以下、本発明について、詳しく説明する。� ��お、以下において、単位「M」は「mol/L」、� ��nM」は「nmol/L」をそれぞれ表わす。
(第一の実施形態)
 本発明のエピトープ解析方法の第一の実施� ��態は、蛍光標識された抗原を含む溶液中の� ��光シグナル(A1)を測定する工程と、前記抗原 を含む溶液と、前記抗原と特異的に結合する 抗体を混合して、混合溶液(X1)を得る工程と� �前記混合溶液(X1)中の蛍光シグナル(B1)を測定 する工程と、前記混合溶液(X1)と、前記抗原� �由来する物質を混合して混合溶液(X2)を得る� ��程と、前記混合溶液(X2)中の蛍光シグナル(C1 )を測定する工程と、前記蛍光シグナル(A1)、( B1)および(C1)を比較する工程と、を含む。

 本発明では、蛍光標識分子が他の分子と� ��互作用して複合体を形成したり、複合体か� ��離脱したりした時の、分子の大きさの変化� ��、蛍光シグナルの変化として検出する。し� ��がって、本発明における蛍光シグナルの測� ��方法としては、蛍光標識分子の大きさの違� ��を検出できるものであれば特に限定されな� ��。なかでも好ましいものとして、蛍光自己� ��関関数解析法(FCS)による蛍光標識分子の並� �拡散時間の測定、蛍光偏光強度分布解析法(F IDA-polarization)による蛍光標識分子の回転拡散� ��間の測定、並びに蛍光強度分布解析法(FIDA)� ��よる共焦点領域に存在する蛍光標識分子の� ��の測定および蛍光標識分子一分子あたりの� ��光強度の測定が例示できる。

 蛍光標識分子の並進拡散時間は、蛍光標識� ��子の大きさに依存するので、蛍光自己相関� ��数解析法で並進拡散時間を測定して比較す� ��ば、蛍光標識分子の大きさの違いを検出で� ��る。
 また、蛍光標識分子の回転拡散時間を測定� ��ることで、蛍光標識分子の回転拡散状態を� ��光偏光度Pとして 1分子レベルで知ることが 可能である。そして、蛍光偏光度Pは分子の� �きさを反映しているので、蛍光偏光強度分� �解析法で蛍光標識分子の回転拡散時間を測� �して比較すれば、蛍光標識分子の大きさの� �いを検出できる。
 また、蛍光標識分子中の蛍光色素は、例え� ��、溶媒の極性が変化すると蛍光強度が変化� ��ることが知られている。そして、蛍光標識� ��子が単独で存在している場合と、他の分子� ��相互作用して複合体を形成したりしている� ��合とでは、蛍光色素の溶媒分子による包囲� ��態が変化するので、その違いを蛍光強度の� ��いとして検出できる。すなわち、蛍光強度� ��布解析法で蛍光標識分子の数の測定および� ��光標識分子一分子あたりの蛍光強度の測定� ��行い比較すれば、蛍光標識分子の大きさの� ��いを検出できる。

 本発明においては、蛍光シグナルの測定方� ��として上記記載のFCS、FIDA-polarization、FIDA等� ��いずれか一つの方法を単独で用いても良い� ��、複数の方法を組み合わせて用いても良い� ��
 また、蛍光シグナルの測定は、対応する分� ��機器を用いて従来公知の方法で行えば良く� ��例えば、上記の蛍光自己相関関数解析、蛍� ��偏光強度分布解析、蛍光強度分布解析法な� ��では、1分子蛍光分析システムMF20(商品名;オ リンパス株式会社製)を用いることができる� �

 蛍光シグナルの測定は、20~27℃で行うこ� �が好ましい。そして、蛍光シグナルA1、B1お� ��びC1は、すべて同じ温度で測定することが� �ましい。

 図1を参照しながら、本実施形態について さらに詳しく説明する。図1は、蛍光自己相� �関数解析(FCS)による並進拡散時間の測定を行 う場合の本発明の第一の実施形態を例示する フローチャートである。

 本発明で用いる抗原は特に限定されるもの� ��はなく、特定の物質と特異的に結合する所� ��抗原抗体反応を示すものであればいずれで� ��良い。具体的には、タンパク質、ペプチド� ��多糖、オリゴ糖、核酸、脂質、糖たんぱく� ��などが例示できるが、天然由来のものに限� ��れず、人工合成品でも良い。これらのなか� ��も、タンパク質またはペプチドが好適であ� ��。
 なお、本発明においては、ポリペプチドで� ��成される高分子のうち、分子量が1万以上の ものをタンパク質、1万未満のものをペプチ� �と呼ぶことにする。

 前記抗原のうち天然由来のものとしては� ��例えば、生体組織や生体成分、あるいはこ� ��らを適宜加工等して得られた生体由来試料� ��どから、抽出、分離精製等したものを用い� ��も良いし、例えば、タンパク質やペプチド� ��あれば、分子生物学的な手法により大腸菌� ��どで発現および精製したものを用いてもよ� ��。

 蛍光標識された抗原(以下、蛍光標識抗原 と略記する)とは、蛍光色素が結合している� �原のことを指す。そして前記蛍光標識抗原� �、従来公知の方法で調製すれば良く、抗原� �タンパク質やペプチドである場合には、例� �ば、これらタンパク質やペプチド中のリジ� �残基やシステイン残基等の構成アミノ酸残� �の側鎖に、化学結合を介して蛍光色素を導� �しても良いし、分子生物学的手法を用いて� �ンパク質やペプチドに蛍光色素を結合させ� �も良い。ここで分子生物学的手法としては� �例えば、4塩基コドンに対応する非天然アミ� ��酸に蛍光標識アミノ酸を対応させることに� ��て、蛍光標識するタンパク質の遺伝子配列� ��この4塩基の変異を導入し、無細胞タンパク 質発現系などを用い、タンパク質の発現時に 蛍光標識を行うという手法が挙げられる。あ るいは、終始コドンに蛍光標識された非天然 アミノ酸を対応させて、目的のタンパク質の 目的のアミノ酸配列部分に蛍光標識を行う手 法も挙げられる。一方、ここに挙げた方法以 外にも、市販のラベリングキット用をいて抗 原を蛍光標識する方法も簡便で好適である。

 前記蛍光色素としては従来公知の如何なる� ��のも用いることができ、具体的には、フル� ��レセイン、ローダミン(ローダミングリーン 、TAMRA等)、アクリフラビン、アレクサ(アレ� �サ647等)、ATTO633等が例示できる。
 また、抗原中の蛍光色素の数は特に限定さ� ��ない。

 蛍光シグナルの検出に際して、蛍光色素� ��励起する光源としては従来公知のものを用� ��れば良い。例えば、蛍光色素の吸収波長に� ��応した波長のレーザーを用いても良いし、� ��色光源からの光を、ガルバノミラーなどを� ��いて分光特性を持つフィルターを通すこと� ��得られる、所望の波長の光を用いても良い� ��

 本発明において測定する蛍光シグナルは、� ��記蛍光標識抗原に由来するものである。蛍� ��標識抗原やその他の試料は溶液中に存在し� ��いるため、自由にブラウン運動している。
 蛍光標識抗原はブラウン運動によって観測� ��域を出入りしており、ある時間内での測定� ��光シグナルについて、例えば、自己相関関� ��解析を行うことによって蛍光標識抗原の並� ��拡散に関する情報を得ることができる。こ� ��は蛍光標識抗原の分子の大きさにも依存す� ��ため、蛍光標識抗原がほかの分子と相互作� ��し、分子の大きさに変化が起こった場合に� ��並進拡散が変化する。これを利用して蛍光� ��識抗原と抗体との相互作用を検出する。ま� ��蛍光シグナルに関して蛍光強度分布解析を� ��うことによって、計測領域に存在している� ��光標識抗原の蛍光強度や分子数を検出する� ��蛍光シグナルの測定値は、測定領域内に存� ��する蛍光標識抗原に由来する蛍光シグナル� ��平均値となる。しかし、蛍光標識抗原の濃� ��はnMの範囲(1´10 ^-6 の範囲)なので、観測領域に存在する蛍光標� �抗原の分子数は1~数個である。
 したがって、1分子あたりの情報として得る ことが可能でまた並進拡散の振る舞いの異な る(例えば、大きさの異なる)分子が混在して� ��れば、それぞれの並進拡散の分子の割合の� ��報を得ることができる。また蛍光強度分布� ��析では明るさが異なる蛍光標識抗原のそれ� ��れの分子の数を算出することができる。

 本発明で用いる抗体は、前記蛍光標識抗原� ��特異的に結合する所謂抗原抗体反応を示す� ��のであればいずれでも良く、測定対象の抗� ��の種類に応じて適宜選択すれば良い。
 抗体は、前記抗原同様に天然由来のもの、� ��工合成品のいずれでも良く、前記抗原同様� ��方法で得られる。本発明では蛍光シグナル� ��検出感度が高いので、例えば、血液から分� ��した血清など、抗体濃度が低い試料も好適� ��用いることができる。

 本発明で用いる抗原に由来する物質(以下、 抗原由来物質と略記する)とは、前記蛍光標� �抗原のうち蛍光色素を除いた部位の一部を� �するものである。
 このような抗原に由来する物質を調製する� ��法は、抗原の種類に応じて適宜選択すれば� ��く、特に限定されない。例えば、抗原を酵� ��分解する方法(以下、方法aと略記する)、抗� ��がタンパク質またはペプチドである場合に� ��、抗原中のアミノ酸配列の一部を有するペ� ��チドを合成する方法(以下、方法bと略記す� �)、抗原のアミノ酸配列の一部を改変する方� ��(以下、方法cと略記する)等が例示できる。

 方法aでは、抗原がタンパク質またはペプチ ドである場合、通常、酵素分解物としてペプ チドが得られる。そして、抗原のエピトープ が特定できていない場合でも、抗原に由来す る複数種類のペプチドを簡便に得られ、これ らを混合溶液(X2)の調製に供することができ� �。この時用いる酵素としては、タンパク質� �分解できるものであればいずれでも良く、� �来公知のプロテアーゼを用いることができ� �抗原の種類に応じて適宜選択することがで� �る。また、プロテアーゼはその種類によっ� �タンパク質中の切断部位が異なるので、エ� �トープに関する情報がある場合には、抗原� �エピトープを切断しないように用いるプロ� �アーゼを選択することが好ましい。
 抗原の酵素分解物は、分離精製してから用� ��ることが好ましい。前記酵素分解物は、通� ��、互いに異なるサイズとなるので、例えば� ��HPLC等により、サイズごとに分離精製するこ とができる。ただし、分離精製手段はHPLCに� �定されるものではない。

 方法bは、エピトープに関する情報がある場 合に好適である。合成すべきペプチドが明確 にできるからである。方法bでは、抗原のア� �ノ酸配列の情報に基づいてペプチドを合成� �る。合成するペプチドは、抗原の種類にも� �るが、合成の容易さおよび取り扱いの容易� �等の観点から、アミノ酸残基数が5~20である� ��のが好ましく、10~15であるものがより好ま� �く、13程度が特に好ましい。そして、後記す るように複数種類のペプチドを抗原由来物質 として解析に供する場合には、これら複数種 類のペプチドは、すべてアミノ酸残基数が同 じであり、かつ、抗原のアミノ酸配列上、N� �端側からC末端側に向けて数残基ずつ、好ま� ��くは2~3残基ずつ配列をずらしたものである� ��とが好ましい。
 また、抗原のすべてのアミノ酸配列が反映� ��れるようにこれら複数種類のペプチドを調� ��しても良いが、エピトープと推測される領� ��およびその近傍領域のアミノ酸配列が反映� ��れるようにこれら複数種類のペプチドを調� ��すれば、解析を効率的に行うことができる� ��

 方法bで用いるペプチドの合成手段は、液 層合成、固相合成等の化学合成が好適である が、分子生物学的な手法により大腸菌などで 発現および精製しても良い。

 方法cは、エピトープが特定の立体構造に 基づくものである場合に好適である。抗原の アミノ酸配列の一部を改変することで、抗原 の立体構造を変えることができるからである 。方法cとしては、大腸菌などを用いてアミ� �酸の変異を導入したタンパク質を発現させ� �、従来公知の分子生物学的な手法を適用す� �ば良い。そしてこのような手法により、ア� �ノ酸配列の一部を改変した複数種類の抗原� �調製して用いることが好ましい。

 本実施形態では、まず蛍光標識抗原を含� ��溶液中の蛍光シグナル、すなわち前記蛍光� ��識抗原の並進拡散時間A1を測定する。この� �の蛍光標識抗原の濃度は、蛍光シグナルの� �定ができる限り特に限定されず、蛍光シグ� �ルの測定方法により適宜選択すれば良いが� �通常は数nM程度で十分である。

 次いでこの溶液と、前記蛍光標識抗原と� ��異的に結合する抗体を混合して混合溶液(X1) を調製する。この時前記抗体は、溶液として 混合することが好ましい。混合溶液(X1)調製� �の温度条件は特に限定されないが、例えば� �37℃で30分、24℃で30分、4℃で一晩などが好� �しい。また、抗体は蛍光標識抗原に対して� �剰モル量混合することが好ましく、蛍光標� �抗原に対して10~20倍のモル量を混合すること がより好ましい。混合溶液(X1)中では、前記� �光標識抗原は前記抗体と複合体を形成し得� �が、すべての蛍光標識抗原を複合体とする� �とが好ましいからである。

 抗体溶液の濃度は、抗体と蛍光標識抗原� ��の反応効率が50%程度となる濃度が好ましい� ��これについては、後に詳細に説明する。こ� ��ような濃度を求めるためには、例えば、濃� ��の異なる複数の抗体溶液を調製し、等量の� ��れら溶液をそれぞれ、並進拡散時間B1の測� �に供する蛍光標識抗原を含む溶液に添加し� �、得られた溶液の並進拡散時間を算出する� �そして、抗体と蛍光標識抗原との反応が飽� �した状態での並進拡散時間と、並進拡散時� �A1のほぼ中間となる並進拡散時間を与える濃 度の抗体溶液を選択すれば良い。抗体と蛍光 標識抗原との反応が飽和した状態での並進拡 散時間は、抗体濃度が大きくなってもほぼ変 化しなくなった時の並進拡散時間である。

 次いで、混合溶液(X1)中の蛍光シグナル、 すなわち前記複合体の並進拡散時間B1を測定� ��る。この時、並進拡散時間A1およびB1を比較 すると、前記複合体は前記蛍光標識抗原より 分子サイズが大きいので、A1<B1となる。

 次いで、前記混合溶液(X1)と、前記抗原由 来物質を混合して混合溶液(X2)を調製する。� �の時該抗原由来物質は、溶液として混合す� �ことが好ましい。混合溶液(X2)調製時の温度� ��件は、混合溶液(X1)調製時の温度条件と同様 である。また、抗原由来物質を複数種類用意 して、これらをその種類ごとに混合溶液(X1)� �混合するようにしておけば、解析効率を向� �させることができる。

 混合溶液(X2)中においては、前記抗原由来 物質中に前記抗原のエピトープが存在すれば 、前記蛍光標識抗原に代わって前記抗原由来 物質が前記抗体と特異的に結合して新たな複 合体を形成(交換反応)し得る。一方、前記抗� ��由来物質中に前記抗原のエピトープが存在� ��なければ、このような新たな複合体は形成� ��れず、混合溶液(X2)中には、蛍光標識抗原お よび抗体の複合体並びに抗原由来物質がその まま共存する。

 次いで、前記混合溶液(X2)中の蛍光シグナ ル、すなわち並進拡散時間(C1)を測定し、A1、 B1およびC1を比較する。上記のように前記抗� �由来物質中に前記抗原のエピトープが存在� �れば、少なくとも一部の蛍光標識抗原は抗� �から分離するので、C1は、A1≦C1<B1の関係� �満たす。一方、抗原由来物質中に前記抗原� �エピトープが存在しなければ、蛍光標識抗� �は抗体と複合体を形成したままであるので� �C1はB1とほぼ同じ、すなわちC1=B1の関係を満� �す。

 本実施形態においては、抗原由来物質は蛍� ��標識抗原に対して過剰モル量を混合するこ� ��が好ましく、本発明の効果を損なわない限� ��、混合する抗原由来物質の量に特に上限は� ��い。そして、抗原由来物質は抗体に対して� ��過剰モル量を用いることが好ましい。例え� ��、抗体を蛍光標識抗原に対して10~20倍のモ� �量を混合した場合には、抗原由来物質は蛍� �標識抗原に対して10~100倍のモル量を混合す� �ことが好ましい。
 これは、蛍光標識抗原に代わって抗原由来� ��質が抗体と特異的結合を形成する際に、こ� ��ような結合の形成は、抗原由来物質の量が� ��光標識抗原の量よりも多いほど進行し易い� ��らである。なお、抗原由来物質中に抗原の� ��ピトープが存在する場合、抗原由来物質の� ��合量にもよるが、混合溶液(X2)中において通 常蛍光標識抗原は、抗体と複合体を形成して いるものと抗体から分離しているものとが共 存していることが多い。したがって、この場 合のC1は、測定領域内のこれら蛍光標識抗原� ��由来する個々のC1の値の平均値となり、抗� �由来物質と抗体との新たな複合体の形成が� �行するほど、C1はA1に近くなる。

 本実施形態においては、複数種類の抗原� ��来物質を解析に供する場合には、抗原由来� ��質の種類ごとに、すべての工程を行う。

 図2は、本実施形態の一例をさらに具体的に 説明した図である。ここでは、蛍光標識抗原 1、抗体2に対して、抗原由来物質として第一� ��ペプチド3、第二のペプチド4および第三の� �プチド5を用いて、並進拡散時間A1、B1および C1を測定する場合について示している。ここ� ��、第一のペプチド3、第二のペプチド4およ� �第三のペプチド5は、それぞれ互いにアミノ� ��配列の異なるものである。
 図示のように、第一のペプチド3を用いた場 合の並進拡散時間C1が、A1<C1<B1の関係を� �たし、第二のペプチド4および第三のペプチ� ��5を用いた場合の並進拡散時間C1が、C1=B1の� �係を満たす場合には、第一のペプチド3中に� ��光標識抗原1のエピトープが存在し、第二の ペプチド4および第三のペプチド5中にはエピ� ��ープが存在しないことになる。

 このように、測定した蛍光シグナル、すな� ��ちA1、B1およびC1を比較することにより、い� ��れの抗原由来物質中に抗原のエピトープが� ��在するか、簡便且つ高精度に判定できる。
 また、エピトープ解析に用いたそれぞれの� ��原由来物質の濃度を算出しておけば、これ� ��を比較することで、エピトープが存在する� ��原由来物質に対する抗体のアフィニティを� ��ることができる。

 なお、本実施形態においては、解析が正� ��に行われれば、蛍光シグナルの比較結果は� ��C1=B1およびA1≦C1<B1のいずれかとなる。し� ��がって、これら以外の結果を与えた時は、� ��析が正常に行われていないので、再測定が� ��要である。

 第一の実施形態としてここでは、並進拡� ��時間の測定を行う場合について説明したが� ��その他の蛍光シグナルを測定する場合も同� ��に行うことができる。

 蛍光標識抗原を含む溶液との混合に用いる� ��体溶液の濃度は、先に述べた通り、抗体と� ��光標識抗原との反応効率が50%程度となる濃� ��が好ましい。これについて、詳しく説明す� ��。
 まず、蛍光標識抗原A(以下、Aと略記する)と 抗体B(以下、Bと略記する)とが特異的に結合� �て複合体AB(以下、ABと略記する)を形成する� �合を考える。この時の反応は、「A+B→AB」と 表記できる。この場合のKdは、
 Kd=[A][B]/[AB]・・・・(1)
 で表される。ここで、[A]、[B]および[AB]は、 それぞれA、BおよびABの時間tにおける濃度を� ��わす。そして、[A]および[B]はそれぞれ
 [A]=[A] ₀ -[AB]・・・・(2)
 [B]=[B] ₀ -[AB]・・・・(3)
 と表される。ここで、[A] ₀ および[B] ₀ は、それぞれAおよびBの時間0における濃度(� �期濃度)を表わす。これらを式(1)に代入する� ��、
 Kd=([A] ₀ -[AB])([B] ₀ -[AB])/[AB]・・・・(4)となる。
 一方、複合体の割合を結合割合Yとすると、
 Y=[AB]/([A]+[AB])=[AB]/[A] ₀
 と表わすことができる。これを変形すると
 [AB]=[A] ₀ Y
 となるので、これを式(4)に代入すると、
 Kd=(1-Y)([B] ₀ -[A] ₀ Y)/Y
 となる。これを変形すると、
 [A] ₀ Y ² -(Kd+[A] ₀ +[B] ₀ )Y+[B] ₀ =0
 となる。これよりYを求めると、
 Y={Kd+[A] ₀ +[B] ₀ -〔(Kd+[A] ₀ +[B] ₀ ) ² -4[A] ₀ [B] ₀ 〕 ^1/2 }/2[A] ₀ ・・・・(5)
 となる。
 例えば、FCSにおいては、[A] ₀ およびKdはそれぞれ、[A] ₀ =1×10 ^-9 M、Kd=1×10 ^-6 M程度であることが一般的である。そこでこ� �らの値を式(5)に代入し、結合割合Y(=[AB]/[A] ₀ )を縦軸に、[B] ₀ を横軸にそれぞれとってグラフをプロットす ると図9に示すようになる。図9から、結合割� ��が0.5すなわち50%になる時の[B] ₀ は、ほぼKd値と同じになることが判り、[B] ₀ がこれよりも大きければ、結合割合も当然高 くなる。

 次に、Bに対して同じように親和性を有する 、すなわちAに対する競合物質である抗原C(以 下、Cと略記する)を添加する場合について考� ��る。この時の反応は、「A+B+C→AB+CB」と表記 できる。この場合、Kdおよび結合割合Yは、
 Kd={([A]+[C])[B]}/([AB]+[CB])・・・・(6)
 Y=([AB]+[CB])/([A] ₀ +[C] ₀ )・・・・(7)
 となる。ここで、[C]および[CB]は、それぞれ CおよびCBの時間tにおける濃度を表わし、[C] ₀ はCの時間0における濃度(初期濃度)を表わす� �この時、[A] ₀ 、[B] ₀ および [C] ₀ は、以下のように表される。
 [A] ₀ =[A]+[AB]・・・・(8)
 [B] ₀ =[B]+[AB]+[CB]・・・・(9)
 [C] ₀ =[C]+[CB]・・・・(10)
 ここで、
 [A] ₀ +[C] ₀ =[Z] ₀ ・・・・(11)
 [AB]+[CB]=[ZB]・・・・(12)
 とすると、式(8)~(12)を用いて式(6)を変形す� �と、
 Kd=([Z] ₀ -[ZB])([B] ₀ -[ZB])/[ZB]となり、これは、
 [ZB] ² -([B] ₀ +[Z] ₀ +Kd)[ZB]+[Z] ₀ [B] ₀ =0・・・・(13)
 と変形されるので、式(13)は[ZB]の二次方程� �と見ることができる。
 ここで、Kd=1×10 ^-6 であって、図9から得られた知見を参考に、� �えば、[B] ₀ =1×10 ^-4 、1×10 ^-5 、1×10 ^-6 の場合について、式(13)を解くことを考える� �この時、[A] ₀ =1×10 ^-9 であるので、式(11)より、[Z] ₀ は[C] ₀ の関数であり、[ZB]は[C] ₀ の関数となる。一方、式(7)に式(11)および(12)� ��代入すると、結合割合Yは、
 Y=[ZB]/[Z] ₀ となる。すなわち、結合割合は[C] ₀ の関数として表される。この式を用いて、[B] ₀ が上記の場合について、結合割合Yを縦軸に� �[C] ₀ を横軸にそれぞれとってグラフをプロットす ると図10に示すようになる。

 [C] ₀ を増やすことで、結合割合Yは小さくなるが� �この時、蛍光標識抗原Aが抗体Bとの複合体と してではなく単独で存在する確率も高くなる 。一方、図10からは、[B] ₀ を1×10 ^-6 Mよりも小さくすれば、さらに小さい[C] ₀ で結合割合Yを小さくできると考えられるが� �[B] ₀ があまり小さ過ぎると、AとBとの結合の変化� ��蛍光シグナルで捉えることが困難となる。� ��方、[B] ₀ =1×10 ^-4 Mの場合は、AとBとの結合の変化を蛍光シグナ ルで捉えることが最も容易となるが、この場 合、[B] ₀ =1×10 ^-6 Mの場合よりも[C] ₀ を2桁も高い濃度にしなければならず、解析� �率が低くなってしまう。
 以上より、蛍光シグナルの測定の容易さお� ��び解析効率を考慮すると、[B] ₀ =1×10 ^-6 M程度の場合、すなわち結合割合Yが0.5程度の� ��合にCを添加することが好ましいことが判る 。
 したがって、本発明においては、抗体と蛍� ��標識抗原との反応効率が50%程度となる濃度� ��好ましいのである。

(第二の実施形態)
 本発明のエピトープ解析方法の第二の実施� ��態は、蛍光標識された抗原を含む溶液中の� ��光シグナル(A1)を測定する工程と、前記抗原 を含む溶液と、前記抗原と特異的に結合する 抗体を混合して、混合溶液(X1)を得る工程と� �前記混合溶液(X1)中の蛍光シグナル(B1)を測定 する工程と、前記抗体と、前記抗原に由来す る物質を混合して混合溶液(Y1)を得る工程と� �前記混合溶液(Y1)と蛍光標識された抗原を混� ��して、混合溶液(Y2)を得る工程と、前記混合 溶液(Y2)中の蛍光シグナル(C2)を測定する工程� ��、前記蛍光シグナル(A1)、(B1)および(C2)を比� ��する工程と、を含む。

 図3を参照しながら、本実施形態について さらに詳しく説明する。図3は、蛍光自己相� �関数解析(FCS)による並進拡散時間の測定を行 う場合の本発明の第二の実施形態を例示する フローチャートである。

 本実施形態においては、蛍光シグナル(A1) を測定する工程から蛍光シグナル(B1)を測定� �る工程までは、前記第一の実施形態と同様� �行えば良い。例えば、蛍光標識抗原を含む� �液と抗体を混合する場合には、抗体は溶液� �して混合することが好ましいのも同様であ� �。ただしこの場合、抗体溶液の濃度は、第� �の実施形態のように、抗体と蛍光標識抗原� �の反応効率が50%程度となる濃度でなくても� �い。並進拡散時間A1およびB1を比較すると、� ��一の実施形態同様、A1<B1となる。

 そして、抗体と抗原由来物質を混合して混� ��溶液(Y1)を調製する。この時抗体および抗原 由来物質は、溶液として混合することが好ま しい。混合溶液(Y1)調製時の温度条件は、混� �溶液(X1)調製時の温度条件と同様である。ま� ��、抗原由来物質は抗体に対して等モル量混� ��すれば良く、必ずしも過剰モル量混合する� ��要はない。これは、本実施形態においては� ��第一の実施形態とは異なり、抗原由来物質� ��蛍光標識抗原に代わって抗体と結合すると� ��う、所謂交換反応を伴わないからである。� ��して抗体は、この後混合する蛍光標識抗原� ��対して10~100倍のモル量を用いることが好ま� ��い。
 抗原由来物質中に抗原のエピトープが存在� ��れば、抗原由来物質が抗体と特異的に結合� ��て複合体を形成する。一方、抗原由来物質� ��に抗原のエピトープが存在しなければ、こ� ��ような複合体は形成されず、混合溶液(Y1)中 で抗体と抗原由来物質はそれぞれ単独で存在 する。

 次いで、前記混合溶液(Y1)と蛍光標識抗原を 混合して、混合溶液(Y2)を調製する。この時� �光標識抗原は、溶液として混合することが� �ましい。混合溶液(Y2)調製時の温度条件は、� ��合溶液(X1)調製時の温度条件と同様である。
 前記抗原由来物質中に抗原のエピトープが� ��在する場合、抗原由来物質および抗体の複� ��体はそのままの状態で、前記蛍光標識抗原� ��単独で、それぞれ混合溶液(Y2)中で共存する 。一方、前記抗原由来物質中に抗原のエピト ープが存在しない場合は、抗体と前記蛍光標 識抗原が特異的に結合して複合体を形成し、 抗原由来物質は単独で存在する。

 次いで、混合溶液(Y2)中の蛍光シグナル、 すなわち並進拡散時間(C2)を測定し、A1、B1お� ��びC2を比較する。上記のように抗原由来物� �中に抗原のエピトープが存在すれば、蛍光� �識抗原は単独で存在しているので、C2は、A1& lt;C2<B1の関係を満たす。一方、抗原由来物� ��中に抗原のエピトープが存在しなければ、� ��光標識抗原は抗体と複合体を形成している� ��で、C2はB1とほぼ同じ、すなわちC2=B1の関係� ��満たす。

 本実施形態では、複数の抗原由来物質を� ��析に供する場合には、各抗原由来物質ごと� ��すべての工程を行っても良いが、蛍光シグ� ��ル(A1)を測定する工程から蛍光シグナル(B1)� �測定する工程までを一度行えば、混合溶液(Y 1)を得る工程から蛍光シグナル(C2)を測定する 工程までを各抗原由来物質ごとに行い、得ら れた複数の蛍光シグナル(C2)と前記蛍光シグ� �ル(A1)および(B1)を比較しても良い。すなわち 、例えば、蛍光シグナル(A1)および(B1)を一回� ��定し、前記測定結果を記録して繰り返し用� ��れば、蛍光シグナル(C2)の測定を複数回行う だけで、蛍光シグナル(A1)、(B1)および(C2)の比 較を繰り返して行うことができる。このよう にすることで、エピトープ解析工程を簡略化 できるだけでなく、蛍光標識抗原および抗体 の使用量を削減することもでき、さらに、サ ンプル数が多くても短時間で処理できる。し たがって、エピトープ解析を迅速且つ低コス トで行うことができる。また、本実施形態で は前記第一の実施形態とは異なり、抗原由来 物質の使用量が少なくて済むので、使用でき る抗原由来物質が少量の場合に特に好適であ る。なお、ここで「複数の抗原由来物質」と は、「複数種類の複数の抗原由来物質」また は「同一種類の複数の抗原由来物質」のこと を指す。

 図4は、本実施形態の一例をさらに具体的に 説明するための図である。図4において、図2� ��示した構成要素と同じ構成要素には同一符� ��を付して、その説明は省略する。ここでは� ��蛍光標識抗原1、抗体2に対して、抗原由来� �質として第一のペプチド3、第二のペプチド4 および第三のペプチド5を用いて並進拡散時� �A1、B1およびC2を測定する場合について示し� �いる。
 図示のように、第一のペプチド3を用いた場 合の並進拡散時間C2が、A1<C2<B1の関係を� �たし、第二のペプチド4および第三のペプチ� ��5を用いた場合の並進拡散時間C2が、C2=B1の� �係を満たす場合(図4では、代表して第三のペ プチド5について図示している)には、第一の� ��プチド3中に蛍光標識抗原1のエピトープが� �在し、第二のペプチド4および第三のペプチ� ��5中にはエピトープが存在しないことになる 。

 なお、本実施形態においては、解析が正� ��に行われれば、蛍光シグナルの比較結果は� ��C2=B1およびA1<C2<B1のいずれかとなる。し たがって、これら以外の結果を与えた時は、 解析が正常に行われていないので、再測定が 必要である。

 本実施形態では、上記の点以外は前記第� ��の実施形態と同様である。

(第三の実施形態)
 本発明のエピトープ解析方法の第三の実施� ��態は、蛍光標識されかつ抗原に由来する物� ��を含む溶液中の蛍光シグナル(A2)を測定する 工程と、前記溶液と抗体を混合して混合溶液 (Z)を得る工程と、前記混合溶液(Z)中の蛍光シ グナル(B2)を測定する工程と、前記蛍光シグ� �ル(A2)および(B2)を比較する工程と、を含む。
 本実施形態では、前記第一および第二の実� ��形態とは異なり、抗原は使用せず、抗原に� ��来する物質を蛍光標識しておき、前記抗原� ��来物質を使用する。また、用いる抗原由来� ��質、抗体、蛍光シグナルの測定条件等は、� ��記第一の実施形態と同様である。

 本実施形態においては、一回の解析に供す� ��抗原由来物質は一種類でも良いし、複数種� ��でも良い。
 複数種類の抗原由来物質を一回の解析に同� ��に供する場合には、抗原由来物質の種類ご� ��にそれぞれ異なる種類の蛍光色素を用いる� ��すなわち、それぞれ分光特性が異なる蛍光� ��素を用いることで、溶液中に複数種類の抗� ��由来物質が含まれる場合でも、抗原由来物� ��の蛍光シグナルをその種類ごとに測定する� ��とができる。ここで分光特性が異なるとは� ��蛍光色素が励起される光の波長および蛍光� ��長の少なくとも一方が互いに異なることを� ��す。励起される光の波長が互いに異なれば� ��適宜対応する異なる波長の光を照射するこ� ��で、抗原由来物質の種類ごとに蛍光シグナ� ��を測定することができる。一方、蛍光波長� ��互いに異なれば、これら蛍光を波長ごとに� ��離することで、抗原由来物質の種類ごとに� ��光シグナルを測定することができる。

 蛍光色素を励起する光源としては、前記第� ��の実施形態と同様のものを用いることがで� ��る。そして、蛍光を分離するためには、ダ� ��クロイックミラー、蛍光フィルターなどの� ��光素子を用いる従来公知の方法を適用すれ� ��良い。
 例えば、ローダミングリーン、TAMRA、アレ� �サ647、ATTO633などは、それぞれ励起される光� ��波長および蛍光波長が異なるので、本実施� ��態で用いるのに好適である。

 図5を参照しながら、本実施形態についてさ らに詳しく説明する。図5は、蛍光自己相関� �数解析(FCS)による並進拡散時間の測定を行う 場合の本発明の第三の実施形態を例示するフ ローチャートである。ここでは、三種類の抗 原由来物質(I)~(III)を用いる場合を例示してお り、これら抗原由来物質はそれぞれ、分光特 性の異なる蛍光色素(I)~(III)で蛍光標識されて いる。蛍光色素(I)は波長488nmの光で励起可能� ��ものであり、蛍光色素(II)は波長543nmの光で� ��起可能なものであり、蛍光色素(III)は波長63 3nmの光で励起可能なものである。
 また、ここでは、三種類の抗原由来物質(I)~ (III)をいずれも含む溶液を用いる場合を例示� ��ている。このようにすることで、エピトー� ��解析を効率良く行うことができる。また、� ��のように複数種類の抗原由来物質を含む溶� ��を用いる場合には、前記溶液中において抗� ��由来物質はいずれも等濃度であることが好� ��しい。このようにすることで、より精度良� ��エピトープ解析を行うことができる。

 本実施形態では、まず蛍光標識された抗原� ��来物質を含む溶液中の蛍光シグナル、すな� ��ち抗原由来物質の並進拡散時間A2を測定す� �。ここでは、三種類の抗原由来物質(I)~(III)� �並進拡散時間をそれぞれ、A2-I、A2-IIおよびA2 -IIIとしている。そして、A2-Iは波長488nmの光� �A2-IIは波長543nmの光、A2-IIIは波長633nmの光で� �れぞれ測定されるものである。
 なお、本実施形態において抗原由来物質と� ��、前記第一および第二の実施形態と同様に� ��抗体と特異的に結合する所謂抗原抗体反応� ��示す抗原の一部を有するものである。

 本実施形態では、次いで、蛍光標識され� ��抗原由来物質を含む前記溶液と抗体を混合� ��て混合溶液(Z)を調製する。この時前記抗体� ��、溶液として混合することが好ましい。こ� ��場合、前記抗体溶液の濃度は特に限定され� ��い。混合溶液(Z)調製時の温度条件は、混合� ��液(X1)調製時の温度条件と同様である。また 、抗体は前記抗原由来物質に対して等モル量 以上混合することが好ましく、前記抗原由来 物質に対して10~100倍モル量混合することがよ り好ましい。前記抗原由来物質中に抗原のエ ピトープが存在すれば、混合溶液(Z)中では、 前記抗原由来物質および抗体が複合体を形成 するが、エピトープが存在するすべての抗原 由来物質を複合体とすることが好ましいから である。

 上記のように、抗原由来物質中に抗原の� ��ピトープが存在すれば、抗原由来物質は抗� ��と特異的に結合して複合体を形成する。一� ��、抗原由来物質中に抗原のエピトープが存� ��しなければ、このような複合体は形成され� ��、混合溶液(Z)中で抗体と蛍光標識された抗� ��由来物質はそれぞれ単独で存在する。

 本実施形態では、次いで、混合溶液(Z)中� ��蛍光シグナル、すなわち並進拡散時間B2を� �定し、A2およびB2を比較する。抗原由来物質� ��複数種類である場合には、それぞれの種類� ��とにA2およびB2を比較する。前記のように、 抗原由来物質はその種類ごとに異なる蛍光色 素で標識されているので、このような種類ご との比較が可能になっている。ここでは、三 種類の抗原由来物質(I)~(III)を用いた場合の並 進拡散時間B2をそれぞれ、B2-I、B2-IIおよびB2-I IIとしている。すなわち、A2-IとB2-I、A2-IIとB2- II、A2-IIIとB2-IIIをそれぞれ比較することにな� ��。

 蛍光標識された抗原由来物質中に抗原のエ� ��トープが存在すれば、上記の通り前記抗原� ��来物質は抗体と複合体を形成するので、A2� �よびB2は、A2<B2の関係を満たす。
 一方、蛍光標識された抗原由来物質中に抗� ��のエピトープが存在しなければ、     前 記抗原由来物質は単独で存在するので、B2はA 2とほぼ同じ、すなわちA2=B2の関係を満たす。
 このような蛍光シグナルの比較を、各抗原� ��来物質ごとに行うことで、いずれの抗原由� ��物質中に抗原のエピトープが存在するか、� ��便且つ高精度に判定できる。

 図6は、本実施形態の一例をさらに具体的に 説明するための図である。図6において、図2� ��示した構成要素と同じ構成要素には同一符� ��を付して、その説明は省略する。ここでは� ��抗体2に対して、抗原由来物質として第一の 蛍光標識ペプチド6、第二の蛍光標識ペプチ� �7および第三の蛍光標識ペプチド8を用いて並 進拡散時間A2およびB2を測定する場合につい� �示している。ここで、第一の蛍光標識ペプ� �ド6、第二の蛍光標識ペプチド7および第三の 蛍光標識ペプチド8は、いずれもアミノ酸配� �が異なり、分光特性が異なる第一の蛍光色� �60、第二の蛍光色素70、第三の蛍光色素80で� �れぞれ標識されている。
 図示のように、第一の蛍光標識ペプチド6を 用いた場合の並進拡散時間B2が、A2<B2の関� �を満たし、第二の蛍光標識ペプチド7および� ��三の蛍光標識ペプチド8を用いた場合の並進 拡散時間B2が、A2=B2の関係を満たす場合には� �第一の蛍光標識ペプチド6中に抗原のエピト� ��プが存在し、第二の蛍光標識ペプチド7およ び第三の蛍光標識ペプチド8中にはエピトー� �が存在しないことになる。

 なお、本実施形態においては、解析が正� ��に行われれば、蛍光シグナルの比較結果は� ��A2=B2およびA2<B2のいずれかとなる。したが って、これら以外の結果を与えた時は、解析 が正常に行われていないので、再測定が必要 である。

 また、図6では、三種類の抗原由来物質を用 いた場合を例示しているが、本実施形態にお いては、抗原由来物質は何種類でも良い。そ して、蛍光色素は、分光特性が互いに異なる ものであればどのようなものでも良く、励起 波長は互いに異なれば上記波長に限定されな い。
 さらに、図6では、複数種類の抗原由来物質 を含む溶液を用いる場合を例示しているが、 本実施形態においては、抗原由来物質を一種 類ずつ含む溶液を複数種類調製して用いても 良い。

 エピトープ解析を行うにあたり、特にエピ� ��ープに関する情報が無い場合などは、多く� ��抗原由来物質を解析に用いる必要がある。� ��かし、ここまで説明した本発明のエピトー� ��解析方法では、蛍光シグナルの測定にはサ� ��プル一つあたり数秒から十数秒程度の時間� ��か要しない。そして、例えば、384個のサン� ��ルウェルを有するガラスボトムプレートな� ��を用いることで、大量のサンプルを解析す� ��ことができる。さらに、解析に必要なサン� ��ル量は数十μl程度と微量なので、例えば、� ��清などの使用量が限られるものも用いるこ� ��ができる。このように本発明によれば、サ� ��プル量が微量でも迅速かつ高精度にエピト� ��プ解析を行うことができる。
 また、本発明は、抗原、抗原由来物質およ� ��抗体のいずれも固相化する必要がないので� ��アミノ酸配列認識だけでなく立体構造認識� ��基づくエピトープの解析も簡便かつ高精度� ��行なうことができる。