortalidad de 18 a 15% (Al igual que

en las etapas anteriores la E-34 es para reforzamiento de crecimiento de cepas resistentes). En las etapas E-35 y E-36 se les adiciona 1 DL (0.00018 gr) de tiodicarb, presentando disminución de mortalidad de 12 a 9%. Al finalizar la E-36 (etapa de reforzamiento del crecimiento de las cepas resistentes) llevamos 1805 dias de adaptación.

Las E-37 y E-38 se adiciona 0.9 DL de bifentrina (0.00000042 gr) ; presentando mortalidad de 10 a 8% (Al igual que en las etapas anteriores la E-38 es para reforzamiento de crecimiento de cepas resistentes) . Las E-39 y E-40 se aumenta a 1 DL de bifentrina (0.00000048 gr) manteniendo la mortalidad del 6% Al finalizar la 40 etapa llevamos 1882 dias de trabajo; 5.6 años de investigación. Tabla No.3 Cuadro Comparativo Características Iniciales y Finales

Al finalizar el proceso de adaptación, el microorganismo presenta una actividad normal en dicho medio encontrándose en su membrana celular trazas de fósforo (P ₂ O ₅ ) . Se observa además que el material orgánico constituido en un 80% de hidratos de carbono se estabiliza en un periodo de 35 dias en promedio a diferencia del microorganismo silvestre con el cual el tiempo fue de 120 dias. Bacillus thurinqiensis

Es un bacilo Gram positivo, no patógeno, esporógeno, anaerobio facultativo, su tamaño inicial es en promedio de 1.2 de ancho x 4.8 pm de largo en promedio, su temperatura óptima ambiente de crecimiento oscila entre 10 a 45°C, su

membrana celular es completamente lisa y su actividad se desarrolla dentro de un pH de 6.5 a 7.2 con una humedad de 60%.

Las células de B. thuringiensis forman inclusiones cristalinas visibles al microscopio óptico durante la esporulación . Estas inclusiones cristalinas están compuestas por protoxinas, que contienen d-endotoxinas , de actividad insecticida especifica contra insectos. Algunas variedades de Bacillus thuringiensis pueden además producir otra toxina, la b-exotoxina. Es una toxina que se produce durante el crecimiento vegetativo, y es un derivado nucleotidico de la adenina que funciona como inhibidor de la ARN-polimerasa . Pero la utilización de esta toxina está prohibida en algunos países, pues es tóxica también para mamíferos.

El medio de cultivo para mantener el B. thuringiensis es un medio nutritivo, con 5% de agar-soya manteniendo los parámetros de pH, niveles mínimos de oxígeno, humedad y temperatura de su estado original.

ETAPAS REALIZADAS EN EL LABORATORIO CON B. thuringiensis Se inicia con las condiciones de hábitat logradas en la adaptación a compuestos de organofosforados , órgano clorados

y mercuriales del microorganismo en la E-38 pH: 7.2, Humedad: 52%, termoresistente (74°C), pH 7.0 y anaerobio facultativo. Estas condiciones son nuestro punto de partida para ir adaptando la cepa a tiodicarb y bifentrina. Durante todas las etapas estamos utilizando lámpara de luz fría para ir adaptando al microorganismo a luz solar.

En la adaptación de este microorganismo se realizaron 48 etapas iniciando los procesos con el medio de cultivo convencional. Durante las etapas E-l y E-2 (Etapa 1 y Etapa 2) al medio de cultivo se le adiciona 0.1 DL de tiodicarb (0.0000175 gr) . Luego de la incubación se registra un crecimiento lento hasta las 72 horas. Hasta el día 45 de incubación se tiene una mortalidad del 72 a 70%. El 30% restante se mantiene por 10 dias en observación diaria, para continuar con la adaptación del microorganismo. Se mantiene la humedad y la temperatura del hábitat. (En la etapa 2 se utiliza la misma concentración de tiodicarb para reforzar el crecimiento de cepas resistentes) . Las cepas resistentes son transferidas a medios de cultivo sólidos con 0.2 DL (0.000035 gr) de tiodicarb (E-3 y E-4, nuevamente en la E-4 se utiliza la misma concentración de tiodicarb para reforzar el crecimiento de las cepas resistentes )

presentando mortalidad de 70 a 68%. Al finalizar la etapa E-4 se han seleccionado los organismos por 282 dias.

Las Etapas E-5 y E-6 se les someten a una primera adición de bifentrina; el medio de cultivo se adiciona con 0.1 DL de bifentrina (0.00000006 gr) , presentando mortalidad de 68 a 65% (de la misma manera que el caso anterior, la E-6 se utiliza para reforzar el crecimiento de las cepas resistentes) . Las Etapas E-7 y E-8 se aumenta al 0.2 DL de bifentrina (0.00000012 gr) presentando mortalidad de 64 a 63%. Al finalizar la E-8 (etapa de reforzamiento del crecimiento de las cepas resistentes) el proceso de adaptación llega a 565 dias.

En las Etapas E-9 y E-10 se agrega 0.3 DL (0.000053 gr) de tiodicarb, presentando mortalidad de 65 a 61% (Al igual que en las etapas anteriores la E-10 es para reforzamiento de crecimiento de cepas resistentes). En las etapas E-ll y E- 12 se les adiciona 0.4 DL (0.000070 gr) de tiodicarb, presentando mortalidad de 57 a 55%. Al finalizar la etapa E-12 (etapa de reforzamiento del crecimiento de las cepas resistentes) se alcanzan 822 dias de proceso de selección.

En las etapas E-13 y E-14 se adiciona 0.3 DL (0.00000018 gr) de bifentrina, presentando mortalidad de 57 a 55% (Al igual que en las etapas anteriores la E-14 es para reforzamiento de crecimiento de cepas resistentes) . En las etapas E-15 y E-16 se aumenta a 0.4 DL (0.00000024 gr) presentando mortalidad de 52 a 50%. Al finalizar la etapa 16 (etapa de reforzamiento del crecimiento de las cepas resistentes) se alcanzan 1064 dias de proceso de selección.

En las etapas E-17 y E-18 se agrega 0.5 DL (0.000087 gr) de tiodicarb, presentando mortalidad de 52 a 50% (Al igual que en las etapas anteriores la E-18 es para reforzamiento de crecimiento de cepas resistentes) . Para la etapa E-19 y E-20 se les adiciona 0.6 DL (0.00011 gr) de tiodicarb, presentando mortalidad de 50 a 45%. Al finalizar la E-20 (etapa de reforzamiento del crecimiento de las cepas resistentes) se contabilizan 1280 dias de selección.

Para las E-21 y E-22 se adiciona se agrega 0.5 DL (0.00000030 gr) de bifentrina, presentando mortalidad de 50 a 45% (Al igual que en las etapas anteriores la E-22 es para reforzamiento de crecimiento de cepas resistentes) . Para las

E-23 y E-24 se aumenta a 0.6 DL de bifentrina (0.00000036 gr) presentando mortalidad de 44 a 42%. Al finalizar la E-24

(etapa de reforzamiento del crecimiento de las cepas resistentes) llevamos 1467 dias de trabajo.

En las etapas E-25 y E-26 se agrega 0.7 DL (0.00012 gr) de tiodicarb, presentando mortalidad de 44 a 40% (Al igual que en las etapas anteriores la E-26 es para reforzamiento de crecimiento de cepas resistentes). En E-27 y E-28 se les adiciona 0.8 DL (0.00014 gr) de tiodicarb, presentando mortalidad de 36 a 35%. Al finalizar la E-28 (etapa de reforzamiento del crecimiento de las cepas resistentes) se alcanzan los 1633 dias de adaptación.

Para las E-29 y E-30 se adiciona el 0.7 DL de bifentrina (0.00000036 gr) presentando mortalidad de 36 a 33% (Al igual que en las etapas anteriores la E-30 es para reforzamiento de crecimiento de cepas resistentes) . En las E-31 y E-32 se aumenta al 0.8 DL de bifentrina (0.00000042 gr) presentando mortalidad de 30 a 28%. Al finalizar la E-32 (etapa de reforzamiento del crecimiento de las cepas resistentes) se alcanzan 1777 días de trabajo.

En las etapas E-33 y E-34 el 0.9 DL (0.00016 gr) de tiodicarb, presentando mortalidad de 30% (Al igual que en las etapas anteriores la E-34 es para reforzamiento de

crecimiento de cepas resistentes) . En las etapas E-35 y E-36 se les adiciona 1 DL (0.00018 gr) de tiodicarb, presentando mortalidad de 25%. Al finalizar la E-36 (etapa de reforzamiento del crecimiento de las cepas resistentes) llevamos 1909 dias de adaptación.

Las E-37 y E-38 se adiciona 0.9 DL de bifentrina (0.00000042 gr) ; presentando mortalidad de 30 a 28% (Al igual que en las etapas anteriores la E-38 es para reforzamiento de crecimiento de cepas resistentes) . Las E-39 y E-40 se aumenta a 1 DL de bifentrina (0.00000048 gr) manteniendo la mortalidad en 18 a 17% Al finalizar la 40 etapa llevamos 2015 dias de trabajo.

En las etapas E-41 y E-42 el 1.1 DL (0.00020 gr) de tiodicarb, presentando mortalidad de 18 a 17% (Al igual que en las etapas anteriores la E-42 es para reforzamiento de crecimiento de cepas resistentes) . En las etapas E-43 y E-44 se les adiciona 1.2 DL (0.00022 gr) de tiodicarb, presentando mortalidad en las 2 etapas de 14%. Al finalizar la E-44

(etapa de reforzamiento del crecimiento de las cepas resistentes) llevamos 2106 dias de adaptación.

En las etapas E-45 y E-46 el 1.1 DL (0.00000054 gr) de bifentrina, presentando mortalidad de 15 a 12% (Al igual gue en las etapas anteriores la E-46 es para reforzamiento de crecimiento de cepas resistentes) . En las etapas E-47 y E-48 se les adiciona 1.2 DL (0.00000060 gr) de Biofentrina, presentando mortalidad de 10 a 7%. Al finalizar la E-48

(etapa de reforzamiento del crecimiento de las cepas resistentes) llevamos 2182 dias de adaptación.

Tabla No.4. Cuadro Comparativo Características Iniciales y Finales

Clostridium pasteuranium Es un bacilo Gram positivo, anaerobio y heterótrofos , su hábitat natural es el suelo, posee un mecanismo para la fosforilación y transporte de electrones, por lo que el ATP lo obtiene por medio de la fosforilación a nivel de sustrato. Su desarrollo óptimo se presenta en un rango de 20 a 30°C de temperatura. Son móviles, se desplazan utilizando un flagelo, es quimioorganotrófico . Este bacilo es anaerobio facultativo.

ETAPAS REALIZADAS EN EL LABORATORIO CON Clostridium

pasteuranium

Se inicia con las condiciones de hábitat logradas en la adaptación a compuestos de organofosforados , órgano clorados y mercuriales del microorganismo en la E-33 pH: 7.2, Humedad: 40%, termoresistente . Estas condiciones son nuestro punto de partida para ir adaptando la cepa a tiodicarb y bifentrina.

En la adaptación de este microorganismo se realizaron 40 etapas iniciando los procesos con el medio de cultivo convencional. Durante las etapas E-l y E-2 (Etapa 1 y Etapa 2) al medio de cultivo se le adiciona 0.1 DL de tiodicarb (0.0000175 gr) . Luego de la incubación se registra un crecimiento lento hasta las 72 horas. Hasta el día 72 de incubación en la E-l se tiene una mortalidad del 87% y disminuye en E-2 a 84%. El 16% restante se mantiene por 10 dias en observación diaria, para continuar con la adaptación del microorganismo. Se mantiene la humedad y la temperatura del hábitat. (En la etapa 2 se utiliza la misma concentración de tiodicarb para reforzar el crecimiento de cepas resistentes) . Las cepas resistentes son transferidas a medios de cultivo sólidos con 0.2 DL (0.000035 gr) de tiodicarb (E-3 y E-4, nuevamente en la E-4 se utiliza la misma concentración de tiodicarb para reforzar el crecimiento de las cepas resistentes) presentando mortalidad de 83 a 80%. Al finalizar la etapa E-4 se han seleccionado los organismos por 281 dias.

Las Etapas E-5 y E-6 se les someten a una primera adición de bifentrina; el medio de cultivo se adiciona con 0.1 DL de bifentrina (0.00000006 gr) , presentando mortalidad de 81

a 77% (de la misma manera que el caso anterior, la E-6 se utiliza para reforzar el crecimiento de las cepas resistentes) . Las Etapas E-7 y E-8 se aumenta al 0.2 DL de bifentrina (0.00000012 gr) presentando mortalidades entre 68 a 74 a 70%. Al finalizar la E-8 (etapa de reforzamiento del crecimiento de las cepas resistentes) el proceso de adaptación llega a 552 dias.

En las Etapas E-9 y E-10 se agrega 0.3 DL (0.000053 gr) de tiodicarb, presentando mortalidad de 70 a 69% (Al igual que en las etapas anteriores la E-10 es para reforzamiento de crecimiento de cepas resistentes) . En las etapas E-ll y E- 12 se les adiciona 0.4 DL (0.000070 gr) de tiodicarb, presentando mortalidades de 60 a 67%. Al finalizar la etapa E-12 (etapa de reforzamiento del crecimiento de las cepas resistentes) se alcanzan 803 dias de proceso de selección.

En las etapas E-13 y E-14 se adiciona 0.3 DL (0.00000018 gr) de bifentrina, presentando mortalidad de 66 a 63% (Al igual que en las etapas anteriores la E-14 es para reforzamiento de crecimiento de cepas resistentes) . En las etapas E-15 y E-16 se aumenta a 0.4 DL (0.00000024 gr) presentando mortalidades entre 60 a 58%. Al finalizar la

etapa 16 (etapa de reforzamiento del crecimiento de las cepas resistentes) se alcanzan 1027 dias de proceso de selección.

En las etapas E-17 y E-18 se agrega 0.5 DL (0.000087 gr) de tiodicarb, presentando mortalidad de 58 a 55% (Al igual que en las etapas anteriores la E-18 es para reforzamiento de crecimiento de cepas resistentes). Para la etapa E-19 y E-20 se les adiciona 0.6 DL (0.00011 gr) de tiodicarb, presentando mortalidades de 55 a 51%. Al finalizar la E-20 (etapa de reforzamiento del crecimiento de las cepas resistentes) se contabilizan 1211 dias de selección.

Para las E-21 y E-22 se adiciona se agrega 0.5 DL (0.00000030 gr) de bifentrina, presentando mortalidad de 48 a 46% (Al igual que en las etapas anteriores la E-22 es para reforzamiento de crecimiento de cepas resistentes). Para las E-23 y E-24 se aumenta a 0.6 DL de bifentrina (0.00000036 gr) presentando mortalidades entre 40 a 38%. Al finalizar la E-24 (etapa de reforzamiento del crecimiento de las cepas resistentes) llevamos 1362 dias de trabajo.

En las etapas E-25 y E-26 se agrega 0.7 DL (0.00012 gr) de tiodicarb, presentando mortalidad de 37 a35% (Al igual que en las etapas anteriores la E-26 es para reforzamiento de

crecimiento de cepas resistentes). En E-27 y E-28 se les adiciona 0.8 DL (0.00014 gr) de tiodicarb, presentando mortalidad de 33 a 30%. Al finalizar la E-28 (etapa de reforzamiento del crecimiento de las cepas resistentes) se alcanzan los 1506 días de adaptación.

Para las E-29 y E-30 se adiciona el 0.7 DL de bifentrina (0.00000036 gr) presentando mortalidad de 29 a 25% (Al igual que en las etapas anteriores la E-30 es para reforzamiento de crecimiento de cepas resistentes). En las E-31 y E-32 se aumenta al 0.8 DL de bifentrina (0.00000042 gr) presentando mortalidades entre 22 a 18%. Al finalizar la E-32 (etapa de reforzamiento del crecimiento de las cepas resistentes) se alcanzan 1631 días de trabajo.

En las etapas E-33 y E-34 el 0.9 DL (0.00016 gr) de tiodicarb, presentando mortalidad de 18 a 16% (Al igual que en las etapas anteriores la E-34 es para reforzamiento de crecimiento de cepas resistentes) . En las etapas E-35 y E-36 se les adiciona 1 DL (0.00018 gr) de tiodicarb, presentando mortalidad de 13 a 12%. Al finalizar la E-36 (etapa de reforzamiento del crecimiento de las cepas resistentes) llevamos 1701 días de adaptación.

Las E-37 y E-38 se adiciona 0.9 DL de bifentrina (0.00000042 gr) ; presentando mortalidad de 10% en las dos etapas, (Al igual que en las etapas anteriores la E-38 es para reforzamiento de crecimiento de cepas resistentes) . Las E- 39 y E-40 se aumenta a 1 DL de bifentrina (0.00000048 gr) manteniendo la mortalidad en 8 a 5% Al finalizar la 40 etapa llevamos 1777 dias de trabajo.

Tabla No.5. Cuadro Comparativo Características Iniciales y Finales

Rhizobium sp

Es un bacilo anaerobio facultativo, crecen en concentraciones de oxigeno bajo, su hábitat natural es el suelo, suelo pantanoso y agua; es una bacteria quimio- organotrofas . Tienen una pared celular compleja, que consiste en una membrana externa y una capa interna de peptidoglicano que contiene ácido muraico y mureina, por lo cual la hace una bacteria fijadora de N ₂ que capta de la atmosfera y la acumula en su capa de mureina. Su desarrollo óptimo se presenta en un rango de 20 a 30°C de temperatura, humead de 25 a 40% y pH acido. Son móviles.

ETAPAS REALIZADAS EN EL LABORATORIO con Rhizobium sp

Se inicia con las condiciones de hábitat: pH: 2.0-4.5, Humedad: 25- 40%, temperatura 20-30 °C. Anaerobio facultativo. Estas condiciones son nuestro punto de partida para ir adaptando la cepa a tiodicarb y bifentrina. Durante todas las etapas estamos utilizando lámpara de luz fría para ir adaptando al microorganismo a luz solar. En la adaptación de este microorganismo se realizaron 40 etapas iniciando los procesos con el medio de cultivo convencional. Durante las etapas E-l y E-2 (Etapa 1 y Etapa

2) al medio de cultivo se le adiciona 0.1 DL de tiodicarb

(0.0000175 gr) . Luego de la incubación se registra un crecimiento lento hasta las 72 horas. Hasta el dia 68 de incubación se tiene una mortalidad del 63 a 62%. El 38% restante se mantiene por 10 dias en observación diaria, para continuar con la adaptación del microorganismo. Se mantiene la humedad y la temperatura del hábitat. (En la etapa 2 se utiliza la misma concentración de tiodicarb para reforzar el crecimiento de cepas resistentes) . Las cepas resistentes son transferidas a medios de cultivo sólidos con 0.2 DL (0.000035 gr) de tiodicarb (E-3 y E-4, nuevamente en la E-4 se utiliza la misma concentración de tiodicarb para reforzar el crecimiento de las cepas resistentes) presentando mortalidad de 60% en las dos etapas. Al finalizar la etapa E-4 se han seleccionado los organismos por 253 dias.

Las Etapas E-5 y E-6 se les someten a una primera adición de bifentrina; el medio de cultivo se adiciona con 0.1 DL de bifentrina (0.00000006 gr) , presentando mortalidad de 62 a 60% (de la misma manera que el caso anterior, la E-6 se utiliza para reforzar el crecimiento de las cepas resistentes) . Las Etapas E-7 y E-8 se aumenta al 0.2 DL de bifentrina (0.00000012 gr) presentando mortalidad de 58 a

55% . Al finalizar la E-8 (etapa de reforzamiento del

crecimiento de las cepas resistentes) el proceso de adaptación llega a 501 días.

En las Etapas E-9 y E-10 se agrega 0.3 DL (0.000053 gr) de tiodicarb, presentando mortalidad de 55 a 53% (Al igual que en las etapas anteriores la E-10 es para reforzamiento de crecimiento de cepas resistentes) . En las etapas E-ll y E- 12 se les adiciona 0.4 DL (0.000070 gr) de tiodicarb, presentando mortalidad de 51 a 49%. Al finalizar la etapa E-12 (etapa de reforzamiento del crecimiento de las cepas resistentes) se alcanzan 727 dias de proceso de selección.

En las etapas E-13 y E-14 se adiciona 0.3 DL (0.00000018 gr) de bifentrina, presentando mortalidad de 49 a 47% (Al igual que en las etapas anteriores la E-14 es para reforzamiento de crecimiento de cepas resistentes) . En las etapas E-15 y E-16 se aumenta a 0.4 DL (0.00000024 gr) presentando mortalidad de 44 a 42%. Al finalizar la etapa 16 (etapa de reforzamiento del crecimiento de las cepas resistentes) se alcanzan 936 días de proceso de selección.

En las etapas E-17 y E-18 se agrega 0.5 DL (0.000087 gr) de tiodicarb, presentando mortalidad de 41 a 40% (Al igual que en las etapas anteriores la E-18 es para reforzamiento de

crecimiento de cepas resistentes) . Para la etapa E-19 y E-20 se les adiciona 0.6 DL (0.00011 gr) de tiodicarb, presentando mortalidad de 38 a 37%. Al finalizar la E-20 (etapa de reforzamiento del crecimiento de las cepas resistentes) se contabilizan 1122 dias de selección.

Para las E-21 y E-22 se adiciona se agrega 0.5 DL (0.00000030 gr) de bifentrina, presentando mortalidad de 36 a 35% (Al igual que en las etapas anteriores la E-22 es para reforzamiento de crecimiento de cepas resistentes) . Para las E-23 y E-24 se aumenta a 0.6 DL de bifentrina (G.00000036 gr) presentando mortalidad de 33 a 31%. Al finalizar la E-24 (etapa de reforzamiento del crecimiento de las cepas resistentes) llevamos 1268 dias de trabajo.

En las etapas E-25 y E-26 se agrega 0.7 DL (0.00012 gr) de tiodicarb, presentando mortalidad de 30 a 28% (Al igual que en las etapas anteriores la E-26 es para reforzamiento de crecimiento de cepas resistentes). En E-27 y E-28 se les adiciona 0.8 DL (0.00014 gr) de tiodicarb, presentando mortalidad de 25 a 23%. Al finalizar la E-28 (etapa de reforzamiento del crecimiento de las cepas resistentes) se alcanzan los 1393 dias de adaptación.

Para las E-29 y E-30 se adiciona el 0.7 DL de bifentrina (0.00000036 gr) presentando mortalidad de 21 a 18% (Al igual que en las etapas anteriores la E-30 es para reforzamiento de crecimiento de cepas resistentes) . En las E-31 y E-32 se aumenta al 0.8 DL de bifentrina (0.00000042 gr) presentando mortalidad de 15 a 14%. Al finalizar la E-32 (etapa de reforzamiento del crecimiento de las cepas resistentes) se alcanzan 1505 días de trabajo.

En las etapas E-33 y E-34 el 0.9 DL (0.00016 gr) de tiodicarb, presentando mortalidad de 25 a 22% (Al igual que en las etapas anteriores la E-34 es para reforzamiento de crecimiento de cepas resistentes) . En las etapas E-35 y E-36 se les adiciona 1 DL (0.00018 gr) de tiodicarb, presentando mortalidad de 20 a 18%. Al finalizar la E-36 (etapa de reforzamiento del crecimiento de las cepas resistentes) llevamos 1601 días de adaptación.

Las E-37 y E-38 se adiciona 0.9 DL de bifentrina (0.00000042 gr) ; presentando mortalidad de 16 a 14% (Al igual que en las etapas anteriores la E-38 es para reforzamiento de crecimiento de cepas resistentes) . Las E-39 y E-40 se aumenta a 1 DL de bifentrina (0.00000048 gr) manteniendo la

mortalidad en 10 a 8% Al finalizar la 40 etapa llevamos 1677 dias de trabajo.

Tabla No. 6 Cuadro Comparativo Características Iniciales y Finales

El microorganismo sometido a envenenamiento con trazas de tiodicarb y bifentrina presenta una actividad normal en dicho medio encontrándose en su membrana celular trazas de Nitrógeno.

MANTENIMIENTO DE LAS CEPAS RESISTENTES A LAS TRAZAS DE CARBAMATO CONTENIDAS EN TIODICARB Y A TRAZAS DE PIRETROIDES

CONTENIDAS EN BIFENTRINA

Durante el desarrollo de esta investigación, realizada por un periodo superior a los 5 años, las cepas se someten a un cambio del medio físico, adaptándolas a soportar concentraciones crecientes de tiodicarb y bifentrina.

Una vez obtenidos los microorganismos adaptados al medio, se comprueba la pureza de la cepa, a través de tomar una alícuota de 0.1 mi de la suspensión del cultivo del microorganismo e inocular una placa de Agar Triptona Soya (TSA) la cual se incuba a 52°C +/- 2°C, se comprueba su movilidad mediante tinción con Gram verde de malaquita.

Determinada la pureza de la cepa, se procede a realizar una suspensión de este microorganismo en una placa de TSA que se incuba de 48 a 72 h a 52°C. +/- 2°C, posteriormente, con un hisopo estéril se toma una muestra y se inoculan 100 mi de medio líquido conteniendo 0.01 DL de bifentrina y/o 0.01 DL de tiodicarb, se coloca en agitación a 37°C y 170 rpm durante 4 horas; posteriormente la biomasa se resuspende en 50 mi de

medio conteniendo diferentes soluciones lioprotectoras (utilizadas para preparar microorganismos para liofilización) , el medio se homogeniza y se procede a determinar el recuento de ÜFC /mi. Este inoculo se lleva a la incubadora y periódicamente se resiembra en el mismo medio de cultivo. Este procedimiento se realiza en periodos de tiempo que van desde 72 horas hasta 120 horas; todos estos procedimientos son realizados periódicamente hasta la fecha. El tiempo de mantenimiento en las mismas condiciones se utiliza para realizar observaciones generales.

Estas cepas se mantienen en medio de cultivo activo, adicionando un aceite mineral previamente esterilizado, de esta manera se garantiza la humedad requerida.

REFERENCIAS

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microorganismos específicamente adaptados a el y su proceso de inoculación. Patente No. 26662, otorgada por el

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