ラクトコッカス・ラクチスの各菌株由� ��のDNAを鋳型として、PrtP酵素遺伝子を検出す るプライマーを用いてPCRを行った結果得られ たPCR産物を、電気泳動法により分離し、染色 により検出したバンドパターンを示した図で ある。

 本発明の乳タンパク質分解物は、細胞壁� ��在性タンパク質分解酵素PrtP(以下、単に「Pr tP酵素」と記載することがある。)を有する乳 酸菌の生菌体、前記乳酸菌の菌体破砕物、及 び前記乳酸菌から分画された前記酵素画分か らなる群より選択される1以上を用いて、乳� �ンパク質を加水分解することにより得られ� �ことを特徴とする。本発明の乳タンパク質� �解物は、ビフィズス菌増殖促進活性を有し� �いるため、本発明の乳タンパク質分解物を� �効成分とすることにより、ビフィズス菌増� �促進効果の高い優れたビフィズス菌増殖促� �剤を得ることができる。本発明の乳タンパ� �質分解物がビフィズス菌増殖促効果を奏す� �理由は明らかではないが、乳タンパク質を� �PrtPを用いて加水分解することにより、ビフ� ��ズス菌増殖促進作用を有するオリゴペプチ� ��が得られるためではないかと推察される。

 本発明において用いられる乳酸菌は、PrtP 酵素を有している。PrtP酵素は、細胞膜に存� �し、細胞表面に活性部位が剥き出しになっ� �いる酵素である。PrtP酵素を有している乳酸� ��としては、例えば、ラクトコッカス・ラク� ��ス・サブスピーシーズ・クレモリス(Lactococc us lactis subsp.cremoris)やラクトコッカス・ラク チス・サブスピーシーズ・ラクチス(Lactococcus  lactis subsp. lactis)等のラクトコッカス属菌� �おいて、PrtPを有する菌株が幾つか報告され� ��いる。

 これまでに、ラクトコッカス・ラクチス由� ��のPrtP酵素には、P _I 型(α―カゼインを余り分解せず、β―カゼイ� ��をC末端の近辺からよく分解する)、P _III 型(α―カゼイン及びβ―カゼインをC末端及び N末端の両方からよく分解する)及びその中間� ��(P _I /P _III 型)が知られている(例えば、Reid,JR.et al.、Appl ied and Environmental Microbiology、1994年、第60巻� �3号、第801~806ページ参照。)。
 具体的には、ラクトコッカス・ラクチス由� ��のPrtP酵素として、NCBI(National center for Biote chnology Information)にアクセッション番号AY542690 、AY542691等として遺伝子配列が登録されてい� ��PrtP酵素等が挙げられる。

 ある乳酸菌が、PrtP酵素含有乳酸菌(PrtP酵� ��を有する乳酸菌)であるか否かは、例えば、 PCR(Polymerase Chain Reaction)等の遺伝子解析技術� ��用いて、PrtP酵素をコードするPrtP遺伝子を� �しているか否かを調べることにより確認す� �ことができる。

 PrtP酵素は、細胞外に酵素活性部位を有す るため、培地中のタンパク質を分解すること ができる。例えば、乳酸菌が乳性培地で増殖 するときに、PrtP酵素が、乳性培地中の乳タ� �パク質を分解し、乳酸菌の生育に必要とな� �オリゴペプチドやアミノ酸が提供される。� �のため、PrtP酵素を有するラクトコッカス・� ��クチスは、10%(W/W)還元脱脂粉乳培地で、25~30 ℃の温度範囲で16時間培養した時に、培地を� ��固させることができるほど増殖が早く、強� ��発酵性を有する、という特徴がある。この� ��うな増殖性や発酵性が高いという特徴を利� ��して、PrtP酵素含有乳酸菌を検出することも できる。その他、PrtP酵素活性を検出するこ� �によっても、PrtP酵素含有乳酸菌を検出する� ��とができる。

 本発明に用いられる乳酸菌は、PrtP酵素を有 するものであれば特に限定されるものではな いが、ラクトコッカス属菌であることが好ま しく、ラクトコッカス・ラクチスであること がより好ましく、ラクトコッカス・ラクチス ・サブスピーシーズ・クレモリスやラクトコ ッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラク チス等であることがさらに好ましい。
 発酵乳等のビフィズス菌を原料とする乳製� ��において、従来から原料として使用されて� ��ることから、安全性が高いと考えられるた� ��である。PrtP酵素を有するラクトコッカス・ ラクチスとしては、例えば、ラクトコッカス ・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリス NBRC100676 ^T 株や、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピ ーシーズ・ラクチスJCM20101株等がある。

 本発明において、PrtP酵素含有乳酸菌の前 培養に用いられる培地は、ラクトコッカス・ ラクチスの培養に通常用いられる培地であれ ば、特に限定されるものではないが、Difco(登 録商標) M17 Broth(Becton,Dickinson社製)等の市販� �半合成培地や、還元脱脂粉乳培地等の乳性� �地であることが好ましい。その他、前培養� �用いられる培地には、グルコースや酵母エ� �ス等の生育促進物質や、L-システイン等の還 元剤等を添加することができる。また、前培 養に用いられる培地は、殺菌処理をしたもの を用いる。該殺菌処理は、通常用いられる方 法で行うことができ、例えば、80~122℃で5~40� �間、好ましくは85~95℃で5~35分間の加熱処理� �より行うことができる。

 本発明において、乳タンパク質の加水分� ��に用いられるものとしては、PrtP酵素の酵素 活性を維持しているものであれば、特に限定 されるものではないが、PrtP酵素含有乳酸菌� �生菌体、前記乳酸菌の菌体破砕物、及び前� �乳酸菌から分画されたPrtP酵素画分であるこ� ��が好ましい。

 本発明において用いられるPrtP酵素含有乳酸 菌の生菌体は、常法により培養した乳酸菌を そのまま用いてもよく、凍結乾燥等の常法に より調整した乾燥菌末であってもよい。培養 した乳酸菌としては、培養に用いた培地ごと 用いてもよく、遠心分離処理等により培地か ら菌体のみを回収した後、適当なバッファー 等に懸濁させたものであってもよい。
 余分な培地等を除去し得ること、また濃縮� ��希釈により濃度を調整することも可能であ� ��ことから、培地から回収した菌体をバッフ� ��ーに懸濁させたものを用いることが好まし� ��。

 培地から回収した菌体を懸濁させるバッ� ��ァー等としては、乳酸菌を生菌の状態で懸� ��させることができる溶媒であれば、特に限� ��されるものではなく、乳酸菌等の懸濁に通� ��用いられるバッファー等を用いることがで� ��るが、カルシウムイオンを含むバッファー� ��であることが好ましい。懸濁に用いられる� ��ッファーのpHとしては、4.5~8.0であることが� ��ましい。該バッファーとして、例えば、MES� ��ッファー、HEPESバッファー、リン酸バッフ� �ー等が挙げられる。その他、生理食塩水で� �ってもよい。

 本発明において用いられるPrtP酵素含有乳 酸菌の菌体破砕物は、該乳酸菌をPrtP酵素の� �素活性を損なうことなく破砕することによ� �得られたものであれば、特に限定されるも� �ではない。このような破砕方法として、例� �ば、超音波を利用した破砕処理、ガラスビ� �ズ破砕処理、浸透圧ショックを利用した破� �処理等が挙げられる。なお、これらの破砕� �理は、50℃以下、好ましくは室温以下、より 好ましくは10℃以下の低温下において行うこ� ��が好ましい。加熱により、PrtP酵素が失活し てしまうためである。

 本発明において用いられるPrtP酵素含有乳 酸菌から分画されたPrtP酵素画分は、該乳酸� �から、PrtP酵素の酵素活性を損なうことなく� ��PrtP酵素を分画することにより得られたもの であれば、特に限定されるものではない。例 えば、培養後に培地から回収された乳酸菌を 、バッファー中に懸濁して保持した後、遠心 分離処理等によって菌体を除去することによ り、乳酸菌の細胞表面から遊離したPrtP酵素� �含む上清を、PrtP酵素画分として得ることが� ��きる。該バッファーに、EDTA等のキレート剤 を添加することにより、乳酸菌の細胞表面か らPrtP酵素が遊離されやすくなるため、EDTA等� ��キレート剤を添加したバッファーを用いる� ��とが好ましい。このような上清を得るため� ��バッファーとしては、例えば、上記生菌体� ��懸濁に用いることができるバッファーとし� ��挙げられたものに、EDTA等のキレート剤を添 加したものを用いることができる。また、バ ッファー中に乳酸菌を保持する温度は、50℃� ��満であれば特に限定されるものではないが� ��4~37℃程度であることが好ましく、30℃程度� ��あることがより好ましい。また、保持時間� ��、保持温度やバッファーの種類等を考慮し� ��適宜決定することができるが、1時間以内で あることが好ましく、5~30分間であることが� �り好ましく、5~15分間であることがさらに好� ��しい。

 なお、このようにして得られた上清を、� ��析処理することにより、PrtP酵素画分からキ レート剤を除去することができる。さらに、 分画されたPrtP酵素画分は、凍結濃縮等の公� �の手法により、PrtP酵素活性を損なうことな� ��濃縮することもできる。その他、乳酸菌の� ��体破砕物を、硫酸アンモニウム沈殿法やク� ��マトグラフィー法等の公知の分画手段を用� ��て分画することにより得られたPrtP酵素画分 であってもよい。

 本発明において用いられる乳タンパク質は� ��ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ等の動物(但しヒ トを除く)から採取された乳由来のタンパク� �であれば、特に限定されるものではなく、� �用に通常用いられる乳由来のタンパク質を� �宜選択して用いることができる。本発明に� �いては、産業上の利用価値の高い牛乳に含� �れている乳タンパク質であることが好まし� �。
 また、牛乳タンパク質としては、カゼイン� ��あってもよく、ホエータンパク質(ホエー中 に含まれるタンパク質)であってもよく、ト� �タルミルクプロテインであってもよい。
 本発明において用いられる乳タンパク質と� ��ては、牛乳由来のカゼイン又はトータルミ� ��クプロテインであることが好ましく、牛乳� ��来のカゼインであることがより好ましい。� ��りビフィズス菌増殖促進効果が高い乳タン� ��ク質分解物を得ることができるためである� ��
 なお、カゼイン、トータルミルクプロテイ� ��、ホエータンパク質等の乳タンパク質は、� ��法により調製したものを用いることができ� ��。また、市販されているものを用いてもよ� ��。

 本発明の乳タンパク質分解物は、乳タン� ��ク質に、PrtP酵素含有乳酸菌の生菌体、前記 乳酸菌の菌体破砕物、及び前記乳酸菌から分 画されたPrtP酵素画分からなる群より選択さ� �る1以上を添加して加水分解することにより� ��られる。添加されるPrtP酵素含有乳酸菌の生 菌体、菌体破砕物、及びPrtP酵素画分は、上� �のように調整したものを、適宜に凍結濃縮� �たは凍結乾燥したものとして添加すること� �好ましい。また、この加水分解の反応条件� �、PrtP酵素により酵素反応が可能な条件であ� ��ば特に限定されるものではなく、PrtP酵素の 種類、乳タンパク質の種類等を考慮して、適 宜決定することができる。例えば、由来する 乳酸菌が生育(増殖)し得る環境と実質的に同� ��の条件であれば、PrtP酵素が酵素活性を有す ることが期待できる。

 本発明においては、加水分解における反応� ��度は、50℃未満であることが好ましく、10~42 ℃であることがより好ましく、20~37℃である� ��とがさらに好ましく、30℃前後であること� �特に好ましい。
 また、加水分解に供される乳タンパク質は� ��pH6.0~8.0に調整されたものであることが好ま� ��く、6.0~7.5に調整されたものであることがよ り好ましく、6.5前後に調整されたものである ことがさらに好ましい。基質である乳タンパ ク質のpHが6.0以上である場合には、得られた� ��タンパク質分解物を加熱殺菌する場合に、� ��ンパク質凝集が生じ難い。一方、乳タンパ� ��質のpHが8.0以下である場合には、得られた� �タンパク質分解物を加熱殺菌する場合に、� �ンパク質の変性が生じ難い。

 本発明においては、加水分解における反� ��系中の乳タンパク質濃度は、所望の乳タン� ��ク質分解物の濃度や、添加するPrtP酵素の量 、反応時間等を考慮して適宜決定することが できる。本発明においては、加水分解におけ る乳タンパク質濃度は、0.5重量%以上である� �とが好ましく、1重量%以上であることがより 好ましい。よりビフィズス菌増殖促進能に優 れた乳タンパク質分解物を得ることができる ためである。

 また、本発明においては、加水分解にお� ��る反応系中に添加されるPrtP酵素含有乳酸菌 の生菌体、菌体破砕物、及びPrtP酵素画分の� �は、添加する乳タンパク質量等を考慮して� �宜決定することができるが、後述するPrtP酵� ��活性の単位として、1Unit/ml以上となるよう� �添加することが好ましい。加水分解の反応� �間は、反応温度、乳タンパク質濃度、添加� �るPrtP酵素の量等を考慮して適宜決定するこ� ��ができるが、例えば、PrtP酵素含有乳酸菌の 生菌体等の添加量が後述するPrtP酵素活性の� �位として3.5Unit/mlであり、反応温度が30℃で� �る場合には、5時間以上であることが好まし� ��。

 なお、本発明においては、加水分解によ� ��得られた乳タンパク質分解物は、反応後の� ��応液をそのまま用いてもよいが、反応後に� ��熱処理等により反応液中のPrtP酵素を失活さ せておくことが好ましい。

 本発明のビフィズス菌増殖促進剤は、上� ��のように製造された乳タンパク質分解物を� ��効成分とする。このように、乳由来成分を� ��効成分とするため、発酵乳等の乳由来原料� ��ビフィズス菌を培養して製造される飲食品� ��対して、乳タンパク質以外のタンパク質ア� ��ルギーに配慮することなく用いることがで� ��る。

 本発明のビフィズス菌増殖促進剤中に含� ��れる本発明の乳タンパク質分解物量は、ビ� ��ィズス菌増殖促進効果が得られる量であれ� ��特に限定されるものではないが、10重量%以� ��であることが好ましく、15重量%以上である� ��とがより好ましく、20重量%以上であること� ��さらに好ましく、40重量%以上であることが� ��に好ましい。

 本発明のビフィズス菌増殖促進剤の剤型� ��特に限定されるものではなく、凍結乾燥品� ��の粉末剤であってもよく、錠剤であっても� ��く、液剤であってもよく、ペースト状であ� ��てもよい。また、本発明のビフィズス菌増� ��促進剤は、本発明の乳タンパク質分解物に� ��るビフィズス菌増殖促進効果を阻害しない� ��り、その他の成分を含有していてもよい。� ��の他の成分として、例えば、澱粉や乳糖等� ��、一般的に添加される剤型補助剤や安定化� ��等が挙げられる。その他、本発明の乳タン� ��ク質分解物の他に、ビフィズス菌増殖促進� ��用を有する公知物質を添加してもよい。

 本発明のビフィズス菌増殖促進剤は、具� ��的には、ビフィズス菌の培養培地に添加す� ��ことにより、ビフィズス菌増殖促進効果を� ��揮することができる。培養培地に添加する� ��は、ビフィズス菌増殖促進効果が得られる� ��であれば特に限定されるものではなく、ビ� ��ィズス菌増殖促進剤中の乳タンパク質分解� ��量、ビフィズス菌の培養培地の組成、スタ� ��ターであるビフィズス菌の接種量、ビフィ� ��ス菌の種類等を考慮して、適宜決定するこ� ��ができる。本発明のビフィズス菌増殖促進� ��としては、例えば、ビフィズス菌の培養培� ��に対して、0.01~10(V/V)%となるように添加する ことが好ましく、0.1~5(V/V)%となるように添加� ��ることが特に好ましい。

 本発明のビフィズス菌増殖促進剤が添加� ��れるビフィズス菌の培養培地としては、通� ��用いられる培地であれば、特に限定される� ��のではなく、所望のビフィズス菌含有製品� ��種類等を考慮して適宜選択することができ� ��。例えば、ビフィズス菌発酵乳を製造する� ��めに用いられる発酵用ベースとしては、発� ��乳の製造に通常用いられるベースであれば� ��特に限定されるものではない。該ベースは� ��例えば、牛乳、脱脂乳、生クリーム、バタ� ��、全粉乳、脱脂粉乳等に、必要に応じて蔗� ��等の甘味料、ペクチン、果実、フルーツジ� ��ース、寒天、ゼラチン、油脂、香料、着色� ��、安定剤、還元剤等を配合し、常法に従っ� ��殺菌、均質化、冷却等することにより調製� ��ることができる。

 なお、本発明のビフィズス菌増殖促進剤� ��添加されるビフィズス菌は、常法により前� ��養したものを用いることができる。ビフィ� ��スの前培養に用いられる培養培地は、通常� ��いられる培地であれば、特に限定されるも� ��ではないが、乳性培地であることが好まし� ��。取り扱いが簡便であるため、還元脱脂粉� ��培地が特に好ましい。該還元脱脂粉乳培地� ��濃度は、3%(W/W)以上が好ましく、8%(W/W)以上� �特に好ましい。その他、前培養に用いられ� �培地には、酵母エキス等の生育促進物質や� �L-システイン等の還元剤等を添加することが できる。特にビフィズス菌は乳性培地での増 殖性が低いため、生育促進物質を添加した培 地を用いることが好ましい。例えば、0.1~1%(W/ W)の酵母エキスを含有した培地を用いること� ��できる。また、前培養に用いられる培地は� ��殺菌処理をしたものを用いる。該殺菌処理� ��、通常用いられる方法で行うことができ、� ��えば、80~122℃で5~40分間、好ましくは85~95℃� ��5~35分間の加熱処理により行うことができる 。

 本発明のビフィズス菌増殖促進剤の増殖� ��象菌は、ビフィズス菌であれば特に限定さ� ��るものではないが、ビフィドバクテリウム� ��ロンガムであることが好ましい。本発明の� ��タンパク質分解物による増殖促進効果が、� ��り顕著に得られるためである。特に、ビフ� ��ドバクテリウム・ロンガムATCC BAA-999株や、 ビフィドバクテリウム・ロンガム タイプス� ��レインATCC15700株であることが好ましい。

 また、本発明のビフィズス菌増殖促進剤� ��、従来に無くビフィズス菌、特にビフィド� ��クテリウム・ロンガムを増殖させることが� ��きるため、本発明のビフィズス菌増殖促進� ��を用いることにより、より整腸効果が高く� ��健康管理上も有用な、ビフィズス菌発酵乳� ��のビフィズス菌含有飲食品を製造すること� ��できる。

 以下、本発明の乳タンパク質分解物の製造� ��法及びビフィズス菌増殖促進作用について� ��さらに詳細に説明する。
1.ラクトコッカス・ラクチスの菌株のPrtP酵素 保有性の検出
 ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシ� ��ズ・クレモリスNBRC100676 ^T (ATCC19257 ^T )株、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピ� �シーズ・クレモリスATCC-9625株、ラクトコッ� �ス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチ� �NBRC12007(NCDO 497)株、ラクトコッカス・ラクチ ス・サブスピーシーズ・ラクチスJCM20101株、� ��びラクトコッカス・ラクチス・サブスピー� ��ーズ・ラクチスJCM20128株が、PrtP酵素を保有� ��ているか否かを確認した。
 具体的には、ラクトース及びグルコースを0 .5%添加したDifco(登録商標) M17 Broth(Becton,Dickin son社製)に、各菌株を3%接種し、30℃で16時間� �養した。遠心分離により菌体を得、DNeasy Blo od and Tissue kit(QIAGEN社製)を用いてDNAを抽出� �、PCR法によりPrtP遺伝子の保有性を確認した� ��PCRは参考文献(Journal of Appieid Microbiology、20 06年、第100巻、第1307~1317ページ。)に記載の手 法に準じて行った。プライマーは、フォワー ドプライマーGBf(GCAAATACGGTGACGGCTGCGA)及びリバー スプライマーGB2r(TGAGCATTATAATAGGTCTTCTTCC)のプラ� �マーセット、もしくはフォワードプライマ� �GHf(CAAATACGGTGACGGCTGCTAA)及びリバースプライマ� �GH2r(TAGCATTATAATAGGTCTTCGTCA)のプライマーセット� �用いた。

 図1はPCR産物を電気泳動法により分離し、染 色により検出したバンドパターンを示した図 である。図1中、「1」は分子量マーカーを流� ��たレーンであり、「2」はラクトコッカス・ ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスNBR C100676 ^T 株のPCR産物、「3」はラクトコッカス・ラク� �ス・サブスピーシーズ・ラクチスJCM20101株の PCR産物、「4」はラクトコッカス・ラクチス� �サブスピーシーズ・ラクチスNBRC12007株のPCR� �物、「5」はラクトコッカス・ラクチス・サ� ��スピーシーズ・ラクチスJCM20128株のPCR産物� �「6」はラクトコッカス・ラクチス・サブス� ��ーシーズ・クレモリスATCC-9625株のPCR産物を� ��それぞれ流したレーンである。この結果、� ��クトコッカス・ラクチス・サブスピーシー� ��・クレモリスNBRC100676 ^T 株及びラクトコッカス・ラクチス・サブスピ ーシーズ・ラクチスJCM20101株にはPrtP遺伝子の 保有が確認された。一方、ラクトコッカス・ ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスATC C-9625株、ラクトコッカス・ラクチス・サブス ピーシーズ・ラクチスNBRC12007株及びラクトコ ッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラク チスJCM20128株では、のそれぞれの菌株には保� ��していないことが判明した。

2.PrtP酵素活性の単位定義
 まず、0.02%のFTC-カゼインを含む30mM MES-NaOH  バッファー(pH6.5)0.4mlに、0.1mlの市販タンパク� ��解酵素トリプシン溶液(Sigma社製、酵素活性1 1,100Unit/mg)を添加し、30℃で1時間反応させた� �5%のトリクロロ酢酸1.2mlを添加し、ボルテッ� ��スで混合後、室温にて15分静置した。15000×g 、5分の遠心分離した上清液0.3mlを500mM Tris-HCl (pH8.5)2mlに混合し、蛍光強度を測定した。測� �はMTP-800AFC/Labマイクロプレートリーダ(コロ� �電気株式会社製)を用い、励起波長490nm、蛍� �波長530nmの条件で行った。
 一方、前記トリプシン溶液の代わりに、後� ��の方法で調製したPrtP酵素遺伝子を有するラ クトコッカス・ラクチスの生菌体、菌体破砕 物又はPrtP酵素画分を添加し、同様に分解反� �を行った。その結果、上記1ユニットのトリ� ��シンの分解により得られた蛍光強度の値を� ��PrtP酵素遺伝子を有するラクトコッカス・ラ クチスの生菌体、菌体破砕物又はPrtP酵素画� �で分解した場合のPrtP酵素活性の1酵素単位と 定義した。

3.乳タンパク質分解物の調製
 まず、70mMのβ―グリセロリン酸2ナトリウム を含む10%(W/W)還元脱脂粉乳を含む乳性培地を� ��95℃で30分間殺菌し、前記各菌株のシードカ ルチャーを3%接種し、30℃で16時間培養した。 この際、菌株の必要に応じて、培地中に0.5%� �グルコース及び0.05%の酵母エキスを添加した 。その後、1%のクエン酸3ナトリウムと水酸化 ナトリウム水溶液を用いてpH6.8に調整した後� ��遠心分離により菌体を得た。次に、菌体を1 0mM塩化カルシウム含有30mM MES-NaOH バッファ� �(pH6.5)で2回洗浄後、同bufferで懸濁し、10倍濃� ��した洗浄菌体(生菌体)を得た。また、菌体� �一部に対して、90℃で10分の加熱処理を行っ� ��。
 次に、1%カゼインを含む50mM Tris-HCl バッフ� ��ー(pH6.5)溶液に生菌体又は加熱処理菌体を1%� ��加し、緩やかに撹拌しながら30℃で24時間保 持した。反応後、90℃で10分間の過熱殺菌処� �を行い、塩酸でpH4.6に調整し、遠心分離によ り上清液を回収した。回収した溶液は、水酸 化ナトリウム水溶液でpH6.5に調整し、凍結濃� ��により50分の1容量まで濃縮した。

4.ビフィズス菌増殖促進活性の測定4-1 ビフ� �ズス菌数の測定
 トータルミルクプロテイン5%(W/W)、乳糖5%(W/W )を含む培地を90℃で10分間殺菌し、前記のよ� ��に調製したラクトコッカス・ラクチスの各� ��株の菌体によるカゼイン分解物を一定量添� ��し、ビフィドバクテリウム・ロンガムATCC B AA-999株のカルチャー0.1%を接種し、37℃で16時� ��培養した。培養後に、TOSプロピオン酸寒天� ��地(ヤクルト薬品工業社製)を用いて、段階� �釈法によりビフィズス菌数を測定した。

4-2 pH変動の測定
 上記4-1の培養試験にて、ビフィズス菌の増� ��に伴い、乳酸や酢酸を生成し、培地のpHを� �下させることが知られている。このため、� �地のpHの低下程度から、ビフィズス菌の増殖 程度を判定することが出来る。pHの測定はpH� �ーター(HORIBA社製)を用いて行った。なお、本 発明の乳タンパク分解物によるビフィズス菌 増殖促進活性は無添加の対照と比較して、pH� ��下の違いが0.3以上を基準に判断した。

5.乳タンパク質分解物によるビフィズス菌へ� ��増殖促進作用
 まず、後記実施例1記載の通り、ビフィドバ クテリウム・ロンガムATCC BAA-999株のカルチ� �ーを調製した。
 次に、トータルミルクプロテイン5%(W/W)、乳 糖5%(W/W)を含む培地を90℃で10分間殺菌し、前� ��のように調製したラクトコッカス・ラクチ� ��の各菌株の菌体によるカゼイン分解物を1%� �、ビフィドバクテリウム・ロンガムATCC BAA-9 99株のカルチャー0.1%を接種し、37℃で16時間� �養した。該培養液を急冷し、ビフィズス菌� �及びpHを測定した。測定結果を表1に示す。

 無添加対照と比べて、PrtP酵素遺伝子を有す るラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシ ーズ・クレモリスNBRC100676株及びラクトコッ� �ス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチ� �JCM20101株の生菌体によるカゼイン分解物添加 では、pHが5.0以下まで低下し、ビフィズス菌� ��が3×10 ⁸ CFU/g前後に達した。対して、PrtP酵素遺伝子を 有しないラクトコッカス・ラクチス・サブス ピーシーズ・クレモリスATCC-9625株、ラクトコ ッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラク チスNBRC12007株、及びラクトコッカス・ラクチ ス・サブスピーシーズ・ラクチスJCM20128株の� ��れぞれの生菌体によるカゼイン分解物添加� ��は、pHが5.5以上であり、ビフィズス菌数が5� �10 ⁷ CFU/g以下で、菌体無処理の対照と大きく違わ� ��かった。一方、加熱処理菌体によるカゼイ� ��分解物ではビフィズス菌増殖促進活性が見� ��れなかった。
 すなわち、PrtP酵素遺伝子を有するラクトコ ッカス・ラクチスの生菌株による乳タンパク 質分解物は、ビフィズス菌に対する増殖促進 性を有していることが明らかである。
 なお、ラクトコッカス・ラクチス・サブス� ��ーシーズ・ラクチスJCM20101株のカゼイン分� �物に、より強いビフィズス菌増殖促進活性� �見られたことから、以下、JCM20101株を用いて 分解条件の検討を行った。

6.他の市販酵素との比較
 上記3記載の通りに、ラクトコッカス・ラク チス・サブスピーシーズ・ラクチスJCM20101株� ��洗浄菌体(PrtP酵素含有生菌体)を得た。
 次に、1%カゼインを含む50mM Tris-HCl バッフ� ��ー(pH6.5)溶液にPrtP酵素含有生菌体を、PrtP酵� ��単位として3.5Units/ml添加し、緩やかに撹拌� �ながら30℃で24時間保持した。反応後、90℃� �10分間の加熱殺菌処理を行い、塩酸でpH4.6に� ��整し、遠心分離により上清液を回収した。� ��収した上清液は水酸化ナトリウム水溶液でp H6.5に調整し、凍結濃縮により20分の1容量ま� �濃縮した。
 一方、1%カゼインを含む50mM Tris-HCl バッフ� ��ー(pH6.5)溶液に上記生菌体の変わりに、市販 タンパク分解酵素トリプシン(Sigma社製)を3.5Un its/ml添加し、同様に分解を行った。反応後、 90℃で10分間の加熱殺菌処理を行い、塩酸でpH 4.6に調整し、遠心分離により上清液を回収し た。回収した上清液は水酸化ナトリウム水溶 液でpH6.5に調整し、凍結濃縮により20分の1容� ��まで濃縮した。
 得られたそれぞれのカゼイン分解物を、上� ��5記載の方法でビフィズス菌増殖促進テスト を行い、培養後のpHを測定した。結果を表2に 示す。市販タンパク分解酵素トリプシンと比 較して、ラクトコッカス・ラクチス・サブス ピーシーズ・ラクチスJCM20101株の生菌体によ� ��カゼイン分解物は、強いビフィズス菌増殖� ��進活性を示した。

7.乳タンパク質の分解時間の影響
 上記3記載の通りに、ラクトコッカス・ラク チス・サブスピーシーズ・ラクチスJCM20101株� ��洗浄菌体(PrtP酵素含有生菌体)を得た。
 次に、1%カゼインを含む50mM Tris-HCl バッフ� ��ー(pH6.5)溶液にPrtP酵素含有生菌体を、PrtP酵� ��単位として3.5Units/ml添加し、緩やかに撹拌� �ながら30℃で5~24時間保持した。反応後、90℃ で10分間の加熱殺菌処理を行い、塩酸でpH4.6� �調整し、遠心分離により上清液を回収した� �回収した上清液は水酸化ナトリウム水溶液� �pH6.5に調整し、凍結濃縮により20分の1容量ま で濃縮した。
 得られたそれぞれのカゼイン分解物を、上� ��5記載の方法でビフィズス菌増殖促進テスト を行い、培養後のpHを測定した。結果を表3に 示す。分解5時間~24時間の範囲では、分解時� �が長いほうがより強いビフィズス菌増殖促� �活性が見られた。すなわち、本発明のPrtP酵� ��活性3.5Units/mlの場合には、分解5時間以上で� ��れば強いビフィズス菌増殖促進作用が見ら� ��た。なお、PrtP酵素活性を強くした場合には 、より短い分解時間でも充分なビフィズス菌 増殖促進作用を有する分解物を得ることが出 来た。

8.乳タンパク質の分解温度の影響
 上記3記載の通りに、ラクトコッカス・ラク チス・サブスピーシーズ・ラクチスJCM20101株� ��洗浄菌体(PrtP酵素含有生菌体)を得た。
 次に、1%カゼインを含む50mM Tris-HCl バッフ� ��ー(pH6.5)溶液にPrtP酵素含有生菌体を、PrtP酵� ��単位として3.5Units/ml添加し、緩やかに撹拌� �ながら10~50℃で24時間保持した。反応後、90� �で10分間の加熱殺菌処理を行い、塩酸でpH4.6� ��調整し、遠心分離により上清液を回収した� ��回収した上清液は水酸化ナトリウム水溶液� ��pH6.5に調整し、凍結濃縮により20分の1容量� �で濃縮した。
 得られたそれぞれのカゼイン分解物を、上� ��5記載の方法でビフィズス菌増殖促進テスト を行い、培養後のpHを測定した。結果を表4に 示す。分解温度50℃未満において、ビフィズ� ��菌増殖促進活性が観察された。10℃~42℃で� �ビフィズス菌増殖促進活性が弱かったが、20 ~37℃では強い活性が見られ、特に30℃前後で� ��より強い活性が見られた。

9.PrtP酵素活性依存性
 上記3記載の通りに、ラクトコッカス・ラク チス・サブスピーシーズ・ラクチスJCM20101株� ��洗浄菌体(PrtP酵素含有生菌体)を得た。
 次に、1%カゼインを含む50mM Tris-HCl バッフ� ��ー(pH6.5)溶液にPrtP酵素含有生菌体を、PrtP酵� ��単位として0.01~10Units/ml添加し、緩やかに撹� ��しながら30℃で24時間保持した。反応後、90� ��で10分間の加熱殺菌処理を行い、塩酸でpH4.6 に調整し、遠心分離により上清液を回収した 。
 回収した上清液は水酸化ナトリウム水溶液� ��pH6.5に調整し、凍結濃縮により20分の1容量� �で濃縮した。
 得られたそれぞれのカゼイン分解物を、上� ��5記載の方法でビフィズス菌増殖促進テスト を行い、培養後のpHを測定した。結果を表5に 示す。それぞれの分解物によるビフィズス菌 増殖促進作用は、PrtP酵素活性に依存して強� �なり、1Units/ml以上の酵素活性でより強いビ� �ィズス菌増殖促進活性が見られた。

10.乳タンパク質分解時の基質濃度の影響
 上記3記載の通りに、ラクトコッカス・ラク チス・サブスピーシーズ・ラクチスJCM20101株� ��洗浄菌体(PrtP酵素含有生菌体)を得た。
 次に、1~10%カゼインを含む50mM Tris-HCl バッ� ��ァー(pH6.5)溶液にPrtP酵素含有生菌体を、PrtP� ��素単位として3.5Units/ml添加し、緩やかに撹� �しながら30℃で24時間保持した。反応後、90� �で10分間の加熱殺菌処理を行い、塩酸でpH4.6� ��調整し、遠心分離により上清液を回収した� ��回収した上清液は水酸化ナトリウム水溶液� ��pH6.5に調整し、凍結濃縮により20分の1容量� �で濃縮した。
 得られたそれぞれのカゼイン分解物を、上� ��5記載の方法でビフィズス菌増殖促進テスト を行い、培養後のpHを測定した。結果を表6に 示す。それぞれの分解物によるビフィズス菌 増殖促進作用は、カゼインタンパク濃度0.5%� �上でビフィズス菌増殖促進活性が見られ、� �に1%以上の濃度でより強い活性が見られた。

11.乳タンパク質分解時のpHの影響
 上記3記載の通りに、ラクトコッカス・ラク チス・サブスピーシーズ・ラクチスJCM20101株� ��洗浄菌体(PrtP酵素含有生菌体)を得た。
 次に、1%カゼインを含む50mM Tris-HCl バッフ� ��ー(pH6.0~8.0)溶液にPrtP酵素含有生菌体を、PrtP 酵素単位として3.5Units/ml添加し、緩やかに撹� ��しながら30℃で24時間保持した。反応後、90� ��で10分間の加熱殺菌処理を行い、塩酸でpH4.6 に調整し、遠心分離により上清液を回収した 。
 回収した上清液は水酸化ナトリウム水溶液� ��pH6.5に調整し、凍結濃縮により20分の1容量� �で濃縮した。
 得られたそれぞれのカゼイン分解物を、上� ��5記載の方法でビフィズス菌増殖促進テスト を行い、培養後のpHを測定した。結果を表7に 示す。pH6.0~8.0の範囲ではビフィズス菌増殖促 進活性が見られ、特にpH6.5前後ではより強い� ��性が見られた。

12.PrtP酵素含有菌体破砕物による分解活性
 上記3記載の通りに、ラクトコッカス・ラク チス・サブスピーシーズ・ラクチスJCM20101株� ��洗浄菌体を得た。続いて、この洗浄菌体を� ��超音波破砕機(BRANSON SONFIER 450)を用いて10分 間以上の超音波破砕処理を行い、菌体を破砕 した後、遠心分離(5000×g、10分)により未破砕� ��体を除き、菌体破砕物を得た。なお、菌体� ��砕物に生きている細胞が存在しないことは� ��顕微鏡観察及びコロニー培養で確認した。
 次に、1%カゼインを含む50mM Tris-HCl バッフ� ��ー(pH6.5)溶液に菌体破砕物をPrtP酵素単位と� �て1Units/ml添加し、緩やかに撹拌しながら30℃ で16時間保持した。反応後、90℃で10分間の加 熱処理を行い、塩酸でpH4.6に調整し、遠心分� ��により上清液を回収した。回収した上清液� ��水酸化ナトリウム水溶液でpH6.5に調整し、� �結濃縮により50分の1容量まで濃縮した。
 得られたそれぞれのカゼイン分解物を、上� ��5記載の方法でビフィズス菌増殖促進テスト を行い、培養後の、培養後のビフィズス菌数 及びpHを測定した。無添加の対照ではビフィ� ��ス菌が1.5×10 ⁷ CFU/ml、pHが6.18であったのに対して、上記菌体 破砕物によるカゼイン分解物添加では、ビフ ィズス菌が2.8×10 ⁸ CFU/ml、pHが5.31まで低下した。これらの結果か ら、本発明の菌体破砕物が、ビフィズス菌に 対する増殖促進性を有していることが明らか である。

13.PrtP酵素画分による分解活性
 上記3記載の通りに、ラクトコッカス・ラク チス・サブスピーシーズ・ラクチスJCM20101株� ��洗浄菌体を得た。続いて、この洗浄菌体を� ��10mM EDTA・2Naを含む30mM MES-NaOH バッファー(p H6.5)に懸濁し、30℃で10分間保持した。その後 急冷し、4℃の遠心分離(8500×g、10分)により遊 離したPrtP酵素を含む上清液を得た。このPrtP� ��素画分を、10mM塩化カルシウムを含む30mM MES -NaOH バッファー(pH6.5)で一晩透析した後、凍� ��濃縮により50分の1容量まで濃縮し、これをP rtP酵素画分とした。
 次に、1%カゼインを含む50mM Tris-HCl バッフ� ��ー(pH6.5)溶液に、このPrtP酵素画分をPrtP酵素� ��位として1Units/ml添加し、緩やかに撹拌しな� ��ら30℃で16時間保持した。反応後、90℃で10� �間の加熱処理を行い、塩酸でpH4.6に調整し、 遠心分離により上清液を回収した。回収した 上清液は水酸化ナトリウム水溶液でpH6.5に調� ��し、凍結濃縮により50分の1容量まで濃縮し� ��。
 得られたそれぞれのカゼイン分解物を、上� ��5記載の方法でビフィズス菌増殖促進テスト を行い、培養後のpHを測定した。無添加の対� ��ではビフィズス菌が1.75×10 ⁷ CFU/ml、pHが6.17であったのに対して、上記PrtP� �素画分によるカゼイン分解物添加では、ビ� �ィズス菌が3.8×10 ⁸ CFU/ml、pHが5.34まで低下した。これらの結果か ら、本発明のPrtP酵素画分が、ビフィズス菌� �対する増殖促進性を有していることが明ら� �である。

 以上のように、PrtP酵素遺伝子を有するラ クトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ ・クレモリスNBRC100676株及びラクトコッカス� �ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスJCM20 101株の生菌体、菌体破砕物、及びPrtP酵素画� �による乳タンパク質分解物には、ビフィズ� �菌に対する増殖促進活性を有していること� �明らかになった。また、その活性は、一般� �な市販タンパク分解酵素による分解物より� �いことが判明した。

 また、これらのPrtP酵素遺伝子を有するラク トコッカス・ラクチスは、ダイアセチル及び アセトインを生成しないため、これらの乳酸 菌を用いることにより、風味の良い発酵物を 製造し得ることも期待できる。
 さらに、高いビフィズス菌数を確保するた� ��に、ビフィズス菌スターターを、これらのP rtP酵素遺伝子を有するラクトコッカス・ラク チスの生菌体、菌体破砕物、又はPrtP酵素画� �による乳タンパク質分解物を添加して発酵� �てもよい。