本发明涉及天然药物化学领域和化妆品领域， 具体涉及化妆品或药品 中一种用于抗老化， 优选抗光老化的中草药杜仲。 背景技术

研究表明， 自由基和紫外线均是皮肤老化的因素之一， 而光老化主 要由曰光中的中波紫外线（UVB， 290-320nm)和长波紫外线（UVA , 320~400nm)共同引起。 紫外线对人皮肤的老化有明显促进作用， 高暴露 人群皮肤老化危险性比低暴露人群高一倍， 老化发生时间提前 10年。 长 期暴露于日光紫外线引起皮肤光老化， 并可导致严重的美容问题， 因而 近年来倍受行业关注， 抗老化和抗光老化的产品纷纷问世， 相关研究如 火如茶， 但天然中草药抗光老化添加剂仍是空缺。 发明内容

本发明目的在于提供一种杜仲提取物的制备方 法， 所述方法包括：

(1) 溶剂提取， 所述溶剂选自水、 甲醇、 乙醇、 异丙醇、 1-丁醇、 乙 二醇、 1,2-丙二醇、 1,3-丙二醇、 1,3-丁二醇、 丙酮、 乙酸乙酯或其組合；

(2) 分离提取液和残渣， 获得提取液；

(3) 可选的溶剂回收；

(4) 可选的溶解或稀释。

优选地， 其中步骤（1)的提取选自浸泡、 煎煮、 回流、 渗漉或其组合。 优选地， 其中步骤 (4)中所用的溶剂选自水、 乙醇、 异丙醇、 1-丁醇、 乙二醇、 1,2-丙二醇、 1,3-丙二醇、 1,3-丁二醇、 丙酮、 乙酸乙酯或其组合。

本发明另一目的在于提供另一种杜仲提取物的 制备方法， 所述方法 包括：

(1) 溶剂提取， 所述溶剂选自曱醇、 乙醇、 异丙醇、 1-丁醇、 乙二醇、 1，2-丙二醇、 1,3-丙二醇、 1,3-丁二醇、 丙酮、 乙酸乙酯或其组合；

(2) 分离提取液和残渣， 获得残渣； (3) 用水提取步骤 (2)的残渣。

(4) 分离水提取液和残渣， 获得水提取液；

(5) 浓缩， 乙醇醇沉， 分离获得沉淀；

(6) 可选地， 将步骤 (5)的沉淀溶解配制成溶液。

优选地， 其中步骤（1)和 (3)的提取独立地选自浸泡、 煎煮、 回流、 渗 漉或其组合。

优选地， 其中步骤 (6)中所用的溶剂选自乙醇、 异丙醇、 1-丁醇、、 乙 二醇、 1,2-丙二醇、 1，3-丙二醇、 1 ,3-丁二醇、 丙酮、 乙酸乙酯或其组合。

本发明的又一个目的是提供根据上述本发明的 制备方法获得的杜仲 提取物。

优选地， 所述杜仲提取物的形式选自乳剂、 溶液剂、 粉剂、 软膏剂、 膜剂或膏霜。 选光老化， 也可作为功效添加剂或者活性成分加入到化妆 品或药品中使 用。

本发明再一个目的是提供杜仲提取物在制备抗 老化， 优选抗光老化

本发明再一个目的是提供一种抗老化， 优选抗光老化的化妆品或药 ， 其中含有杜仲提取物。

在本发明中， 杜仲是指杜仲科植物杜仲 Eucommia ulmoides oliv的树 皮。 杜仲主产于四川、 陕西、 湖北、 河南、 贵州、 云南。 在清明至夏至 间， 选取生长 15-20年以上的植株， 按药材规格大小， 剥下树皮， 刨去粗 皮， 晒干， 置通风干燥处。

杜仲,甘微辛，温，入肝肾经，补肝肾，强筋� �， 延年驻颜。 杜仲含有木脂 素类、 环烯醚菇类、 有机酸、 菇类、 多糖、 氨基酸和杜仲胶等有机化合 物和钙、铁等无机元素。《别录》"主脚中酸� �， 不欲践地"，《神农本草经》 "补中益精气， 坚筋骨，久服轻身。，，现代药理研究，杜仲 有延緩衰老作用， 可以抗脂质过氧化， 并由双向调节免疫功能的作用。

本发明的方法制得的杜仲提取物具有清除自由 基抗氧化的作用， 同 时能够帮助皮肤抵御 UVB和 UVA的紫外线照射， 保护皮肤， 减少细胞 损伤， 防止真皮胶原蛋白的减少， 有效预防皮肤老化， 尤其是光老化， 且对皮肤无刺激性。 具体实施方式

实施例 1

取杜仲 Eucommia ulmoides 100g, 力 8倍量 (倍量： 指溶剂体积与杜 仲重量的比值， 其中溶剂体积的单位是 ml , 杜仲重量的单位是 g , 下 同） 75%乙醇 (v/v)冷浸 48小时， 滤过， 滤液回收乙醇， 所得提取物用水溶 解， 制成含生药量为 1000mg/ml的溶液， 得到提取物 A。 实施例 1

取杜仲 Eucommia ulmoides 100g, 加 8倍量曱醇回流提取 2小时， 滤 过， 滤液回收曱醇， 所得提取物用水溶解， 制成含生药量为 500mg/ml的 溶液， 得到提取物 B。 实施例 3

取杜仲 Eucommia ulmoides 100g, 用 10倍量水煎煮提取约 2小时， 浓缩， 滤过， 上清液加水制成含生药量为 1000mg/ml 的溶液， 得到提取 物 C。 实施例 4

取杜仲 Eucomm i i mok s l QOg, 力。 6倍量乙醇回流提取， 滤过， 残 渣再用 10倍量水煎煮提取约 2小时， 浓缩， 加 2倍量乙醇沉淀， 滤过， 沉淀用水溶解， 制成含生药量为 500mg/ml的溶液， 得到提取物 D。 实施例 5: DPPH实验

自由基是一类性质活泼、 具有极强氧化能力的化学物质。 紫外线 UVA/UVB的照射会产生大量自由基， 对机体造成损伤， 加速衰老。 在此 采用 DPPH自由基清除法测定实施例中提取物的体外� �氧化活性。

用蒸馏氷将实施例中的提取物从 5%开始对半稀释至 0.625%v/v)共 4 个浓度。 然后取实施例提取物 2ml、 浓度为 50(^mol/L的 DPPH乙醇溶液

0.5ml和 1.5ml水， 先后加入同一试管中， 摇匀， 静置， 30min后在 517nm 处测定其吸光度（OD )， 并以相应的混合液作为空白对照。 实施例提取物 对 DPPH的清除率根据以下公式计算： 清除率（ ％)

其中：

T— DPPH+实施例提取物的吸光度，

TO—实施例提取物 +溶剂的吸光度，

C一 DPPH+溶剂的吸光度。

实验结果见表 1。

表 1、 杜仲提取物抗氧化能力评估

实验结果表明， 实施例 1提取物 A、 实施例 2提取物 B、 实施例 23 取物 C、 实施例 4提取物 D在体外四个浓度下均有较好清除自由基的抗 氧化能力， 其中以实施例 4提取物 D效果最好。 实施例 6: 成纤维细胞增殖试验

皮肤中的成纤维细胞是合成胶原蛋白的主要细 胞， 成纤维细胞的大 量增殖或成紆维细胞合成和分泌胶原蛋白能力 的增强， 都可以使胶原蛋 白总量增加， 从而减緩皮肤的衰老。 因此， 研究促成纤维细胞的增殖作 用是评价样品抗衰老活性的重要方法之一。 本试验根据以上皮肤衰老的 机理， 采用体外培养人成纤维细胞的方法， 来初步评价本发明中的杜仲 提取物的抗衰老功效。

将制备好的细胞悬液（配制成浓度为 5* 10 ³ 个 /ml )接种于 96孔板内， 待细胞贴壁后， 除空白对照组， 其他每孔加入 20ul相应浓度的实施例的 中草药提取物， 设 4个浓度組， 每組 6个孔， 置孵箱（37°C,5%C0 ₂ )中培养 24 h， 然后加人 MTT液 20ul， 继续在孵箱（37 C，5。/。C0 ₂ )中培养 4h。 取出 酶标板后， 小心吸去每孔内的培养液， 加入 DMSO,混合均匀。 用酶联免 疫检测仪测定光密度（ 570nm )， 通过与对照组的比较得到样品組的相对 增殖率.

杜仲提取物对成纤维细胞的增殖活性结果如表 2所示。

表 2、 杜仲提取物对成纤维细胞的增殖活性

实验结果表明， 实施例 1提取物 A、 实施例 2提取物 B、 实施例 3 提取物 C、 实施例 4提取物 D均可以促进成圩维细胞的增殖， 以实施例 3 提取物 C的效果最好， 其 0.001%浓度促成纤维细胞增殖达 11.91%。 实施例 7: UV照射对成纤维细胞损伤的保护作用

皮肤光老化主要由日光中的中波紫外线 （UVB, 290~320nm ) 和长 波紫外线 （UVA, 320~400nm ) 共同引起， 紫外线对人皮肤的老化有明 显促进作用。 UVA/UVB照射会引起成纤维细胞的损伤死亡， 对皮肤造成 伤害，导致光老化。在此通过 UV照射实验来考察实施例的中草药提取物 对 UV照射的细胞保护的抵御光老化作用。

分别取实施例中提取物 0.5ml, 力。 4.5ml PBS进行稀释， 配成 1/10浓 度 (v/v)进行抽滤， 然后取 0.1ml加 9.9ml无菌 PBS最后稀锋成 1/1000的 浓度 (v/v)。 以正常 DMEM液培养的皮肤成纤维细胞（ Fb ) 为对照组， 以 正常 DMEM液培养后用 UVA(5-20J/cm ² )/UVB UVB(20- 80J/cm ² )照射的 Fb 细胞为模型组，以含 1/1000浓度的实施例提取物和 DMEM液共培养并经 UVA/UVB照射的 Fb细胞为加药组。 紫外线处理后 24h， 通过 CCK-8用 酶标仪测定各孔的吸光度 (OD值）， 细胞增殖率为各处理组 OD值占阴性 对照组 OD值的百分率， 每个试验重复三次。

实验结果见表 3和表 4。

表 3、 UVA照射

实验结果表明， 实施例 1提取物 A、 实施例 2提取物 B、 实施例 3 提取物 C、 实施例 4提取物 D均可以减少 UV照射对成纤维细胞的损伤， 使细胞增值率均恢复至 90%以上， 并以实施例 4提取物 D的效果最好。 实施例 8: UV照射对对真皮成纤维细胞 MMP-1， MMP-3mRNA表 达的影响及杜仲的保护作用

MMP-1 (间质胶原酶）和 MMP-3 (基质溶解素）是降解真皮细胞外 基质的两种主要酶类， 它们表达水平的异常将引起真皮细胞外基质合 成 和分解代谢的失衡， 是光老化中真皮结构破坏的重要原因。

将真皮成纤维细胞接种于 60mm培养 中， 以含 1/1000浓度的实施 例提取物孵育细胞， 在细胞接受 UV照射后 24h， 进行细胞总 RNA的抽

RNA的反转录， 根据设计引物， 进行 Real- time PCR。

实验结果见表 5和表 6。

表 5

薩 Ρ-Ι/β-actin MMP-3/p-actin

未照射组 0.29+0.04 5.32±0.69

UVA照射组 0.40±0.04 9.07±1.32 ^#

实施例 1提取物 A 0.32±0.02* 6.47±1.66*

实施例 2提取物 B 0.32±0.03* 6.45±1.18 ^A

实施例 3提取物 C 0.31±0.03 * 6.67±0.64 *

实施例 4提取物 D 0.30±0.03 ** 4.18+0.92 **

与未照射组相比 ： ^# P<0.01 , 与 UVA组相比 *P<0.05 , **P<( 表 6

ΜΜΡ-Ι/β-actin MMP-3/p-actin

未照射组 0.20+0.03 3.91±0.18

UVB照射组 0.31±0.03 ^# 6.33±0.25 ^# 实施例 1提取物 A 0.24±0.03* 4.66±0.28* 实施例 2提取物 B 0.24±0.06* 4.6510.71* 实施例 3提取物 C 0.22±0.04 * 4.08±0.11 ** 实施例 4提取物 D 0.21±0.03 ** 3.65±0.52 ** 与未照射组相比： ^# P<0.01 , 与 UVB组相比： *P<0.05 , **P<0.01 实验结果表明， 实施例 1提取物 A、 实施例 2提取物 B、 实施例 3 提取物 C、 实施例 4提取物 D均可以减弱 UV照射引起的真皮成纤维细 胞 MMP-1 , MMP-3mRNA的异常表达， 并以实施例 4提取物 D的效果最 好。 实施例 9: UV照射对真皮成纤维细胞 I， m型前胶原蛋白表达水平 的影响及杜仲的保护作用

光老化的主要病理改变在真皮层， 而真皮成纤维细胞是维持真皮正 常结构和功能的主要细胞， I 、 in型胶原是构成真皮细胞外基质的主要 成分。 研究表明， 光老化皮肤胶原产生减少， UV照射 24h后前胶原会显 著减少。

皮肤成纤维细胞接种于 35mm培养 中。 以以含 1 /1000浓度的实施 例提取物孵育细胞， UV照射后 24h， 收集细胞培养上清液， 采用双抗体 夹心 ABC-ELISA法， 用酶标仪在 450nm处测吸光值 ( OD值）。 在标准 曲线上根据 OD值读出样品 I和 III型前胶原蛋白含量（ ng/ml )。 同时收集 细胞， 于 -20°C反复冻融细胞三次， 4°C 14000g离心 15min, 取上清液进 行测定细胞蛋白定量， 加标准品或待测样品 20ul于 96孔板中， 各孔加入 200ulBCA工作液， 37°C放置 20-30min, 用酶标仪在 562nm处测吸光值 ( OD值）， 根据标准曲线计算出待测样品的蛋白含量（mg/ ml )。 细胞培 养上清液中 I和 III型前胶原蛋白表达水平由细胞蛋白含量矫正 ，以 ng/mg 表示。

实验结果见表 7和表 8。

表 7

I型前胶原蛋白 （ng/mg ) ：； ΙΠ型前 ^"白 （ng/mg ) 未照射组 106.50±5.20 43.07±1.85

UVA照射组 64.13±7.21 ^{# : :} 24.30±2.80* 实施例 1提取物 A 84.37±2.42* 29.77±2.37* 实施例 2提取物 B 82.88±1.81* ' 30.12±2.66* 实施例 3提取物 C 83.57±0.91* 30.10±3.65* 实施例 4提取物 D ： 85.60±3.50 ** ；：31.47±5.45 * 与未照射组相比： <0.01 , 与 UVA1组相比： *Ρ<0·05 , **Ρ<0.01 I型前 蛋白 （ ng mg) ; m型前 蛋白 未照射組 123.80±5.82 64.87±2.65

UVB照射组 74.57±3.89 ^# 37.47±2.75 ^§ 实施例 1提取物 A 94.37±3.84* 40.77±2.37* 实施例 2提取物 B 92.88±2.36* 40.12i4.29* 实施例 3提取物 C 93.57±6.73* 40.10±2.43* .实施例 4提取物 D 114.40±4.77 ** ： 44.40±2.80 * 与未照射組相比： ^# 尸<0.01 , 与 UVA1组相比： *尸<0.05， ** <0.01 实验结果表明， UV照射显著抑制了成纤维细胞表达 I , III型前胶原 蛋白 （Ρ<0.01 )。 照射同时加入含 1/1000浓度的各实施例提取物 Α、 Β、 C和 D， 可使细胞培养上清液中 I型和 III型前胶原蛋白的含量不同程度 的增高， 以实施例 4提取物 D的效果最好。 实施例 10: 分别以本发明实施例 1-4提取得到的杜仲提取物 、 B、 C、 和 D制备的乳剂一、 二、 三和四

MGS-AV 甘油硬脂酸酯 1.0 1.0 1.0 1.0 ( NIKKOL )

Sepigel305 聚丙烯酰胺， 0.8 0.8 0.8 0.8

C13-14异链烷

烃， 月桂醇聚

醚 -1

丁二醇 丁二醇 2.0 2.0 2.0 2.0 戊二醇 ( Symrise ) 1，2-戊二醇 1.0 1.0 1.0 1.0

甘油 甘油 3.0 3.0 3.0 3.0

Liquid 双咪唑烷基 0.65 0.65 0.65 0.65 Germall Plus 脲, 丙炔醇

丁基氨曱酸

酯， 丙二醇

实施例 1提取物 A 2.5 - - - 实施例 2提取物 B - 2.5 - 一 实施例 3提取物 C - - 2.5 - 实施例 4提取物 D - - - 2.5 制备方法： 将辛 癸酸甘油三酯、棕榈酸乙基己酯、 鲸蜡醇、 山嵛醇聚 醚 -25、 甘油硬脂酸酯混合后， 加热搅拌溶解均匀； 将丁二醇、 1,2-戊二醇、 甘油、黄原胶、去离子水力。热搅拌溶解均匀 ； 均质条件下将两部分混合均匀， 然后加入 Sepigel305 _o 冷却至 50度加入 Liquid Germall Plus和本发明杜仲提 取物， 搅拌均勾即得成品。

实施例 11: 分别以本发明实施例 1-4提取得到的杜仲提取物 、 B、 C, 和 D制备的溶液剂一、 二、 三和四

丙二醇 丙二醇 3.0 3.0 3.0 3.0 戊 二 醇 I, ² -戊二醇 2.0 2.0 2-0 2.0 ( Symrise )

Liquid 双咪唑烷基脲， 0.60 0.60 0.60 0.60 Germall Plus 碘丙炔醇丁基

氨曱酸酯， 丙二

醇

EDTA二钠 EDTA二钠 0.05 0.05 0.05 0.05 透明质酸钠 透明质酸钠 0.02 0.02 0.02 0.02 实施例 1提取物 A 3.0 - - - 实施例 2提取物 B - 3.0 - - 实施例 3提取物 C - - 3.0 - 实施例 4提取物 D - - - 3.0 制备方法： 将水、 丁二醇、 丙二醇、 1,2-戊二醇、 EDTA二钠、 透明质 酸钠混合， 加热， 搅拌溶解均勾后， 冷却至 55度， 加入 Liquid Germall Plus 和本发明杜仲提取物， 搅拌溶解均匀， 即得成品。

根据以上实施例 10和 11 的配方制得的化妆品制剂， 具有一定的抗 氧化和抗光老化的作用。

皮肤光老化主要由日光中的中波紫外线 (UVB , 290~320nm )和长波紫 外线 (UVA, 320〜400nm )共同引起， 紫外线对人皮肤的老化有明显促进作 用。 UVA/UVB照射会引起成纤维细胞的损伤死亡， 以及真皮胶原蛋白的 减少，对皮肤造成伤害。本发明以一定强度的 UVA/UVB照射培养的皮肤 成纤维细胞， 以杜仲提取物孵育，可以有效减少 UV照射对成纤维细胞增 殖的影响， 同时可以有效减少真皮成纤维细胞胶原蛋白的 变化， 保护皮 肤， 说明杜仲提取物对皮肤成纤维细胞具有紫外照 射损伤的保护作用， 能够防御光老化。