[0001] 本发明属于医药技术领域， 涉及特异性纳米抗体生物医药通过皮肤的体外 给药 方式， 纳米抗体生物皮肤给药制剂的制备， 以及所述产品针对病灶的应用。 背景技术

[0002] 1993年比利时科学家首次报道： 骆驼血液中的抗体有一半左右没有轻链， 而且 这些缺失轻链的"重链抗体" (heavy-chain antibodies, HCAbs)能像正常抗体一样与 抗原等靶标紧密结合， 另外不像 scFv那样互相沾粘， 甚至聚集成块。

[0003] 骆 3它单链抗体只包含一个重链可变区 (Variable domain of heavy-chain antibody , VHH)和两个常规的恒定区 CH2与 CH3区， 更重要的是单独克隆并表达出来的 VH H区具有很好的结构稳定性与抗原结合活性， VHH是目前己知的可结合目标抗原 的最小单位， 所以 VHH也被称为纳米抗体 (N _an0 body)。 骆驼单链抗体具有高亲 和力和高特异性的特点， 而免疫原性 (尽管非人源， 但免疫原性很低;)和毒性则非 常低， 且不容易粘连。

[0004] 与人抗体的重链可变区 VH相比， 纳米抗体的簇互补区 CDR3更长， 可以形成凸 环结构， 能够深入抗原内部更好的结合抗原， 因而亲和力更高。 此外， 纳米抗 体的疏水残基被亲水残基取代， 水溶性更好， 不易形成聚集体。

[0005] 纳米抗体是目前已知的可结合目标抗原的最小 单位。 VHH晶体大小 2.5nmx4nm , 分子量只有 12KD-15KD, 其分子结构比较稳定， 能够耐高温并在极端苛刻的 环境中保持活性。 研究证实， 将 VHH在 37°C放置 1周仍能保持 80%的生物活性， 表明纳米抗体在室温下保存相当稳定， 这使其比常规抗体更易于储藏和运输。 纳米抗体具有强而快的组织穿透能力， 利于它们进入致密组织如实体瘤中发挥 作用， 而且能够有效的穿透血脑屏障， 为脑部给药提供了新方法。

[0006] 同时， 纳米抗体具有可逆的重折叠能力即易复性， 试验表明， 纳米抗体在 90°C 高温处理后， 仍然保持了较高的活性， 能重新获得抗原结合能力。 而所有常规 抗体在 90°C处理后都丧失了活性， 发生了不可逆的聚合。 在恶劣条件， 如在离液 剂、 存在蛋白酶和极度 pH值变性的条件下， 正常抗体会失效或分解， 而纳米抗 体仍具有高度的稳定性。

另外， 纳米抗体在强变性剂的条件下也表现出不易变 性或者变性后易复性的特

[0008] 与传统抗体相比， 1 ) 纳米抗体容易获得， 通过免疫、 B淋巴细胞分离、 抗体库 展示技术筛选等均能获得； 2) 稳定性好， 其内部折叠中含有多个二硫键， 使其 结构具有很好的稳定性， 可在常温放置； 3) 可溶性高， 不像 _scFv 那样容易聚集 成团， 纳米抗体亲水性好， 具有很好的水溶性， 能提高作为药物的利用率； 4) 吸收好， 由于可溶性高， 所以纳米抗体具有高吸收率的优点； 5) 纳米抗体表达 容易， 不像传统抗体那样必须要在哺乳动物细胞中进 行表达， 难度大、 产量低 、 成本高， VHH可以在原核细胞中进行高效表达， 有研究者将产量提高到了 2.5g /L; 6) 人源化简单， 与人类重链基因的同源性在 80〜90% , 人源化已经取得成 功； 7) 纳米抗体容易穿过生物膜系统， 也易于偶联其他分子。

[0009] 当然， 纳米抗体在体内的半衰期并不是非常长， 需要采取措施延长其在抗体药 物载体及人体里的半衰期， 通过纳米抗体与白蛋白融合、 Fc融合、 PEG化等改造 措施， 纳米抗体存在于抗体药物载体及人体内的半衰 期将大大延长。

[0010] 随着生物工程技术的不断发展， 大量纳米抗体药物将不断涌现。 目前其临床试 验的主要剂型为注射剂和口服剂。 由于纳米抗体药物分子量小， 体内稳定性差 , 且口服时易受胃肠道酶降解和肝脏酶系统的首 过效应影响， 要达到有效的药 物治疗浓度， 病人需要长期多次重复注射或口服给药。

[0011] 透皮或体外给药系统是指能促进具治疗量的药 物透过皮肤， 进入体循环发挥系 统作用的控释药物经皮给药系统。 其可以避免胃肠道 pH、 酶、 食物及其他药物 的相互作用而引起的胃肠道吸收困难， 避免首过效应。 还可以避免注射给药带 来的不便， 延长单次给药后的疗效， 通过药物贮库和控释特性控制半衰期短药 物的治疗时间， 并可随时撕下以中止用药。 其可用于紧急情况下无应答、 无知 觉的昏迷患者。 透皮给药系统显然是现代药剂学研究的热点。

[0012] 纳米抗体透皮给药方式无疑是最具创造性的创 新， 其适合纳米抗体的特点。 纳 米抗体经皮或体外给药是一种安全有效的给药 方式， 且皮肤组织中蛋白水解酶 含量较少， 有利于保持此类药物的稳定。 纳米抗体药物分子量小， 易穿过生物 膜系统， 很容易达到理想的透皮吸收效果。 因此， 利用纳米抗体的特性与优点 , 通过优化载体配方， 能够维护和增加纳米抗体的稳定性和皮肤组织 穿透性， 实现纳米抗体生物医药的透皮体外给药。 对于纳米抗体的透皮或体外给药制剂 系统， 国内外未见其相关报道。

技术问题

问题的解决方案

技术解决方案

[0013] 本发明的目的是提供一种纳米抗体生物药透皮 给药制剂系统， 所述制剂系统无 毒、 低成本、 方便使用， 特别适用于纳米抗体类药物与其他药物混合的 经皮给 药。

[0014] 此外， 本发明的目的还在于提供上述透皮给药制剂系 统的制备方法及应用。

[0015] 本发明所述的纳米抗体生物药透皮给药制剂系 统中包括有具有生物活性的特异 性纳米抗体和维护增加纳米抗体稳定性和组织 穿透性的抗体药物载体， 所述纳 米抗体包括人源化和非人源化的抗体形式。 所述纳米抗体生物药透皮给药制剂 系统非同于注射剂型和口服剂型， 是将药物有效成分通过皮肤进行给药， 具有 无疼痛、 自我给药和可在任何时间处理等优点， 与注射剂型相比， 使用简单， 且给药效率高。

[0016] 本发明中， 所述的特异性纳米抗体包括活性纳米抗体， 纳米抗体片段， 多粑向 纳米抗体聚合链接体， 纳米抗体与蛋白的偶联体， 纳米抗体与药物的偶联体。

[0017] 本发明所述的纳米抗体还可以是表达和纯化的 纳米抗体， 或给药系统中活性益 生微生物表达释放的活性纳米抗体， 纳米抗体片段， 多靶向纳米抗体聚合链接 体， 纳米抗体与蛋白的偶联体， 纳米抗体与药物的偶联体， 以在人体皮肤表面 和内皮层组织表面进行表达和分泌。

[0018] 具体地， 上述纳米抗体聚合链接体中， 可以是相同或不同的纳米抗体之间进行 聚合， 也可以是纳米抗体与白蛋白进行结合， 以延长药物在抗体药物载体以及 人体内的半衰期。

[0019] 本发明所述的纳米抗体生物药透皮给药制剂系 统中， 所述纳米抗体是针对不同 病灶的特异性纳米抗体， 所述病灶靶点包括， 但不限于， 皮肤病、 炎症和风湿 病、 癌症、 病毒细菌、 心血管病、 糖尿病、 老年痴呆症、 脑肿瘤、 骨质疏松症 、 银屑病 (牛皮癣)、 哮喘、 特异性皮炎、 慢性鼻窦炎等。

[0020] 进而， 具体地， 所述纳米抗体针对性的病症靶点包括， 伹不限于， HER2(h _Uma n epidermal growth factor receptor 2 or HER2/neu)、 EGFR(epidermal growth factor receptor)、 VEGF (vascular endothelial growth factor) - VEGFR、 FGFa(Fibroblast Growth Factor a)、 FGFb (Fibroblast Growth Factor b)、 TNFa(Tumor Necrosis Factor a)、 TNFb(Tumor Necrosis Factor b)、 Sclerostin、 Glucagon-like peptide

1(GLP1)、 Glucagon-like peptide

receptor(GLPR) , 免疫疗法靶点 PD-1、 PD-L1、 CTLA4 , 干扰素 IL-4、 IL-5、 IL-6 、 IL-9、 IL- B、 IL- 17a, 等。

[0021] 更进一步地， 本发明所述纳米抗体生物药透皮给药制剂系统 中可以包含有多种 特异性纳米抗体， 并可以与其它种药物组合， 形成复合透皮给药制剂。

[0022] 本发明中， 所述维护增加纳米抗体稳定性和组织穿透性的 抗体药物载体是由水 溶性高分子生物糖胶基质、 多羟化合物、 聚乙烯醇 (PEG)、 左旋糖酐、 多酸、 甘 油、 磷脂、 明胶、 羧甲基纤维素钠、 植物醇、 植物油、 聚丙烯酸钠中的一种或 几种的任意比例混合物与水混合构成， 但并不限于此。 该抗体药物载体的载药 量大， 与多种药物包括植物提取物、 化学药物的亲和力好， 可稳定蛋白结构与 功效， 经皮肤缓释释药， 透皮效果好； 该抗体药物载体皮肤贴敷舒适度高， 且 基本无皮肤刺激及过敏反应， 是理想的经皮给药传送平台； 该抗体药物载体与 多种药物组合， 能够制备出多种缓释经皮给药制剂。

[0023] 本发明所述的纳米抗体生物药透皮给药制剂系 统中， 所述抗体药物载体的基础 配方之一可以由如下重量份数的辅料混合构成 ： 水溶性高分子生物糖胶基质 18 份、 多羟化合物 10份、 聚乙烯醇 5份、 左旋糖酐 10份、 多聚氨基酸 10份、 甘油 10 份、 磷脂 5份、 明胶 2.5份、 羧甲基纤维素钠 1份、 水 20份。

[0024] 本发明采用上述抗体药物载体的纳米抗体生物 药透皮给药制剂系统可以采用下 述非唯一的制备方法得到： 将所述重量份数的水溶性高分子生物糖胶基质 和聚 乙烯醇加入所述重量份数的水中， 95°C加热搅拌 45min使完全溶解， 依次加入所 述重量份数的多羟化合物、 左旋糖酐、 多聚氨基酸、 甘油、 磷脂、 明胶、 羧甲 基纤维素钠， 加热至 60〜70°C搅拌 15min, 使完全溶解并混合均匀， 待温度降至 10〜20°C， 加入需要剂量的特异性纳米抗体， 制成纳米抗体生物药透皮给药制剂 系统。

[0025] 本发明所述的纳米抗体生物药透皮给药制剂系 统的具体应用包括将所述制剂系 统用于局部施药区域发挥作用， 也包括将制剂系统用于穿透皮肤组织进入血液 循环系统到达预设病灶部位。

[0026] 具体地， 所述施药部位包括人体外表皮肤与体内皮层组 织， 如口腔、 鼻腔、 眼 睛、 耳腔、 阴道、 肛门附近肠道等。

[0027] 基于此， 本发明所述的纳米抗体生物药透皮给药制剂系 统包括水质和脂质、 凝 胶、 膏霜载体形式， 用于涂抹于皮肤表面使用， 或管柱推入鼻腔、 阴道、 肛门 附近肠道， 或点滴进入口腔、 鼻腔、 眼睛、 耳腔。

[0028] 本发明所述的纳米抗体生物药透皮给药制剂系 统还包括将制剂系统用于有效穿 过角质层， 综合消除表皮基底层的黑色素沉淀， 以消除或减弱黄褐斑、 老年斑

, 雀斑。

[0029] 具体地， 所述应用包括应用于皮肤丘疹、 脓疱， 痤疮 (俗称青春痘)等多种皮疹 , 以及形成治疗面部粉刺、 护肤等的美容产品。

发明的有益效果

有益效果

[0030] 本发明首次公幵了以特异性纳米抗体生物医药 穿透皮肤组织的透皮给药制剂系 统及制备方法和应用。 由于传统抗体或蛋白大分子活性不稳定等生物 特质， 生 物医药的给药方式目前基本仅限于注射剂型。 纳米抗体是目前已知的可结合目 标抗原的最小单位， 其三维结构的特点决定了结构和生物活性的相 对稳定性及 生物特性。 本发明通过优化载体配方， 维护和增加了纳米抗体的稳定性和皮肤 组织穿透性， 实现了纳米抗体生物医药的透皮体外给药剂型 。 透皮给药是一种 安全有效的给药方式， 皮肤组织中蛋白水解酶含量较少， 有利于保持生物药物 的稳定。 本发明的纳米抗体生物药透皮给药制剂系统具 有无毒、 稳定、 可控、 给药方便、 易于操作等优点， 开拓了纳米抗体生物医药的新剂型， 其应用前景 非常广阔。

发明实施例

本发明的实施方式

[0031] 下述实施例给出了本发明具体的实施方式。 然而， 需要说明的是， 下面仅是针 对本发明应用的示例或举例说明。 本领域技术人员可以设计出许多改变和可选 的组合物、 方法和系统， 而没有脱离本发明的精神和范围。 所附权利要求意欲 覆盖这些改变和安排。 因此， 尽管本发明在下面进行了详细的举例描述， 但也 仅是提供了本发明实施方式的某个细节之一。 在不脱离本发明的核心内容： 纳 米抗体生物药透皮给药制剂系统构思的前提下 ， 所做出的若干的变形和改进， 均应属于本发明的保护范围。

[0032] 实施例 1。

[0033] 本实施例的目的在于提供一种以水溶性高分子 蛋白材料为主要基质的经皮或体 外缓释给药系统， 该给药系统的制备方法， 以及所述给药系统的应用。

[0034] 该给药系统是一种以水溶性高分子生物糖胶为 主要抗体药物载体的经皮或体外 给药系统， 该给药系统中， 一个典型的抗体药物载体的重量份数组成为： 水溶 性高分子生物糖胶基质 18份， 多羟化合物 10份， 聚乙烯醇 5份， 左旋糖酐 10份， 多聚氨基酸 10份， 甘油 10份、 磷脂 5份， 明胶 2.5份， 羧甲基纤维素钠 1份， 水 20 份。

[0035] 本实施例上述以水溶性高分子生物糖胶为主要 抗体药物载体的经皮或体外缓释 给药系统可以采用下述方法制备得到： 按照处方比例， 称取水溶性高分子生物 糖胶基质、 聚乙烯醇加入到适量水中， 95°C水浴加热搅拌 45min, 使完全溶解； 按处方比例称取多羟化合物、 左旋糖酐、 多聚氨基酸、 甘油、 磷脂、 明胶、 羧 甲基纤维素钠依次加入到上述溶液中， 60〜70°C加热搅拌 15min, 使加入的辅料 完全溶解并混合均勾； 按处方比例， 称取纳米抗体加入到前述溶液中， 搅拌均 匀； 即成为经皮或体外给药缓释系统。

[0036] 上述制备的纳米抗体生物药透皮给药制剂系统 的应用为用于制备纳米抗体药物 的经皮或体外给药制剂。

[0037] 具体地， 是用于制备治疗自身免疫病、 皮肤病、 炎症和风湿病、 癌症、 病毒细 菌感染、 心血管病、 糖尿病、 老年痴呆症、 局部炎症、 血液疾病、 骨科疾病的 制剂， 但不限于在此列举的疾病。

[0038] 所述经皮或体外给药系统的施药部位包括体外 皮肤与体内皮层组织， 例如阴道

, 口腔， 鼻腔， 眼睛， 耳腔， 肛门附近肠道。 因此， 可以将所述经皮或体外给 药纳米抗体制剂分散于水、 凝胶或膏霜中外涂于皮肤上使用， 其在皮肤表层释 放的活性抗体或抗体片段能有效穿过表皮层。

[0039] 同时， 所述经皮或体外给药系统释放的活性抗体或扰 体片段， 既能有效穿过角 质层， 又能消除表皮基底层的黑素细胞， 具有很好的色斑治疗作用， 适用于黄 褐斑、 老年斑， 雀斑等色素沉着疾病的治疗。

[0040] 所述经皮或体外给药系统的药液可以深入渗透 至肌肤内层， 既有控制油脂、 抗 菌消炎的作用， 又能消除发于颜面、 胸背及体外皮肤上的丘疹、 脓疱、 痤疮 (俗 称青春痘)等多种皮疹， 对皮肤无任何副作用， 可用于有效地治疗面部粉刺的生 物美容药液以及用于抗衰老的化妆品中。

[0041] 实施例 2。

[0042] 水溶性高分子生物糖胶基质 18份， 聚乙烯醇 5份， 聚丙烯酸钠 8份， 植物油 2份 , 植物醇 6份， 甘油 10份、 明胶 2.5份， 羧甲基纤维素钠 1份， 水 20份。

[0043] 按照处方比例， 称取水溶性高分子生物糖胶基质、 聚乙烯醇加入到适量水中， 95°C水浴加热搅拌 45min使全溶； 按处方比例， 称取明胶、 羧甲基纤维素钠加入 到上述溶液中， 60〜70°C加热搅拌 15min , 使加入的辅料完全溶解并混合均匀； 按处方比例， 称取 70<¾植物醇， 加入到前述溶液中， 60〜70°C搅拌均匀； 按处方 比例， 称取聚丙烯酸钠、 甘油， 将聚丙烯酸钠加入到甘油中搅拌均匀后加入到 前述溶液中， 70〜80°C加热 lOmin , 搅拌均匀； 按处方比例， 称取植物油与纳米 抗体加入到前述溶液中搅拌均匀； 即成为经皮或体外给药缓释系统。

[0044] 实施例 3。

[0045] 一种纳米抗体生物药透皮给药制剂系统 , 所述给药系统中的纳米抗体可以消除

IL-1 alpha (Interleukin 1 alpha) TNF- alpha, IL-8 (Interleukin 8)等炎症因子。

[0046] 实施例 4。

[0047] 一种纳米抗体生物药透皮给药制剂系统， 所述给药系统中的纳米抗体可以消除 Propionibacterium acnes (P. acnes)等感染皮肤的细菌。

[0048] 实施例 5。

[0049] 一种纳米抗体生物药透皮给药制剂系统， 所述给药系统中的纳米抗体 IL-6 (Int rleukin

6)在严重炎症性疾病中起到重要作用， 将其制备成基于靶向 IL-6/IL-6R的纳米抗 体药物膏霜， 涂于关节皮肤使用， 消除自身免疫病的 IL-6炎症因子。

[0050] 实施例 6。

[0051] 一种纳米抗体生物药透皮给药制剂系统， 所述给药系统是基于 IgE靶点的纳米 抗体的膏霜制剂， 可涂于喉咙皮肤治疗过敏性哮喘。

[0052] 实施例 7。

[0053] 一种纳米抗体生物药透皮给药制剂系统， 所述给药系统是基于靶向 vWF靶点的 纳米抗体的膏霜， 可涂于皮肤， 用于治疗血小板减少性紫癜 (TTP)。

[0054] 实施例 8。

[0055] 一种纳米抗体生物药透皮给药制剂系统， 是基于 ALX-0171靶向的纳米抗体的 膏霜制剂， 可涂于喉咙皮肤， 用于治疗 RSV感染。 RSV感染对于婴儿来说非常常 见， 但目前没有可用的药物。

[0056] 实施例 9。

[0057] 一种纳米抗体生物药透皮给药制剂系统， 是基于靶向 RANKL的纳米抗体的膏 霜， 可涂于关节皮肤， 用于治疗骨质疏松适应症。

[0058] 实施例 10。

[0059] 一种纳米抗体生物药透皮给药制剂系统， 是基于靶向 EGFR、 HER2、 VEGFR2 、 c-Met、 CXCR7等的抗肿瘤纳米抗体的膏霜， 可涂于相应皮肤， 也可以形成纳 米颗粒在癌变区域渗透， 而用于治疗癌症。

[0060] 实施例 11。

[0061] 一种膏霜型的纳米抗体生物药透皮给药制剂系 统， 所述给药系统中的纳米抗体 相关抗肿瘤纳米抗体涂于相应皮肤， 也可以起到抗蛇毒和解毒效果。

[0062] 实施例 12。

[0063] 一种纳米抗体生物药透皮给药制剂系统， 是基于纳米抗体 Nb An46的膏霜， 可 以抗非洲锥虫的感染。

[0064] 实施例 13。

[0065] 一种纳米抗体生物药透皮给药制剂系统， 是基于特异性抑制 TNFR1的三价纳米 抗体的膏霜， 可以抗炎症性疾病。

[0066] 本发明的纳米抗体生物药透皮给药制剂系统中 还可以包含活性微生物。 其中抗 体或抗体片段可以在皮肤表面进行表达和 /或分泌。

[0067] 上述本发明所列举的任何一项纳米抗体生物药 透皮给药制剂系统， 其中的抗体 是 VHH型或 VNAR型重链免疫球蛋白或其片段， 优选来源于羊驼 Camelids, 最优 选来源于美洲驼重链抗体或其片段， 或者抗体是免疫球蛋白重链或轻链的结构 域抗体 (dAb)或其片段。

[0068] 本发明所述的纳米抗体生物药透皮给药制剂系 统能够提高生物利用度 , 减少用 药剂量， 降低不良反应， 提高药物治疗指数， 增加临床用药安全性和制剂顺应 性。 因此， 本发明所述的给药系统不仅具备传统药物传输 系统无法比拟的优越 性， 更可实现多途径透皮给药， 如可用于口服给药、 肺部给药、 眼部给药及鼻 腔给药等。 然而目前世界上尚没有本发明所述的纳米抗体 生物药透皮给药制剂 系统应用。

[0069] 以下列举了部分本发明可实施的纳米抗体 VHH序列， 该序列均已公幵报道。 但 适用于本发明的纳米抗体 VHH序列并不限于此。

[0070] 含有 128个氨基酸的 VHH-CIHER2序列 1 : DVQLVESGGG, SVQGAAGGSL, R LSCAASDIT , YSTDCMGWFR, QAPG EREGV, ATINNGRAIT, YYADSVK GRF, TISQDNAKNT, VYLQMNSLRP, KDTAIYYCAA, RLRAGYCYPA, D YSMDYWGKG, TQVTVSSG。

[0071] 含有 126个氨基酸的 VHH- aHER2

序列 2: DVQLEESGGG, SVQTGGSLRL, SCAASGYTYS , SACMGWFRQG, P GKEREAVAD , VNTGGRRTYY, ADSVKGRFTI, SQDNTKDMRY , LQMNNL KPED， TATYYCATGP, RRRDYGLGPC, DYNYWGQGTQ, VTVSSG。

[0072] 含有 132个氨基酸的 VHH- aVEGF序列 1: MAQVQLQESG, GGSVQDGGSL, R LSCAASGYA, YDTYYMGWFR, QAPGKEREWV, AGITSLVSGV, AYYKYY TDSV, KGRFTIFRDD, DKNTVDLQM , SLKPEDTAIY, YCAASRSGLR, A

RLLRPELYE, YWGQGTQVTV, SS。

[0073] 含有 129个氨基酸的 VHH-ocVEGF序歹 lj2: MAQVQLQESG, GGSVQAGGSL, R

LSCVASGDT, YSSACMGWFR, QAPGKEREGV, ATICTSTSMR, TRYYADA

VKA, RFTISQDNAK, NTVYLQMNSL, KPEDIAMYYC, ATGHTVGSSW, R

DPGAWRYWG, QGTQVTVSS。

[0074] 含有 138个氨基酸的 VHH-ocEGFR序列 1 : QVQLQESGGG, LVQPGGSLRL, SC

AASGRTFS , SYAMGWFRQA, PGKQREFVAA, IRWSGGYTYY, TDSVKGR

FTI, SRDNAKTTVY, LQMNSLKPED, TAVYYCAATY, LSSDYSRYAL, PQ

RPLDYDYW, GQGTQVTVSS , LEHHHHHH。

[0075] 以上非人源化的纳米抗体 VHH序列， 可将其天然存在的 VHH序列结构域的氨 基酸序列进行人源化改造， 即可将其天然存在的 VHH序列结构域的氨基酸序列 中的一个以上氨基酸残基替换为常规人 VH序列结构域相应位置处存在的氨基酸 残基。