CAMPO TÉCNICO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se relaciona con el campo técnico de la Biotecnología y Agricultura, ya que proporciona cepas bacterianas endófitas aislada de Vaccinium corymbosum (arándano azul), mezclas probióticas que comprenden a las cepas bacterianas, formulación y método, para estimular el llenado de frutos vegetales, mediante el uso de la formulación, la cual contiene a las cepas bacterianas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

El cultivo de mora azul en la actualidad se encuentra extendido en países como China, Japón, Chile, Nueva Zelanda, Argentina y México. Según la FAO, la superficie mundial del cultivo ha aumentado 15000 ha aproximadamente entre el 2010 y el 2014. México, se encuentra entre los países que ha impulsado el cultivo de este arbusto. En 2019, SIAP reportó la cantidad de 3786.45 ha sembradas de arándano azul en México, principalmente en los estados de Jalisco, Michoacán, Sinaloa y Puebla. El uso indiscriminado de productos químicos para la cosecha de este cultivo a llevado a los productores a decantarse por un sistema de producción orgánica, utilizando fuentes orgánicas para suministrar los requerimientos nuthcionales de la planta. Esta decisión de un tratamiento orgánico se ve reflejado en el valor agregado del producto, sin embargo, presenta dos restricciones: el uso de herbicidas y las pocas fuentes de aporte de nitrógeno para el cultivo.

El uso de microorganismo como biofertilizantes ha surgido como una alternativa ya que no sólo es amigable con el ambiente, sino también como una alternativa para incrementar el rendimiento del cultivo, además de proporcionar los diferentes nutrientes, incluidos el Nitrógeno, para un correcto llenado de frutos vegetales.

El documento de patente WO2015118516 (A1 ) se refiere a bacterias del suelo para inocular suelos estresados. Entre las cepas que la invención proporciona está una cepa AP productora de exopolisacáridos, preferiblemente seleccionada del grupo que consiste en Bacillus simplex S 28 NCAIM (P) B 001432, Kocuria rosea S 225 NCAIM (P) B, 001426, Leuconostoc mesenteroides K2009 25/4 NCAIM (P) B 001372, Pseudomonas chlororaphis K2009 13/4 B NCAIM (P) B 001370, y Pseudomonas chlororaphis K2009 9/4-B NCAIM (P) B 001371. Este documento WO2015118516 (A1 ) ya propone el uso de cepas bacterianas para suelos con estrés, en donde se han aislado cepas de los géneros Bacillus spp. y Kocuria spp., pero ninguna cepa corresponde a las especies que propone la presente invención. Además, este documento no hace referencia de que se haya aislado alguna cepa del género Caulobacter spp. El fin de las cepas de este documento es muy distinto al uso que propone la presente invención. Más aún, estas cepas fueron aisladas de suelos fuera de México, por lo que sus características de crecimiento y de invasión de microorganismos están determinadas por su constitución genética y el medio ambiente (región geográfica) en donde se desarrollaron. Por lo tanto, las cepas bacterianas del documento WO2015118516 (A1 ) no tendrán la misma efectividad de crecimiento, de invasión y fomento al llenado de frutos vegetales, si fueran utilizadas en suelos mexicanos. Es por ello el gran interés en aislar, validar las posibles características antagonistas y de fomento el llenado de frutos vegetales, de cepas bacterianas endófitas en México, para garantizar una alta efectividad de dichas cepas aisladas.

El documento de patente CN201710185079 (A) describe fungicidas biológicos para prevenir y controlar enfermedades y plagas en árboles frutales. Los fungicidas biológicos pueden comprender una mezcla compuesta de una mezcla de cepas del género Bacillus spp., un medio de cultivo, y un portador. La mezcla de bacilos comprende: Bacillus licheniformis, Bacillus pumilus y Bacillus thuringiensis. Como se puede ver este documento de patente solamente propone el uso de cepas del género Bacillus spp., y son para controlar enfermedades y plagas en árboles frutales, por lo que no están destinados específicamente a fomentar el llenado de frutos vegetales. Además, si estas cepas bacterianas son originarias de la República popular de China, difícilmente tendrán el mismo efecto para fomentar el llenado de frutos vegetales.

El documento de patente KR2007137133 (A) divulga un método de cultivo de frutas con un alto contenido de vitamina y calcio mediante una pulverización foliar de un líquido fermentado utilizando algas, azúcar, azúcar en polvo derivado de la maicena, ajo, harina de pescado y similares para mejorar el valor añadido de la fruta a bajo costo. El método comprende preparar polvo fermentado de algas, con azúcar, azúcar en polvo derivado de la maicena se disuelven en agua y se fermentan con un cultivo de Bacillus subtilis ATCC 9372 para obtener un extracto de algas fermentadas. El ajo machacado y el agua se calientan en una caldera doble, se filtran, se mezclan con azúcar, azúcar en polvo derivado de la maicena y un cultivo de Lactobacillus acidophilus ATCC 9224 y fermentado para dar extracto de ajo fermentado. El extracto de algas fermentadas se mezcla con el extracto de ajo fermentado en una proporción en peso de 1 a 51 y se rocía foliarmente 3 veces en un intervalo de tiempo de 6 semanas antes de la cosecha. La harina de pescado de lomo azul se mezcla con un cultivo de Lactobacillus acidophilus ATCC 9224, azúcar y extracto de levadura y fermentado para dar extracto de pescado lomo azul. El polvo de pescado se disuelve en agua, se degrada enzimáticamente con una proteasa y se filtra para dar un hidrolizado de pescado enzimático. El polvo de pescado de lomo azul se mezcla con el hidrolizado de pescado enzimático en una proporción en peso de 1 a 51 y rociado foliar antes y después de la temporada de lluvias y de 5 a 4 semanas antes de la cosecha. El polvo de algas, el azúcar y el azúcar en polvo derivado de la maicena se disuelven en agua, se fermenta con un cultivo de Bacillus pumilus ATCC 7061 , se rocía foliar después de la floración, 2 semanas después de la primera pulverización y después del cuajado de la fruta. El documento KR2007137133 (A) se aleja del espíritu de la presente invención, ya que las cepas bacterianas que se utilizan son para generar un extracto fermentado, el cual se mezcla con otras sustancias, por lo que las cepas no se aplican vivas a las plantas.

Por lo tanto, con la finalidad de contribuir a la solución de los inconvenientes antes mencionados, se aislaron cepas bacterianas endófitas de plantas de Vaccinium corymbosum (arándano azul), las cuales mostraron estimulación en el llenado de frutos vegetales; por lo que también se desarrollaron mezclas probióticas con dichas cepas endófitas, y formulaciones y un método, para estimular el llenado de frutos vegetales.

Los detalles característicos de la presente invención, se muestran claramente en la siguiente descripción, y ejemplos, que se acompañan meramente con la finalidad de ilustrar algunas realizaciones de la invención.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

La presente invención tiene como objeto una cepa aislada de Caulobacter vibrioides identificada como B18, caracterizada porque comprende las características de la cepa depositada con el número de acceso CM-CNRG TB186.

La presente invención tiene también como objeto una cepa aislada de Providencia rettgeri identificada como B105, caracterizada porque comprende las características de la cepa depositada con el número de acceso CM-CNRG TB187.

Dicha invención tiene además como objeto una cepa asilada de Bacillus pumilus identificada como B124, caracterizada porque comprende las características de la cepa depositada con el número de acceso CM-CNRG TB188.

Las cepas bacterianas, aisladas y depositadas: CM-CNRG TB186 (Caulobacter vibrioides), CM-CNRG TB187 (Providencia rettgeri), y CM-CNRG TB188 (Bacillus pumilus) donde dichas cepas bacterianas son endófitas de plantas de Vaccinium corymbosum (arándano azul); y se encontró que las cepas bacterianas exhiben actividad estimulante en llenado de frutos vegetales, por ejemplo en frutos vegetales pertenecen a plantas de la familia Ericaceae, específicamente en frutos vegetales que son de plantas que pertenecen al género Vaccinium, y más específicamente en frutos vegetales de plantas pertenecientes a la especie Vaccinium corymbosum.

Un objeto más de la presente invención es una mezcla probiótica, la cual puede comprender, al menos, dos cepas bacterianas aisladas, de conformidad con las cepas bacterianas descritas en la presente invención.

La mezcla de la reivindicación anterior, donde dichas cepas bacterianas son endófitas de plantas de Vaccinium corymbosum (arándano azul).

Otro objeto más de esta invención es una formulación para estimular el llenado de granos vegetales, la cual puede comprender: al menos, una cepa bacteriana aislada, la cual es seleccionada del siguiente grupo de cepas depositadas: CM- CNRG TB186 (Caulobacter vibrioides), CM-CNRG TB187 (Providencia rettgeri), y CM-CNRG TB188 (Bacillus pumilus), y sus mezclas entre ellas; al menos, una sustancia prebiótica; y al menos, un diluyente.

Una realización de la formulación de la presente invención, es donde la cepa bacteriana, ya sea individual o mezclada está en una cantidad de 0.01%, la sustancia prebiótica en 4.99%, y el diluyente en 95%, con respecto al volumen total de la formulación.

Dicha invención también tiene como objeto un método para estimular el llenado de frutos vegetales, que comprende, aplicar a frutos vegetales, una cantidad suficiente de una formulación para estimular el llenado de frutos vegetales, de conformidad con presente invención. llna variante del método para estimular el crecimiento en plantas vegetales, es cuando la cantidad suficiente de la formulación es de 1 L por cada 4,166 plantas vegetales de Vaccinium corymbosum.

Una realización más del método en cuestión, es cuando la aplicación de la formulación es en la etapa denominada “amarre de fruto” que es cuando las plantas ya florearon y se llevó acabo la polinización y los frutos inician su formación.

Una realización más de dicho método para estimular el crecimiento en plantas vegetales, es cuando las plantas vegetales son de la familia Ericaceae, preferentemente del género Vaccinium, y más preferentemente de la especie Vaccinium corymbosum.

EJEMPLOS

Los siguientes ejemplos se incluyen con única finalidad de demostrar la concepción de la presente invención y de algunas realizaciones preferentes, por lo que no deberán ser considerados como una limitante para los alcances de protección de la presente invención.

Ejemplo 1 . Aislamientos de cepas bactrianas endófitas de plantas de Vaccinium corymbosum (arándano azul).

Se estableció un estudio de simbiosis en diferentes regiones del estado de Jalisco, entre los meses de septiembre de 2020 a julio del año 2021 , con la finalidad de evaluar el potencial de cepas bacterianas en la producción de auxinas y producción de la hormona de inhibición de acetileno, ACC desaminasa. Las cepas se aislaron de Vaccinium corymbosum (arándano azul), utilizando el método de extracción de endófitos, los tejidos de donde se aislaron las cepas fue hojas, tallo, raíz, flor, fruto y peciolo debido a que en la literatura se ha encontrado que estas cepas se concentran ahí. Se aislaron un total de 3 cepas de los géneros Bacillus (1 cepa), Caulobacter (1 cepa) y Providencia (1 cepa) de un total de 145 cepas aisladas, porque dichas cepas mostraron mayor producción de ACC desaminasa, enzima que inhibe la producción de etileno, molécula de maduración de los frutos, más obtención de micronuthentes como lo es el Fe, además de la mayor producción de hormonas de crecimiento vegetal como lo son las auxinas.

Específicamente, las 3 cepas bacterianas fueron seleccionadas porque mostraron las siguientes actividades:

- Caulobacter vibrioides B18 (Proteobacteria), identificada como B18 fue seleccionada porque fija nitrógeno, produce sideróforos, produce oxidasas, ácido cianhídrico, amonio y quitinasas, así como ACC deaminasa y es la cepa que produce más polihidroxibutirato.

- Providencia rettgeri B105 (Proteobacteria), identificada como B105, fue seleccionada porque fija nitrógeno, produce sideróforos, ácido cianhídrico, amonio, quitinasas, ACC deaminasa, y catalasas.

- Bacillus pumilus B124 (Firmicutes), identificada como B124, fue seleccionada porque fija nitrógeno, solubiliza fosfatos, produce sideróforos, produce catalasas, quitinasas, amonio, ACC deaminasa, polihidroxibutirato, glucanasas y es la que produce mayor cantidad de proteasas.

Ejemplo 2. Pruebas agronómicas de las 3 cepas bacterianas aisladas.

A los aislados de arándano azul seleccionados se le realizaron las siguientes pruebas agronómicas: prueba de fijación de nitrógeno (NFB), prueba de solubilización de fosfato (NBRIP Ca, y NBRIP Fe), prueba de quelantes de hierro (sideróforos), prueba de producción de fitohormonas (auxinas) y prueba de producción de enzima ACC desaminasa (ACC). En este caso, como nuestro principal objetivo era seleccionar microorganismos que indujeran el crecimiento de la planta, pusimos énfasis en la producción de auxinas, ya que esta es una fitohormona relacionada con el crecimiento, así como la fijación de nitrógeno, elemento esencial para la planta y sobre todo la producción de la enzima ACC desaminasa, una enzima cuya función es inhibir la síntesis de etileno, molécula relacionada con la maduración de los frutos. Sin embargo, también consideramos los resultados de las demás pruebas para generar un producto que no solo logre un crecimiento adecuado, sino que también aporte otras propiedades que pueden ser beneficiosas para la planta. Al analizar todos los aislados, seleccionamos los siguientes 3 microorganismos, cuyos resultados se muestran en la tabla 1 .

En la tabla 1 observamos que las 3 cepas son positivas para la prueba de fijación de nitrógeno, debido al cambio de coloración que se generó en el medio de cultivo. Para la solubilización de fosfatos, se mide el halo generado alrededor de la colonia inoculada en el medio, la cepa correspondiente a B124 fue la única que generó un halo en la solubilización de fosfatos de calcio siendo la cepa con mayor solubilización de fosfatos de las tres seleccionadas generando un halo de 0.4 cm, el resto de las cepas fueron negativas para esta prueba. Con los fosfatos de hierro, ningún aislado incluyendo las tres cepas seleccionadas lograron solubilizar dichos fosfatos.

Tabla 1. Resultados de las pruebas agronómicas de las 3 cepas seleccionadas para la formulación de llenado de frutos vegetales.

Donde, lig + es una producción mínima. + es poca producción. ++ es producción moderada y +++ es una producción abundante.

En el caso de sideróforos, las tres cepas mostraron ser efectivas para para la producción de estos quelantes, siendo la cepa B124 la que tiene mayor producción de sideróforos. En la producción de auxinas, la cepa que produjo mayor cantidad de esta fitohormona es la cepa B105, al obtener 3 cruces de 3, mientras que las cepas B18 y B124, no fueron capaces de producir esta molécula. Por último, la producción de la enzima ACC desaminasa, como observamos en la tabla, las tres cepas producen una buena cantidad de esta enzima al obtener 3 cruces de 3

DEPÓSITO DE LAS CEPAS BACTERIANAS AISLADAS

Al ver que las cepas bacterianas aisladas Caulobacter vibrioides identificada como B18, Providencia rettgeri identificada como B105, y Bacillus pumilus identificada como B124, tienen potencial agronómico, se procedió a depositarlas el 21 de enero de 2022, en la Colección de Microorganismos del Centro Nacional de recursos Genéticos que pertenece al Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias, con número de registro ante la World Federation of Culture Collection 1006 (CM-CNRG) y Autoridad Depositaría Internacional con notificación 308 con fines de procedimiento de patente conforme al Tratado de Budapest; y que tiene su domicilio en Boulevard de la Biodiversidad 400, C. P. 47600. Tepatitlán de Morelos, Jalisco, México. La cepa bacteriana Caulobacter vibrioides identificada como B18 le correspondió el número de depósito CM-CNRG TB186, la cepa Providencia rettgeri identificada como B105 fue depositada con el número CM-CNRG TB187 y Bacillus pumilus identificada como B124 depositada con el acceso CM-CNRG TB188.