以下、実施例により本発明を更に詳細に� ��明する。

〔実施例1〕 バイオフィルム形成菌株のスク リーニング
 鹿児島県の福山地方に伝わる福山壷酢の醸� ��試料から分離した乳酸菌と酵母とを組み合� ��せて培養し、バイオフィルムの形成量を調� ��た。

 2006年秋仕込み5日目と11日目に試料を採取 し(合資会社伊達醸造伊達英史氏より供与頂� �た。)、試料から分離した乳酸菌と酵母の共� ��養を行った。培養は30℃で行い、培養開始� �ら24時間後にバイオフィルムをクリスタルバ イオレットで染色し、形成量を1~5の5段階で� �価した。この結果を図1に示す。

 幾つかの組み合わせで、乳酸菌、酵母そ� ��ぞれ単独で培養した場合よりも、バイオフ� ��ルム形成量が増加した。最もバイオフィル� ��形成量が多かったのは、乳酸菌ML11-11と酵母 Y11-43とを共培養した場合であった。

〔実施例2〕ML11-11とY11-43の同定
 16SリボゾームDNA及び18SリボゾームDNAを用い� ��菌の同定を行ったところ、乳酸菌ML11-11はラ クトバチルス・プランタラム( Lactobacillus   plantarum )、酵母Y11-43はサッカロミセス・セレビシエ( Saccharomyces   cerevisiae  )と同定された。乳酸菌ML11-11の16Sリボゾー� �DNAの塩基配列を配列番号1に、酵母Y11-43の18S� ��ボゾームDNAの塩基配列を配列番号2に、それ ぞれ示す。

〔実施例3〕ML11-11とY11-43のバイオフィルム形� ��条件の検討
 酵母Y11-43及び乳酸菌ML11-11をそれぞれYPD培地 及びMRS培地(Proteose peptone No. 3, 10.0 g: Beef  Extract, 10.0 g: Yeast Extract, 5.0 g: Dextrose, 20. 0 g: Polysorbate 80, 1.0 g: Ammonium Citrate, 2.0 g :Sodium Acetate, 5.0 g: Magnesium Sulfate, 0.1 g: Ma nganese Sulfate, 0.05 g: Dipotassium phosphate, 2.0 g : (1 L中))を用いて27℃で24時間前培養を行っ� ��。Y11-43、ML11-11の前培養菌液をYPD培地に接種 し、これを96穴タイタープレートに1ウェル当 たり100μL分注した。前培養菌液は1菌株のみ� �接種する場合はYPD培地の100分の1量接種し、2 菌株接種する場合は1菌株当たりYPD培地の200� �の1量接種した。前培養菌液接種後、30℃で24 時間静置培養を行い、クリスタルバイオレッ ト(0.1%)染色法によりバイオフィルムを染色し た。染色したバイオフィルムから色素を溶出 させ、溶出した色素の吸光度を測定し、バイ オフィルム形成量として評価した。

 酵母Y11-43と乳酸菌ML11-11のバイオフィルム 形成条件について検討した結果を図2に示す� �バイオフィルムは、両者を同一の培地中で� �培養した場合に顕著に形成が促進されたが� �ML11-11の単独培養液をフィルター除菌した上� ��をY11-43の単独培養培地に添加しても形成は� ��進されなかった。上清を加えた条件では、� ��養源の欠乏やpHの低下によってバイオフィ� �ム形成が抑制されている可能性が考えられ� �ので、この点についても検討を加えたが、Y1 1-43の単独培養にもちいる培地に、ML11-11上清� ��加えて培地成分を添加したり、pHを7.0に再� �整したりしても、バイオフィルム形成は促� �されなかった。

 以上の結果は、バイオフィルム形成には� ��酵母細胞と乳酸菌細胞が直接接触すること� ��必要なことを示している。

〔実施例4〕 壷酢分離株以外の菌株のバイオ フィルム形成量評価
(使用菌株)
 Y11-43、ML11-11以外の菌株として、以下の菌株 を使用した。

乳酸菌: Leuconostoc   mesenteroides  subsp.  mesenteroides  IAM 1046
     Lactobacillus   sakei  IFO 3541
     Lactobacillus   case i subsp.  rhamnosus  IFO 3831
酵母:  Saccharomyces   cerevisiae  X2180-1A
     Saccharomyces   cerevisiae  協会7号
     Saccharomyces   cerevisiae  協会10号
(培地、培養条件)
 酵母の前培養にはYPD培地を用い、乳酸菌の� ��培養にはMRS培地を用いた。前培養は、27℃� �24時間行った。

(バイオフィルム形成量の評価)
 酵母、乳酸菌の前培養菌液をYPD培地に接種� ��、これを96穴タイタープレートに1ウェル当� ��り100μL分注した。前培養菌液は1菌株のみを 接種する場合はYPD培地の100分の1量接種し、2� ��株接種する場合は1菌株当たりYPD培地の200分 の1量接種した。前培養菌液接種後、30℃で24� ��間静置培養を行い、クリスタルバイオレッ� ��(0.1%)染色法によりバイオフィルムを染色し� ��。染色したバイオフィルムから色素を溶出� ��せ、溶出した色素の吸光度を測定し、バイ� ��フィルム形成量として評価した。Y11-43とML11 -11以外の乳酸菌を共培養した場合のバイオフ ィルム形成量を図3に、ML11-11とY11-43以外の酵� ��を共培養した場合のバイオフィルム形成量� ��図4にそれぞれ示す。

 ML11-11以外の乳酸菌では、Y11-43と共培養して もバイオフィルムの形成量は増えなかった。 一方、ML11-11とY11-43以外の酵母との共培養を� �ったところ、顕著なバイオフィルム形成の� �加が確認された。特に、 S. cerevisiae  X2180に関して、数値はY11-43との共培養には� �ばないものの、バイオフィルムの形成の仕� �が、非常に近似していた。以上のことから� �Y11-43とML11-11のバイオフィルム形成量増加の� ��因は、ML11-11の働きによる可能性が高いこと が推測された。また、ML11-11は S. cerevisiae に属する出芽酵母に対し一般的にバイオフィ ルム形成を促進するものと考えられる。

〔比較例〕
 非特許文献1(河原井武人ら、日本農芸化学� �2007年度大会講演要旨集、169頁)に記載されて いる Saccharomyces   cerevisiae  協会10号と Lactobacillus   case i subsp.  rhamnosus  IFO 3831を、実施例4と同様の条件で、共培養 し、バイオフィルム形成量を評価した。この 結果を図5に示す。

 図5に示すように S.   cerevisiae  協会10号と L.   case i subsp.  rhamnosus  IFO 3831との共培養によるバイオフィルム形� ��量は、Y11-43とML11-11の共培養によるバイオフ ィルム形成量の1/10以下であった。

〔実施例5〕 一倍体酵母によるバイオフィル ム形成
 実用酵母の多くは多数倍体である。したが� ��て、本発明の方法が異なる倍数体の酵母で� ��同様に適用可能かどうかを実施例4と同様の 方法で検討した。実験には、モデルとして二 倍体実験室酵母X2180及びその一倍体であるハ� ��ロタイプ1Aと、異なるハプロタイプ1Bを使用 し、野生酵母Y11-43と比較した。その結果、一 倍体でも二倍体でも、乳酸菌ML11-11との共培� �で、野生酵母と全く同様にバイオフィルム� �形成することが確認でき、酵母の倍数性に� �かわらずバイオフィルム形成が起こること� �明らかとなった(図6)。

〔実施例6〕 糖濃度の二酸化炭素生成に及ぼ す影響
 共培養で生成したバイオフィルム形成細胞� ��び酵母単独培養細胞(浮遊細胞)を用いて10%� �ら30%のグルコース濃度の培地における二酸� �炭素生成量を調べた。YPD培地に酵母Y11-43を� �独、又は乳酸菌ML11-11と共に接種し、30℃、24 時間静置培養後、浮遊細胞(単独培養)ならび� ��バイオフィルム形成細胞(共培養)を遠心分� �により回収し、洗浄後、グルコースを10~30%� �有するYP培地中に加え、30℃にて静置培養し� ��生成するガス量を測定した。その結果、バ� ��オフィルム、酵母単独培養細胞のいずれを� ��いた場合も、10%及び20%のグルコース濃度培� ��における二酸化炭素生成量はほぼ同等であ� ��、30%グルコース濃度培地においては二酸化� ��素生成が抑制される傾向が見られた(図7及� �図8)。この結果より、バイオフィルム形成細 胞は酵母の単独培養で得られる浮遊細胞と同 様に糖から二酸化炭素を生成することが確認 された。これはバイオフィルムをもちいて単 独培養の場合と同様のエタノール生成が可能 なことを意味している。

〔実施例7〕 共培養バイフィルムにおける酵 母細胞の安定性
 バイオフィルムを固定化細胞として利用す� ��ためには、バイオフィルムの機械的衝撃に� ��する安定性が重要となる。そこで、酵母Y11- 43と乳酸菌ML11-11の共培養で形成させたバイオ フィルムの洗浄に対する安定性を評価した。

 シャーレに入れた20mlYPD培地中で酵母Y11-43 と乳酸菌ML11-11を静置条件にて共培養するこ� �によってステンレス板(1辺25mm)上にバイオフ� ��ルムを形成させた。培養後、バイオフィル� ��が形成されたステンレス板を100ml滅菌生理� �塩水に2回浸漬し付着している浮遊細胞を取� ��除いた後、容器に入れた400mlの滅菌食塩水� �に置き、スターラーによる攪拌(1500-1600rpm、� ��0.7 m/sの流速)で室温にて30分間洗浄を行っ� �。洗浄処理後のステンレス板を滅菌食塩水40 mlが入った100ml容ビーカーに入れ、5分間中程� ��の出力にて超音波処理を行った。処理後細� ��懸濁液を滅菌生理食塩水にて適宜希釈し生� ��数を測定した。その結果、酵母単独培養の� ��合、洗浄によってステンレス板に残存する� ��胞数は約25%にまで減少したのに対し、乳酸� ��との共培養によってバイオフィルムが形成� ��れたステンレス板の場合には、洗浄しても� ��菌数の減少は3%以下に止まり、バイオフィ� �ム中の酵母は洗浄しても遊離しにくく、バ� �オフィルムを形成した細胞は安定的に固体� �面に保持されることが明らかとなった(図9)� �

〔実施例8〕 共培養で形成したバイオフィル ムの構造の走査型電子顕微鏡による観察
 乳酸菌ML11-11と酵母Y11-43を20mlYPD培地に摂取� �30℃にて静置培養し、培養液中に設置したカ バーガラスの表面にバイオフィルムを形成さ せた。24時間培養後、カバーガラスを軽く洗� ��後、ガラス表面に形成されたバイオフィル� ��の構造をガラスに付着したまま走査型電子� ��微鏡によって観察した。乳酸菌前培養は、M RS培地 (DIFCO) 、酵母前培養はYPD培地 (DIFCO)  にて、それぞれ二代継代培養を27℃で行った� ��バイオフィルム形成は全てYPD培地 (DIFCO) � �て行った。構造解析にもちいたバイオフィ� �ム細胞は、滅菌シャーレに20 mLのYPD培地と� �アルコールで殺菌したMICRO COVER GLASS 22×22  (MATSUNAMI) 又は、MICRO SLID GLASS 76×26 (MATSUNAMI )を入れ、二代培養菌液を単独時は200 μL、複 合時には100 μLずつ接種し、30℃、24時間静置 培養した。培養後、培地を取り除き、カバー ガラスに形成させたバイオフィルム細胞をカ バーガラスごと50ml容プラスチック容器に入� �、0.1 Mリン酸バッファーで2回洗浄した。洗� ��後もガラス表面上に付着している細胞をバ� ��オフィルム細胞とした。こうして調製した� ��イオフィルム細胞を、常法にしたがい2% グ ルタルアルデヒド溶液による固定、ならびに 、2% オスミウム酸溶液による固定を行った� �に、臨界点乾燥機 HCP-2 (日立サイエンスシ� ��テムズ株式会社) にて乾燥を行った。その� ��、イオンスパッタE-1010 (日立サイエンスシ� ��テムズ株式会社) でイオンコーティングを� ��い、アルミニューム試料台に固定した。以� ��のようにして調整した標品をもちいて、走� ��型電子顕微鏡3Dリアルサーフェスビュー顕� �鏡 VE-8800 (KEYENCE株式会社)により微細構造の 観察を行った。

 その結果、共培養の系では酵母細胞が単� ��でバイオフィルムを形成している部位は見� ��せなかったのに対し、乳酸菌細胞は単独で� ��固体表面に付着する傾向が認められた(図11) 。また共培養で形成されたバイオフィルム中 では、酵母細胞と乳酸菌細胞が絡み合って存 在していた(図12)。一方、酵母単独培養では� �母細胞はガラス表面にほとんど付着しない(� ��13)のに対し、乳酸菌の場合単独培養でもあ� ��程度細胞がガラス表面に付着しバイオフィ� ��ムを形成する傾向が認められた(図14)。

〔実施例9〕 共培養におけるバイオフィルム 形成過程の位相差顕微鏡による観察
 図15~18には共培養におけるバイオフィルム� �成の経時的変化の観察結果を示した。乳酸� �ML11-11と酵母S. cerevisiaeBY4741を前述と同様に� �YPD培地にて30℃で共培養し、培養液中に設置 したカバーガラス表面にバイオフィルムを形 成させた。培養開始後4時間ごとにカバーガ� �スを培地から取り出して、軽く洗浄した後� �ガラスの表面に形成されたバイオフィルム� �システム顕微鏡 BX60 (OLYMPUS)をもちいた位相 差観察した。

 その結果、培養の4時間目には乳酸菌がガ ラス表面へ付着し始めたが、酵母の付着は殆 ど認められなかった(図15)。培養8時間目には� ��酸菌細胞がガラス表面にフィルム状集落を� ��成していたが、フィルムを構成する酵母細� ��は乳酸菌に比べて極めて数が少なく、ガラ� ��表面には付着せず、すべて乳酸菌集落の上� ��に付着していた(図16)。ついで、培養12時間� ��のガラス表面には急速に成長したバイオフ� ��ルムが観察され、多数の酵母細胞が乳酸菌� ��胞のバイオフィルムを土台として付着し始� ��ていたが、やはりガラス表面に直接付着し� ��いる酵母細胞は観察されなかった(図17)。さ らに培養16時間目のガラス表面には酵母細胞� ��乳酸菌細胞が絡み合って高細胞密度のバイ� ��フィルムが形成されていた(図18)。

 これらの所見より、図19に図示するよう� �、まず乳酸菌細胞が固体表面に付着して薄� �バイオフィルムを形成し、次いで乳酸菌が� �母細胞同士を架橋して酵母細胞と乳酸菌細� �の凝集体を形成、沈降して、固体表面にあ� �かじめ形成された乳酸菌のバイオフィルム� �土台として、顕著な複合バイオフィルムを� �成していくことが強く示唆された。

 以上の結果より、本発明のバイオフィルム� ��形成には、酵母と乳酸菌の細胞同士の直接� ��触が不可欠なこと、および、本発明のバイ� ��フィルムが、「酵母と乳酸菌を含むバイオ� ��ィルムであって、乳酸菌細胞が固体表面に� ��着し、酵母細胞が乳酸菌細胞を介して固体� ��面に固定されていることを特徴とするバイ� ��フィルム」であることがあきらかとなった� ��細胞同士の直接接触による架橋形成によっ� ��バイオフィルムが形成される例はこれまで� ��告はなく、また、このような酵母と乳酸菌� ��含むバイオフィルムであって、乳酸菌細胞� ��固体表面に付着し、酵母細胞が乳酸菌細胞� ��介して固体表面に固定されていることを特� ��とするバイオフィルムは、これまで観察さ� ��たことはなく、本発明のバイオフィルムは� ��く新規な構造物と考えられる。
 本明細書は、本願の優先権の基礎である日� ��国特許出願(特願2007-198792号及び特願2008-04719 5号)の明細書および/または図面に記載されて いる内容を包含する。また、本発明で引用し た全ての刊行物、特許および特許出願をその まま参考として本明細書にとり入れるものと する。