(材料、及び雄性不稔系統の作出工程)
 まず、材料及び雄性不稔系統の作出工程に� ��いて説明する。図1は、本実施例に係る雄性 不稔ネギ属植物の作製方法を模式的に示すフ ローチャート図である。本実施例においては 、図1に示す様に、ロイレイ種ネギ属植物(Alli um roylei)の細胞質を有し、核ゲノムが非ロイ� ��イ種ネギ属植物の核ゲノムで置換された雄� ��不稔ネギ属植物を得るために、工程(1)とし� ��、ロイレイ種とシャロット(A.cepa Aggregatum g roup)との交配を行った。ロイレイ種のCPRO97175� ��を種子親(rRR:2n=16;rはロイレイ種細胞質を、R はロイレイ種ゲノムをそれぞれ表す。以下同 じ)とし、シャロットの86208株(aAA:2n=16;aはシャ ロット細胞質を、Aはシャロットゲノムをそ� �ぞれ表す。以下同じ)を花粉親として交配を� ��った。交配の際にはCPRO97175株(ロイレイ種)� �自家受粉が起こらないように除雄を行い、� �量のシャロット花粉を手作業にてCPRO97175株(� ��イレイ種)に受粉させてF1を得た。これらの� ��配で得られた果実から、成熟した種子を採� ��した。採取された種子の一部を、湿らせた� ��紙を敷いたシャーレ上に置き、25℃、暗黒� �件下で発芽させた。発芽後は25℃、照明下で 緑化させ、ある程度まで成長させた後、順化 させて培養土に移植し、温室内で栽培した。 以後の交配についても、同様の方法を用いた 。

 次に、図1の工程(2)に示すように、ロイレ イ種とシャロットのF1(rAR)の染色体の倍加を� �った。先の工程(1)で得られたF1から茎頂部組 織を切り出し、コルヒチン0.1%を含むLinsmeier-S koog(LS)固形培地上に組織を置床して、暗黒条� ��下で4日間培養した。その後、組織をLSフリ� ��培地上に移し、2ヶ月間培養した後、得られ た再生植物体について根端細胞の染色体を酢 酸カーミンで染色し、顕微鏡下で染色体調査 を行った。予めロイレイ種とシャロットの染 色体の形や大きさを顕微鏡下で調べておき、 これと再生植物体の染色体像を形態的に比較 することで、どの染色体をどれだけもってい るかを決定した。染色体の観察は以下の方法 で行った。まず、5-10mmに伸長した二次根を採 取し、酢酸-エタノール混合液(1:3)内にて冷蔵 庫内で一晩固定した。次に、固定後の根を60� ��の1N塩酸で6分間処理し、解離・加水分解さ� ��た後、塩基性フクシンを用いてフォイルゲ� ��染色を行った。続いて、スライドガラス上� ��45%酢酸を1滴落とし、その中に染色した根端 を入れ、カバーガラスを載せて先の尖った棒 でカバーガラス上から試料を叩き、カバーガ ラスを圧した。この操作により細胞や染色体 を分散させ、染色体を一平面上に配列させた 後、光学顕微鏡下で染色体を観察した。この 観察により、再生植物体の中から、ロイレイ 種染色体とシャロットの染色体をそれぞれ2� �ずつ持つもの、すなわち複2倍体(rAARR:2n=32)を 選抜して次代の交配に用いた。

 更に図1の工程(3)に示すように、先の工程 (2)で得られた複2倍体を種子親とし、シャロ� �ト18-5株(aAA)、及びタマネギ晩抽苔株(cCC)を花 粉親として戻し交配を行って第一代の異質3� �体(BC1)を作出した。下記表22に、交配の結果� ��示す。なお、下記表22において種子形成胚� �率は、種子形成胚珠率=[種子数/(交配小花数� �6)]で示す計算式により求めたものである。

 上記表22からも明らかな様に、複2倍体(rAARR) ×シャロット(aAA)の組み合わせでは、568個の� �花に交配を行い、うち124個の小花が結実し� �種子数は232個であった。この値を基に種子� �成胚珠率[種子数/(交配小花数×6)]を計算する と、6.8%という値を示した。このうち79個の種 を前述の方法にて発芽させたところ、29個が� ��芽し、発芽率は36.7%であった。この29個体を 培養したところ、23個体が正常に成長し、そ� ��生存率は86.2%であった。
 一方、複2倍体(rAARR)とタマネギ晩抽苔株(cCC) との組み合わせでは、79個の小花に交配を行� ��、うち33個の小花が結実し、種子数は75個で あった。種子形成胚珠率はシャロットよりも 高く15.8%の値を示した。種子のうち52個を発� �させたところ、10個が発芽し、発芽率は19.2%� ��あった。この10個体を培養したところ、6個� ��が正常に成長し、その生存率は60%であった� ��タマネギとシャロットは形態的に違いはあ� ��が、種レベルでは同種とされ、そのゲノムA とCとは等価であると指摘されているが、こ� �結果はそれを裏付けるものである。

 続いて、図1に示すように、工程(3)で得ら れた子孫株のうち、複2倍体(rAARR)とシャロッ� ��(aAA)の交配に由来し、染色体数が24である異 質3倍体(rAAR)CM23系統を材料とし、ここにタマ� ��ギ北見交39号(cCC)をかけ合わせ、工程(4)の戻 し交配を行って第二代(BC2)を作出した。交配� ��結果を、下記表23に示す。

 上記表23で示すように、交配で得られた種� �178個のうち、130個が発芽し、発芽率は73.0%で あった。発芽した個体のうち正常に成長した ものは127個体あり、生存率は97.7%と高い値を� ��した。
 正常に成長したBC2世代108個体につき、その� ��色体数を上記の方法で形態学的に調査した� ��結果を下記表24に示す。

 上記表24に示すように、染色体数が16、すな わちロイレイ種由来の染色体が排除され、核 ゲノムがシャロット及びタマネギの核ゲノム で置換されたと考えられるものが68個体あり� ��全体の63%を占めた。次いで、染色体数が17� �すなわちロイレイ種由来の単一染色体を有� �るものが38個体で、割合は35%であった。染色 体数が18-22のものは見られず、染色体数が23� �なわちロイレイ種由来の染色体が1本欠失し� ��個体が1個体、染色体数が24すなわちロイレ� ��種由来の染色体を全て持つ異質3倍体が1個� �で、割合はそれぞれ0.9%と非常に少なかった� ��4倍体(2n=32)は観察されなかった。
 これらの結果は、本発明の提供する、ロイ� ��イ種由来の細胞質を有し、核ゲノムが非ロ� ��レイ種由来の核ゲノムからなるネギ属植物� ��作製方法(工程1-4)を用いれば、BC2世代でロ� �レイ種の染色体を持たないものが7割近くと� ��率よく目的の系統を作製することが可能で� ��ることを示している。

 (アイソザイム分析による核ゲノムの同定)
 実施例2においては、アイソザイム分析によ る核ゲノムの同定を行った。以下に、その詳 細を説明する。染色体数が2n=16を示したBC2系� ��、及び2n=17を示し染色体の形態からロイレ� �種の第1染色体を有すると推定されたBC2系統� ��各1個体を、ネギ属植物第1染色体特異的ア� �ソザイムマーカーLap-l(非特許文献9参照)を用 いて分析し、ロイレイ種、シャロット、ロイ レイ種とシャロットのF1及びBC1におけるアイ� ��ザイムの出現パターンを比較・検討した。L ap-1(ロイシンアミノペプチダーゼ-1)は細胞内� ��は単量体(モノマー)として存在し、種によ� �てその分子量にばらつきがあることから、� �イソザイム分析のマーカーとして広く利用� �れているタンパク質である。またネギ属植� �では、Lap-1をコードする遺伝子が第1染色体� �に存在することが知られており、Lap-1は第1� �色体のマーカーとして利用可能である。各� �物試料から、それぞれ葉身部を0.2g程度切り� ��って乳鉢に入れ、Wendelの抽出液(0.6%リン酸� �素2Na,7%ショ糖,5%PVP-40,0.05%EDTA,0.05%Dithiothreitol,0 .1%L-アスコルビン酸Na,0.1%Diethyldithiocarbamic acid -sodium salt,0.05%ピロ亜硫酸Na,0.1% v/v メルカプ トエタノール;非特許文献10参照)を1mlと石英� �を加え、氷上にて乳棒を用いて磨砕した。� �砕した試料を、15000rpm、4℃で5分間遠心し、� ��清20μlを電気泳動用の試料とした。電気泳� �は5%ポリアクリルアミドゲルを用い、15A(ゲ� �1枚あたり)の定電流で3時間半、冷蔵庫内に� �泳動した。電気泳動の終了後、ゲルを染色� �[0.2Mリン酸緩衝液(pH4.8)中に0.02%L-Leucineβ-Naphth ylamide,0.05%Fast Garnet GBC salt,10mM MgCl ₂ ・6H ₂ O]に移し、37℃、暗黒条件下で30分間、振とう させながら染色した。ゲル上にバンドが出現 した後、1.5%酢酸で染色反応を止め、ゲルを� �道水で5-6回洗浄して酢酸を除去した。ガラ� �板上にGelbond(登録商標)PAG film(タカラバイオ� ��製)を乗せ、その上にゲルを乗せ、10%グリセ ロールをゲルの上に重層し、更にその上から セロファンを乗せてシールした。この状態で 25℃の暗所に置き、全体を乾燥させた。

 アイソザイム分析の結果を模式化したも� ��を、図2に示す。図中レーン1-6は電気泳動で 得られたバンドパターンを模式化したもので あり、レーン1はロイレイ種、レーン2はシャ� ��ット、レーン3はロイレイ種とシャロットの F1、レーン4はBC1の異質3倍体、レーン5は2n=16� �示したBC2、レーン6は2n=17を示したBC2の結果� �それぞれ表している。ロイレイ種第1染色体� ��コードされたLap-1の産物をαで、シャロット 及びタマネギの第1染色体にコードされたLap-1 の産物をβでそれぞれ示しており、これらの� ��果から、2n=17のBC2個体はロイレイの第1染色� ��とシャロット及び/またはタマネギの第1染� �体の両方を持っており、反対に2n=16のBC2個体 はロイレイ種の染色体を持たず、シャロット 及び/またはタマネギの染色体を持っている� �とが明らかとなった。この結果はまた、本� �明の方法を用いることでロイレイ種の染色� �がBC2世代で排除可能であることも示してい� �。

 (SSR多型解析による細胞質の同定)
 実施例3においては、SSR多型解析による細胞 質の同定を行った。以下に、その詳細を説明 する。上記の様なBC2系統において染色体数が 2n=16を示した個体7個体(5,6,14,22,24,30,41株)につ� ��て、葉緑体DNA由来のSSR配列(Short Sequence Repe at:ccSSR11)に着目してDNA多型解析を行い、それ� ��れの細胞質の同定を行った。葉緑体は母系� ��伝することが知られており、その葉緑体中� ��含まれるDNAの多型は細胞質の由来を知るた� ��のマーカーとなる。
 試料からの全DNAの抽出は、van Heusdenらの方� ��(非特許文献11参照)に従った。具体的には、 植物試料から葉身部0.05gを切り取り、これに� ��出液(Lysis buffer 312.5μl,Extraction buffer 312.5μ l,Sarkosyl 125μl,亜硫酸ナトリウム2.85mgを混合� �たもの)750μlを加えて磨砕した後、65℃で1時� ��インキュベートした。次に、磨砕試料をチ� ��ーブに移し、14000rpm、4℃で90秒遠心し、上� �にクロロホルム-イソアミルアルコール(24:1)� ��750μl加えて振とうし、14000rpm、4℃で5分間遠 心した。続いて、上清(水相)400μlを別チュー� ��に移し、等量の冷やしたイソプロパノール� ��加えて混合し、14000rpm、4℃で5分間遠心して ペレットを得た。そして、上清を捨て、ペレ ットに70%エタノールを500μl加えて14000rpm、4℃ で5分間遠心し、上清を捨ててペレットを室� �で乾かし、100μlのTE(Tris-EDTA buffer)を加えて� �濁し葉緑体DNA(cpDNA)試料とした。分光高度計� ��用い試料液中のDNA濃度を測定し、終濃度が2 0ng/μlとなるように調整した。この試料液をPC R用に供した。
 PCRは、Chung&Staubにより開発されたプライ� ��ーセット(非特許文献12)のうちccSSR-11プライ� ��ーを用いて,以下の条件により行った。反応 液組成は、全量25μl;50mM KCl,4mM MgCl ₂ ,0.2mM dNTP,0.4mM Forward Primer,0.4mM Reverse Primer,0 .125 unit Taq Gold,100ng template DNA,15mM Tris-HCl(pH 8.0)に調整した。PCR反応は,予備反応95℃ 11分; 変性94℃ 30秒,アニーリング56℃ 30秒,伸長反� ��72℃ 30秒を40サイクル;後処理72℃ 10分で行� ��た。PCR産物をポリアクリルアミドゲルにア� ��ライして電気泳動を行い、そのバンドパタ� ��ンをロイレイ種、シャロット、タマネギ、2 n=16であるBC2で比較した。

 PCRの結果を、図3に示す。図3はcpDNAのccSSR- 11のPCR増幅パターンを示す図である。図中レ� ��ンmは分子量マーカー(bp)を表し、レーンRは� ��イレイ種を、レーンAはシャロットを、レー ンCはタマネギを表し、以降の5-41はBC2各株の� ��ンプルの結果である。本解析で用いたccSSR-1 1プライマー(非特許文献12)でPCRを行うと、葉� ��体DNAの多型が増幅されるバンドの分子量の� ��いとして表れ、今回用いた試料ではロイレ� ��種が最も大きく、次いでタマネギ(ロイレイ 種よりも1塩基小さい)、最も小さいシャロッ� ��となり、BC2細胞の葉緑体DNAが示す多型と比� ��可能である。レーン5-41が示す通り、全ての BC2個体でロイレイ種と同じ位置に単一のバン ドが出現し、このことから、これらのBC2個体 はロイレイ種に由来する細胞質を有している ことが明らかとなった。

 (BC2世代の花粉稔性の調査)
 実施例4では、BC2世代の花粉稔性の調査を行 った。以下に、その結果について説明する。 BC2世代において、栽培により開花が見られた 個体の花粉稔性を、酢酸カーミンの染色性と 10%(w/v)ショ糖寒天培地上における発芽率の2つ の指標により測定した。酢酸カーミンの染色 性は、最初の小花が開花した直後とその約1� �間後に、1個体につき3小花、合計1500粒以上� �花粉を採取し、酢酸カーミンで染色して形� �学的に観察して、生殖核と栄養核の両方を� �つ花粉を可稔の正常な花粉、生殖核を持た� �い花粉を不稔の花粉とし、それぞれの個体� �ついて全花粉中の可稔の花粉の割合(%)を求� �た。またショ糖寒天培地上における発芽率� �、酢酸カーミン染色による2回目の調査後に� ��い、1個体から3小花、合計300粒以上の花粉� �採取してショ糖寒天培地上に蒔き、25℃、湿 度50%の条件下で2時間培養して、顕微鏡下で� �粉管が伸長していたものを可稔の花粉、伸� �がみられなかったものを不稔の花粉とし、� �れぞれの個体について全花粉中の可稔の花� �の割合(%)を算出した。
 花粉稔性の調査の結果を下記表25に示す。

 上記表25に示すように、カーミン染色によ� �2回の調査から、全個体のうち8割-9割近くの� ��体が、生殖核と栄養核の両方を持ち正常(可 稔)と考えられる花粉を10%も持たず、花粉稔� �が極めて低いことが示された。更に、ショ� �寒天培地上における花粉の発芽率は、カー� �ン染色による結果よりも更に低く、ほとん� �の個体が正常花粉を花粉全体の12%未満しか� �たないことが明らかとなった。カーミン染� �と花粉培養の両調査結果から、2n=16であるBC2 世代の各個体に、強い雄性不稔形質が表れて いることが示された。
 これらの結果から、本発明の提供する、ロ� ��レイ種の細胞質を有し非ロイレイ種の核ゲ� ��ムを有するネギ属植物が、雄性不稔形質を� ��していることが示された。

 実施例4の花粉稔性調査結果について、より 本質的な雄性不稔形質、すなわち花粉稔性が 0または1%未満という個体の頻度に着目して改 めて集計した。結果を下記表26に示す。表26� �表25と基本的に同じ調査結果を元にしており 、個体あたりの可稔花粉の割合(%)を表25より� ��細かく分け、可稔花粉が0のもの、及び1%未� ��のものを示している。
 カーミン染色1回目の調査では、可稔花粉が 0のものが全体の20%にあたる12個体観察され、 また1%未満のものも16個体(26.7%)観察された。2 回目の調査でも可稔花粉が0、1%未満の個体が それぞれ全体の18.5%、14.8%を占めていた。更� �、花粉の発芽率に着目した調査では、全体� �実に75%が可稔花粉をまったく持たない不稔� �個体であり、本発明の提供するロイレイ種� �細胞質を有し非ロイレイ種の核ゲノムを有� �る2倍体のネギ属植物に、強い雄性不稔の形� ��が付与されていることが改めて示された。

 (葉緑体SSRの塩基配列を用いた他種ネギ属植 物との比較)
 実施例3で解析した葉緑体DNA上のくり返し配 列(Consensus Chloroplast Simple sequence repeat:ccSSR)� ��ついて、より詳細な多型解析を行い、本発� ��において作出した核置換系統が確かにロイ� ��イ種の細胞質を有しているかどうかを検証� ��た。
 多型解析用のプライマーとしては、先行研� ��(非特許文献13)において本発明者らが明らか にした結果より、Chung&Staubにより開発され たccSSRのプライマー(非特許文献12)のうち、ccS SR-11プライマー及びccSSR-17プライマーの2組の� ��ライマーを用いた。試料としては栽培種、� ��生種を含む複数種のネギ属植物-A.cepa種に属 する4つの栽培種、すなわちネギ’九条細’� �統、タマネギ’北見交39号’系統、シャロッ ト’86208’系統、ワケギ’寒知らず(晩成)’� �統、及び4種の野生種であるA.galanthum’97205-22 ’系統、A.roylei’95001-1’系統、A.vavilovii’9720 3-8’系統、A.altaicum’97010-25’系統の4系統、� �ラA.tuberosum’広幅にら’系統とラッキョウA.c hinense(系統不詳)の10種類に加え、本発明の核� ��換系統であるCM23-RB6、CM23-RB15、CM23-RB25、CM23- RB30、CM23-RB36、CM23-RB39、CM23-RB41の7系統の合計1 7系統を試料として供した。

 各試料から微量サンプル抽出法(実施例3� �方法に従う)により全DNAを抽出した。この全D NAを鋳型とし、上記2組のプライマーについて 、Forwardプライマーの5’末端を6-FAM、HEX、NED� �うち1種類で蛍光標識し、これらの蛍光プラ� ��マーを1反応につき1組用いてPCRを行い、各� �料のDNAからccSSR領域を増幅させた。PCR産物は ABI Prism310 genetic analyzer(Applied Biosystems社製)� ��よりキャピラリー電気泳動を行い、GeneScan  Analysis Software(Applied Biosystems社製)によりフラ グメントサイズを決定した。

 下記表27に、フラグメント解析の結果を示� �。表中の種名・品種名はそれぞれ上記野生� �、栽培種、核置換の各系統を示し、産物の� �子量は葉緑体DNAからccSSR-11プライマー、ccSSR- 17プライマーで増幅した産物の分子量(bp)の測 定結果を示す。
 ccSSR-11プライマーにより、102-120bpのPCR産物� �増幅され、本発明の核置換系統では111.6-111.7 bpの産物が増幅された。これを他種と比較す� ��と、野生種ではA.royleiの111.6bpと一致し、一� ��で従来技術において核置換による雄性不稔� ��報告されているA.galanthumの102.7bpとは異なっ� ��おり、本発明の核置換により作出された雄� ��不稔系統が従来知られた系統とは異なる系� ��であることが示された。更に交配に用いた� ��ャロット(106.1bp)及びタマネギ(110.7bp)とも異� ��っており、本発明の雄性不稔系統がA.roylei� �細胞質を有していることが示された。

 一方、ccSSR-17プライマーにより、194-202bpのPC R産物が増幅され、本発明の核置換系統では19 4.4-194.8bpの産物が増幅された。これはA.roylei� �194.7bpと一致し、一方ccSSR-11プライマーではPC R産物の分子量が比較的近かったタマネギに� �ける199.6bpとは大きく異なっていた。ここで� ��北見交39号系統が細胞質-核遺伝子支配によ� ��雄性不稔系統(自然突然変異から従来技術に より作製された雄性不稔系統)を母方とするF1 品種であり、雄性不稔の細胞質(s細胞質)を有 することから、本発明で作製された雄性不稔 系統が、従来用いられてきたタマネギの雄性 不稔系統とは異なる雄性不稔系統であること が改めて示された。
 なお本実施例におけるPCR産物の分子量は、� ��析ソフトを用いた計算値であるため、小数� ��以下の数字を含む値で示されている。

 以上の結果を、図4及び図5に可視化して表� �。図4はccSSR-11プライマーを用いたPCRの結果� �、その産物の分子量からグラフ上に模式化� �たものであり、レーン1-4は野生種(1:A.roylei,2: A.galanthum,3:A.altaicum,4:A.vavilovii)を、レーン5-10� �栽培種(5:シャロット、6:タマネギ、7:ラッキ� ��ウ、8:ニラ、9:ネギ、10:ワケギ)を、レーン11 -17は本発明の核置換系統(CM23-RB系統、番号は� ��番号)をそれぞれ表し、またグラフ縦軸は分 子量(bp)を表している。図中矢印で示した様� �、核置換系統のPCR産物はA.royleiのものとほぼ 一致し、他の野生種や栽培種とは異なってい た。
 図5はccSSR-17プライマーを用いたPCRの結果を� ��その産物の分子量からグラフ上に模式化し� ��ものであり、レーン1-4は野生種(1:A.roylei,2:A. galanthum,3:A.altaicum,4:A.vavilovii)を、レーン5-10は� ��培種(5:シャロット、6:タマネギ、7:ラッキョ ウ、8:ニラ、9:ネギ、10:ワケギ)を、レーン11-1 7は本発明の核置換系統(CM23-RB系統、番号は株 番号)をそれぞれ表し、またグラフ縦軸は分� �量(bp)を表している。図中矢印で示した様に� ��核置換系統のPCR産物はA.royleiのものとほぼ� �致し、加えて図中囲みで示したタマネギ(雄� ��不稔のs細胞質を持つ)とは異なるサイズで� �った。
 これらの結果は、本発明で作製した核置換� ��よる雄性不稔系統が、ロイレイ種(A.roylei)の 細胞質を有している事を示している。