以下、本発明を詳細に説明する。なお、本� ��細書において、補酵素Q ₁₀ とのみ記載した場合は、酸化型、還元型を問 わず、両者が混在する場合には混合物全体を 表すものである。

 本発明の製造方法は、還元剤にアスコルビ� ��酸類を、反応溶媒に含水有機溶媒を使用し� ��かつ、pHが5以下の条件で、酸化型補酵素Q ₁₀ の還元反応を実施し、還元型補酵素Q ₁₀ を製造することを特徴とする。

 本発明の製造方法において、原料として用� ��る酸化型補酵素Q ₁₀ は、合成、発酵、天然物からの抽出等により 調製したものであってもよく、一般に市販さ れている既存の高純度補酵素Q ₁₀ であってもよい。また、酸化型補酵素Q ₁₀ のみを含有するものであってもよく、酸化型 補酵素Q ₁₀ と還元型補酵素Q ₁₀ の混合物であってもよい。

 本発明の製造方法では、還元反応を行う� ��の反応溶媒として含水有機溶媒を使用する� ��とが必要である。この場合の含水有機溶媒� ��、水を含有する有機溶媒、すなわち水と有� ��溶媒の混合溶媒であれば特に限定されない� ��、水と有機溶媒が相溶状態、つまり均一に� ��合された状態であるのが好ましい。そのよ� ��な観点から、上記還元反応において反応溶� ��として使用される含水有機溶媒中の有機溶� ��は、任意あるいは特定の混合比率下におい� ��水と溶解する水溶性の有機溶媒が好ましい� ��そのような有機溶媒としては特に制限され� ��いが、例えば、アルコール類、ケトン類、� ��トリル類、エーテル類等を挙げることがで� ��る。

 上記アルコール類としては、環状、非環� ��を問わず、又、飽和、不飽和を問わず、特� ��制限されないが、一般に、飽和のものが好� ��しく用いられる。例えば、炭素数1~5、特に� ��素数1~4、とりわけ炭素数1~3、なかでも炭素� ��2~3の1価アルコール、炭素数2~5の2価アルコ� �ル、又は、炭素数3の3価アルコールが好まし い。

 1価のアルコールとしては、例えば、メタ ノール、エタノール、1-プロパノール、2-プ� �パノール、1-ブタノール、2-ブタノール、イ� ��ブチルアルコール、tert-ブチルアルコール� �1-ペンタノール、2-ペンタノール、3-ペンタ� �ール、2-メチル-1-ブタノール、イソペンチル アルコール、tert-ペンチルアルコール、3-メ� �ル-2-ブタノール、ネオペンチルアルコール� �を挙げることができる。

 好ましくは、メタノール、エタノール、1 -プロパノール、2-プロパノール、1-ブタノー� ��、2-ブタノール、イソブチルアルコール、te rt-ブチルアルコールであり、より好ましくは 、メタノール、エタノール、1-プロパノール� ��2-プロパノールであり、さらに好ましくは� �エタノール、1-プロパノール、2-プロパノー� ��であり、最も好ましくは、エタノールであ� ��。

 2価のアルコールとしては、1,2-エタンジ� �ール、1,2-プロパンジオール、1,3-プロパンジ オール、1,2-ブタンジオール、1,3-ブタンジオ� ��ル、1,4-ブタンジオール、2,3-ブタンジオー� �、1,5-ペンタンジオール等を挙げることがで� ��る。好ましくは、1,2-エタンジオール、1,2-� �ロパンジオール、1,3-プロパンジオールであ� ��、最も好ましくは、1,2-エタンジオールであ る。

 3価のアルコールとしてはグリセリン等を 好適に用いることができる。

 上記ケトン類としては、特に制限されず� ��普通炭素数3~6のものが好適に用いられる。� ��体例としては、例えば、アセトン、メチル� ��チルケトン、メチルブチルケトン、メチル� ��ソブチルケトン等を挙げることができ、好� ��しくは、アセトン、メチルエチルケトンで� ��り、最も好ましくは、アセトンである。

 上記ニトリル類としては、環状、非環状� ��問わず、又、飽和、不飽和を問わず、特に� ��限されないが、一般に飽和のものが好まし� ��用いられる。普通、炭素数2~8、特に炭素数2 ~6、とりわけ炭素数2~4のものが好適に用いら� ��る。

 具体例としては、例えば、アセトニトリ� ��、プロピオニトリル、マロノニトリル、ブ� ��ロニトリル、イソブチロニトリル、スクシ� ��ニトリル、バレロニトリル、グルタロニト� ��ル、ヘキサンニトリル、ヘプチルシアニド� ��クロロアセトニトリル、ブロモアセトニト� ��ル、クロロプロピオニトリル、ブロモプロ� ��オニトリル、メトキシアセトニトリル、シ� ��ノ酢酸メチル、シアノ酢酸エチル、クロロ� ��ンゾニトリル、ブロモベンゾニトリル等を� ��げることができる。

 好ましくは、アセトニトリル、プロピオ� ��トリル、スクシノニトリル、ブチロニトリ� ��、イソブチロニトリル、バレロニトリル、� ��アノ酢酸メチル、シアノ酢酸エチルであり� ��より好ましくは、アセトニトリル、プロピ� ��ニトリル、ブチロニトリル、イソブチロニ� ��リルであり、最も好ましくは、アセトニト� ��ルである。

 上記エーテル類としては、環状、非環状� ��問わず、又、飽和、不飽和を問わず、特に� ��限されないが、一般に、飽和のものが好ま� ��く用いられる。又、普通、炭素数3~12、特に 炭素数4~8、とりわけ炭素数4~8のものが好適に 用いられる。

 具体例としては、例えば、ジエチルエー� ��ル、メチルtert-ブチルエーテル、ジプロピ� �エーテル、ジイソプロピルエーテル、ジブ� �ルエーテル、ジヘキシルエーテル、エチル� �ニルエーテル、ブチルビニルエーテル、ア� �ソール、フェネトール、ブチルフェニルエ� �テル、メトキシトルエン、ジオキサン、フ� �ン、2-メチルフラン、テトラヒドロフラン、 テトラヒドロピラン、エチレングリコールジ メチルエーテル、エチレングリコールジエチ ルエーテル、エチレングリコールジブチルエ ーテル、エチレングリコールモノメチルエー テル、エチレングリコールモノエチルエーテ ル、エチレングリコールジブチルエーテル等 を挙げることができる。

 好ましくは、ジエチルエーテル、メチルt ert-ブチルエーテル、ジプロピルエーテル、� �イソプロピルエーテル、ジオキサン、2-メチ ルフラン、テトラヒドロフラン、テトラヒド ロピラン、エチレングリコールジメチルエー テル、エチレングリコールジエチルエーテル 、エチレングリコールジブチルエーテル、エ チレングリコールモノメチルエーテル、エチ レングリコールモノエチルエーテルであり、 より好ましくは、ジエチルエーテル、メチル tert-ブチルエーテル、ジオキサン、テトラヒ� ��ロフラン、エチレングリコールモノメチル� ��ーテル、エチレングリコールモノエチルエ� ��テルであり、さらに好ましくは、ジエチル� ��ーテル、メチルtert-ブチルエーテル、ジオ� �サン、テトラヒドロフラン等であり、最も� �ましくは、ジオキサン、テトラヒドロフラ� �である。

 言うまでもなく、上記有機溶媒は複数を� ��用しても良い。

 上記有機溶媒の中でも、沸点、粘性等の� ��質を考慮して選定するのが好ましい。具体� ��には、溶解度や反応速度を高めるための適� ��な加温ができ、且つ、湿体からの溶媒の乾� ��除去や晶析濾液等からの溶媒回収を行いや� ��いという観点から、例えば、1気圧下の沸点 が約30~150℃の範囲であること、室温での取り 扱い時及び室温以下に冷却した時も固化しに くいという観点から、例えば、約20℃以下、� ��ましくは約10℃以下、より好ましくは約0℃� ��下の融点を有していること、また、例えば� ��20℃において約10cp以下の低い粘性を有して� ��ること等が挙げられる。特に、工業的な作� ��上の観点から、常温で揮発し難いものが好� ��しく、一般に、例えば、沸点が約50℃以上� �更には約55℃以上のものが好ましい。

 上記性質、及び価格の点やリサイクルま� ��は入手のしやすさの観点、そして食品や医� ��品用途で使用を考慮した場合、還元反応に� ��用される有機溶媒としては、メタノール、� ��タノール、1-プロパノール、2-プロパノール 、アセトンが好ましく、メタノール、エタノ ール、2-プロパノールがより好ましく、エタ� ��ールがもっとも好ましい。

 本発明の製造方法において、還元反応時の� ��応溶媒である含水有機溶媒中の水の含有量� ��言い換えれば、含水有機溶媒中の有機溶媒� ��水との重量比は、反応時間に大きな影響を� ��える。含水有機溶媒中の有機溶媒と水との� ��量比は、使用する有機溶媒の種類に影響さ� ��るため、一概に規定できないが、有機溶媒� ��対する水の重量比が小さい場合には、反応� ��間の短縮効果も小さい。一方、水の重量比� ��高すぎる場合には、相対的に有機溶媒の重� ��比が低くなるため、例えば酸化型補酵素Q ₁₀ 及び/又は還元型補酵素Q ₁₀ を含有する層と、水を含有する層が分離し、 むしろ反応時間が遅延する傾向が見られる。 この2層の分離を抑制するために、含水有機� �媒自体の使用量を増加させることも考えら� �るが、これは反応時の容積効率等の観点か� �好ましくない。

 このような観点から、含水有機溶媒中の� ��の含有量の上限は、好ましくは約15重量%、� ��り好ましくは約13重量%、さらに好ましくは� ��10重量%であり、その下限は好ましくは約1重 量%、より好ましくは約3重量%、さらに好まし くは約5重量%である。すなわち、含水有機溶� ��中の有機溶媒と水との重量比として、好ま� ��くは約99/1~85/15、より好ましくは約97/3~87/13� �さらに好ましくは約95/5~90/10の範囲である。� ��のような割合の含水有機溶媒を調製する方� ��としては特に限定されず、含水有機溶媒中� ��水は外部添加されたものであってもそうで� ��くともかまわない。

 本発明の製造方法において、還元剤とし� ��使用するアスコルビン酸類としては、特に� ��限されず、例えば、アスコルビン酸のみな� ��ず、rhamno-アスコルビン酸、arabo-アスコルビ ン酸、gluco-アスコルビン酸、fuco-アスコルビ� ��酸、glucohepto-アスコルビン酸、xylo-アスコル ビン酸、galacto-アスコルビン酸、gulo-アスコ� �ビン酸、allo-アスコルビン酸、erythro-アスコ� ��ビン酸、6-デスオキシアスコルビン酸等の� �スコルビン酸に類するものを含み、更に、� �れらのエステル体や塩であってもかまわな� �。

 これらは、L体、D体、或いは、ラセミ体で� �っても良い。具体的には、例えば、L-アスコ ルビン酸、L-アスコルビン酸パルミテート、L -アスコルビン酸ステアレート、D-arabo-アスコ ルビン酸等を挙げることができる。本発明の 製造方法において、還元剤としては、上記ア スコルビン酸類をいずれも好適に使用できる が、生成した還元型補酵素Q ₁₀ との分離のしやすさ等を考慮すると、上記の アスコルビン酸類のうち、特に水溶性のもの 、具体的には、上記アスコルビン酸類のうち 、フリー体や塩が好適に用いられ、最も好ま しくは、入手容易性、価格等の観点から、L-� ��スコルビン酸、D-arabo-アスコルビン酸等の� �リー体である。

 上記のアスコルビン酸類の使用量は、特に� ��限されず、原料である酸化型補酵素Q ₁₀ をすべて(あるいはほとんど)還元型補酵素Q ₁₀ に変換しうる有効量であればよい。一般的に 、酸化型補酵素Q ₁₀ をすべて還元型補酵素Q ₁₀ に変換しうるアスコルビン酸類の有効量は、 酸化型補酵素Q ₁₀ に対して、1倍モル量以上、好ましくは1.2倍� �ル量以上である。上限は特に制限されない� �、経済性も考慮して、普通10倍モル量、好ま しくは5倍モル量、より好ましくは3倍モル量� ��ある。

 本発明の製造方法において、酸化型補酵素Q ₁₀ の還元反応は、pHが5以下、好ましくはpHが4以 下、より好ましくはpH2~4の条件で実施される� ��ここでいうpHの値は、還元反応における、� �応混合物全体のpH値である。本発明において 、少なくとも反応開始時のpHが上記範囲とな� ��必要があるが、還元反応中のすべての期間� ��おけるpH値が上記範囲内となるのが好まし� �。本発明において上記pH値を調整する方法と しては特に限定されず、酸や塩基を用いてpH� ��を調整してもよいが、特段のpH調整手段を� �要としない場合もある。

 pH調整に使用できる酸としては、特に限� �されないが、硫酸、塩化水素(塩酸も含む)、 燐酸等の無機酸;メタンスルホン酸、エタン� �ルホン酸、ベンゼンスルホン酸、p-トルエン スルホン酸等のスルホン酸やトリフルオロ酢 酸、トリクロロ酢酸等のカルボン酸やクエン 酸、リンゴ酸等の有機酸などを挙げることが できる。なかでも、硫酸、塩化水素、燐酸等 の無機酸が好ましい。

 pH調整に使用できる塩基としては、特に� �限されないが、例えば、炭酸ナトリウム等� �アルカリ金属炭酸塩、炭酸水素ナトリウム� �のアルカリ金属炭酸水素塩、炭酸マグネシ� �ム等のアルカリ土類金属炭酸塩、アンモニ� �、トリエチルアミン等のアミン等を挙げる� �とができる。これらの中でも、pHの調整を容 易にするという観点から、金属(好ましくは� �アルカリ金属、アルカリ土類金属等)の炭酸� ��、炭酸水素塩、アンモニア、アミン等とい� ��た弱塩基が好ましい。

 本発明の製造方法において、還元反応は、� ��制流動下に実施するのが好ましい。具体的� ��は、単位容積当たりの撹拌所要動力として� ��通常約0.01kW/m ³ 以上、好ましくは約0.1kW/m ³ 以上、より好ましくは約0.3kW/m ³ 以上の流動が好ましい。上記の強制流動は、 通常、撹拌翼の回転により与えられるが、上 記流動が得られれば必ずしも撹拌翼を用いる 必要はなく、例えば、液の循環による方法な どを利用しても良い。

 本発明の製造方法において、還元反応は� ��普通30℃以上、好ましくは40℃以上、より好 ましくは50℃以上で実施される。還元反応温� ��の上限は系の沸点以下である。通常、30~150� ��程度、好ましくは40~120℃程度、より好まし� ��は50~100℃程度で好適に還元反応は実施でき� ��。

 本発明の製造方法において、還元反応を実� ��する際の反応溶媒に対する酸化型補酵素Q ₁₀ の初期濃度は、特に制限はないが、一般に、 含水有機溶媒100重量部に対する酸化型補酵素 Q ₁₀ の重量として、普通約1重量部以上、好まし� �は3重量部以上、より好ましくは5重量部以上 、とりわけ10重量部以上である。上限は、特� ��制限されないが、普通約60重量部以下、好� �しくは50重量部以下、より好ましくは40重量� ��以下、とりわけ30重量部以下である。一般� �、含水有機溶媒100重量部に対する酸化型補� �素Q ₁₀ の重量として約1~30重量部、好ましくは約5~30� ��量部、より好ましくは約10~30重量部で好適� �実施できる。

 本発明の製造方法において、還元反応は、� ��用するアスコルビン酸類の種類や量によっ� ��異なり、一律に規定できないが、通常、24� �間以内、好ましくは20時間以内、より好まし くは15時間以内、とりわけ10時間以内に完了� �せることができる。還元反応終了後の還元� �補酵素Q ₁₀ /酸化型補酵素Q ₁₀ の重量比は、97/3以上、好ましくは98/2以上、� ��り好ましくは99/1以上が期待できる。

 本発明の製造方法においては、上記還元反� ��を行った後、引き続き、反応液から還元型� ��酵素Q ₁₀ を単離するのが好ましい。反応液からの還元 型補酵素Q ₁₀ の単離方法としては、特に制限されないが、 例えば、以下の方法を挙げることができる。

 方法1:反応液から直接還元型補酵素Q ₁₀ を晶析し、固液分離して、還元型補酵素Q ₁₀ 結晶を取得する方法、
 方法2:反応液に、有機溶媒及び/又は水を添� ��して、還元型補酵素Q ₁₀ を有機層に移行させ、還元型補酵素Q ₁₀ を含有する有機層と水層とに分離させて有機 層を取得し、必要に応じて有機層の水洗・溶 媒置換を行った後、該有機層より還元型補酵 素Q ₁₀ の晶析を行い、固液分離して、還元型補酵素 Q ₁₀ 結晶を取得する方法、
 方法3:反応液に、有機溶媒及び/又は水を添� ��して、還元型補酵素Q ₁₀ を有機層に移行させ、還元型補酵素Q ₁₀ を含有する有機層と水層とに分離させて有機 層を取得し、必要に応じて有機層の水洗・溶 媒置換を行った後、該有機層より溶媒を留去 して、還元型補酵素Q ₁₀ の油状物もしくは固形物を取得する方法。

 以下に、上記方法1~3について説明する。

 上記方法1においては還元反応を行った後、 引き続き、反応液から還元型補酵素Q ₁₀ の晶析(結晶化)を行う。言うまでもなく、還� ��型補酵素Q ₁₀ を含有する反応液に含有される不純物の除去 も兼ねて精製晶析するのが特に効果的である 。これにより、共存する不純物、特に、通常 除去するのが必ずしも容易ではない構造の類 似した類縁化合物(例えば、還元型補酵素Q ₉ 、還元型補酵素Q ₈ 、還元型補酵素Q ₇ 等)を除去することができる。

 方法1における還元型補酵素Q ₁₀ の晶析は、冷却、濃縮、溶媒置換、貧溶媒の 使用等の一般的な晶析操作を、単独で用いて 、又は、適宜組み合わせて、実施することが できる。特に、冷却操作を用いる又は併用す る冷却晶析が好ましい。

 還元型補酵素Q ₁₀ の晶析は、強制流動下に実施するのが好まし い。過飽和の形成を抑制し、スムースに核化 ・結晶成長を行うために、或いは、高品質化 の観点から、単位容積当たりの撹拌所要動力 として、通常約0.01kW/m ³ 以上、好ましくは約0.1kW/m ³ 以上、より好ましくは約0.3kW/m ³ 以上の流動が好ましい。上記の強制流動は、 通常、撹拌翼の回転により与えられるが、上 記流動が得られれば必ずしも撹拌翼を用いる 必要はなく、例えば、液の循環による方法な どを利用しても良い。

 晶析に際しては、過飽和の形成を抑制し� ��スムースに核化・結晶成長を行うために、� ��晶を添加するのが好ましい。

 還元型補酵素Q ₁₀ の晶析温度(晶析時の冷却温度)は、晶析溶媒� ��種類や晶析方法にもより異なるので、一律� ��規定できないが、例えば、好ましくは25℃� �下、より好ましくは20℃以下、とりわけ15℃� ��下、なかんずく10℃以下である。下限は、� �の固化温度である。通常、0~25℃程度で好適� ��実施できる。
 得られる還元型補酵素Q ₁₀ 中への各種不純物の混入を最小化する、又は 良好な性状のスラリーを得る目的で、晶析時 の単位時間当たりの結晶の晶出量を制御する ことができる。好ましい単位時間当たりの晶 出量は、例えば、単位時間当たり全晶出量の 約50%量が晶出する速度以下(即ち、最大で50%� �/時間)であり、好ましくは、単位時間当たり 全晶出量の約25%量が晶出する速度以下(即ち� �最大で25%量/時間)である。尚、冷却晶析にお ける冷却速度は、普通、約40℃/時間以下であ り、好ましくは約20℃/時間以下である。

 このようにして得られる還元型補酵素Q ₁₀ の結晶は、例えば、遠心分離、加圧濾過、減 圧濾過等による固液分離を行い、更に、必要 に応じてケーキ洗浄を行って、湿体として取 得することができる。また、更に内部を不活 性ガスに置換した減圧乾燥器(真空乾燥器)に� ��湿体を仕込み、減圧下、乾燥することで、� ��元型補酵素Q ₁₀ の結晶を乾体として取得することができるし 、乾体として取得するのが好ましい。

 方法1においては、所望の濃度あるいは性状 等で晶析を行うために、必要に応じ、溶媒を 追加しても良い。このとき、追加する溶媒と しては、特に制限されないが、炭化水素類、 脂肪酸エステル類、エーテル類、アルコール 類、脂肪酸類、ケトン類、窒素化合物類(ニ� �リル類、アミド類を含む)、硫黄化合物類、� ��等を挙げることができる。そのなかでも特� ��、1価又は2価のアルコール及び/又はケトン� ��、好ましくは1価又は2価のアルコール及び/� ��は水溶性のケトン類、具体的にはメタノー� ��、エタノール、1-プロパノール、2-プロパノ ール、アセトン、メチルエチルケトン等、よ り好ましくはエタノール、アセトン等の有機 溶媒を追加するのが好ましい。該有機溶媒存 在下で晶析を行うことにより、スラリー性状 や結晶性状の良い還元型補酵素Q ₁₀ の結晶を取得することができ好ましい。

 一方、操作の簡便性等からは、還元反応� ��に反応溶媒として使用した有機溶媒及び/又 は水を追加するのが好ましいことから、従っ て、方法1においては、メタノール、エタノ� �ル、1-プロパノール、2-プロパノール、アセ� ��ン、メチルエチルケトン等、好ましくはエ� ��ノール、アセトン等の有機溶媒と水の混合� ��媒である含水有機溶媒中で還元反応を行い� ��引き続き晶析を行うのが特に好ましい。

 晶析時の溶媒中の還元型補酵素Q ₁₀ 濃度は特に制限されないが、溶媒中での還元 型補酵素Q ₁₀ の酸化防護効果は、還元型補酵素Q ₁₀ の高濃度溶液において更に高まる傾向もある ので、溶媒100重量部に対する還元型補酵素Q ₁₀ 含有量として通常1重量部以上、好ましくは2� ��量部以上の濃度で晶析させるとより効果的� ��ある。

 上記方法2においては、還元反応終了後の反 応液に、還元型補酵素Q ₁₀ を含有する有機層と水層が2層に分離するよ� �に、有機溶媒及び/又は水を添加して、還元� ��補酵素Q ₁₀ を有機層に移行させ、還元型補酵素Q ₁₀ を含有する有機層を取得し、必要に応じ、有 機層の水洗・溶媒置換を行った後、該有機層 より還元型補酵素Q ₁₀ の晶析を行い、固液分離の後に還元型補酵素 Q ₁₀ 結晶を取得する。

 方法2においては、還元反応に使用したア スコルビン酸類や、デヒドロアスコルビン酸 類等の反応時に生じる副生成物を水層に移行 させるのが好ましく、また、得られた有機層 は水洗して、残存する上記成分をさらに除去 するのがより好ましい。

 上記還元型補酵素Q ₁₀ を含有する有機層と水層とを2層に分離する� �めに添加する有機溶媒としては、還元反応� �了後の反応液に、該有機溶媒、または該有� �溶媒と水とを添加したときに水層と還元型� �酵素Q ₁₀ を含有する有機層とが分層する性質を有して いるものであれば、特に制限されない。また 、このとき添加する有機溶媒は、還元反応時 に反応溶媒として使用した含水有機溶媒中の 有機溶媒と同じであってもよく、異なってい てもよい。

 このような有機溶媒としては、例えば、炭� ��水素類、脂肪酸エステル類、エーテル類、� ��ルコール類、ケトン類、窒素化合物類(ニト リル類、アミド類を含む)、硫黄化合物類等� �挙げることができる。また、還元反応後の� �応液(含水有機溶媒溶液)に、さらに水を添加 することにより、水層と還元型補酵素Q ₁₀ を含有する有機層とに分離するのであれば、 有機溶媒を必ずしも使用する必要はない。言 うまでもなく、有機溶媒と水の両者を添加し ても良い。還元型補酵素Q ₁₀ の有機層への移行時、あるいは、該有機層の 水洗時において、還元型補酵素Q ₁₀ を分子酸素による酸化から防護するという観 点から、添加する有機溶媒として、炭化水素 類、脂肪酸エステル類、エーテル類、ニトリ ル類のうち、少なくとも一種を用いるのが好 ましく、最も好ましくは炭化水素類である。

 炭化水素類としては、例えば、脂肪族炭� ��水素、芳香族炭化水素、ハロゲン化炭化水� ��等を挙げることができる。特に、脂肪族炭� ��水素、芳香族炭化水素が好ましく、とりわ� ��、脂肪族炭化水素が好ましい。

 上記脂肪族炭化水素としては、環状、非� ��状を問わず、又、飽和、不飽和を問わず、� ��に制限されないが、通常、炭素数3~20、好ま しくは、炭素数5~12のものが用いられる。

 具体例としては、例えば、プロパン、ブ� ��ン、イソブタン、ペンタン、2-メチルブタ� �、シクロペンタン、2-ペンテン、ヘキサン、 2-メチルペンタン、2,2-ジメチルブタン、2,3-� �メチルブタン、メチルシクロペンタン、シ� �ロヘキサン、1-ヘキセン、シクロヘキセン、 ヘプタン、2-メチルヘキサン、3-メチルヘキ� �ン、2、3-ジメチルペンタン、2,4-ジメチルペ� ��タン、メチルシクロヘキサン、1-ヘプテン� �オクタン、2,2,3-トリメチルペンタン、イソ� �クタン、エチルシクロヘキサン、1-オクテン 、ノナン、2,2,5-トリメチルヘキサン、1-ノネ� ��、デカン、1-デセン、p-メンタン、ウンデカ ン、ドデカン等を挙げることができる。

 中でも、炭素数5~8の飽和脂肪族炭化水素� ��好ましく、ペンタン、2-メチルブタン、シ� �ロペンタン、ヘキサン、2-メチルペンタン、 2,2-ジメチルブタン、2,3-ジメチルブタン、メ� ��ルシクロペンタン、シクロヘキサン、ヘプ� ��ン、2-メチルヘキサン、3-メチルヘキサン、 2,3-ジメチルペンタン、2,4-ジメチルペンタン� ��メチルシクロヘキサン、オクタン、2,2,3-ト� ��メチルペンタン、イソオクタン、エチルシ� ��ロヘキサン、及びこれらの混合物が好まし� ��用いられる。

 上記芳香族炭化水素としては、特に制限� ��れないが、普通、炭素数6~20、特に炭素数6~1 2、とりわけ炭素数7~10のものが好適に用いら� ��る。具体例としては、例えば、ベンゼン、� ��ルエン、キシレン、o-キシレン、m-キシレン 、p-キシレン、エチルベンゼン、クメン、メ� ��チレン、テトラリン、ブチルベンゼン、p-� �メン、シクロヘキシルベンゼン、ジエチル� �ンゼン、ペンチルベンゼン、ジペンチルベ� �ゼン、ドデシルベンゼン、スチレン等を挙� �ることができる。好ましくは、トルエン、� �シレン、o-キシレン、m-キシレン、p-キシレ� �、エチルベンゼン、クメン、メシチレン、� �トラリン、ブチルベンゼン、p-シメン、シク ロヘキシルベンゼン、ジエチルベンゼン、ペ ンチルベンゼンであり、より好ましくは、ト ルエン、キシレン、o-キシレン、m-キシレン� �p-キシレン、クメン、テトラリンであり、最 も好ましくは、クメンである。

 上記ハロゲン化炭化水素としては、環状� ��非環状を問わず、又、飽和、不飽和を問わ� ��、特に制限されないが、一般に、非環状の� ��のが好ましく用いられる。普通、塩素化炭� ��水素、フッ素化炭化水素が好ましく、特に� ��素化炭化水素が好ましい。炭素数1~6、特に� ��素数1~4、とりわけ炭素数1~2のものが好適に� ��いられる。

 具体例としては、例えば、ジクロロメタ� ��、クロロホルム、四塩化炭素、1,1-ジクロロ エタン、1,2-ジクロロエタン、1,1,1-トリクロ� �エタン、1,1,2-トリクロロエタン、1,1,1,2-テト ラクロロエタン、1,1,2,2-テトラクロロエタン� ��ペンタクロロエタン、ヘキサクロロエタン� ��1,1-ジクロロエチレン、1,2-ジクロロエチレ� �、トリクロロエチレン、テトラクロロエチ� �ン、1,2-ジクロロプロパン、1,2,3-トリクロロ� ��ロパン、クロロベンゼン、1,1,1,2-テトラフ� �オロエタン等を挙げることができる。

 好ましくは、ジクロロメタン、クロロホ� ��ム、四塩化炭素、1,1-ジクロロエタン、1,2-� �クロロエタン、1,1,1-トリクロロエタン、1,1,2 -トリクロロエタン、1,1-ジクロロエチレン、1 ,2-ジクロロエチレン、トリクロロエチレン、 クロロベンゼン、1,1,1,2-テトラフルオロエタ� ��であり、より好ましくは、ジクロロメタン� ��クロロホルム、1,2-ジクロロエチレン、トリ クロロエチレン、クロロベンゼン、1,1,1,2-テ� ��ラフルオロエタンである。

 上記脂肪酸エステル類としては、例えば� ��プロピオン酸エステル、酢酸エステル、ギ� ��エステル等を挙げることができる。特に、� ��酸エステル、ギ酸エステルが好ましく、と� ��わけ、酢酸エステルが好ましい。特に制限� ��れないが、一般に、エステル基としては、� ��素数1~8のアルキルエステル又はアラルキル� ��ステル、好ましくは炭素数1~6のアルキルエ� ��テル、より好ましくは炭素数1~4のアルキル� ��ステルが好ましく用いられる。

 プロピオン酸エステルとしては、例えば� ��プロピオン酸メチル、プロピオン酸エチル� ��プロピオン酸ブチル、プロピオン酸イソペ� ��チルを挙げることができる。

 酢酸エステルとしては、例えば、酢酸メ� ��ル、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸イソ� ��ロピル、酢酸ブチル、酢酸イソブチル、酢� ��sec-ブチル、酢酸ペンチル、酢酸イソペンチ ル、酢酸sec-ヘキシル、酢酸シクロヘキシル� �酢酸ベンジル等を挙げることができる。好� �しくは、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸プ� �ピル、酢酸イソプロピル、酢酸ブチル、酢� �イソブチル、酢酸sec-ブチル、酢酸ペンチル� ��酢酸イソペンチル、酢酸sec-ヘキシル、酢酸 シクロヘキシルであり、より好ましくは、酢 酸メチル、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸 イソプロピル、酢酸ブチル、酢酸イソブチル であり、最も好ましくは、酢酸エチルである 。

 ギ酸エステルとしては、例えば、ギ酸メ� ��ル、ギ酸エチル、ギ酸プロピル、ギ酸イソ� ��ロピル、ギ酸ブチル、ギ酸イソブチル、ギ� ��sec-ブチル、ギ酸ペンチル等を挙げることが できる。好ましくは、ギ酸メチル、ギ酸エチ ル、ギ酸プロピル、ギ酸ブチル、ギ酸イソブ チル、ギ酸ペンチルであり、最も好ましくは 、ギ酸エチルである。

 エーテル類としては、環状、非環状を問� ��ず、又、飽和、不飽和を問わず、特に制限� ��れないが、一般に、飽和のものが好ましく� ��いられる。普通、炭素数3~20、特に炭素数4~1 2、とりわけ炭素数4~8のものが好適に用いら� �る。

 具体例としては、例えば、ジエチルエー� ��ル、メチルtert-ブチルエーテル、ジプロピ� �エーテル、ジイソプロピルエーテル、ジブ� �ルエーテル、ジヘキシルエーテル、エチル� �ニルエーテル、ブチルビニルエーテル、ア� �ソール、フェネトール、ブチルフェニルエ� �テル、メトキシトルエン、ジオキサン、フ� �ン、2-メチルフラン、テトラヒドロフラン、 テトラヒドロピラン、エチレングリコールジ メチルエーテル、エチレングリコールジエチ ルエーテル、エチレングリコールジブチルエ ーテル、エチレングリコールモノメチルエー テル、エチレングリコールモノエチルエーテ ル、エチレングリコールジブチルエーテル等 を挙げることができる。

 好ましくは、ジエチルエーテル、メチルt ert-ブチルエーテル、ジプロピルエーテル、� �イソプロピルエーテル、ジブチルエーテル� �ジヘキシルエーテル、アニソール、フェネ� �ール、ブチルフェニルエーテル、メトキシ� �ルエン、ジオキサン、2-メチルフラン、テト ラヒドロフラン、テトラヒドロピラン、エチ レングリコールジメチルエーテル、エチレン グリコールジエチルエーテル、エチレングリ コールジブチルエーテル、エチレングリコー ルモノメチルエーテル、エチレングリコール モノエチルエーテルであり、より好ましくは 、ジエチルエーテル、メチルtert-ブチルエー� ��ル、アニソール、ジオキサン、テトラヒド� ��フラン、エチレングリコールモノメチルエ� ��テル、エチレングリコールモノエチルエー� ��ルであり、さらに好ましくは、ジエチルエ� ��テル、メチルtert-ブチルエーテル、アニソ� �ル、テトラヒドロフラン等であり、最も好� �しくは、メチルtert-ブチルエーテル、テトラ ヒドロフランである。

 ニトリル類としては、環状、非環状を問� ��ず、又、飽和、不飽和を問わず、特に制限� ��れないが、一般に飽和のものが好ましく用� ��られる。普通、炭素数2~20、特に炭素数3~12� �とりわけ炭素数3~8のものが好適に用いられ� �。具体例としては、例えば、アセトニトリ� �、プロピオニトリル、マロノニトリル、ブ� �ロニトリル、イソブチロニトリル、スクシ� �ニトリル、バレロニトリル、グルタロニト� �ル、ヘキサンニトリル、ヘプチルシアニド� �オクチルシアニド、ウンデカンニトリル、� �デカンニトリル、トリデカンニトリル、ペ� �タデカンニトリル、ステアロニトリル、ク� �ロアセトニトリル、ブロモアセトニトリル� �クロロプロピオニトリル、ブロモプロピオ� �トリル、メトキシアセトニトリル、シアノ� �酸メチル、シアノ酢酸エチル、トルニトリ� �、ベンゾニトリル、クロロベンゾニトリル� �ブロモベンゾニトリル、シアノ安息香酸、� �トロベンゾニトリル、アニソニトリル、フ� �ロニトリル、ブロモトルニトリル、メチル� �アノベンゾエート、メトキシベンゾニトリ� �、アセチルベンゾニトリル、ナフトニトリ� �、ビフェニルカルボニトリル、フェニルプ� �ピオニトリル、フェニルブチロニトリル、� �チルフェニルアセトニトリル、ジフェニル� �セトニトリル、ナフチルアセトニトリル、� �トロフェニルアセトニトリル、クロロベン� �ルシアニド、シクロプロパンカルボニトリ� �、シクロヘキサンカルボニトリル、シクロ� �プタンカルボニトリル、フェニルシクロヘ� �サンカルボニトリル、トリルシクロヘキサ� �カルボニトリル等を挙げることができる。

 好ましくは、プロピオニトリル、スクシ� ��ニトリル、ブチロニトリル、イソブチロニ� ��リル、バレロニトリル、シアノ酢酸メチル� ��シアノ酢酸エチル、ベンゾニトリル、トル� ��トリル、クロロプロピオニトリルであり、� ��り好ましくは、アセトニトリル、プロピオ� ��トリル、ブチロニトリル、イソブチロニト� ��ルである。

 アルコール類としては、環状、非環状を� ��わず、又、飽和、不飽和を問わず、特に制� ��されないが、一般に、飽和のものが好まし� ��用いられる。普通、炭素数1~20、特に炭素数 4~12、とりわけ炭素数4~6の1価アルコールが好� ��しい。

 1価のアルコールとしては、例えば、メタ ノール、エタノール、1-プロパノール、2-プ� �パノール、1-ブタノール、2-ブタノール、イ� ��ブチルアルコール、tert-ブチルアルコール� �1-ペンタノール、2-ペンタノール、3-ペンタ� �ール、2-メチル-1-ブタノール、イソペンチル アルコール、tert-ペンチルアルコール、3-メ� �ル-2-ブタノール、ネオペンチルアルコール� �1-ヘキサノール、2-メチル-1-ペンタノール、4 -メチル-2-ペンタノール、2-エチル-1-ブタノー ル、1-ヘプタノール、2-ヘプタノール、3-ヘプ タノール、1-オクタノール、2-オクタノール� �2-エチル-1-ヘキサノール、1-ノナノール、1-� �カノール、1-ウンデカノール、1-ドデカノー� ��、アリルアルコール、プロパルギルアルコ� ��ル、ベンジルアルコール、シクロヘキサノ� ��ル、1-メチルシクロヘキサノール、2-メチル シクロヘキサノール、3-メチルシクロヘキサ� ��ール、4-メチルシクロヘキサノール等を挙� �ることができる。

 好ましくは、1-ブタノール、2-ブタノール 、イソブチルアルコール、tert-ブチルアルコ� ��ル、1-ペンタノール、2-ペンタノール、3-ペ� ��タノール、2-メチル-1-ブタノール、イソペ� �チルアルコール、tert-ペンチルアルコール、 3-メチル-2-ブタノール、ネオペンチルアルコ� ��ル、1-ヘキサノール、2-メチル-1-ペンタノー ル、4-メチル-2-ペンタノール、2-エチル-1-ブ� �ノール、シクロヘキサノールであり、より� �ましくは、メタノール、エタノール、1-プロ パノール、2-プロパノール、1-ブタノール、2- ブタノール、イソブチルアルコール、tert-ブ� ��ルアルコール、1-ペンタノール、2-ペンタノ ール、3-ペンタノール、2-メチル-1-ブタノー� �、イソペンチルアルコール、tert-ペンチルア ルコール、3-メチル-2-ブタノール、ネオペン� ��ルアルコールであり、さらに好ましくは、1 -ブタノール、2-ブタノール、イソブチルアル コール、2-メチル-1-ブタノール、イソペンチ� ��アルコールである。

 2価のアルコールとしては、1,2-エタンジ� �ール、1,2-プロパンジオール、1,3-プロパンジ オール、1,2-ブタンジオール、1,3-ブタンジオ� ��ル、1,4-ブタンジオール、2,3-ブタンジオー� �、1,5-ペンタンジオール等を挙げることがで� ��る。

 3価のアルコールとしてはグリセリン等を 挙げることができる。

 ケトン類としては、特に制限されず、普� ��炭素数3~6のものが好適に用いられる。具体� ��としては、例えば、アセトン、メチルエチ� ��ケトン、メチルブチルケトン、メチルイソ� ��チルケトン等を挙げることができ、好まし� ��は、メチルエチルケトンである。

 窒素化合物類としては、例えば、ニトロ� ��タン、ホルムアミド、N-メチルホルムアミ� �、N,N-ジメチルホルムアミド、N,N-ジメチルア セトアミド、N-メチルピロリドン等を挙げる� ��とができる。

 硫黄化合物類としては、例えば、ジメチ� ��スルホキシド、スルホラン等を挙げること� ��できる。

 方法2において添加される水として、アス コルビン酸類やその他の副生成物等を効率よ く水層に移行させる、水層と有機層との混合 による乳濁液の生成を回避する、等の観点か ら、食塩水等の水溶液を用いても良い。また 、還元反応終了後の反応液に、上記水との相 溶性の低い溶媒を添加するだけで水層と有機 層に分離する場合は、必ずしも水を添加しな くともよい。

 方法2においては、反応液に有機溶媒及び/� �は水を添加することで水層と分離して得ら� �た還元型補酵素Q ₁₀ を含有する有機層を、必要に応じて水洗した 後、そのまま晶析することもできる。この場 合、還元反応時に使用する有機溶媒や上記反 応後に添加する有機溶媒として、炭化水素類 、脂肪酸エステル類、エーテル類、ニトリル 類のうち、少なくとも一種を用いるのが、晶 析時の還元型補酵素Q ₁₀ を分子酸素による酸化から防護するという観 点から好ましい。

 言うまでもなく、上記反応後に添加する有� ��溶媒として、炭化水素類、脂肪酸エステル� ��、エーテル類、アルコール類、ケトン類、� ��素化合物類(ニトリル類、アミド類を含む)� �硫黄化合物類等を用いて還元型補酵素Q ₁₀ を含有する有機層を取得した後、他の溶媒に 溶媒置換し、その後、晶析を行っても良い。 特に、1価又は2価のアルコールあるいはケト� ��、好ましくは1価又は2価のアルコールある� �は水溶性のケトン(具体的にはメタノール、� ��タノール、1-プロパノール、2-プロパノール 、アセトン、メチルエチルケトン等、好まし くはエタノール、アセトン等)と水との混合� �媒を用いて晶析を行った場合には、スラリ� �性状や結晶性状の良い還元型補酵素Q ₁₀ の結晶を取得することができる。この観点か らは、炭化水素類、脂肪酸エステル類、エー テル類、アルコール類、脂肪酸類、ケトン類 、窒素化合物類(ニトリル類、アミド類を含� �)、硫黄化合物類、水等の溶媒を添加して、� ��ましくは、還元型補酵素Q ₁₀ の酸化防護の観点、及び、還元剤として使用 したアスコルビン酸類の除去性の観点から炭 化水素類、脂肪酸エステル類、エーテル類、 ニトリル類のうち、少なくとも一種の溶媒と 水とを添加して、還元型補酵素Q ₁₀ を含有する有機層を取得し、必要に応じて水 洗した後、1価又は2価のアルコールあるいは� ��トン類に溶媒置換し、晶析するのも好まし� ��態様である。

 上記、溶媒置換の方法としては特に制限さ� ��ないが、溶媒置換の操作を最短化し、還元� ��補酵素Q ₁₀ の酸化型補酵素Q ₁₀ への酸化を抑制するという観点から、好まし くは還元型補酵素Q ₁₀ の融解温度以上で溶媒を留去し、その後、所 望の別の溶媒を添加するのが好ましい。

 方法2における、上記有機層からの晶析方 法やその後の処理は、上記方法1と同様の方� �により行うことができる。

 上記方法3においても、上記方法2と同様、� �元反応に使用したアスコルビン酸類及びデ� �ドロアスコルビン酸類等の反応時に生じる� �生成物を水層に移行させるのが好ましく、� �得した有機層を水洗して、残存する上記成� �をさらに除去するのがより好ましい。その� �、添加する有機溶媒及び/又は水の種類や添� ��方法、還元型補酵素Q ₁₀ の有機層への移行、取得した有機層の水洗、 溶媒置換等の方法として、上記方法2と同様� �ものや手法を取ることができる。

 方法3において、還元型補酵素Q ₁₀ を含有する有機層より溶媒を留去する方法と しては、溶媒が除去された還元型補酵素Q ₁₀ が取得できれば、特に制限されず、還元型補 酵素Q ₁₀ を油状物として取得しても良いし、固形物と して取得しても良い。しかしながら、操作を 最短化し、還元型補酵素Q ₁₀ の酸化型補酵素Q ₁₀ への酸化を抑制するという観点、及び、濃縮 缶からの払い出し性等の観点からは、還元型 補酵素Q ₁₀ 又は還元型補酵素Q ₁₀ を主成分とする濃縮物の融解温度以上(融解� �度に幅がある場合は、融解開始温度以上)で� ��媒を留去し、還元型補酵素Q ₁₀ の油状物として取得するのが好ましい。言う までもなく、還元型補酵素Q ₁₀ を油状物として取得した後に、該油状物を冷 却し、固形物とするのも好ましい態様である 。

 上記方法1~3の中でも、取得した還元型補酵� ��Q ₁₀ の取り扱いやすさ等から、上記方法1または� �法2のように結晶として取得するのが好まし� ��、操作の簡便性等から、上記方法1が特に好 ましい。

 尚、本発明の製造方法は、脱酸素雰囲気下� ��実施することが、還元型補酵素Q ₁₀ を酸化から防護する上で効果的である。脱酸 素雰囲気は、不活性ガスによる置換、減圧、 沸騰やこれらを組み合わせることにより達成 できる。少なくとも、不活性ガスによる置換 、即ち、不活性ガス雰囲気を用いるのが好適 である。上記不活性ガスとしては、例えば、 窒素ガス、ヘリウムガス、アルゴンガス、水 素ガス、炭酸ガス等を挙げることができ、好 ましくは窒素ガスである。

 本発明の製造方法では、酸化型補酵素Q ₁₀ を還元型補酵素Q ₁₀ へと還元するに際し、反応時間を大幅に短縮 することができ、高品質の還元型補酵素Q ₁₀ を作業性、経済性良く得ることができる。