本明細書において、アミノ酸配列および� ��基配列の同一性(相同性)は、遺伝情報処理� �フトウェアGENETYX(ゼネティックス社製)を用� �たLipman-Person法(Lipman, D. J. and Pearson, W. R.� �1985. Rapid and sensitive protein similarity searches . Science227:1435-1441)によるホモロジー解析(Searc h homology)プログラムを用いることが出来る。 具体的には、例えばラクトバチルス・カゼイ  YIT 9029及びラクトバチルス・ラムノーサス� �ATCC 53103の遺伝子を既知の遺伝子と相同性比 較して解析することにより算出したものであ り、パラメーターとしては、Unit Size to compa re=2, Pick up Location=5とし、結果を%表示させ� �行う。

 また、遺伝子とは、2本鎖DNAのみならず、 それを構成するセンス鎖およびアンチセンス 鎖といった各1本鎖DNAを包含する趣旨であり� �またその長さに何ら制限されるものではな� �。また、ポリヌクレオチドとしては、RNA、DN Aを例示でき、DNAは、cDNA、ゲノムDNA、合成DNA� ��包含する。

 本発明の酸素耐性付与遺伝子は、ラクトバ� ��ルス・カゼイ YIT 9029及びラクトバチルス� �ラムノーサス ATCC 53103から見出され、 fnr と命名された遺伝子(ラクトバチルス・カゼ� � fnr 、ラクトバチルス・ラムノーサス fnr ( fnr-r とも称する))、並びに当該遺伝子から演繹さ� ��る遺伝子であり、酸素耐性付与能を有する� ��ンパク質をコードするものである。

 本発明の酸素耐性付与遺伝子は、具体的に� ��、以下の(a)~(c)から選ばれるタンパク質をコ ードする遺伝子である。
 (a)配列番号2又は6に示すアミノ酸配列から� �るタンパク質
 (b)(a)のアミノ酸配列において1若しくは数個 のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された アミノ酸配列からなり、且つ酸素耐性付与能 を有するタンパク質
 (c)(a)のアミノ酸配列と85%以上の同一性を有� ��るアミノ酸配列からなり、且つ酸素耐性付� ��能を有するタンパク質

 ここで、配列番号2に示すアミノ酸配列から なるタンパク質はラクトバチルス・カゼイ Y IT 9029由来のタンパク質であり、配列番号6に 示すアミノ酸配列からなるタンパク質はラク トバチルス・ラムノーサス ATCC 53103由来の� �ンパク質である。
 配列番号2又は6に示すアミノ酸配列におい� �、1若しくは2以上のアミノ酸が欠失、置換若 しくは付加されたアミノ酸配列には、1若し� �は数個、好ましくは1~10個のアミノ酸が欠失� ��置換若しくは付加されたアミノ酸配列が含� ��れ、付加には、両末端への1~数個のアミノ� �の付加が含まれる。

 アミノ酸の欠失、置換、付加は、例えば、� ��列番号2に示すアミノ酸配列からなるタンパ ク質が1塩基置換等の天然に生じる変異や、� �位特異的変異導入法や突然変異処理等によ� �て遺伝子に人為的に導入される変異等によ� �生じ得るものが包含される。斯かるアミノ� �の欠失、置換もしくは付加を人為的に行う� �合の手法としては、例えば、配列番号2で示� ��れるアミノ酸配列をコードする塩基配列か� ��なるポリヌクレオチドに対して慣用の部位� ��異的変異導入を施し、その後このポリヌク� ��オチドを常法により発現させる手法が挙げ� ��れる。
 また、アミノ酸の置換としては、例えば、� ��水性、電荷、pK、立体構造上における特徴� �の類似した性質を有するアミノ酸への置換� �挙げることができる。

 また、(a)のアミノ酸配列と85%以上の同一性� ��有するアミノ酸配列としては、配列番号2又 は6に示すアミノ酸配列において相当する配� �を適切にアライメントした時、当該アミノ� �配列と85%以上、好ましくは90%以上、より好� �しくは95%以上の同一性を有するアミノ酸配� �を意味する。
 尚、配列番号2に示すアミノ酸配列からなる タンパク質と配列番号6に示すアミノ酸配列� �らなるタンパク質とのアミノ酸配列の同一� �は89.0%である。

 「酸素耐性付与」とは、微生物に酸素耐性� ��付与すること、すなわち、微生物が酸素存� ��下でも生育可能ならしめること、及び/又は 生育した微生物を酸素存在下においても死滅 しないことを意味し、酸素の消去能を有する こと、酸素から発生する活性酸素の消去能を 有すること、酸化状態となった細胞内を還元 状態へと変換すること、酸素や活性酸素によ り酸化されたDNA、タンパク質、脂質等を還元 することができることも包含される。
 具体的には、大気中において寒天平板培地� ��で培養した時にコロニー形成を可能ならし� ��ること、液体培地では振とうして溶存酸素� ��飽和に保った状態や、大気中の酸素が自然� ��溶け込んだ状態で生育可能ならしめること� ��言う。

 配列番号2又は6に示すアミノ酸配列から� �るタンパク質と既知のタンパク質との相同� �(同一性)を以下に示す。尚、同一性検索は、 遺伝情報処理ソフトウェアGENETYXを使用し、� �塩基配列によって規定されるタンパク質の� �ミノ酸配列と、公開されている主に乳酸菌� �ゲノムやDNA断片の塩基配列により規定され� �タンパク質のアミノ酸配列との比較を行な� �ことにより、同一性を有する遺伝子を検索� �た。同一性の指標としては、該アミノ酸配� �全体あるいは一部でもより長い領域での同� �性が50%以上を目安に行なった。

 配列番号2に示されるアミノ酸配列からなる タンパク質(FNR)は、そのアミノ酸配列におい� ��、ラクトバチルス・カゼイ ATCC 334株由来� �チオレドキシンレダクターゼとアノテーシ� �ンされている trxB にコードされるタンパク質と99.4%の同一性を� ��し、配列番号6に示されるアミノ酸配列から なるタンパク質(FNR-R)は、同タンパク質と89.3% の同一性を有する。

 本発明の酸素耐性付与遺伝子は、好適には� ��以下の(d)~(f)から選ばれるポリヌクレオチド からなる遺伝子が挙げられる。
 (d)配列番号1又は5に示す塩基配列からなる� �リヌクレオチド
 (e)(d)の塩基配列と相補的な塩基配列からな� ��ポリヌクレオチドとストリンジエントな条� ��下でハイブリダイズし、且つ酸素耐性付与� ��を有するタンパク質をコードするポリヌク� ��オチド
 (f)(d)の塩基配列と75%以上の同一性を有する� ��基配列からなり、且つ酸素耐性付与能を有� ��るタンパク質をコードするポリヌクレオチ� ��

 ここで、配列番号1に示す塩基配列からなる ポリヌクレオチドはラクトバチルス・カゼイ  YIT 9029由来のDNA(ラクトバチルス・カゼイ  fnr 遺伝子)であり、配列番号5に示す塩基配列か� ��なるポリヌクレオチドはラクトバチルス・� ��ムノーサス ATCC 53103由来のDNA(ラクトバチ� �ス・ラムノーサス  fnr 遺伝子( fnr-r 遺伝子))であり、共に当該微生物に酸素耐性� ��付与し、酸素存在下での生育を可能とする� ��

 本発明において、「ストリンジエントな� ��件下」とは、例えばMolecular cloning-a Laborator y manual 2nd edition(Sambrookら、1989)に記載の条� �等が挙げられる。例えば、6XSSC(1XSSCの組成:0. 15M 塩化ナトリウム、0.015M クエン酸ナトリ� �ム、pH7.0)、0.5% SDS、5Xデンハート及び100mg/mL� ��シン精子DNAを含む溶液に当該塩基配列と相� ��的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと� ��もに65℃で8~16時間恒温し、ハイブリダイズ� ��せる条件が挙げられる。

 また、(d)の塩基配列と75%以上の同一性を有� ��る塩基配列としては、配列番号1又は5に示� �塩基配列において相当する配列を適切にア� �イメントした時、当該塩基配列と75%以上、� �ましくは90%以上、より好ましくは95%以上の� �一性を有する塩基配列を意味する。
 尚、配列番号1に示す塩基配列からなるポリ ヌクレオチドと配列番号5に示す塩基配列か� �なるポリヌクレオチドとの塩基配列の同一� �は75.3%である。

 本発明の遺伝子は、配列番号1又は5の塩基� �列を参考にプライマーを作製し、ラクトバ� �ルス・カゼイ YIT 9029又はラクトバチルス・ ラムノーサス ATCC 53103のDNAをテンプレート� �する常法のPCR法で容易に得ることができる� �
 すなわち、例えば、いずれかの遺伝子のN末 端開始コドンを含む配列からなるオリゴヌク レオチドA、及び該遺伝子の終始コドンを含� �配列と相補的な配列からなるオリゴヌクレ� �チドBを化学合成し、これらのオリゴヌクレ� ��チドAとBを1セットにし、ラクトバチルス・� ��ゼイ YIT 9029のDNAをテンプレートとしてPCR� �応を行なうことにより得ることができる。� �た、こうして得られる遺伝子断片を効率よ� �プラスミドベクター等にクローニングを行� �うために、オリゴヌクレオチドプライマー� �5'末端側に制限酵素切断のための配列を付加 して用いることもできる。ここで、プライマ ーとしては、本発明の遺伝子の塩基配列に関 する情報をもとにして化学合成されたヌクレ オチド等が一般的に使用できるが、既に取得 された本発明遺伝子やその断片も良好に利用 できる。当該ヌクレオチドとしては、配列番 号1又は5に対応する部分ヌクレオチド配列で� ��って、10~50個の連続した塩基、好ましくは15 ~35個の連続した塩基等が挙げられる。
 また、PCRの条件は、例えば2000塩基対の長さ のDNA断片を得る場合には、94℃2分、(95℃10秒� ��52℃10秒、72℃2分)x30サイクル、72℃7分が挙� �られる。

 また、その当該塩基配列に従い、DNA合成� ��により人工的に合成して得ることもできる� ��

 本発明の遺伝子は、酸素耐性付与に関与す� ��遺伝子であることから、これを微生物に導� ��する、或いは微生物が有する当該遺伝子を� ��変することにより、当該微生物において、� ��素耐性能を付与又は増強することができる� ��
 本発明の遺伝子の導入は、当該遺伝子を、� ��来有しない微生物に導入することにより行� ��ことができる。遺伝子を導入する方法とし� ��はDNAの取り込み能を利用したコンピテンス� ��、プロトプラストを利用したプロトプラス� ��PEG法及び高電圧パルスを利用したエレクト� ��ポレーション法等を利用すればよく、特に� ��レクトロポレーション法が好ましい。また� ��遺伝子を微生物染色体に組み込む場合には� ��相同組換えを利用した方法、部位特異的に� ��み込む方法を用いることができる。

 本発明の遺伝子の改変には、発現増強が挙� ��られる。
 遺伝子の発現を増強するには、本発明の遺� ��子を運ぶ組換えプラスミドを対象とする微� ��物に導入すること、該遺伝子を染色体の別� ��場所に部位特異的組換えによって組み込む� ��とによって微生物内での該遺伝子のコピー� ��を増加させること、該遺伝子の発現を制御� ��る制御領域を改変したり、制御遺伝子を改� ��することによって発現を増加させる方法等� ��よって行えばよいが、特に該遺伝子のコピ� ��数を増加させる方法が好ましい。具体的に� ��、1個の微生物細胞あたり複数個のコピー数 を持つプラスミドに、対象とする遺伝子をそ の遺伝子の本来のプロモーター配列とリボソ ーム結合部位を含めてクローニングするか、 別の遺伝子から分離した、あるいは化学合成 によって作成したプロモーターとリボソーム 結合部位の下流に該遺伝子のポリペプチドを コードする領域だけをつなげてクローニング した組換えプラスミドを作成し、微生物細胞 内にエレクトロポレーション法などによって 導入することによって、微生物細胞内での該 遺伝子のコピー数を上げることができる。

 また、当該遺伝子を元来有する微生物に対� ��ては、当該遺伝子を発現阻害若しくは発現� ��制することにより、当該微生物の酸素耐性� ��を低下させることも可能である。
 遺伝子の発現を阻害するには、本発明の遺� ��子を破壊、欠損すればよく、この方法とし� ��は、全く別のDNA断片を遺伝子の内部に挿入� ��る挿入失活法や段階的な相同組換えによっ� ��標的遺伝子の一部又は全部を欠失する段階� ��二重交叉法を用いればよく、特に段階的二� ��交叉法が好ましい。
 具体的には、標的遺伝子の一部又は全部を� ��失する場合には、欠失領域をはさむ両側の� ��域を染色体DNAから分離するか、あるいはPCR� ��によって増幅して分離し、例えばpYSSE3のよ� ��な大腸菌では増殖するが対象とする微生物� ��では複製が出来ないプラスミドベクターに� ��れら両DNA断片を本来の向きと同じ向きに並� ��だ状態でクローニングする。次に、得られ� ��組換えプラスミドDNAを、欠失を起こさせよ� ��とする微生物にエレクトロポレーション法� ��を用いて導入し、生じる抗生物質耐性のク� ��ーンから、PCR法等によって目的の欠失領域� ��上流又は下流のクローニングした領域との� ��同領域で組換えを起こしてプラスミドが染� ��体上に挿入したクローンを選択する。こう� ��て得たクローンを、抗生物質を含まない培� ��で継代培養を繰り返すことによって、プラ� ��ミドが再び近接して存在する相同領域間の� ��換えによって染色体から離脱し、菌の増殖� ��伴って消失することによって、抗生物質耐� ��をなくしたクローンを選択する。こうして� ��たクローンからPCR法等によって標的遺伝子� ��域を欠失したクローンを分離することがで� ��る。

 遺伝子の発現を抑制するには、本発明の� ��伝子のmRNAの5’末端領域と相補的な短いRNA� �合成することによる、いわゆるRNA干渉によ� �方法や、該遺伝子の発現を制御する領域又� �制御遺伝子を破壊若しくは欠損等して改変� �る方法を用いることができ、特に該遺伝子� �発現を制御する領域の改変が好ましい。具� �的には、遺伝子の転写を制御するプロモー� �ーの配列を改変することによって、該遺伝� �のmRNAへの転写量を多くしたり、少なくした� ��することができる。

 ここで、遺伝子導入又は改変の対象とな� ��微生物は、特に限定されるものではなく、� ��ラム陽性細菌、グラム陰性細菌、酵母等を� ��いることができるが、グラム陽性細菌を好� ��に利用することができ、特に生体への安全� ��が確認されているラクトバチルス属細菌、� ��フィドバクテリウム属細菌等の利用が好ま� ��い。ラクトバチルス属細菌の中でも、ラク� ��バチルス・カゼイ、ラクトバチルス・パラ� ��ゼイ、ラクトバチルス・ゼアエ、ラクトバ� ��ルス・ラムノーサス等のラクトバチルス・� ��ゼイグループに属する細菌の利用が好まし� ��、特にラクトバチルス・カゼイ、ラクトバ� ��ルス・ラムノーサスを好適に利用すること� ��できる。また、酸素耐性付与遺伝子を元来� ��する微生物としては、ラクトバチルス・カ� ��イ YIT 9018(FERM BP-665)やラクトバチルス・カ ゼイ YIT 9029や、ラクトバチルス・カゼイ AT CC 334、ラクトバチルス・ラムノーサス ATCC  53103が挙げられる。

 ビフィドバクテリウム属細菌は偏性嫌気� ��菌であり、酸素や低pH、高酸度に弱く、製� �時の増殖や保存時の生残性等、取扱いに困� �な点が多い。ビフィドバクテリウム属細菌� �ヒトにとって有用な生理効果を示すことか� �、育種改良により酸素耐性を有する変異株� �取得したり、酸素不透過性容器を使用する� �の工夫をして、飲食品や医薬品への応用が� �んでいるが、培養が困難であったり、保存� �に生菌数が低下するといった様々な問題が� �る。ビフィドバクテリウム属細菌は、本願� �明の酸素耐性付与遺伝子を有さないことが� �らかになっているので、本願発明の遺伝子� �入又は改変の対象となる微生物として好適� �利用することができる。

 斯くして得られる遺伝子導入又は改変さ� ��た微生物は、酸素耐性能が付与又は増強さ� ��ているため、当該微生物が元来有する種々� ��生理効果を効果的に発揮する飲食品や医薬� ��として利用することができる。

 遺伝子導入又は改変された本発明の微生� ��を飲食品や医薬品とする場合、菌体は、生� ��又は加熱菌体(死菌体)のいずれでもよく、� �凍結乾燥したものであってもよく、あるい� �これら微生物を含む培養物、菌体処理物と� �て利用することもできるが、生菌の状態で� �用することが好ましい。

 医薬品として使用する場合は、本発明の� ��生物を固体又は液体の医薬用無毒性担体と� ��合して、慣用の医薬品製剤の形態で投与す� ��ことができる。このような製剤としては、� ��えば、錠剤、顆粒剤、散在、カプセル剤等� ��固形剤、溶液剤、懸濁剤、乳剤等の液剤、� ��結乾燥製剤等が挙げられる。これらの製剤� ��製剤上の常套手段により調製することがで� ��る。上記の医薬用無毒性担体としては、例� ��ば、グルコース、乳糖、ショ糖、澱粉、マ� ��ニトール、デキストリン、脂肪酸グリセリ� ��、ポリエチレングリコール、ヒドロキシエ� ��ルデンプン、エチレングリコール、ポリオ� ��シエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ア� ��ノ酸、ゼラチン、アルブミン、水、生理食� ��水等が挙げられる。また、必要に応じて、� ��定化剤、湿潤剤、乳化剤、結合剤、等張化� ��、賦形剤等の慣用の添加剤を適宜添加する� ��ともできる。

 また、遺伝子導入又は改変された本発明� ��微生物は、上記のような製剤とするだけで� ��く、飲食品に配合して使用することもでき� ��。飲食品に配合する場合は、そのまま、ま� ��は種々の栄養成分と共に含有せしめればよ� ��。この飲食品は、微生物の酸素耐性能が付� ��又は増強されているため、当該微生物が元� ��有する種々の生理作用を効果的に発揮する� ��健用食品又は食品素材として利用できる。� ��体的に本発明の方法により得られた微生物� ��飲食品に配合する場合は、飲食品として使� ��可能な添加剤を適宜使用し、慣用の手段を� ��いて食用に適した形態、すなわち、顆粒状� ��粒状、錠剤、カプセル、ペースト等に成形� ��てもよく、また種々の食品、例えば、ハム� ��ソーセージ等の食肉加工食品、かまぼこ、� ��くわ等の水産加工食品、パン、菓子、バタ� ��、粉乳に添加して使用したり、水、果汁、� ��乳、清涼飲料、茶飲料等の飲料に添加して� ��用してもよい。なお、飲食品には、動物の� ��料も含まれる。

 さらに飲食品としては、本発明の微生物� ��利用した発酵乳、乳酸菌飲料、発酵豆乳、� ��酵果汁、発酵植物液等の発酵飲食品の例が� ��げられる。これら発酵飲食品の製造は常法� ��従えばよい。例えば発酵乳を製造する場合� ��、まず、殺菌した乳培地に本発明の微生物� ��単独又は他の微生物と同時に接種培養し、� ��れを均質化処理して発酵乳ベースを得る。� ��いで、別途調製したシロップ溶液を添加混� ��し、ホモゲナイザー等で均質化し、更にフ� ��ーバーを添加して最終製品に仕上げればよ� ��。このようにして得られる発酵乳は、シロ� ��プ(甘味料)を含有しないプレーンタイプ、� �フトタイプ、フルーツフレーバータイプ、� �形状、液状等のいずれの形態の製品とする� �ともできる。

 本発明の方法により得られた微生物は、� ��い酸素耐性能を有することから、飲食品中� ��の菌の生残性が高いため、保存中の生菌数� ��低下や死滅速度の増加が抑制され、製品規� ��の維持が容易となり、ラクトバチルス属細� ��等の微生物が有する整腸作用等の一般的な� ��理効果を効果的に発揮させることができる� ��また、抗がん作用、ヘリコバクター・ピロ� ��の除菌作用等の特異的な生理効果を元来有� ��るラクトバチルス属細菌やビフィドバクテ� ��ウム属細菌に対して、本発明の方法により� ��素耐性能を付与又は増強することで、該菌� ��を様々な飲食品に利用することが可能にな� ��と共に、該菌株の生残性が改善することで� ��菌株が有する生理効果を増強させることが� ��能となる。

 また、ビフィドバクテリウム属細菌を利� ��した飲食品において、保存時の生残性を高� ��る目的で、ガラスやアルミコーティング紙� ��の酸素不透過性の包剤で構成された容器が� ��に用いられてきたが、本発明の方法により� ��られた酸素耐性能を有するビフィドバクテ� ��ウム属細菌は、高い生残性を有し、厳密な� ��気状態を必要としないため、酸素透過性の� ��い樹脂(ポリスチレン、ポリエチレン、ポリ エチレンテレフタレート等)も容器素材とし� �使用できる。これらの樹脂を用いた容器は� �酸素不透過性の包剤で構成された容器と比� �して、コストが低く、成型の自由度が高い� �いうメリットを有する。

 本発明の遺伝子は、酸素耐性能を有する微� ��物のスクリーニングのために使用すること� ��できる。
 すなわち、本発明の遺伝子の有無及び/又は その発現量を測定することにより、酸素耐性 能を有する微生物をスクリーニングすること ができる。
 ここで、遺伝子の有無及び/又はその発現量 の測定は、本発明の遺伝子や遺伝子由来のmRN Aを検出し得るプローブやプライマーを用い� �、微生物における標的とする遺伝子の有無� �コピー数や発現量をサザーンハイブリダイ� �ーション法やDNAマイクロアレイやRT-PCR法に� �り行うことができる。そして、標的遺伝子� �その発現の有無により、目的の微生物を選� �すればよい。

 (d)~(f)で示されるポリヌクレオチド又はそ の一部(断片)を含む本発明の組換えベクター� ��、大腸菌及び対象とする微生物において該� ��クターの導入を選択できるような遺伝子マ� ��カーを有している任意のベクター(例えば、 pHY400、pSA1、pYSSE3等)を用いてインビトロライ� ��ーション法等の公知の方法により得ること� ��できる。

 また、上記の組換えベクターを含む宿主� ��生物は、公知の方法、すなわち、当該組換� ��ベクターを宿主微生物に導入する場合はエ� ��クトロポレーション法等の方法により、微� ��物染色体に組み込む場合は該微生物と相同� ��DNA領域を持つ組換えベクターをエレクトロ� ��レーション法等により導入した後に相同組� ��えにより染色体に組み込まれたものをPCR法� ��によって確認する等の方法を用いることに� ��り得ることができる。

 また、(d)~(f)で示されるポリヌクレオチド 又はその一部(断片)を含む本発明のDNAアレイ� ��はDNAチップは、フォトリソグラフィー法等� ��公知の方法により作製することができる。� ��のDNAアレイ又はDNAチップを用いることによ� ��、本発明の遺伝子を発現する微生物をスク� ��ーニングすることができる。

 尚、上述した微生物の遺伝子導入又は改変� ��微生物のスクリーニングを効率よく行うた� ��には、本発明のポリヌクレオチド又はその� ��部を含む組換えベクター、本発明のポリヌ� ��レオチドの一部断片からなるPCR及びRT-PCR用� ��ライマー、本発明のポリヌクレオチド又は� ��の一部を増幅することができるPCR及びRT-PCR� ��プライマー、本発明のポリヌクレオチドに� ��異的にハイブリダイズするポリヌクレオチ� ��又はその一部からなるハイブリダイゼーシ� ��ン用の核酸断片を用いることが好ましい。
 ここで、使用されるプライマー等の核酸断� ��としては、本発明の遺伝子の塩基配列に関� ��る情報をもとにして化学合成されたヌクレ� ��チド等が一般的に使用できるが、当該ヌク� ��オチドとしては、配列番号1又は5に示す塩� �配列に対応する部分ヌクレオチド配列であ� �て、10~50個の連続した塩基、好ましくは15~35� ��の連続した塩基が好ましい。
 以下、実施例によって本発明の内容をさら� ��詳細に説明する。