De nombreuses cellulases possèdent un domaine de fixation à la cellulose (CBD) indépendant du domaine catalytique et dont le rôle essentiel est d'ancrer la protéine au substrat.

L'ablation de ce domaine par protéolyse génère des noyaux catalytiques qui conservent leur activité vis-à-vis des substrats amorphes et solubles, mais perdent la majeure partie, voire la totalité de l'activité de l'holoenzyme sur la cellulose cristalline. La fonction du domaine de liaison à la cellulose pourrait tre non seulement d'ancrer l'enzyme au substrat, mais de contribuer à la défibrillation de la cellulose en décollant les chaînes du réseau cristallin.

Les deux CBD les mieux étudiés sont ceux du champignon Trichoderma reesei et de la bactérie Clostridiumfimi. Le CBD fongique est très court (37 acides aminés) et de séquence très conservée (surtout au niveau des deux extrémités) qui fait de lui un des domaines les plus conservés dans la nature. Celui des bactéries est long d'une centaine de résidus. Dans les deux cas, ces domaines constituent, avec le segment riche en Pro/Thr/Ser une"queue"qui confère l'aspect d'un ttard aux cellulases.

Nous avons cloné et séquencé un domaine (CBD) de la souche N1 (Stachybotrys. sp) sécrétant des cellulases agissant à une large gamme de pH : de 5 à 9.

Malgré les similitudes de ce CBD avec les CBD fongiques, une conservation des résidus clefs et invariables : les quatre Cystéines formant les deux ponts dis-sulfure et les trois résidus aromatiques impliqués dans la fixation à la cellulose, il se montre particulier puisqu'il est plus court d'un acide aminé (soit trois bases) et contient deux résidus chargés « E » à des positions inhabituelles.

Les « Glutathion S Transférases » représentent une famille d'enzymes multifonctionnelles essentiellement cytosoliques, impliquées dans des opérations diverses de transports et de biosynthèses intracellulaires. Elles sont très importantes dans la détoxification des molécules xénobiotiques. En effet, les « Glutathion S transférases » sont des enzymes, catalysant la conjugaison de molécules activées (acétylées, alkylées, hydroxylées ou encore oxygénées) des xéno biotiques au Glutathion. Chez l'homme, 4 isoenzymes sont connues : GSTu, GSTtheta, GSTalpha et GSTpi.

Rappelons que le Glutathion est un tri-peptide « Glu-Cys-Gly » fabriquée dans toutes nos cellules. Il est très important dans le piégeage des radicaux libres et dans la détoxification.

La GST a été utilisée dans des vecteurs d'expression où la protéine d'intért est fusionnée à la GST. La GST de Schistosomajaponicum est souvent utilisée. Cette protéine de fusion est alors facilement purifiée, en une seule étape, grâce à sa fixation sur une colonne de Glutathion- Sépharose. L'élution se fait par la suite par addition de Glutathion.

Sous sa forme spécifique, cette invention est caractérisée par les étapes suivantes : a) L'expression hétérologue d'un CBD fongique chez E. coli : fusion de la protéine CBD à la GST b) Purification de la protéine de fusion « GST-CBD » c) Détermination des aptitudes enzymatiques et des propriétés physico-chimiques de la protéine de fusion La protéine de fusion obtenue et appelée « GST-CBD » possède une multitude d'activités du genre carbohydrate hydrolase : cellulase (à la fois endoglucanase, exoglucanase et beta- glucosidase), xylanase, chitinase, etc... mais aussi laccase ou « phenol oxydase » tout en gardant son activité originelle qui est la « Glutathion S transférase ».

L'invention montre que les activités spécifiques obtenues sont trop élevées et dépassent les activités spécifiques habituellement obtenues par des cocktails enzymatiques produits généralement par des mutants de champignons surproducteurs de ces enzymes.

Nous montrons que si l'on prend chaque élément tout seul (la GST seule ou le CBD seul), les nouvelles activités ne sont plus observées.

L'invention montre aussi que si l'on scinde la protéine de fusion en ses deux éléments constitutifs, par le biais d'une protéase, elle perd les nouvelles activités.

Pareillement, si l'on ajoute un anticorps anti-GST, il annule toutes les activités pré-citées.

Ceci montre que l'élément actif reste la GST mais il lui faut le CBD pour exercer cette multitude d'activités.

Exemples : Exemple 1 : EXPRESSION ET PURIFICATION DE LA PROTEINE DE FUSION « GST-CBD » L'expression a été réalisée dans le vecteur pGEX4T-2 qui permet une fusion de la protéine d'intért « le CBD » à la GST. Ce gène est sous le control du promoteur tac ; la protéine chimérique peut tre par la suite purifiée facilement en une seule étape et tre clivée par une protéase spécifique afin de libérer la protéine d'intért. Le plasmide pGEX4T-2 (Pharmacia Biotech) est un vecteur d'expression permettant la fusion de gène avec celui de la GST. Il possède un multisite de clonage en aval de la séquence codant la GST et contenant 6 sites de restriction différents, ainsi qu'une séquence de clivage protéique par la Thrombine. Le promoteur inductible en amont du gène GST ainsi que la séquence codant l'inhibiteur de l'opéron lactose permettent l'induction massive de l'expression du gène de fusion chez E. coli par ajout de l'IPTG dans le milieu de culture. Une origine de réplication et le gène de résistance à l'ampicilline complètent ce plasmide pour permettre sa multiplication, sa transmission et la sélection des bactéries transformées.

Le fragment CBD purifié sur gel d'agarose Nusieve est ligué au vecteur pGEX4T-2 digéré par les enzymes EcoRI et NotI. Après transformation des cellules d'E. coli « XL-lblue » et minipréparation de l'ADN plasmidique, nous avons retenu le clone recombinant CBD2/pGEX qui a été vérifié par des analyses de digestion par des enzymes de restriction appropriées, par PCR et par séquençage. L'expression a été réalisée en milieu LB (1 % Bacto-Tryptone, 0.5 % Yeast extract, 1 % NaCl) jusqu'au début de la phase stationnaire, suivie d'une induction à l'IPTG (entre 0,4 et 1 mM) et arrt au bout de 4 à 16 heures. Les protéines intracellulaires sont alors purifiées sur colonne G-sepharose et éluée par le glutathion réduit. La protéine de fusion a été purifiée à homogénéité en une seule étape sur colonne G-sepharose et éluée par le glutathion réduit.

Exemple 2 : DOSAGE DES ACTIVITES CELLULASIQUES DE LA FUSION « GST- CBD » Les différentes activités cellulasiques pf, CMCase, Salicinase de la protéine chimérique « GST- CBD » ont été dosées par le suivi des sucres réducteurs libérés en utilisant 1 % de substrat : Cellulose, CMC et Salicine (Tableau 1) en présence d'1 ul de l'enzyme purifiée dans le tampon citrate pH 4.8. L'activité beta-glucosidase a été dosée en suivant la libération du para- Nitrophénol à partir du pNPG.

Les résultats montrent que la protéine chimérique, contre toute attente, est capable d'attaquer la cellulose alors que la GST, purifiée dans les mmes conditions, n'a aucune activité contre la cellulose et ses dérivés. L'enzyme est capable d'attaquer aussi bien la CMC (activité principalement endoglucanase), la salicine (beta-glucosidase) que le papier filtre (toutes les activités cellulases confondues). De plus, ces activités sont trop élevées et dépassent les activités spécifiques habituellement obtenues par des cocktails enzymatiques produits généralement par des mutants surproducteurs. A titre comparatif, la comparaison des activités cellulasiques de cette protéine chimérique avec celles de souches de référence sont indiquées dans le Tableau 2.

Exemple 3 : REVELATION DE L'ACTIVITE DE LA « GST-CBD » SUR BOITE Utilisant la technique de coloration au rouge Congo, nous avons vérifié l'activité obtenue par un test sur boite. 10 ul de chaque clones « GST-CBD » et GST a été déposé sur une boite LBA contenant 1 % CMC et 20, ug/ml IPTG. Après incubation à 37°C pendant une nuit, la coloration au rouge Congo a montré un halo d'hydrolyse important uniquement avec le clone « GST- CBD ».

Exemple 4 : ACTION SUR DES SUBSTRATS APPARENTES A LA CELLULOSE 1-ANALYSE QUALITATIVE SUR DES SUBSTRATS CHROMOGENES Nous avons réalisé certains tests d'activité en mettant la « GST-CBD » et la GST seule en présence de certains substrats chromogènes à savoir : MUC : 4, Méthyl Ubeliferyl-p-cellobiopyranoside révélateur des cellobiohydrolases MUG : 4, MéthylUbeliferyl-p-D-Glucopyranoside révélateur des p-glucosidases XGLU : 5, bromo-4-chloro-3-inodyl-p-D-glucopyranoside : révélateur des p-glucosidases MAF : 4, Méthyl Ubelliferyl a-L-arabino Furanoside : révélateur des hémicellulases MUA : 4, MéthylUbeliferyl-a-Arabinoside : révélateur des hémicellulases Pour ce faire, nous avons ajouté 100 ul de la « GST-CBD » (ou de la GST seule) (à partir d'un mélange contenant 10 Ill d'enzyme et 500 ul tampon citrate 50 mM pH 4. 8) à 5 ul de substrat (concentration initiale 50 mg/ml).

L'analyse des résultats de ces expériences est effectuée par une simple observation sous UV.

Elle montre que la GST seule est totalement inactive sur ces différents substrats alors que la protéine « GST-CBD » présente encore une fois toutes les activités.

2-ANALYSE QUANTITATIVE : DOSAGE DES ACTIVITES DE LA « GST- CBD » SUR DIFFERENT SUBSTRATS CHROMOGENES La « GST-CBD » ou la GST seule ont été incubées avec 9 aryl-glucosides (a-glycoside ou p-glycoside) (Tableau 3). Avec tous ces substrats, nous avons détecté une libération du para- Nitrophénol, témoin des capacités de la « GST-CBD » ; ces activités sont absentes avec la GST seule. p-Nitrophenyl ß-D-cellobioside : révèle les exoglucanases, principalement. p-Nitrophenyl ß-D-lactoside : révèle certaines exoglucanases. p-Nitrophenyl (3-D-glucoside : révèle les aryl p-glucosidases. pNP ß-D-Cellotrioside : révèle les endoglucanases, principalement. pNP-p-D-Xylopyranoside révèle les xylobiosidases. pNP a-Arabinopyranoside : révèle les arabinases. pNP Mannopyranoside : révèle les mannosidases. pNP-Phosphate : révèle les phosphatases. pNP-NAcetyl-p-glucosaminide : révèle les chitinases. pNP a-Glucoside : révèle les alpha glucosidases.

De ce tableau, il ressort que notre enzyme chimérique est plutôt active sur les aryl beta monoglucosides, donc elle est plus proche d'une beta glucosidase que d'une vraie endo ou exoglucanase. Ceci étant, elle est aussi active sur d'autres substrats portant d'autres monosaccharides tels que le xylose, le N acétylglucosamine ou encore l'arabinose. Le lactose, un disaccharide hétérogène est aussi attaqué activement. Cependant, l'enzyme est nettement moins active sur l'alpha glucoside que le beta glucoside, elle est donc plus proche d'une cellulase que d'une amylase. Elle est aussi faiblement active sur le mannoside en tant que sucre ainsi que sur le pNP phosphate en tant que substrat non osidique.

3-AUTRES ACTIVITES « CARBOHYDRATE HYDROLASE » Nous avons dosé la « GST-CBD » avec d'autres substrats (Tableau 4). En plus des activités hydrolases, laccase, cette protéine de fusion est douée : - D'une activité amylolitique révélée sur l'amidon - D'une activité p-glucanase détectée avec le substrat laminarine.

- D'une activité chitinase, - D'une activité pectinase.

Toutes ces activités sont absentes avec la GST seule.

Exemple 5 : INHIBITION DE L'ACTIVITE PAR L'ADDITION DE L'ANTICORPS ANTI-GST OU PAR CLIVAGE DE LA PROTEINE « GST-CBD » PAR LA THROMBINE La protéine chimérique ne garde pas son activité après clivage protéolytique de la jonction entre GST et CBD, après traitement à la thrombine. 5,3 Rg de « GST-CBD » a été incubée avec 1 jul de Thrombine protéase (10 unités) à différent temps et à 22°C. Le résultat de la digestion est analysé par Western Blot en utilisant l'anticorps anti GST. Cette figure montre que la protéine chimérique « GST-CBD » est clivée au fur et à mesure du temps d'incubation.

Nous avons dosé l'activité pf après deux heures de digestion, nous avons noté une diminution de cette activité de presque 30 fois. Nous montrons ainsi que si l'on scinde la protéine de fusion en ses deux éléments constitutifs, par le biais d'une protéase, elle perd ses nouvelles activités ; ce qui montre qu'ils ne peuvent pas se complémenter en trans.

L'activité pf a été déterminée avec ou sans ajout de l'anticorps Anti-GST. Le Tableau 5 montre que l'ajout de l'anticorps anti-GST, annihile toutes les activités pré-citées. Ceci montre que l'élément actif reste la GST mais il lui faut le CBD pour exercer cette multitude d'activités.

Exemple 6 : BILAN DE LA PURIFICATION SUR GLUTATHION SEPHAROSE Les activités CMCase et pf ont été dosées avant et après purification de la « GST-CBD » sur colonne de Glutathion sépharose. Le Tableau 6 montre une très légère perte d'activité après purification.

Le Tableau 7 montre le bilan de la purification, sachant que nous avions déposé 35ml sur la colonne de G-sépharose, à partir de 50ml d'extrait brut (à 22.2 mg/ml de protéines). 45 ml de protéines éluées (à 0.05 mg/ml) ont été récupérés. L'augmentation des rendements de purification montrent qu'il y aurait une certaine inhibition exercée par les protéines endoplasmiques d'E. coli.

Exemple 7 : MESURE DE L'ACTIVITE ORIGINELLE « GLUTATHION S TRANFERASE » DE LA FUSION « GST-CBD » La protéine de fusion « GST-CBD », qui a gagné toutes ces potentialités hydrolytiques, a gardé son activité vis à vis de son substrat originel. Nous l'avons incubé en présence du substrat CDNB (l-chloro-2, 4-dinitro-benzene) et de Glutathion réduit (Figure 1). L'activité Glutathion S transférase a été mesurée à 22°C.

Le résultat montre que cette protéine garde encore son activité Glutathion S transférase malgré la présence du CBD et malgré sa conversion en hydrolase capable de scinder plusieurs substrats poly-osidiques.

Exemple 8 : OPTIMUM DE pH ET DE TEMPERATURE DE L'ACTIVITE CELLULASE DE LA « GST-CBD » Noua avons étudié l'effet de la température et du pH sur son activité pf. Pour ce faire nous avons réalisé le dosage de l'activité pf à des températures allant de 4°C à 80°C (en maintenant le pH de la réaction à 5) et à des pH allant de 3 à 10 (en maintenant la température d'action à 50°C).

La Figure 2 montre que l'optimum de pH et de température sont respectivement 5 et 50°C donc la « GST-CBD » se comporte comme la plupart des « cellulases » fongiques classiques.

Exemple 9 : EFFET DE CERTAINS ADDITIFS Les résultats présentés à la Figure 3 montrent l'effet de certains additifs sur l'activité pf.

Certains additifs ont montré un effet bénéfique comme le DDT (1 mM). Par contre, le SDS, comme attendu d'un puissant dénaturant des protéines, affecte drastiquement l'activité.

Exemple 10 : DOSAGE D'AUTRES ACTIVITES ENZYMATIQUES SUR DES SUBSTRATS NON SACCHARIDIQUES 1-ABSENCE D'ACTIVITE LIPASE Ceci a été réalisé par un premier test qualitatif, en étalant la « GST-CBD » sur milieu LB contenant 1 % d'huile d'olive et 1 % de rhodamine. L'observation sous U. V n'a révélée aucun halo d'hydrolyse.

Ce résultat a été confirmé par titration des acides gras libérés en utilisant un pH-stat à une température de 40°C. Nous avons noté l'absence de toute activité lipasique.

2-ABSENCE D'ACTIVITE PROTEASE Le test qualitatif a été effectué par incubation du clone « GST-CBD » sur milieu LB contenant 1 % caséine. La coloration avec l'iode était négative, ce qui montre que la « GST- CBD » n'est pas douée d'une activité protéase.

3-ABSENCE D'ACTIVITE DNASE De mme, en incubant notre enzyme en présence d'ADN du phage lambda en présence ou non de 10 mM MgCl2, aucune activité dégradative n'a été enregistrée.

4-PRESENCE D'ACTIVITE LACCASE En plus des activités hydrolases, la protéine « GST-CBD » a montré une activité « phenol oxydase », estimée à 45.33 U. I./ml (méthode ABTS) et 17 nkatals/ml (méthode syringaldazine). Cette activité laccase est négligeable avec la GST seule, respectivement 0.45 U. I. et 0.91 nkatals/ml.

A titre comparatif, nous avions estimé l'activité laccase du champignon Trametes versicolor à 3283 U. I/ml (ABTS), après induction au son de blé. L'activité de notre protéine de fusion est donc certes faible mais si on l'a convertit en activité spécifique, elle n'est pas négligeable.

Exemple 11 : APPLICATION DE LA PROTEINE GST-CBD DANS LE DELAVAGE DE JEANS Nous avons utilisé la protéine de fusion « GST-CBD » dans une des applications industrielles, à savoir le traitement ou délavage des blue-jeans. Habituellement, le délavage de jeans se fait par abrasion à la pierre ponce. Par la suite, les cellulases ont fait leur entrée dans le marché et se sont avérées capables de remplacer la pierre ponce dans leur effet abrasif, appelé bio-stoning. Les laccases sont aussi utilisées pour décolorer les tissus grâce à leur propriété de casser la molécule d'Indigo.

La présente invention montre que notre protéine, douée à la fois de capacités cellulasiques et laccase, est parfaitement capable de décolorer les tissus colorés à l'indigo. Son effet est bien meilleur que les cellulases classiquement utilisées. Enfin, notre protéine peut tre appliquée dans plusieurs autres domaines industriels tels que l'industrie papetière et le traitement de la pulpe et du papier, la panification, l'agroalimentaire, l'alimentaire, etc...