Domaine technique

L’invention concerne une population de cellules stromales néonatales (CSN), industrialisable, exprimant faiblement le complexe majeur d’histocompatibilité de type I (dites CMH-I low ou CMH-I ^L ) et optionnellement fortement le CD90 (dites CD90 high ou CD90 ^h ), une composition comprenant ladite population de CSN CMH-I ^L et optionnellement CD90 ^H et le procédé d’obtention de cette composition à partir de tissus néonataux. En particulier, l’invention concerne l’utilisation avantageuse de cette population de cellules en médecine régénérative, vétérinaire ou humaine, plus précisément comme traitement de l’arthrose et de maladies inflammatoires chroniques et plus généralement pour le traitement de lésions tissulaires, de maladies dégénératives, de maladies auto-immunes, de maladies infectieuses avec ou sans composante inflammatoire ou encore dans le rejet de greffe et les maladies tumorales. L’invention concerne également une composition pharmaceutique prête à l’emploi comprenant une telle population de CSN.

Contexte

Des cellules stromales mésenchymateuses (CSM) ont été isolées pour la première fois dans la moelle osseuse ; toutefois leur fréquence est assez faible dans ce tissu et décline avec l’âge (0.01% des cellules mononuclées totales chez l’adulte) (Bruder et al., 1997). Des cellules présentant des caractéristiques similaires ont été par la suite identifiées dans la fraction vasculaire stromale du tissu adipeux en proportion plus importante. Les CSM sont caractérisées par l’expression d’un panel de marqueurs de surface CD105, CD73, CD90 et n’expriment pas CD45, CD34, CD14 ou CDl lb, CD79alpha ou CD19 et HLA-DR ( Dominici , 2006). Par ailleurs, les CSM doivent être capables de se différencier dans les lignages adipogénique, ostéogénique, chondrogénique in vitro, en utilisant des milieux de différenciation adaptés. Dans le cadre d’une utilisation thérapeutique, les CSM sont habituellement isolées à partir d’un tissu adulte (moelle osseuse, tissu adipeux) prélevé chez un patient, et réinjectées au patient lui-même suite à une phase d’amplification en laboratoire. Un délai est donc nécessaire pour administrer la thérapie au patient.

Les populations de CSM isolées de manière conventionnelle à partir de plusieurs échantillons provenant d’une même source tissulaire mais de sujets différents, sont hétérogènes entre elles (hétérogénéité inter-population) du point de vue des marqueurs cellulaires. De plus, il est également considéré qu’au sein d’une population cellulaire provenant d’un même échantillon, plusieurs phénotypes de CSM coexistent (hétérogénéité intra-population). Cela implique un manque de reproductibilité dans le cadre de leur industrialisation et de l’efficacité clinique (Phinney, 2012). En effet, le phénotype cellulaire influe les propriétés et caractéristiques biologiques. Cette hétérogénéité inter- et intra-population est notamment constaté pour les marqueurs membranaires CMH-I et CD90 présents chez les CSM. Plusieurs études montrent des variations de l’expression de ces marqueurs en fonction des sources tissulaires, des procédés d’isolement ou d’amplification.

Jacobs et al., (2013) mentionnent des cellules progénitrices adultes humaines multipotentes isolées de moelle osseuse, possédant une faible expression du CMH-I et une forte expression du CD90, capables notamment de se différencier en ostéoblastes et en chondrocytes.

Tessier et al, (2015) et Davies et al, (W02004/072273) ont décrit des CSM néonatales exprimant faiblement le CMH-I et exprimant le CD9G, néanmoins les travaux de ces équipes montrent à la fois une forte fluctuation de l’expression du CMH-I parmi les souches isolées durant du procédé de cryoconservation et d’amplification (Lepage et al, 2019) (Sarugaser, et al, 2005). Portmann-Lanz et al, (2006) ont décrit des CSM isolées de membranes fœtales et de tissus placentaires humains et montrent une importante variabilité dans l’expression du CD90 et du CMH-I chez ces CSM.

Ces différents travaux exploitent de manière descriptive l’expression du CMH-I sans pour autant identifier les effets de ces différences d’expression sur les propriétés biologiques des CSM. La prise en compte de la fluctuation de ces deux marqueurs, CMH-I et CD90, et les caractéristiques fonctionnelles associées des CSM n’ont pas été investiguées.

Certaines sources tissulaires comme le placenta montrent de forts différentiels d’expression de ces marqueurs, limitant ainsi la reproductibilité d’une stratégie d’industrialisation et d’application clinique.

Par ailleurs, il est à noter qu’une importante contrainte technique réside dans les méthodes d’analyse d’expression du CMH-I et/ou du CD90 dans ces études. En effet, l’ensemble de ces travaux définissent leurs cellules comme étant positives ou négatives pour ces marqueurs. Cette notion de positivité ou négativité impose la détermination d’un seuil dont la pertinence est dépendante de nombreux paramètres techniques et biologiques. Cela implique entre autres, des limites d’analyses pour les populations de CSM hétérogènes et/ou pour les marqueurs faiblement exprimés.

Aucune des caractéristiques des cellules décrites dans ces documents ne permet d’envisager une culture à grande échelle reproductible et donc une industrialisation de la production cellulaire, en particulier pour une utilisation thérapeutique de ces cellules.

Objectifs

Un objectif est de fournir une population de cellules destinée à la thérapie cellulaire, possédant une bonne capacité de prolifération pour permettre sa production à échelle industrielle et ce de façon reproductible. Un autre objectif est de fournir une population de cellules destinée à la thérapie cellulaire, possédant des capacités à se différencier dans d’autres types cellulaires en particulier en chondrocytes tout en limitant le risque de formation de tissu ectopique. Un autre objectif est de fournir des cellules capables d’interagir avec les cellules du système immunitaire et réguler leur activité. Un autre objectif est de fournir de nouveaux moyens de traitements efficaces des lésions tissulaires, de maladies dégénératives, de maladies auto-immunes, de maladies à composante inflammatoire, de maladies infectieuses ou encore dans le rejet de greffe et les maladies tumorales, en particulier chez le mammifère non-humain, notamment le chien, le cheval ou le chat, ou chez l’Homme.

Encore un autre objectif consiste à fournir un procédé d’obtention de la population cellulaire répondant aux critères recherchés, à partir d’échantillons prélevés de manière non invasive pour permettre une industrialisation de la production et ce de manière reproductible.

Les Inventeurs ont découvert de manière surprenante que les tissus néonataux comprenaient une sous-population de CSN de phénotype CMH-I ^L et optionnellement CD90 ^H possédant un fort potentiel de prolifération et permettant ainsi leur industrialisation et leur utilisation avantageuse en thérapie cellulaire notamment pour le traitement de lésions tissulaires et de maladies dégénératives en médecine vétérinaire ou humaine.

L’utilisation de ces cellules est d’autant plus justifiée pour le traitement des pathologies articulaires, aux vues de leur fort potentiel de différenciation chondrogénique, de leur faible potentiel de différenciation ostéogénique et de leur capacité d’immunomodulation. D’autre part, la sous expression du CMH-I parmi ces cellules pourrait induire une réponse immunitaire limitée vis-à-vis de ces cellules, par rapport à celle induite vis-à-vis de cellules exprimant fortement le CMH-I.

Les Inventeurs ont également réussi à surmonter la forte hétérogénéité inter- et intra- population existant dans le placenta pour fournir une population homogène de CSN placentaires CMH-l ^L et optionnellement CD90 ^H possédant un fort potentiel de prolifération et permettant ainsi leur industrialisation et leur utilisation avantageuse en thérapie cellulaire.

De plus, les propriétés biologiques des CSN isolées par les Inventeurs restent stables durant des étapes de cryoconservation/décongélation.

Description détaillée Population de CNS

Un premier objet de la présente divulgation porte sur une population de cellules stromales néonatales (CSN), comprenant des cellules stromales néonatales de phénotype CMH-I ^L , et optionnellement de phénotype CD90 ^H . Les Inventeurs ont découvert que ces cellules isolées d’un échantillon biologique néonatal, possédaient une forte capacité de multiplication, leur conférant ainsi un fort potentiel d’industrialisation et un fort potentiel thérapeutique.

Le CMH-I correspond au complexe majeur d’histocompatibilité de classe 1, exprimé de façon quasi ubiquitaire au sein de l’organisme.

Le CMH-I également appelé HLA-I (« human leukocyte antigen class I ») chez l’homme, est issu de l’expression d’une famille de gènes appelés gènes HLA. Parmi ces gènes nous pouvons citer le HLA- A, le HLA-B et le HLA-C qui codent pour les formes classiques de HLA-I. Chez le chien, le CMH est également appelé DLA (Dog Leukocyte Antigen), chez le cheval, on parle de ELA (Equine Leukocyte Antigen), et chez le chat, on parle de FLA (Feline Leukocyte Antigen).

Le CD90 correspond à la protéine membranaire « Thy-l Cell Surface Antigen » et est exprimé par une large majorité des cellules du stroma. Par « phénotype CMH-I ^L », on entend que les CSN ont une très faible expression, ou une absence d’expression de CMH-I. Par « phénotype CD90 ^H », on entend que les CSN ont une expression forte de l’antigène de surface CD90.

Les cellules selon la présente divulgation sont naturellement de phénotype CMH-I faible (CMH-I ^l ) et optionnellement CD90 fort (CD90 ^H ), c’est-à-dire que l’expression faible de CMH-I et l’expression forte de CD90 n’est pas un phénotype résultant de modification génétique sur la population de cellules.

Dans un mode de réalisation particulier, la population de CSN comprend des cellules stromales néonatales de phénotype CMH-I ^L et de phénotype CD90 ^H (noté CMH- I ^L /CD90 ^h ).

L’expression de ces deux marqueurs au sein d’une population cellulaire peut être évaluée par la technique de cytométrie en flux.

Une population cellulaire peut être qualifiée d’homogène, lorsqu’une population de CSN (isolée d’une unique source donnée) est homogène d’un point de vue de l’expression CMH-I et CD90 (absence d’hétérogénéité intra-population), c’est-à-dire que les cellules ont toutes un taux d’expression similaire du CMH-I et du CD90, et donc présentent toutes le même phénotype vis-à-vis de l’expression des marqueurs CMH-I et CD90 (Figure 12). Une population cellulaire est qualifiée d’hétérogène, lorsqu’une population de CSN (isolée d’une unique source donnée) est composée de différentes sous-populations exprimant de façon différente le CMH-I et/ou le CD90. On parle d’hétérogénéité intra- population.

Dans le cas d’une population homogène, l’analyse de l’expression des marqueurs CMH-I et CD90 peut être réalisée en cytométrie en flux par une stratégie dite de simple marquage, c’est-à-dire que le marquage de chacun des marqueurs est réalisé de manière indépendante dans 2 tubes séparés.

Dans le cas d’une population hétérogène, l’analyse de l’expression des marqueurs CMH-I et CD90 peut être réalisée en cytométrie en flux par un double marquage, c’est-à-dire un marquage simultané des deux marqueurs dans un unique tube pour une même population cellulaire afin de bien discriminer les sous-populations. Le double marquage peut également être utilisé aussi dans le cas d’une population homogène. Lorsque l’on considère une population de CSN comprenant des cellules de phénotype d’intérêt CMH-I ^L /CD90 ^h , ladite population est considérée comme hétérogène lorsque ladite population de CSN comprend entre 10% et 90% de cellules de phénotype CMH- I ^L /CD90 ^H

Lorsque l’on considère une population de CSN comprenant des cellules de phénotype d’intérêt CMH-I ^L /CD90 ^h , ladite population est considérée comme homogène lorsque ladite population de CSN comprend plus de 90% de cellules de phénotype CMH-I ^L /CD90 ^H OU moins de 10% de cellules de phénotype CMH-I ^H /CD90 ^l .

Le niveau d’expression d’un marqueur (faible ou fort ou absence d’expression) peut être apprécié par une technique d’analyse par cytométrie en flux correctement mise au point par l’homme de l’art. La notion de faible ou forte expression implique une notion de seuil de discrimination permettant de correctement discerner cette population des populations possédant à l’inverse une forte ou une faible expression dudit marqueur d’un point de vu analytique. La méthodologie d’analyse d’expression d’un marqueur est dépendante de la stratégie de marquage du marqueur utilisée. Par exemple, l’utilisation de fluorochrome avec des rendements de fluorescence différents n’aura pas la même capacité de détection. Le recours à des stratégies de marquage avec des systèmes d’amplification de signal (biotine-avidine par exemple) influera également sur les capacités de détection de l’anticorps d’intérêt. Il est donc impératif de définir des seuils de positivité/négativité adéquats en fonction de la stratégie utilisée.

L’expression du CMH-I en particulier, chez les CSN est relativement faible par rapport à d’autres types cellulaires comme les fîbroblastes ou les cellules mononuclées sanguines périphériques (PBMC). Les inventeurs ont donc développé une stratégie de marquage du CMH-l assez sensible pour détecter de faibles différences d’expression de ce marqueur chez les CSN.

Les résultats des figures 12 et 14 montrent que l’analyse du CMH-I et du CD90 par simple marquage peut se montrer limitante dans le cas d’hétérogénéité intra-population. L’analyse de moyennes de fluorescence pour des populations hétérogènes ne permet pas d’établir avec précision si une population totale est de phénotype CMH-I ^L /CD90 ^H OU CMH- I ^H /CD90 ^l . La méthodologie de double marquage apporte ainsi une meilleure résolution dans le cadre de la caractérisation des populations de CSN montrant une forte hétérogénéité intra-population. Double marquage des marqueurs CMH- et CD90

Un exemple de marquage simultané (également dit double-marquage ou co-marquage immunophénotypique) du CMH-I et du CD90 au sein d’une même population de CSN, peut être réalisé en utilisant :

- pour le marquage du CMH-I, un anticorps primaire de souris anti-CMH-I IgG2a, tel que l’anticorps primaire anti-CMH-I DG-BOV2001/DG-H58A IgG2a (Monoclonal Antibody Center Washington State University), révélé avec un anticorps secondaire de chèvre F(ab')2 anti-IgG secondaire de souris couplé à l’allophycocyanine (APC), et

- pour le marquage du CD90, un anticorps monoclonal anti-CD90 couplé au phycoérythrine (PE), tel que l’anticorps monoclonal de rat anti-CD90/Thyl Antibody YKIX337.217 (PE).

Après marquage, la fluorescence des fluorochromes APC et PE est analysée. Afin de discerner les sous populations de CSN, une représentation 2D de la fluorescence APC et PE est réalisée. Les résultats sont comparés à ceux obtenus avec l’utilisation des isotypes couplés aux fluorochromes respectifs décrits précédemment.

Une population ou sous population de CSN est qualifiée CMH-I ^L /CD90 ^H si le ratio des moyennes de d’intensité de fluorescence (MFI) entre le CMH-I et son isotype contrôle (également appelé MFI relative ou rMFI) est inférieur à un seuil de 20, plus particulièrement 15, plus particulièrement 10 et si le rMFI entre le marqueur CD90 et son isotype contrôle est supérieur à 15, plus particulièrement 20.

Une population ou sous population de CSN est qualifiée CMH-I ^H /CD90 ^L si le ratio des moyennes de d’intensité de fluorescence (MFI) entre le CMH-I et son isotype contrôle est supérieur à 20, plus particulièrement 15, plus particulièrement 10 et si le rMFI entre le marqueur CD90 et son isotype contrôle est inférieur à 15, plus particulièrement 20.

Avec le double-marquage, la présence de différents profils de sous-population de CSN au regard de l’expression des marqueurs CMH-I/CD90 (CMH-I ^L , CMH-I ^H et CD90 ^H , CD90 ^L ) est mise en évidence, au sein d’une même population cellulaire provenant d’un même échantillon (Figure 12). Ces différents phénotypes dans l’expression des marqueurs CMH- I/CD90 impliquent des différences biologiques entre les différentes sous-populations mises en évidence.

Une analyse de l’expression des deux marqueurs CMH-I et CD90 peut être réalisée pour plusieurs populations de CSN issues de sources définies et isolées selon le même protocole expérimental. Les inventeurs ont confirmé par leur méthode l’existence d’une hétérogénéité inter-population vis-à-vis de l’expression de ces deux marqueurs parmi les populations de CSN provenant de tissus néonataux de différentes natures (placenta, cordon ombilical, sang de cordon ombilical) (Figure 13).

Simple marquage des marqueurs CMH- et CD90

De manière alternative, un simple marquage de CMH-I et CD90 peut être réalisé.

Un exemple de simple marquage du CMH-I au sein d’une population de CSN, pour une analyse cytométrique, peut être réalisé en utilisant l’anticorps primaire anti-CMH-I DG- BOV2001/DG-H58A IgG2a (Monoclonal Antibody Center Washington State University) et l’anticorps primaire isotype contrôle Mouse-COL2002/COLIS205C IgG2a (Monoclonal Antibody Center Washington State University). Ces anticorps non couplés à un fluorochrome sont utilisés conjointement à l’utilisation d’un anticorps secondaire de lapin F(ab')2 anti souris IgG STAR12A (AbSerotec) marqué à la phycoérythrine (PE). Cette méthode d’analyse cytométrique est décrite plus en détail dans l’Exemple B. 2).

Dans ce mode de réalisation du simple marquage, une population de CSN est considérée comme étant de phénotype CMH-I faible (CMH-I ^L ), si le rapport entre les valeurs d’intensité de fluorescence moyenne (MFI, mean fluorescence intensity) telles que mesurées en cytométrie de flux, des cellules marquées par un anticorps spécifique d’un épitope du CMH-I par rapport aux valeurs de MFI des cellules marquées par l’isotype contrôle est inférieur à 3, en particulier inférieur à 2,5, en particulier inférieur à 2, plus particulièrement inférieur à 1.96.

Inversement, une population de CSN est considérée de phénotype CMH-l fort (CMH-I ^h ), selon la même méthode, si le rapport entre les valeurs de MFI, telles que mesurées en cytométrie de flux, des cellules marquées par un anticorps spécifique d’un épitope du CMH-l par rapport aux valeurs de MFI des cellules marquées par l’isotype contrôle est supérieur à 1.96, en particulier supérieur à 2, en particulier supérieur à 2.5, plus particulièrement supérieur à 3.

Dans un autre mode de réalisation, le simple marquage du CMH-I au sein d’une population de CSN, pour une analyse cytométrique, peut être réalisé en utilisant l’anticorps primaire anti-CMH-I DG-BOV2001/DG-H58A IgG2a (Monoclonal Antibody Center Washington State University) et l’anticorps primaire isotype contrôle Mouse-COL2002/COLIS205C IgG2a (Monoclonal Antibody Center Washington State University). Ces anticorps non couplés à un fluorochrome sont utilisés conjointement à l’utilisation d’un anticorps secondaire chèvre F(ab')2 anti souris IgG secondaire (eBio science) couplé à l’allophycocyanine (APC). Cette méthode d’analyse cytométrique est décrite plus en détail dans la partie l’Exemple B. 2).

Dans ce mode de réalisation du simple marquage, une population de CSN est considérée comme étant de phénotype CMH-I ^L , si le rapport entre les valeurs d’intensité de fluorescence moyenne (MFI, mean fluorescence intensity) telles que mesurées en cytométrie de flux, des cellules marquées par un anticorps spécifique d’un épitope du CMH-I par rapport aux valeurs de MFI des cellules marquées par G isotype contrôle est inférieur à 12, en particulier inférieur à 10, plus particulièrement inférieur à 9.

Inversement, une population de CSN est considérée CMH-l ^H , selon cette méthode, si le rapport entre les valeurs de MFI, telles que mesurées en cytométrie de flux, des cellules marquées par un anticorps spécifique d’un épitope du CMH-l par rapport aux valeurs de MFI des cellules marquées par l’isotype contrôle est supérieur à 9, en particulier supérieur à 10, plus particulièrement supérieur à 12.

Dans un autre mode de réalisation du simple marquage, une population de CSN est considérée comme étant de phénotype CMH-I ^L , si le rapport entre les valeurs d’intensité de fluorescence moyenne (MFI, mean fluorescence intensity) telles que mesurées en cytométrie de flux, des cellules marquées par un anticorps spécifique d’un épitope du CMH-I par rapport aux valeurs de MFI des cellules marquées par G isotype contrôle est inférieur à 20, en particulier inférieur à 15, plus particulièrement inférieur à 10.

Fa détermination de ces seuils est expliqué dans l’Exemple A, partie 2) e) et en Figure 3. Inversement, une population de CSN est considérée comme étant de phénotype CMH-I ^h , si le rapport entre les valeurs d’intensité de fluorescence moyenne (MFI, mean fluorescence intensity) telles que mesurées en cytométrie de flux, des cellules marquées par un anticorps spécifique d’un épitope du CMH-I par rapport aux valeurs de MFI des cellules marquées par l’isotype contrôle est supérieure 20, en particulier supérieur à 15, plus particulièrement supérieur à 10.

Outre, la méthode basée sur la cytométrie en flux, l’analyse du phénotype CMH-I peut également être confirmée au niveau protéique et/ou transcriptionnel.

Au niveau protéique l’expression du CMH-I, quelle que soit l’espèce d’intérêt, peut être étudiée par G utilisation d’anticorps ou fragments d’anticorps (monoclonaux ou polyclonaux) spécifiquement dirigés contre un ou plusieurs épitopes du HLA- A, B, C, ou leurs homologues selon les espèces. Les techniques associées à ces anticorps comprennent entre autre l’analyse cytométrique, le Westem-blot, le test ELISA, l’immunofluorescence et/ou l’immunohistochimie. Plus généralement, des technologies impliquant l’interaction entre le CMH-I et une protéine marquée, tels qu’un inhibiteur, peuvent être utilisées comme outils d’analyse. D’autres technologies utilisant des oligonucléotides marqués par une sonde peuvent servir à évaluer cette expression tels que P utilisation d’aptamères, sondes ARN et/ou sondes ADN.

Au niveau transcriptionnel, l’analyse de l’expression des différents gènes peut être effectuée par des techniques de PCR en temps final, RTqPCR, PCR digitales et/ou RNA microarray. Il est également possible de mesurer l’expression transcriptionnelle d’un composant des molécules du CMH, comme peut l’être à titre d’exemple la microglobuline beta 2 ( B2M ).

Concernant le simple marquage du CD90 pour une analyse en cytométrie en flux, celui-ci peut par exemple être réalisé en utilisant un anticorps anti-CD90 couplé au fluorochrome PE, tel que l’anticorps CD90 Antibody YKIX337.217 (Bio Rad) par rapport au signal obtenu avec un contrôle isotypique couplé au même fluorochrome Mouse (BALB/c) IgGl,K MOPC-2l(AbSerotec). Dans ce mode de réalisation, Une population de CSN est considérée comme étant de phénotype CD90 fort ou dite CD90 fort (CD90 ^H ), si le rapport entre les valeurs d’intensité de fluorescence moyenne (MFI, mean fluorescence intensity) telles que mesurées en cytométrie de flux, des cellules marquées par un anticorps spécifique d’un épitope du CD90 par rapport aux valeurs de MFI des cellules marquées par l’isotype contrôle est supérieur à 15, plus particulièrement supérieur à 20. (Exemple B partie 2)). Inversement, une population de CSN est considérée comme étant de phénotype CD90 ^L , si le rapport entre les valeurs d’intensité de fluorescence moyenne (MFI, mean fluorescence intensity) telles que mesurées en cytométrie de flux, des cellules marquées par un anticorps spécifique d’un épitope du CMH-I par rapport aux valeurs de MFI des cellules marquées par l’isotype contrôle est inférieur à 15, plus particulièrement inférieur à 20. Outre, la méthode basée sur la cytométrie en flux, l’analyse du phénotype CD90 peut également être confirmée au niveau protéique et/ou transcriptionnel en utilisant des anticorps spécifiquement dirigés contre un ou plusieurs épitopes du CD90 et/ou au niveau transcriptionnel par l’analyse du gène Thyl codant pour CD90 par des techniques de PCR en temps final, RT-qPCR, PCR digitales et/ou RNA microarray.

Détermination du seuil

Que ce soit par simple ou double marquage, l’évaluation du niveau d’expression du CMH-I et du CD90 nécessite la détermination d’un seuil. Par « détermination du seuil », on entend la méthodologie que peut appliquer l’homme de l’art afin de mettre en évidence l’ensemble des expressions différentielles du CMH-I et/ou du CD90 parmi les populations de cellules et plus particulièrement des CSN et d’en définir une limite d’expression relative acceptable. Ce seuil a pour rôle d’exclure les CSN surexprimant le CMH-I et/ou sous exprimant le CD90 et d’inclure celles sous exprimant le CMH-I et/ou sur exprimant le CD90 dans la démarche d’industrialisation.

La majorité des travaux sur les CSM décrits dans l’art antérieur, exploite l’expression des marqueurs membranaires par le biais de la notion de positivité ou négativité d’une cellule pour un marqueur donné (soit l’absence ou la présence de ce marqueur). Ces seuils méthodologiques sont déterminés à partir de la population de CSN dont les épitopes aspécifiques ont été saturés et marquées par des anticorps isotypiques ne ciblant aucun épitope de façon spécifique (population isotypique). Les seuils de positivité/négativité sont fixés de manière générale entre 2 et 3 écart-types de la population isotypique dont la distribution statistique est de nature gaussienne. C’est à dire un seuil placé de façon à ce que 95,45%-99,73 % de la population isotypique correspondent à la population négative des cellules marquées pour le marqueur d’intérêt. Pour les marqueurs protéiques hautement spécifiques d’un type cellulaire particulier, ce seuil joue un rôle dans l’interprétation des données.

Or, dans le cas du CMH-I et du CD90, ces deux protéines sont exprimées par une grande majorité des cellules du stroma et ne sont pas spécifiques des CSM ou des CSN. Il existe par ailleurs une fluctuation d’expression plus ou moins importante entre les différents types cellulaires, y compris parmi les CSM et les CSN. Ainsi, le fait de placer les seuils de positivité/négativité entre 2 ou 3 écart-types de la population isotypique peut induire un important biais méthodologique pour de faibles expressions, telles que pour l’analyse des CSN décrites dans la présente invention.

Ainsi, malgré la possibilité technique d’évaluer la positivité ou la négativité des cellules pour le CMH-I et/ou le CD90, il est possible que le critère d’appartenance à ces catégories ne représente pas une réalité biologique. En effet, le caractère CMH-I ^L et/ou CD90 ^L ne reflète qu’une faible expression de ce marqueur par les cellules et sous-entend une positivité relative pour toutes les cellules (Figure 1E et Figure 14).

Idéalement et dans le cadre d’une stratégie de marquage pour un panel d’anticorps donné et pour l’analyse de CMH-I et/ou du CD90, un seuil précis peut être déterminé par l’homme du métier grâce à l’analyse d’un nombre statistiquement suffisant, ou échantillon représentatif, de population cellulaire appartenant aux deux catégories : sous exprimant le CMH-I et surexprimant le CMH-I à titre d’exemple qui, respectivement, permettent une industrialisation des CSN ou ne le permettent pas.

Le caractère d’industrialisation, qui est couplé à l’expression faible du CMH-I et optionnellement du phénotype CMH-I ^L /CD90 ^H pour discerner les deux populations de CSN, peut être remplacé par un autre caractère biologique dans la mesure où ce dernier peut être corrélé avec l’expression du CMH-I et ou du CD90 (ex : le caractère de différenciation chondrogénique).

L’obtention, par l’homme du métier, de ce nombre suffisamment important de populations de CSN, ou échantillon représentatif, d’un point de vue statistique dans les deux catégories de CSN, permet de déterminer une limite de discrimination entre les deux populations. Dans le cadre de l’invention, cette limite de discrimination se traduit par la détermination d’un seuil d’expression relative du CMH-I et/ou du CD90 et plus précisément dans le cadre de l’analyse cytométrique par un seuil de rMFI. Par « limite de discrimination », on entend le seuil et les fluctuations de ce seuil permettant sans ambiguïté de discriminer les CSN sur-exprimant le CMH-I ou le CD90 et sous-exprimant le CMH-I ou le CD90. Cette limite de discrimination doit permettre de valider la forte expression pour le CMH-I ou la faible expression pour le CD90 d’une population de CSN non industrialisable avec une haute sensibilité, soit de garantir une interprétation élevée comme vrai positif Par ailleurs, cette limite de discrimination doit permettre de valider la faible expression pour le CMH-I ou une forte expression pour le CD90 d’une population de CSN industrialisable avec une haute spécificité, soit de garantir une interprétation faible comme faux négatif Dans la mesure où le nombre de populations de CSN analysées est suffisamment important, l’homme de l’art peut affiner cette limite de discrimination en s’appuyant sur la courbe de la fonction d’efficacité du récepteur (courbe ROC).

L’analyse du CMH-I a plusieurs répercussions d’un point de vue industriel car son expression est d’une part spécifique de l’origine tissulaire mais également dépendante du microenvironnement des CSN in vivo et/ou in vitro.

D’un point de vue technique, cette limite de discrimination, ou seuil, peut servir d’une part à exclure de l’industrialisation les cellules non industrialisables et d’autre part :

• Les CSN ayant déjà subi une stimulation à un environnement inflammatoire in vivo ou ex vivo ;

• Les CSN contaminées par une population de CSN ne répondant pas aux critères de sélection ;

• Les CSN contaminées par une population d’un autre type cellulaire exprimant des taux élevés de CMH-I (par exemple, les fibroblastes).

Concernant le CD90 l’expression de ce dernier est dépendant de l’état de différenciation des cellules et sert d’indicateur pour un autre versant biologique que ceux renseignés par l’expression du CMH-I (Sibov et al., 2012). Il est possible pour l’homme de l’art, d’établir une méthode d’analyse similaire à celle décrite pour le CMH-I.

Il est de ce fait avantageux d’utiliser une stratégie de marquage immunologique permettant d’apprécier le panel d’expression de ces deux marqueurs.

Par la notion de « panel » nous entendons, par ordre de grandeurs, à minima 2 catégories d’expressions observables dans différents types cellulaires et phénotypes de CSN analysés dans nos expériences pour le CMH-I et pour le CD90 (Table 1). Table 1 : Catégories d’expressions observables des marqueurs CMH-I et CD90 dans des CSN industrialisables, des CSN non industrialisables, des CSN stimulées par IFN-g et des Fibroblastes.

La limite de discrimination peut varier en fonction de la technique d’analyse utilisée ou les paramétrages des outils d’analyse utilisés. A titre d’exemple, dans le cas d’une analyse cytométrique par fluorescence, il est possible d’augmenter le signal d’acquisition lors de l’analyse cytométrique et de faire varier les seuils de positivité/négativité par :

· une augmentation de la sensibilité des photomultiplicateurs,

• l’utilisation d’anticorps secondaires,

• l’utilisation d’anticorps primaires et/ou secondaires polyclonaux et/ou cocktails d’anticorps monoclonaux et/ou possédant un meilleur titre pour l’épitope d’intérêt,

• un anticorps avec un fort ratio protéine/fluorochrome,

· un anticorps couplé à un fluorochrome de forte énergie d’émission.

Ainsi, afin de permettre la sélection des populations d’intérêt, l’homme du métier peut déterminer finement la limite de discrimination en fonction de trois aspects suivants : la stratégie d’analyse donnée, la stratégie de marquage donnée et/ou le paramétrage de l’outil d’analyse donné. Dans le cadre de la stratégie d’analyse utilisée par les inventeurs, la méthodologie est détaillée dans le matériel et méthode et dans les figures associées à ce document.

La présente invention concerne donc une population de CSN comprenant des CSN de phénotype CMH-I ^L , et optionnellement de phénotype CD90 ^H .

Par « population de cellules », on entend un ensemble de cellules comprenant un ou plusieurs types cellulaires différents, par exemple un mélange de cellules à différents stades de différenciation, comprenant des cellules ayant une même origine tissulaire ou issues de différentes origines tissulaires. Selon un mode de réalisation, la population de CSN provient d’un échantillon tissulaire néonatal, en particulier d’un ou plusieurs placentas et/ou d’un ou plusieurs cordons ombilicaux, et/ou d’une ou plusieurs membranes amniotiques, ou d’un échantillon de fluide néonatal, en particulier le sang d’un ou plusieurs cordons ombilicaux, ou le liquide amniotique d’un ou plusieurs fluides amniotiques.

L’avantage des tissus néonataux permet de disposer d’un grand nombre de CSN CMH- I ^L /CD90 ^H à partir d’un échantillon.

Pour cela, les annexes extra embryonnaires (placenta, cordon ombilical, membrane amniotique) sont généralement prélevées de manière aseptique lors de césariennes ou de mises bas par voie naturelle chez des femelles gestantes, de préférence à terme. Par exemple, dès que le nouveau-né est sorti du sac amniotique et mis en sécurité, le tissu extra embryonnaire est immédiatement transféré dans une boite de transport contenant par exemple une solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco pour être acheminé en laboratoire. Le sang de cordon ombilical peut être quant à lui récupéré par ponction au niveau de la veine ombilicale, en particulier à l’aide d’une aiguille connectée à une poche de prélèvement sanguin ou un tube ou tout autre contenant.

Dans un autre exemple, le liquide amniotique peut être récupéré par ponction au travers de la membrane amniotique, en particulier à l’aide d’une aiguille connectée à une poche de prélèvement sanguin ou un tube ou tout autre contenant.

Ratio des CSN d’intérêt dans la population cellulaire et origine des CSN

Dans un mode de réalisation particulier, la population de CSN selon l’invention est caractérisée en ce que moins de 20% en nombre, en particulier moins de 15 %, plus particulièrement moins de 10% des cellules de ladite population sont CMH-I ^H et optionnellement caractérisée en ce que moins de 20% en nombre, en particulier moins de 15 %, plus particulièrement moins de 10% des cellules de ladite population sont CD90 ^L .

Dans un mode de réalisation particulier, la population de CSN selon l’invention est caractérisée en ce qu’elle comprend au moins 80% en nombre, en particulier au moins 85%, plus particulièrement au moins 90% de cellules de phénotype CMH-I ^L /CD90 ^h .

La population de CSN selon l’invention correspond donc soit à une population homogène de CSN de phénotype CMH-I ^L /CD90 ^h , c’est-à-dire une population comprenant entre 90 et 100% de CSN de phénotype CMH-I ^L /CD90 ^h , soit à une population hétérogène comprenant entre 80 et 90% de CSN de phénotype CMH-I ^L /CD90 ^H (Figure 13).

Dans un mode de réalisation particulier, les CSN proviennent d’un échantillon tissulaire néonatal, tel qu’un ou plusieurs placentas et/ou un ou plusieurs cordons ombilicaux, ou une ou plusieurs membranes amniotiques, ou un échantillon de fluide néonatal comme par exemple le liquide amniotique d’un ou plusieurs sacs amniotiques et en particulier le sang d’un ou plusieurs cordons ombilicaux.

Dans un mode de réalisation particulier, la population de cellules stromales néonatales, comprenant des cellules stromales néonatales de phénotype CMH-I ^L , et optionnellement de phénotype CD90 ^H , est une population de CSN issues d’un ou de plusieurs placentas.

Dans un mode de réalisation particulier, ladite population de CSN est une population de CSN de placenta et comprend au moins 80% en nombre, en particulier au moins 85%, plus particulièrement au moins 90% de cellules de phénotype CMH-I ^L /CD90 ^h .

Dans un mode de réalisation particulier, l’échantillon provient de tissus ou de fluides néonataux de mammifère, et en particulier du chien, du chat, du cheval ou de l’Homme. Dans un mode de réalisation plus particulier, l’échantillon néonatal provient du chien ou du chat.

Autres caractéristiques structurales des CSN d’intérêt

Les CSN peuvent en outre être caractérisées par le fait que moins de 10% des cellules expriment un ou plusieurs des marqueurs de surface suivants : CDl lb, CD14, CD31, CD34, CD45, ou, HLA-DR, dénommé également CMH-II.

Les CSN peuvent également être caractérisées par l’expression au niveau transcriptionnel de facteurs de croissance, tels que le facteur croissance de l’endothélium vasculaire de (VEGF), le facteur de croissance (HGF), le facteur de croissance kératinocyte (KGF), le facteur de croissance transformant de type b (TGF-b). Caractéristiques biologiques des CSN selon l’invention

Outre leurs propriétés structurales, les CSN selon la présente divulgation sont caractérisables par leurs caractéristiques biologiques.

En effet, les CSN selon l’invention peuvent être caractérisées par leur capacité de prolifération cellulaire.

Ainsi, dans un mode de réalisation spécifique, la population de CSN est caractérisée en ce qu’au moins 80% des cellules de ladite population de CSN possèdent une capacité de doublement cellulaire consécutif supérieur à 20 doublements cumulés.

Par « capacité de prolifération cellulaire », on entend qu’une population de CSN selon l’invention est capable de doubler en nombre, plus de 20 fois au total.

Pour évaluer le nombre de doublements, à chaque passage cellulaire, les cellules sont détachées de leur support, centrifugées puis comptabilisées, par exemple par la technique d’exclusion au bleu trypan à l’aide d’un compteur électronique. Le nombre de doublement à chaque passage cellulaire est calculé selon la formule suivante : Nb de doublements = LOG (Nf/Ni)/LOG(2) (Nf : nombre de cellules finales et Ni : nombre de cellules initiales). Le nombre total de doublements cellulaires est égal à la somme du nombre de doublements cumulés à chaque passage cellulaire.

Les cellules selon la présente divulgation sont industrialisables, c’est-à-dire que leur source d’origine peut fournir une grande quantité de cellules d’intérêt et rendent possible une amplification cellulaire in vitro à l’échelle industrielle. Selon un mode de réalisation, les CSN ont une capacité de prolifération supérieure à 20 doublements cellulaires cumulés durant au minimum 4 passages cellulaires.

Parmi différentes populations de CSN isolées d’une même source et plus particulièrement de placenta canin, les inventeurs ont montré qu’il existe une disparité de potentiel de prolifération, rendant difficilement industrialisable une partie de ces populations CSN (Ligure 15).

Les inventeurs ont identifié de manière totalement inattendue que le phénotype CMH- I ^L /CD90 ^H des CSN était lié à la capacité de prolifération des cellules, permettant à celles-ci de doubler un plus grand nombre de fois in vitro que les CSN de phénotype CMH- I ^H /CD90 ^L (Ligure 4) Cette capacité de doublements cellulaires permet de ce fait d’atteindre un nombre suffisant de cellules pour l’élaboration de préparations thérapeutiques et ainsi d’industrialiser la production de ces cellules pour une utilisation notamment en médecine vétérinaire ou humaine. Par ailleurs, cette capacité de doublement possède une limite, minimisant ainsi une dérive génétique des cellule et l’émergence d’un phénotype néoplasique. Cette caractéristique est un argument supplémentaire à l’utilisation de ces CSN en tant que produit de thérapie cellulaire ou tissulaire.

La population de cellules stromales néonatales peut également être caractérisée en ce qu’au moins 80% des cellules de ladite population de CSN possèdent :

une capacité d’adhérence sur support plastique ; et/ou

un potentiel de différenciation chondrogénique, et/ou

un potentiel immunomodulateur.

Dans un mode de réalisation spécifique, la population de cellules stromales néonatales est également caractérisée en ce qu’au moins 80% des cellules de ladite population de CSN présentent un potentiel de différenciation ostéogénique limité ou ne présentent pas de potentiel de différenciation ostéogénique.

Par « capacité d’adhérence sur support plastique », on entend que la population de CSN est caractérisée par sa propriété d’adhérence sur support plastique.

Par « potentiel de différenciation chondrogénique », on entend que les CSN ont la capacité de pouvoir se différencier en chondrocytes. Les expressions « différenciation chondrocytaire » et « différenciation en chondrocytes » peuvent également être utilisées de manière indifférente.

Cette capacité de différenciation en chondrocytes peut être évaluée par l’étude protéique et/ou transcriptionnelle des marqueurs spécifiques du cartilage tels que le Collagène de type II (COL2A1), SOX-9 (SOX9), l’aggrécane ( ACAN ), le cartilage Oligomeric Matrix Protein ( COMP ), le Collagène de type IX ( COL9A1 ), le collagène de type XI ( COL11A1 ), le collagène de type IIB ( COL2B ) après induction de la chondrogenèse. D’autre part, des propriétés visco-élastiques de la matrice extracellulaire, exprimée par les CSN différenciées, se rapprochent des propriétés visco-élastiques du cartilage. Ces propriétés visco-élastiques peuvent ainsi servir de caractéristique pour l’évaluation de la chondrogenèse.

Dans un mode de culture privilégié, pour induire la chondrogénèse, les CSN sont détachées de leur support par trypsination et utilisées pour former des micromasses par gravitation dans une goutte de milieu d’amplification comme par exemple le DMEM (lg/L de glucose) supplémenté avec 10% de S VF (vol :vol), 2mM de glutamine et 0 à 20 ng/ml de facteur de croissance fibroblastique (FGF2-P). Une micromasse de CSN se forme alors après 24h d’incubation, à la base de la goutte. Cette micromasse est récupérée et mise en présence d’un milieu de différenciation chondrocytaire composé de DMEM avec 4.5 g/L de glucose et additionné de TGF- b3 ou d’une combinaison TGF-pi/BMP-2, pendant 7 à 28 jours. A l’issue, une extraction ARN ou protéique est réalisée afin d’analyser l’expression de marqueurs spécifiques du lignage chondrogénique tels que le collagène de type II, l’aggrécane, les COMP, SOX9.

Les CSN CMH-I ^L /CD90 ^H présentent un potentiel de différentiation en chondrocyte accru par rapport aux CSN CMH-I ^H /CD90 ^L au regard de la taille des micromasses générées (voir Figures 5A, 5B, 5C et 5D) et/ou de l’expression de marqueurs chondrogéniques tels que COL2A1, SOX9, ainsi qu’au regard de l’expression d’une matrice extracellulaire sulfatée et composée de collagène de type II. Cette relation est en accord avec l’utilisation thérapeutique avantageuse des CSN selon la présente divulgation dans le contexte d’arthropathie dans la mesure où ces dernières peuvent participer à la réparation tissulaire du cartilage articulaire.

Les inventeurs ont ainsi mis en évidence que le phénotype CMH-I ^L /CD90 ^H des CSN selon la présente divulgation peut être corrélé avec une importante capacité de différenciation chondrogénique des cellules en comparaison avec des cellules de type CSM, issues de tissu adipeux, d’amnios ou encore de moelle osseuse, possédant également cette capacité chondrogénique.

Ainsi, dans un mode de réalisation particulier, la population de CSN CMH-I ^L /CD90 ^H selon l’invention, est caractérisée en ce qu’au moins 80% des cellules de ladite population de CSN possèdent un potentiel de différenciation chondrogénique. En particulier, ce potentiel de différenciation chondrogénique est apprécié par rapport à l’expression du gène Col2al, et est au moins 10 fois supérieur par rapport à une population de CSN CMH-I ^H /CD90 ^l .

Par « potentiel immunomodulateur », on entend la capacité d’immunomodulation des CSN.

Ce potentiel peut se caractériser par la capacité qu’ont les CSN à exprimer un ensemble de facteurs immunomodulateurs tels que PGE2, IL-6, IL- 10, TGL-b, IDO, iNOS, HGL, KGL, CCL2 et/ou TSG-6. En effet, en présence d’un contexte inflammatoire, les CSN peuvent modifier leur phénotype. Le contexte inflammatoire peut être mimé in vitro par stimulation des cellules par le biais de cytokines et/ou facteurs de croissance tels que l’ILN-g, IL-l, IL- 6 et/ou TNF-a. Une modification du phénotype des CSN se traduit par la capacité des CSN à modifier l’expression transcriptionnelle et/ou protéique de marqueurs intervenant dans l’immunomodulation. Parmi ces marqueurs nous pouvons citer PGE2, IL-6, IL- 10, TGF-b, IDO, iNOS, HGF, KGF, TSG-6, CCL2, CMH-I, CMH-II, HLA-E. Ainsi, le potentiel immunomodulateur peut par exemple être déterminé par une étude de l’expression de la prostaglandine (PGE2) sécrétée par les cellules en condition basale et après stimulation en contexte inflammatoire. Pour cela les cellules sont cultivées en milieu de prolifération (milieu avec sérum de veau fœtal) ou en milieu complémenté avec de l’interféron gamma, puis le PGE2 sécrété est mesuré par test Elisa (Figure 6).

Le potentiel immunomodulateur des CSN peut également se caractériser par l’effet antiprolifératif des CSN sur des cellules mononuclées sanguines périphériques (PBMC) traitées avec un agent mitogène tel que la phytohémagglutinine, la concanavalin A et/ou au lipopolysaccharides. L’immunomodulation des CSN peut également être évaluée par la capacité des CSN à inhiber la prolifération, la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires et/ou la différenciation des lymphocytes T, NK, Lymphocytes B, des monocytes et/ou macrophages.

Ainsi, le potentiel immunomodulateur des CSN peut également être déterminé par la capacité des CSN à inhiber la prolifération des lymphocytes in vitro. Pour cela des cellules mononuclées sanguines (PBMCs) préalablement incubées avec un colorant fluorescent, sont co-cultivées avec les CSN en proportion CSN/ PBMC 1 :l0 en présence d’un agent mitogène comme la concanavalin A. Après 4 jours de culture à 37°C, les cellules non adhérentes sont récupérées et marquées par un anticorps anti-CD3 (spécifique des lymphocytes T) couplé à un fluorochrome, puis analysées en cytométrie en flux pour évaluer le signal du colorant fluorescent au sein de la population CD3 positive. La comparaison du marquage avec celui réalisé dans un contrôle correspondant aux PBMCs cultivées en présence d’agent mitogène mais sans CSN (PBMC-ctrl), permet de définir un indice de prolifération de la population lymphocytaire. Avec un ratio (CSN+ PBMC 1 :10) / (PBMC-ctrl) inférieur ou égal à 0.5, les CSN sont considérées comme exerçant une activité antiproliférative significative (Figure 7 et Figure 8D).

Les inventeurs ont en effet mis en évidence que les CSN de phénotype CMH-I ^L /CD90 ^H selon la présente divulgation présente une bonne capacité d’immunomodulation.

Dans un mode de réalisation spécifique, la population de CSN selon la présente divulgation peut également être caractérisée en ce qu’au moins 80% des cellules de ladite population de CSN ne présentent pas de potentiel de différenciation ostéogénique. On parle également de faible potentiel de différenciation ostéogénique ou de faible potentiel d’ostéogenèse. Cette absence de potentiel de différenciation ostéogénique ou ce faible potentiel de différenciation ostéogénique peut être évalué par l’étude protéique et/ou transcriptionnelle des marqueurs spécifiques de l’os (ALPL, RUNX2...) ou par analyse des dépôts calciques après induction de l’ostéogenèse sous 7 à 15 jours. Cette induction ostéogénique peut être réalisée par culture des CSN en monocouche en présence d’un milieu de différenciation ostéogénique contenant un corticostéroïde, tel que le déxaméthasone (0.1-1mM), un agent réducteur tel que l’acide ascorbique 2-phosphate (entre 0 et 200pg/ml) et du b- glycérophosphate (0-50mM). La BMP-2 peut par exemple remplacer la dexaméthasone.

A l’issue du processus de différenciation, la présence de dépôts calciques dans la boite de culture est mise en évidence par coloration avec une solution de rouge Alizarine 1% (poids/volume) sous microscope. L’absence de dépôts révèle l’absence de potentiel de différenciation ostéogénique tandis que la présence de dépôts calciques colorés par un rouge intense montre la présence d’une différenciation ostéogénique.

Alternativement ou en complément, une étude protéique et/ou transcriptionnelle des marqueurs spécifiques de l’os (ALPL, RUNX2) est réalisée.

Il est à noter que les CSN CMH-I ^L /CD90 ^H présentent un potentiel de différenciation ostéogénique limité par rapport aux CSM CMH-I ^H /CD90 ^L au regard des marqueurs quantifiés (ALPL, RUNX2).

Les inventeurs ont pu mettre en évidence que le phénotype CMH-I ^L /CD90 ^H de CSN selon la présente divulgation est en relation avec une faible capacité de différenciation ostéogénique de ces cellules.

Cette caractéristique permet ainsi aux CSN d’être utilisées en thérapie cellulaire. En particulier, il s’agit de thérapie cellulaire pour le traitement d’arthropathie, dans la mesure où ces dernières limitent la génération de tissu ectopique calcifié au sein de l’articulation. Cette propriété est particulièrement importante pour les applications telles que l’arthrose, avec ou sans atteinte tissulaire.

Composition pharmaceutique et solution injectable

Un autre aspect de l’invention concerne une composition pharmaceutique comprenant une population de CSN telles que décrite précédemment. Ainsi, la présente invention porte également sur une composition pharmaceutique ou une solution injectable prête à l’emploi comprenant une population de cellules stromales néonatales CMH-I ^L , et optionnellement CD90 ^H telles que définies précédemment, et un véhicule pharmaceutiquement acceptable.

Typiquement, la composition pharmaceutique ou la solution injectable comporte une population de CSN de 1.10 ⁶ à 1.10 ⁸ cellules dans un volume de 0.1 ml à 15 ml, soit une concentration de 5.10 ⁴ à 1.10 ⁹ cellules/ml. En particulier, elle comprend de 1.10 ⁶ à 5.10 ⁷ cellules dans un volume de 0.1 ml à 15 ml, soit une concentration de 7.10 ⁴ à 5.10 ⁷ cellules/ml. En particulier, elle comprend de 2, 5.10 ⁶ à 1.10 ⁷ cellules pour un volume de 0.1 ml à 15 ml de composition, soit une concentration de 1,5.10 ⁵ et 1.10 ⁸ cellules/ml. En particulier, elle comprend de 1.10 ⁶ à 1.10 ⁷ cellules dans 0.5 à 2 ml, soit une concentration de 5.10 ⁵ à 2.10 ⁷ cellules/ml.

Typiquement, ladite composition ou solution injectable comprend entre 1.10 ⁶ et 1.10 ⁸ cellules, en particulier 1.10 ⁷ cellules.

Par « prête à l’emploi », on entend que la composition pharmaceutique ou solution injectable comprenant des CSN est prête à être injectée à l’individu. La remise en culture des cellules avant utilisation chez l’individu n’est pas nécessaire et les cellules n’ont pas besoin d’être lavées ou ressuspendues dans un milieu physiologique, et ceci même lorsqu’elles sont formulées avec un cryoprotecteur comme décrit ci-dessous. L’expression « prête à l’emploi » signifie que seule une étape de décongélation est nécessaire lorsque la composition ou solution injectable est sous forme congelée, avant une injection chez le sujet.

Cette composition pharmaceutique ou solution injectable pouvant être congelée, elle est ainsi mobilisable à tous moments. Cette dernière a l’avantage de rendre disponible dans les plus brefs délais le traitement tout en limitant l’intervention humaine nécessaire à son efficacité et en limitant le risque de contamination inhérent à chaque manipulation par un opérateur. Ainsi, il est possible de séparer le procédé d’obtention de la composition pharmaceutique de son utilisation clinique finale.

Typiquement, le véhicule pharmaceutiquement acceptable et/ou le conditionnement permet de maintenir les propriétés biologiques des CSN pendant un temps suffisant. Le véhicule peut être tous types de liquides, gels, polymère solides capables de contenir ces CSN sans détériorer leurs propriétés désirées, notamment une solution aqueuse saline, du sérum, du milieu de culture.

Le conditionnement peut être tous types de réceptacles, contenants, dispositifs médicaux capables d’isoler de manière aseptique les préparations pharmaceutiques de l’environnement extérieur et/ou de l’environnement de transport et/ou du manipulateur. En particulier, le conditionnement permet de maintenir l’intégrité et la formulation de la composition pharmaceutique et/ou de faciliter la distribution/transport de la composition pharmaceutique.

En particulier, le véhicule pharmaceutiquement acceptable peut être toute solution permettant la congélation et/ou la décongélation des cellules tout en limitant l’influence biologique de ces procédés sur les cellules comme l’induction de mort cellulaire, la différenciation, l’induction de la sénescence cellulaire, les chocs osmotiques, l’induction de porosité membranaire, la modification de la composition membranaire et/ou les changements phénotypiques.

Dans un mode de réalisation particulier, le véhicule pharmaceutiquement acceptable est une solution correspondant à du D-PBS (Dulbecco's phosphate-buffered saline), du DMEM (Dulbecco's Modifïed Eagle Medium), du MEM (Minimum Essential Media), une solution comprenant du sérum de veau fœtal (SVF), une solution comprenant du sérum animal, et/ou tout autre solution isotonique. Dans un mode de réalisation particulier, ladite solution comprend entre 0 et 20% de SVF, plus particulièrement entre 5 et 20%, encore plus particulièrement 10%. Dans un mode de réalisation particulier, ladite solution est exempte de produit d’origine animale.

Dans un mode de réalisation particulier, ledit véhicule pharmaceutiquement acceptable est une solution comprenant un cryoprotecteur. Dans la mesure où l’ensemble de la formulation de la solution est compatible avec une injection in vivo, la solution comprenant un cryoprotecteur peut être utilisée comme solution injectable pour les traitements concernés par la composition pharmaceutique décrite dans ladite invention.

Par cryoprotecteur, on entend tous composés permettant d’assurer la fonction de cryoconservation. Selon un mode de réalisation plus particulier, ledit cryoprotecteur est choisi parmi le glycerol, le Diméthylsulfoxyde (DMSO), le propylène glycol, les protéoglycanes, le tréhalose, la « Bovine sérum albumin » (BSA), la gélatine, du polyéthylène glycol (PEG), du polyacrylic-acide, du poly-L- lysine, de l’éthylène glycol ou une combinaison de plusieurs de ces cryoprotecteurs. Dans un mode de réalisation particulier, ladite solution comprend entre de 0,5 à 30 %, en particulier de 0,5 à 20%, en particulier de 2 à 10%, plus particulièrement 5% de cryoprotecteur.

Des solutions commerciales comprenant un cryoprotecteur utilisable dans la composition pharmaceutique sont des solutions synthétiques de cryoprotection pré-formulées du type StemAlpha, CryoStor® CS2, CS5 ou CS 10.

Dans un mode de réalisation particulier, ladite solution comprend de 0,5 à 30 % de glycérol, de 0,5 à 30 % de DMSO, de 0,5 à 30 % propylène glycol ou de 0,5 à 20% de poly-L-lysine. En particulier, ladite solution comprenant un cryoprotecteur est une solution comprenant de 2 à 10% de DMSO, plus particulièrement 5% de DMSO. En particulier, ladite solution comprenant un cryoprotecteur est une solution comprenant 2 à 20% de glycérol.

Dans un mode de réalisation particulier, un ou plusieurs adjuvants peuvent être ajoutés comme du chlorure d’ammonium, de lactate de Ringer ou du BSA.

Dans un mode de réalisation particulier, ladite solution comprenant un cryoprotecteur est une solution de DMEM comprenant du SVF, en particulier de 5 à 20% de SVF et plus particulièrement 10%.

Dans un mode de réalisation particulier, ladite solution comprenant un cryoprotecteur est exempt de produit d’origine animal et comprend de 1 à 90% de DMSO, plus particulièrement de 0,5 à 30 %, plus particulièrement de 2 à 10%, en particulier 5%.

Dans un autre mode de réalisation particulier, ladite solution comprenant un cryoprotecteur est une solution de DMEM comprenant du SVF, en particulier de 5 à 20% de SVF et plus particulièrement 10%, et de 2 à 20% de glycérol.

Dans un mode de réalisation particulier, la composition pharmaceutique ou solution injectable est caractérisée en ce qu’elle est sous forme congelée.

Fa composition pharmaceutique ou solution injectable peut être congelée avec l’utilisation d’un cryoprotecteur adéquat, capable de garantir l’intégrité et la formulation de la composition pharmaceutique. Fa composition pharmaceutique congelée peut alors être stockée à température négative entre -70°C et -l96°C, et plus particulièrement à des températures inférieures à -70°C pour un stockage à long terme (supérieur à 12 mois). Pour être utilisée, elle subit une décongélation.

Fes inventeurs ont mis en évidence de manière inattendue que les propriétés biologiques de la composition pharmaceutique cryoconservée jusqu’à 12 mois à -80°C étaient maintenues (Exemple E) (Figure 8A, 8B, 8C et 8D). En outre l’efficacité thérapeutique de la composition pharmaceutique de CSN de phénotype CMHl ^L / CD90 ^H cryoconservée a été mise en évidence pour le traitement de l’arthrose canine, avec une amélioration de la mobilité de l’animal, évaluée au moyen d’un questionnaire validé (LOAD : Liverpool Osteoarthritis in Dogs) (Figure 9), et/ou par une évaluation clinique effectuée par le vétérinaire (Figure 10). Dans un mode de réalisation particulier, les inventeurs ont mis également en évidence l’efficacité thérapeutique de la composition pharmaceutique de CSN de phénotype CMHl ^L / CD90 ^H cryoconservée pour le traitement de la thrombocytopénie (Figure 11). Les inventeurs ont mis également en évidence l’efficacité thérapeutique de la composition pharmaceutique de CSN de phénotype CMHl ^L / CD90 ^H cryoconservée pour le traitement des maladies inflammatoires chroniques (MICI) (Exemple H).

Une composition ou solution injectable sous forme congelée « prête à l’emploi » selon l’invention, est ainsi mobilisable à tous moments. Cette dernière a l’avantage de rendre disponible dans les plus brefs délais le traitement tout en limitant l’intervention humaine nécessaire à son efficacité et en limitant le risque de contamination inhérent à chaque manipulation par un opérateur. Ainsi, il est possible de séparer le procédé d’obtention de la composition pharmaceutique de son utilisation thérapeutique finale.

Dans un mode de réalisation, la présente invention concerne une solution injectable prête à l’emploi comprenant une population de CSN CMH-I ^L , et optionnellement CD90 ^H , telles que décrites précédemment et un cryoprotecteur tel que défini précédemment.

Typiquement ladite population de CSN et ledit cryoprotecteur sont formulés dans un véhicule pharmaceutiquement acceptable tel que défini précédemment.

Dans un mode de réalisation particulier, ladite solution injectable prête à l’emploi comprend une dose unitaire de CSN CMH-I ^L , et optionnellement CD90 ^H , de 1.10 ⁶ à 1.10 ⁸ cellules, en particulier de 1.10 ⁷ cellules, et une solution comprenant un cryoprotecteur telle que définie précédemment.

Dans un mode de réalisation particulier, ladite solution injectable comprend une dose unitaire de 1.10 ⁶ à 1.10 ⁸ cellules dans un volume de 0.1 à 15 ml, plus particulièrement de 1.10 ⁶ à 1.10 ⁷ cellules, typiquement 1.10 ⁷ cellules, dans un volume de 0.5 à 2 ml.

Dans un mode de réalisation particulier, au moins 80% en nombre, en particulier au moins 85%, plus particulièrement au moins 90% des CSN sont de phénotype CMH-I ^L /CD90 ^h . Dans un mode plus particulier, les CSN sont des CSN placentaires, plus particulièrement d’origine canine. Dans un mode réalisation particulier, le cryoprotecteur dans ladite solution injectable est le DMSO. Dans un mode particulier, la solution injectable est exempte de produit d’origine animal et comprend de 1 à 90% de DMSO, plus particulièrement de 0,5 à 30 %, plus particulièrement de 2 à 10%, en particulier 5%.

Dans un mode de réalisation particulier, les CSN peuvent subir une stimulation/modification exogène avant injection par le biais d’effecteurs physiques, biologique et/ou chimique. Par stimulation exogène (également appelée « priming ») nous entendons toutes stimulation/modifications des cellules et/ou de leur microenvironnement déclenchant chez elles un changement phénotypique favorisant leurs propriétés biologiques dans le cadre de thérapies spécifiques. Par exemple, un traitement avec des cytokines en concentrations comprises entre 1 et 500 ng/ml d’IFN-g, d’IL- 1 b, 11-6 et/ou de TNF-a permet d’augmenter de façon significative l’expression de molécules exerçant une activité immunomodulatrice. Dans un autre exemple, des stimulations mécaniques et/ou l’induction d’une prédifférenciation chondrogénique peut permettre de favoriser les propriétés de reconstruction tissulaires in vitro.

Cellule stromale néonatale

Un autre aspect de la divulgation porte sur une cellule stromale néonatale de phénotype CMH-I ^l , en particulier de phénotype CMH-I ^L /CD90 ^h .

Cette cellule peut être en plus caractérisée structurellement par le fait qu’elle n’exprime pas un ou plusieurs des marqueurs de surface suivants : CDl lb, CD14, CD31, CD34, CD45, ou le HLA-DR dénommé également CMH-II.

Par ailleurs, fonctionnellement, elle peut être caractérisée en ce qu’elle possède :

une capacité d’adhérence sur support plastique ; et/ou

une capacité de doublement cellulaire consécutif supérieur à 20 doublements cumulés, et/ou

un potentiel de différenciation chondrogénique, et/ou

un potentiel immunomodulateur ; et/ou

pas ou peu de potentiel de différenciation ostéogénique.

Dans un mode de réalisation particulier, la présente divulgation concerne une cellule stromale néonatale pour son utilisation thérapeutique chez le chien, le chat, le cheval, ou l’Homme, par exemple pour le traitement : a. des atteintes tissulaires ou ostéo-articulaires, avec ou sans composante inflammatoire ;

b. des maladies dégénératives, notamment l’arthrose, les tendinopathies, les fibroses tissulaires, Alzheimer, Parkinson ;

c. des maladies auto-immunes, inflammatoires et/ou infectieuses, notamment les dermatites atopiques, les gingivostomatites, la thrombocytopénie, l’epidermolyse bulleuse, sepsis, les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI) ;

d. du rejet de greffe, ou

e. des maladies tumorales.

Une telle cellule CSN peut être isolée avantageusement de la population de cellules CSN selon la présente divulgation tel que décrit ci-dessus, selon les méthodes de clonage connues de l’homme du métier.

Utilisation thérapeutique

Un autre aspect de la présente divulgation porte sur une population de CSN, une composition pharmaceutique ou une solution injectable telle que définie précédemment pour son utilisation thérapeutique.

Typiquement, il s’agit d’une utilisation en thérapie cellulaire. Par « thérapie cellulaire », on entend un traitement thérapeutique comprenant l’administration de cellules susceptibles d’induire un effet thérapeutique bénéfique chez l’individu. Dans le cadre d’une approche de médecine régénérative, cette thérapie cellulaire est susceptible de favoriser directement (différenciation cellulaire) ou indirectement (sécrétion de facteurs biologiques, activation ou inhibition de cellules de l’environnement) la régénération in vivo d’un ou plusieurs tissus biologiques chez un individu en attente d’un tel traitement.

En particulier, il s’agit d’une utilisation chez un même individu, ou chez un individu de la même espèce, ou chez un individu d’une espèce différente par rapport à l’espèce de provenance desdites CSN.

Lorsque le sujet receveur est identique à l’individu dont proviennent les CSN, on parle d’une utilisation thérapeutique autologue. Lorsque le sujet receveur est un individu de la même espèce que l’espèce de provenance des CSN, on parle d’une utilisation thérapeutique hétérologue ou allogénique.

Lorsque le sujet receveur est un individu d’une espèce différente par rapport à l’espèce de provenance des CSN, on parle d’une utilisation thérapeutique xénogénique.

Dans un mode de réalisation particulière, la présente invention porte sur une population de CSN telle que définie précédemment pour son utilisation thérapeutique xénogénique.

Dans un mode de réalisation particulier, la présente divulgation concerne ladite population de CSN, d’une composition pharmaceutique ou une solution injectable telle que définie précédemment pour son utilisation thérapeutique chez un mammifère. En particulier, ledit mammifère est le chien, le chat, le cheval, ou l’Homme.

A titre d’exemple, l’utilisation thérapeutique peut être le traitement :

a. des atteintes tissulaires ou ostéo-articulaires, avec ou sans composante inflammatoire ;

b. des maladies dégénératives, notamment l’arthrose, les tendinopathies, les fibroses tissulaires, Alzheimer, Parkinson ;

c. des maladies auto-immunes, inflammatoires et/ou infectieuses, notamment les dermatites atopiques, les gingivostomatites, la thrombocytopénie, l’epidermolyse bulleuse, sepsis, les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI) ;

d. du rejet de greffe, ou

e. des maladies tumorales.

Par atteintes tissulaires, on entend lésions, perte de fonction normale et/ou dégradations induites par une sollicitation trop importante du tissu, une sollicitation normale d’un tissu pathologique ou tous tissus nécessitant une reconstruction/cicatrisation tissulaire : infarctus du myocarde, atteintes rénales, atteintes hépatiques, brulure, lésions cutanées, fractures, atteintes respiratoires, atteintes ostéo-articulaires telles que l’ostéochondrite disséquante. Par maladie dégénérative, on entend tous types de maladies où la balance homéostasique est dérégulée en faveur d’un catabolisme tissulaire exacerbé ou une induction trop importante de l’anabolisme tissulaire, comme par exemple : l’arthrose, les tendinopathies, les fibroses tissulaires, Alzheimer, Parkinson. Les CSN peuvent également être utilisées dans le traitement de maladies ou de dérèglements physiologiques liés à une réponse immunitaire non désirée, c’est-à-dire tous types de maladies où le système immunitaire interfère avec le fonctionnement normal/physiologique du tissu ou avec un traitement visant à traiter une maladie immunitaire et/ou résorber le fonctionnement normal/physiologique d’un tissu, comme par exemple les dermatites atopiques, les gingivostomatites.

Elles peuvent être utilisées dans le traitement de maladies auto-immunes et inflammatoires telles que la réaction du greffon contre l’hôte (graft versus host disease ou GvHD), greffe tissulaire ou d’organe, maladies auto immunes comme la sclérose en plaques, inflammation tissulaire, allergie, asthme, bronchites allergiques, bronchites chroniques telles que la bronchopathie pulmonaire chronique obstructive (BPCO), maladie inflammatoire chronique des intestins, insuffisance rénale, thrombocytopénie, lupus érythémateux, polyarthrite rhumatoïde, l’epidermolyse bulleuse.

Par « maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI) », on entend les inflammations chroniques des muqueuses de l'intestin grêle, du colon et de la région ano- périnéale idiopathiques, telles que l’entérite duodénale chez le chien et le chat, et plus particulièrement les inflammations telles que la maladie de Crohn et la rectocolite hémorragique chez l’homme. Ces affections sont caractérisées par des troubles gastro- intestinaux et chroniques associés à une infiltration inflammatoire de la muqueuse. Elles sont diagnostiquées le plus souvent lors de vomissements et de diarrhée chronique chez l’animal et chez l’homme. Les MICI sont distinctes des entéropathies répondant à un changement alimentaire et des diarrhées répondant aux antibiotiques. Par définition, elles répondent aux agents immunosuppresseurs et non à une alimentation spécifique ou à des antibiotiques. Les signes cliniques tels que les vomissements, la diarrhée, la perte de poids, une perte d’appétit sont dus aux infiltrats cellulaires de la muqueuse, aux médiateurs de l’inflammation, à un dysfonctionnement des entérocytes associé à l’inflammation et à un trouble de la motilité de l’intestin.

Les CSN selon l’invention peuvent également être utilisées dans le traitement de maladies dans lesquelles une inflammation chronique liée ou non à un dérèglement immunitaire entraîne une dégénérescence tissulaire ou un dysfonctionnement de la fonction d’un organe ou d’un tissu telles que l’arthrose, les tendinites.

D’autre part, ladite population de CSN, composition pharmaceutique ou une solution injectable peuvent être utilisées dans le traitement de maladies infectieuses associées ou non aux composantes précédentes. Par maladies infectieuse nous entendons les maladies impliquant une contamination par des pathogènes tels que les micro -organismes comme les protozoaires, les bactéries, et/ou les virus. Ces maladies à composante infectieuse peuvent être de nature localisée ou systémique. L’utilisation des CSN peut notamment être prescrite dans le cadre particulier de résistance aux antibiotiques des pathogènes impliqués et dans le cadre d’une réponse inflammatoire généralisée associée à une infection grave, comme le sepsis.

Le cadre thérapeutique peut s’étendre à des maladies ayant plusieurs versants pathologiques telles que l’arthrose avec un versant dégénératif et un versant inflammatoire. Ladite population de CSN, composition pharmaceutique ou une solution injectable peuvent aussi être utilisées dans le traitement de maladies de nature tumorale avec ou non une composante métastasique.

Le cadre thérapeutique peut également s’étendre à l’utilisation des CSN de façon combinée avec d’autres types de thérapies comme par exemple : laser ; ondes de choc ; plasma riche en plaquettes (PRP) ; acide hyaluronique ; anti inflammatoire non stéroïdiens.

Dans un mode de réalisation particulier, la présente divulgation concerne une population de CSN pour son utilisation en ingénierie tissulaire. Par « ingénierie tissulaire », on entend l’ensemble des techniques de biotechnologie utilisant des cellules et des biomatériaux (d’origine biologique ou synthétique) pour générer des substituts tissulaires in vitro/ex vivo pour une implantation in vivo ou pour être utilisé comme modèle tissulaire en laboratoire. (Ex : reconstruction de la peau, osseuse ou cartilagineuse).

Dans un mode de réalisation particulier, la présente divulgation concerne une population de CSN, une composition pharmaceutique ou une solution injectable telle que définie précédemment pour son utilisation dans le traitement d’indications de l’appareil locomoteur telles que l’arthrose chez le mammifère, plus particulièrement chez le chien, le chat ou le cheval, préférablement chez le chien.

Dans un autre mode de réalisation particulier, la présente divulgation concerne ladite population de CSN, composition pharmaceutique ou solution injectable telle que définie précédemment pour son utilisation dans le traitement de la thrombocytopénie chez le mammifère, plus particulièrement chez le chien, le chat ou le cheval, préférablement chez le chien.

Dans un mode de réalisation particulier, la présente divulgation concerne ladite population de CSN, composition pharmaceutique ou solution injectable telle que définie précédemment pour son utilisation dans le traitement de maladies inflammatoires chroniques de l’intestin, telles que l’entérite duodénale chez le mammifère, plus particulièrement chez le chien, le chat ou le cheval, préférablement chez le chien.

Dans un mode de réalisation particulier, la présente divulgation concerne ladite population de CSN, composition pharmaceutique ou solution injectable telle que définie précédemment pour son utilisation dans le traitement de maladies inflammatoires chroniques de l’intestin, telles que la maladie de Crohn chez l’homme.

Méthode de traitement

Selon un autre aspect, la présente invention porte sur une méthode de traitement :

a. des atteintes tissulaires ou ostéo-articulaires, avec ou sans composante inflammatoire ;

b. des maladies dégénératives, notamment l’arthrose, les tendinopathies, les fibroses tissulaires, Alzheimer, Parkinson ;

c. des maladies auto-immunes, inflammatoires et/ou infectieuses, notamment les dermatites atopiques, les gingivostomatites, la thrombocytopénie, l’epidermolyse bulleuse, sepsis, les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI) ;

d. du rejet de greffe, ou

e. des maladies tumorales,

comprenant l’administration de ladite population de CSN ou d’une composition pharmaceutique ou une solution injectable telle que définie précédemment chez le sujet à traiter.

En particulier, la présente invention porte sur une méthode de traitement d’indications de l’appareil locomoteur telles que l’arthrose chez le mammifère, plus particulièrement chez le chien, le chat ou le cheval, préférablement chez le chien, comprenant l’administration de ladite population de CSN ou d’une composition pharmaceutique ou une solution injectable telle que définie précédemment chez le sujet à traiter.

En particulier, la présente invention porte sur une méthode de traitement le traitement de la thrombocytopénie chez le mammifère, plus particulièrement chez le chien, le chat ou le cheval, préférablement chez le chien, comprenant l’administration de ladite population de CSN ou d’une composition pharmaceutique ou une solution injectable telle que définie précédemment chez le sujet à traiter. En particulier, la présente invention porte sur une méthode de traitement le traitement de maladies inflammatoires chroniques de l’intestin chez le mammifère, plus particulièrement chez le chien, le chat ou le cheval, préférablement chez le chien, comprenant l’administration de ladite population de CSN ou d’une composition pharmaceutique ou une solution injectable telle que définie précédemment chez le sujet à traiter.

Mode d’administration

La population de CSN une composition pharmaceutique ou une solution injectable telle que définie précédemment, peut être administrée localement ou par voie intra-veineuse (IV) ou de façon plus générale par voie parentérale.

Typiquement, une administration locale peut être une administration par injection intra- articulaire, par exemple dans le cas du traitement d’indications de l’appareil locomoteur telles que l’arthrose, au niveau de chaque articulation à traiter.

Par administration IV on entend une administration des CSN directement dans le système veineux du sujet à l’aide d’un cathéter ou d’une aiguille ou par exemple via une poche de soluté de perfusion ou par exemple par la tubulure du perfuseur. Typiquement, une administration par voie intra-veineuse est réalisée dans le cas du traitement de la thrombocytopénie, de l’arthrose, ou du traitement d’une maladie inflammatoire chronique de l’intestin telle que l’entérite duodénale ou la maladie de Crohn.

Dans un mode de réalisation particulier, 1.10 ⁶ à 1.10 ⁸ CSN, en particulier 2,5.10 ⁶ à 1.10 ⁷ CSN, plus particulièrement 1.10 ⁷ CSN, sont administrées par voie intra-articulaire, au niveau de chaque articulation à traiter, pour le traitement d’indications de l’appareil locomoteur telles que l’arthrose.

Dans un mode de réalisation particulier, 1.10 ⁶ à 10.10 ⁸ CSN, en particulier 1.10 ⁷ CSN, sont administrées par voie intraveineuse pour le traitement de maladies inflammatoires à composante dysimmunitaire, telle que la thrombocytopénie.

Dans un mode de réalisation particulier, 1.10 ⁶ à 5.10 ⁶ CSN/kg sont administrées par voie intraveineuse pour le traitement de maladies inflammatoires à composante dysimmunitaire, telle que la thrombocytopénie.

Dans un mode de réalisation particulier, 1.10 ⁶ à 10.10 ⁸ CSN, en particulier 1.10 ⁷ CSN, sont administrées par voie intraveineuse pour le traitement d’une maladie inflammatoire chronique de l’intestin. Le mode d’administration est évidemment adapté en fonction du sujet et de la pathologie à traiter. Le nombre exact de cellules à administrer dépend de différents facteurs, et notamment, l’âge, le poids, le sexe du sujet à traiter, la pathologie et l’étendue ou la sévérité de la pathologie à traiter.

Procédé d’obtention

La présente divulgation porte également sur un procédé in vitro d’obtention d’une composition pharmaceutique de cellules stromales néonatales issues de tissus néonataux (Figure 16 et Figure 17), ladite composition pharmaceutique comprenant à titre de principe actif une population de cellules stromales néonatales comprenant des CSN de phénotype CMH-I ^l , et optionnellement de phénotype CD90 ^H , ledit procédé comprenant :

a. la fourniture d’un ou plusieurs échantillons biologiques néonataux comprenant des CSN, le ou les échantillons biologiques ayant été préalablement obtenus à partir d’un ou plusieurs individus,

b. l’isolement de la population de CSN présentes dans le ou les échantillons biologiques,

c. optionnellement, au moins une étape d’amplification ex vivo des CSN obtenues à l’étape b.,

d. optionnellement, la cryoconservation de la population de CSN obtenues à l’étape b. ou c.,

e. optionnellement, une stimulation par effecteur physique, biologique et/ou chimique de la population de CSN obtenues à l’étape b., c. ou d.,

f. la caractérisation de la présence de CSN de phénotype CMH-I ^L , et optionnellement d’un phénotype CD90 ^H , parmi au moins 80% de la population de CSN, après isolement à l’étape b. et/ou après l’étape d’amplification ex vivo à l’étape c. et/ou après cryoconservation des CSN à l’étape d.,

g. la mise en suspension de la population de CSN comprenant au moins 80% de CSN de phénotype CMH-I ^L , et optionnellement de phénotype CD90 ^H , dans un milieu de suspension pharmaceutiquement acceptable.

Dans un mode de réalisation, le ou les échantillons biologiques néonataux fournis à l’étape a., proviennent d’un échantillon tissulaire néonatal, en particulier d’un ou plusieurs placentas et/ou d’un ou plusieurs cordons ombilicaux, ou d’une ou plusieurs membranes amniotiques, ou d’un échantillon de fluide néonatal comme par exemple le liquide amniotique d’un ou plusieurs sacs amniotiques et en particulier le sang d’un ou plusieurs cordons ombilicaux. Dans un mode de réalisation particulier, l’échantillon biologique néonatal est un placenta.

Cet échantillon peut être prélevé comme précédemment expliqué dans la demande.

En particulier, le ou les échantillons biologiques néonataux fournis à l’étape a) du procédé proviennent de mammifère, et plus particulièrement du chien, du chat, du cheval ou de l’Homme. Dans un mode de réalisation particulier, l’échantillon biologique néonatal est un échantillon provenant du chien, également dit échantillon canin.

Dans un mode de réalisation particulier, le ou les échantillons biologiques néonataux fournis proviennent d’un même individu, d’un ou de plusieurs individus ou d’un modèle mammifère différent de celui auquel est destinée la composition pharmaceutique.

Par « isolement » on entend l’opération consistant à extraire par un processus enzymatique et/ou mécanique, les cellules contenues dans un tissu et sa matrice extracellulaire.

L’isolement des CSN est réalisé à partir d’un tissu néonatal, par exemple, par dissection et digestion enzymatique du tissu, puis par centrifugation et récupération du culot cellulaire contenant des CSN. Alternativement, il est réalisé à partir d’un échantillon de sang de cordon ombilical. Les cellules de sang peuvent alors être séparées sur un gradient de densité, en particulier en utilisant du Licoll. L’anneau cellulaire formé à l’interphase entre le plasma dilué et le Licoll est récupéré, et les cellules sont lavées et centrifugées, puis le culot cellulaire contenant des CSN est récupéré. Les cellules sont en général comptées et ensemencées à une densité comprise entre 10 ⁵ et 5.10 ⁵ cellules/cm2. Le nombre de cellules totales récupérées après centrifugation peut être compris par exemple entre 0,1.10 ⁶ et 500.10 ⁶ cellules, plus précisément chez le chien entre 0,1.10 ⁶ et 10.10 ⁶ , plus précisément chez le cheval 100.10 ⁶ et 500.10 ⁶ .

Suite à l’isolement des cellules contenant une fraction de CSN, une étape d’amplification des CSN peut être réalisée par adhésion au plastique.

Afin d’obtenir des quantités plus importantes de CSN dans le but de réaliser différentes préparations pharmaceutiques, les CSN isolées peuvent subir une étape d’amplification en laboratoire.

Par « étape d’amplification », on entend toute étape permettant une prolifération des CSN sur support plastique ou polymère. Cette phase doit être capable de favoriser la présence des CSN au détriment d’autres types cellulaires ne répondant pas aux caractéristiques des CSN. Elle doit également assurer une prolifération optimale des cellules tout en limitant les phénomènes de dédifférenciation, de différenciation et/ou de sénescence. Cette étape implique des conditions en atmosphère contrôlée telles que l’homme de l’art est capable d’établir comme par exemple avec 90% d’humidité et comportant 5% de C0 ₂ . La température d’amplification doit être constante et comprise entre 35-40°C, plus précisément entre 37-39°C. Parmi les milieux de culture, de façon non exhaustive, il est possible de citer les milieux de type Alpha-MEM, DMEM, RPMI, IMDM, Opti-MEM, EGM, EGM-2, milieux synthétiques adaptés à la culture de CSM dépourvus d’endotoxine et/ou de sérum, milieux synthétiques adaptés aux bonnes pratiques de fabrication, complémentés ou non avec du sérum de veau fœtal (SVF) de 0,1% à 20%, du lysat plaquettaire, de l’insuline -transferine-sélénium, des compléments commerciaux définis et/ou autres facteurs de croissance et/ou molécules favorisant la prolifération des CSN tout en limitant leur sénescence comme le FGF, EGF, VEGF, dexamethasone et/ou A2P.

Cette phase d’amplification peut être réalisée sur différents supports une fois que la population de CSN est obtenue suite à l’étape d’isolement. Ces différents supports peuvent être de nature 2D ou 3D.

Par amplification sur support 2D, on entend toutes méthodes de culture cellulaire permettant une amplification des CSN sur support monocouche et correctement mis au point par l’homme de l’art. Dans des modes de réalisation particuliers les cellules peuvent être cultivées dans des boites de cultures en plastique traitées ou non pour favoriser l’adhésion cellulaire, de type flasque, à un ou plusieurs étages et/ou de type multicouches avec ou sans perfusion continue, avec ou sans optimisation du flux d’air.

Par amplification sur support 3D, on entend toutes techniques connues par l’homme de l’art utilisant des biomatériaux, microporteurs et/ou polymères capables d’assurer une amplification des CSN en bioréacteur et correctement mise au point par l’homme de l’art. Dans des modes de réalisation particuliers, les CSN peuvent être amplifiés en bioréacteurs sous agitation, axiales et/ou pendulaire, sous agitation à vagues, sous agitation à lit tournant, en bioréacteurs statiques et/ou perfusés. Les biomatériaux et/ou microporteurs peuvent être de plusieurs natures et selon des modes de réalisation particuliers peuvent être de tailles comprises entre 100-500 mhi de diamètre, ont une porosité de différente nature, présentent une surface traitée, chargée ou non négativement ou positivement, comportent des facteurs de croissance ou protéines recombinantes de type intégrines et/ou matrice extracellulaire ou toutes autres molécules biologiques/chimique favorisant l’adhésion cellulaires et/ou la prolifération cellulaire.

Les CSN étant des cellules adhérentes, afin d’assurer l’étape d’amplification, un passage cellulaire des CSN peut être nécessaire et réalisé par une méthode correctement mise au point par l’homme de l’art. Un passage cellulaire (P) correspond au détachement des cellules de leur support lorsqu’elles arrivent à confluence (tapis cellulaire), pour les remettre en culture sur un nouveau support. Typiquement, le détachement des cellules peut être réalisé sous l’effet d’action mécanique, d’enzymes et/ou inhibiteurs comme, de façon non exhaustive, la trypsine, EDTA et/ou accutase recombinantes ou animales. Il est également possible de réaliser ces passages cellulaires par l’utilisation de biomatériaux/microporteurs dissolvables selon un procédé mis au point par l’Homme de l’art.

Dans un mode de réalisation particulier, pour la phase d’amplification, les cellules sont par exemple traitées avec de la trypsine-EDTA, puis reprises dans un milieu d’amplification et centrifugées. Après reprise dans du milieu d’amplification, elles sont remises en culture à hauteur de 1500 à 5000 cellules/cm ² ou équivalent 3D dans du milieu d’amplification avec ou sans suivi monitoré du microenvironnement et/ou atmosphère de culture.

Dans un mode de réalisation particulier, l’étape d’amplification peut comprendre plusieurs passages cellulaires.

Pendant cette étape d’amplification, les CSN se multiplient par doublement cellulaire. Ainsi, l’étape d’amplification peut également être définie en termes de doublement cellulaire.

Dans un mode de réalisation particulier, ledit procédé comprend une étape d’amplification dans laquelle la population de CSN selon l’invention subi 2 à 25 doublements cellulaires, plus particulièrement 5 à 15 doublements cellulaires.

A l’issue de l’isolement à partir des tissus néonataux, les cellules peuvent être cryoconservées en unités cellulaires d’ensemencement. Pour cela, les cellules sont centrifugées puis reprises dans un milieu de congélation. Le milieu de congélation peut être soit un milieu de culture comme par exemple le DMEM enrichi avec 5-50% du SVF (vol : vol) et 5-10% (vol : vol) de DMSO ou un milieu de cryopréservation commercial, contenant ou non une fraction de DMSO. La congélation des cellules est réalisée par exemple en condition de descente en température contrôlée (- l°C/min jusqu’à une température de -80°C), en utilisant par exemple un container CoolCell® Cell Freezing Containers (BioCision) ou un congélateur programmable de type Digitcool (Cryobiosystem) Fes CSN ainsi congelées peuvent être conservées en particulier à des températures inférieures à -70°C pour un stockage à long terme (supérieur à 12 mois).

L’étape de caractérisation de la présence d’un phénotype CMH-I ^L , et optionnellement de phénotype CD90 ^H , est réalisée selon les méthodes précédemment décrites de simple marquage ou de double marquage. Cette étape est réalisée sur un prélèvement de la population de CSN issue de l’étape b., c. et/ou d., pour caractériser ladite population. Cette étape a pour but de sélectionner une population de CSN comprenant au moins 80% de sa population cellulaire de phénotype CMH-I ^L , et optionnellement de phénotype CD90 ^H . Fes populations de CSN répondant à ce critère sont sélectionnées et peuvent être mises en suspension dans un milieu de suspension pharmaceutiquement acceptable, comme par exemple une solution saline tamponnée, une solution stérile injectable contenant 10-100 USP d’héparine sodique, un milieu de cryopréservation commercial utilisé comme excipient.

Dans un mode de réalisation particulier, l’étape de caractérisation consiste à la caractérisation de CSN CMH-I ^L et CD90 ^H , et est réalisée par un double marquage des marqueurs CMH-I et CD90 en cytométrie en flux, tel que décrit précédemment. F’étape de caractérisation de la présence d’un phénotype CMH-I ^L /CD90 ^H correspond à une évaluation de rMFI CMH ^L inférieure à 20, plus particulièrement inférieur à 15, plus particulièrement inférieure à 10 et selon une évaluation de rMFI CD90 supérieure à 15 et plus particulièrement supérieure à 20, parmi au moins 80% des CSN de la population de CSN.

Dans un mode de réalisation particulier, ledit procédé comprend une étape d’amplification c., ladite étape d’amplification comprenant 1 à 5 passages cellulaires, plus particulièrement comprenant 2 ou 3 passages cellulaires. Dans ce mode de réalisation, la caractérisation de la population de CSN isolées à l’étape b. est donc réalisée après une étape d’amplification comprenant 1 à 5 passages cellulaires (étape c.), plus particulièrement comprenant 2 ou 3 passages cellulaires.

Dans un mode de réalisation, ledit procédé comprend une étape d’amplification c., ladite étape d’amplification ladite étape d’amplification correspond à un doublement de la population de CSN isolées à l’étape b. de 2 à 25 doublements cellulaires, en particulier 5 à 15 doublements cellulaires. Dans ce mode de réalisation, la caractérisation de la population de CSN isolées à l’étape b. est donc réalisée après une étape d’amplification correspondant à un doublement de la population de CSN isolées à l’étape b. de 2 à 25 doublements cellulaires, en particulier 5 à 15 doublements cellulaires.

Dans un mode de réalisation, ladite étape d’amplification peut être caractérisée en termes de passages et en termes de doublements cellulaires tels que définis ci-dessus.

Les inventeurs ont constaté qu’entre le passage 1 (Pl) et le passage 5 (P5), en particulier entre le passage 2 (P2) et le passage 3 (P3), un important changement phénotypique a lieu. En effet, ils ont découvert que de manière surprenante, les profils phénotypiques des différentes populations de CSN sont similaires entre P0-P1 et sont principalement de type CMH-I ^H et CD90 intermédiaire. En revanche entre Pl et P5, plus particulièrement entre P2 et P3, une individualisation des sous-populations de CSN de phénotype différente est observable. Par « individualisation », on entend que deux sous-populations CMH- I ^L /CD90 ^H et CMH-I ^H /CD90 ^L sont observables au sein d’une même population de CSN, au cours de l’amplification cellulaire. En effet, au cours de l’amplification in vitro entre Pl et P5 et plus particulièrement entre P2 et P3, les populations de CSN passent par une phase d’individualisation où les deux sous-populations CMH-I ^H /CD90 ^L et CMH-I ^L /CD90 ^H sont facilement identifiables, en cas de population hétérogène.

Dans un mode de réalisation alternatif, il est possible de combiner la notion de passage avec le nombre de doublements : la phase d’individualisation peut alors être considérée entre 2 et 25 doublements, en particulier 5 à 15 doublements.

Typiquement, la caractérisation de l’expression des marqueurs est réalisée par la méthode du double marquage décrite précédemment.

Dans le cas où cette individualisation est observable, une matrice d’analyse spécifique à la population de CSN isolée de phénotype CMH-I ^L /CD90 ^h , peut être déterminée afin de servir à l’analyse des sous-populations qu’elle contient et/ou des unités thérapeutiques et banques produites à partir de cette même population de CSN (Figure 16 et Figure 18). Par matrice d’analyse, on entend une fenêtre d’analyse déterminée pour l’analyse en cytométrie en flux. Cette matrice a pour vocation à définir le stade d’individualisation et/ou le phénotype d’une population de CSN données, au cours des étapes d’amplification et/ou après décongélation et/ou au cours du procédé de fabrication de la préparation pharmaceutique.

L’exploitation de cette matrice comme outil de caractérisation implique une analyse à minima au premier passage, en particulier à minima au deuxième passage pour correctement apprécier la proportion des différentes sous populations de CSN au cours du procédé de fabrication.

Dans un mode de réalisation particulier, cette phase d’individualisation et l’établissement d’une matrice d’analyse peuvent être exploités afin d’ajuster la détermination de seuils précédemment décrits, pour la caractérisation de l’expression des marqueurs. Ce phénomène peut être exploité afin de déterminer les rMFI du CMH-I et du CD90 pour chacune des sous populations au sein même de la population mère (Figure 3). L’analyse, également, d’un nombre suffisamment important de populations de CSN hétérogène peut permettre d’établir des seuils avec plus de précision pour la détermination du phénotype CMH-I ^L /CD90 ^H au cours du procédé de fabrication de l’invention.

Dans un mode de réalisation particulier, le procédé d’obtention de la composition pharmaceutique de CSN comprend une étape d’enrichissement de la population de CSN en CSN de phénotype CMH-I ^L , et optionnellement de phénotype CD90 ^H , qui peut correspondre à une étape de déplétion des cellules CSN de phénotype CMH-I ^L , et optionnellement de phénotype CD90 ^H . Cette étape d’enrichissement par déplétion cellulaire peut être réalisée par des méthodes de tri cellulaire de chromatographie sur colonne, par l’utilisation de billes magnétiques couplées à des anticorps d’intérêt, ou par cytométrie en flux couplé à un trieur cellulaire.

Dans un mode de réalisation particulier, le procédé d’obtention de la composition pharmaceutique de CSN peut également comprendre une étape d’inhibition du CMH-I, par exemple par modification in vitro du phénotype des cellules (extinction d’un gène) ou en masquant des récepteurs par exemple en utilisant un anticorps.

A l’issue du procédé, la préparation de CSN peut ensuite être amplifiée in vitro, cryoconservée ou administrée à un individu souffrant d’une des pathologies mentionnées précédemment. Au cours du procédé, il est possible de procéder à une étape de cryoconservation, après la mise en suspension des CSN dans un milieu de suspension pharmaceutiquement acceptable comprenant un cryoprotecteur. Par « cryoconservation », on entend l’étape de stockage des cellules congelées pour une durée allant de 1 jour à 5 ans et plus. La banque de cellules est conditionnée de façon à garantir l’intégrité et les propriétés biologiques des populations cellulaires.

L’étape de cryoconservation est précédée par une étape de congélation correspondant à la descente en température de la suspension cellulaire jusqu’à sa température de stockage.

Dans un mode de réalisation particulier, cette étape de congélation correspond à une descente progressive de la température de la suspension cellulaire (-l°C / minutes) pour atteindre la température de stockage allant de -70°C à -l96°C. Dans un mode de réalisation alternatif, les cellules peuvent être congelées à une vitesse de congélation comprise entre - 0,3°C / minutes et -99°C / minutes. Un même protocole de congélation peut comprendre une ou plusieurs vitesses de congélation différentes comme dans le cas d’une montée graduelle de vitesse de congélation. Dans un mode de réalisation alternatif, les cellules sont directement congelées sans contrôle de température dans une enceinte de stockage dont la température est comprise entre -70°C et l96°C. Le stockage final peut être en phase liquide (de type azote liquide) ou phase gazeuse (de type enceinte -l40°C, -80°C ou stockage en azote en phase gazeuse).

Afin de rendre disponible les cellules cryoconservées pour une administration thérapeutique au sujet, une étape de décongélation est réalisée suite à l’étape de congélation, dans le cas où les CSN utilisées pour l’administration sont sous la forme d’unités de banque. Cette décongélation est réalisée de façon à passer du stade de cellules congelées au stade de cellules décongelées au cours d’un mode de réalisation limitant la mort cellulaire par dessiccation, lésion mécanique de la membrane plasmique, choc osmotique. Dans un mode de réalisation particulier, les unités de CSN sont réchauffées par friction manuelle durant moins de 10 min. Dans un autre mode de réalisation particulier, les unités de CSN sont placées au bain marie liquide ou sec, réglé à une température comprise entre 30 et 40°C pendant moins de 10 min, en particulier à 37°C pendant 3 à 5 min. Dans un autre mode de réalisation particulier, les unités de CSN sont placées dans un appareil de décongélation automatique. Dans un autre mode de réalisation particulier, les unités de CSN sont décongelées à température ambiante pendant moins de 10 min si le cryoprotecteur utilisé le permet. Population de CSN obtenues par le procédé

La présente invention porte également sur une population de CSN telle que définie précédemment, obtenue par un procédé comprenant :

a. la fourniture d’un ou plusieurs échantillons biologiques néonataux comprenant des CSN, le ou les échantillons biologiques ayant été préalablement obtenus à partir d’un ou plusieurs individus,

b. l’isolement de la population de CSN présentes dans le ou les échantillons biologiques,

c. une étape d’amplification ex vivo des CSN obtenues à l’étape b.,

d. optionnellement, la cryoconservation de la population de CSN obtenues à l’étape b. ou c.,

e. optionnellement, une stimulation par effecteur physique, biologique et/ou chimique de la population de CSN obtenues à l’étape b., c. ou d.,

f. la caractérisation de la présence de CSN de phénotype CMH-I ^L , et optionnellement d’un phénotype CD90 ^H , parmi au moins 80% de la population de CSN, après isolement à l’étape b. et/ou après l’étape d’amplification ex vivo à l’étape c. et/ou après cryoconservation des CSN à l’étape d.,

Dans un mode de réalisation particulier, ladite étape d’amplification comprend 1 à 5 passages cellulaires, plus particulièrement comprenant 2 ou 3 passages cellulaires.

Dans un mode de réalisation particulier, ladite étape d’amplification correspond à un doublement de la population de CSN isolées à l’étape b. de 2 à 25 doublements cellulaires, en particulier 5 à 15 doublements cellulaires.

Après caractérisation, ladite population de CSN peut être formulée en tant que composition pharmaceutique ou solution injectable, tel que décrit précédemment.

FIGURES

Figure 1 : Paramétrage et analyse cytométrique de CSN.

(A) Définition d’une fenêtre d’analyse basée sur les paramètres d’analyse FSC-A/SSC-A, puis d’une fenêtre d’analyse basée sur les paramètres d’analyse FSC-H/FSC-A. (B) Une représentation en 2D (histogramme à 2 paramètres) est utilisée sur la base de l’analyse de la fluorescence issue du fluorochrome utilisé (FL:2 pour PE) et de F auto fluorescence des cellules en utilisant un canal de fluorescence avec un spectre d’excitation/émission non utilisé dans l’analyse (FL-4). Une fenêtre d’analyse est définie sur les échantillons marqués par l’isotype, pour un seuil de négativité de tolérance d’environ 0,5%. (C) Analyse du marqueur CMH-I. (D) Analyse du marqueur CD90. (E) Une représentation par superposition des histogrammes est réalisée en conservant les mêmes paramètres.

Figure 2 : Mise en évidence des différences d’expression du CMH-I chez les CSN.

Sur la base du paramétrage et de l’analyse présentée en figure 1, plusieurs échantillons de CSN sont analysés. L’analyse de l’expression du CMH-I indique des expressions variables de ce marqueur entre les différents échantillons. La méthode analytique proposée consiste à normaliser les valeurs de fluorescence moyenne (MFI ; Mean Fluorescence Intensity) des cellules marquées avec l’anticorps d’intérêt (ici MFI FL2 (CMH-I-PE)) avec la MFI des cellules marquées avec l’isotype couplé au même fluorochrome (ici MFI FL2 _(isotype-PE) )· Un ratio est ainsi calculé MFI FL2 (CMH-I-PE)/ MFI FL2 (isotype-PE). (A) Analyse du marqueur CMH-I. Le seuil d’acceptabilité pour définir les cellules CMH-I négatives a été fixé à 2.5. (B) Les paramètres et les analyses sont réalisées conformément à la description de la figure 1 à la différence qu’un anticorps secondaire couplé à un fluorochrome de type allophycocyanine (APC) est utilisé. Les cellules marquées par un isotype (CSN-ISO) et par le CMH-I (CSN-CMH-I) sont présentées. De la même manière, la méthode analytique consiste à normaliser les valeurs de fluorescence moyenne (MFI ; Mean Fluorescence Intensity) des cellules marquées avec l’anticorps d’intérêt (ici MFI FL4 (CMH-I-APC)) avec la MFI des cellules marquées avec l’isotype couplé au même fluorochrome (ici MFI FL4 (isotype-APC)). Un ratio est ainsi calculé MFI FL4 (CMH-I-APC)/ MFI FL4 (isotype-APC). Le seuil d’acceptabilité pour définir les cellules CMH-I négatives a été fixé à 10.

Figure 3 : Comparaison des expressions des marqueurs CMH-I et CD90 entre les deux sous-populations présentes dans des populations de CSN hétérogènes (mixtes).

Des CSN sont isolées de placenta canin et analysées en cytométrie en flux entre P1-P4. Lorsqu’une population mixte est identifiée, les expressions du CMH-I et du CD90 sont évaluées dans chacune des sous populations respectives CMH-I ^H /CD90 ^L (MHC-I/CD90 - HL) et CMH-I ^L /CD90 ^H (MHC-I/CD90 - LH). Les résultats sont présentés sous forme de MFI relatives (rMFI). L’analyse permet d’établir avec précision des seuils d’expressions du CMH-I et CD90 pour la population d’intérêt CMH-I ^L /CD90 ^H (n=l3). Figure 4 : Différence de potentiel de prolifération entre les CSN de type CMH- I ^L /CD90 ^H et CMH-I ^H /CD90 ^l .

Des CSN sont isolées de placenta canin et analysées en cytométrie en flux sur plusieurs passages entre P2 et P7. Une matrice d’analyse présentée en Figure 18 est déterminée pour chaque population de CSN isolées ayant présenté les deux sous-populations CMH- I ^L /CD90 ^H et CMH-I ^H /CD90 ^L en cours de culture. Les CSN sont caractérisées comme CMH-I ^L /CD90 ^H lorsque la médiane d’analyse des pourcentages de la sous population CMH-I ^L /CD90 ^H (des passages entre P2-P7) représente à minima 75% de la population totale. Les résultats du nombre de doublements maximal et de la moyenne de temps de doublement sont présentés sous forme de boxplot (CMH-I ^L /CD90 ^H n=4 ; CMH-I ^H /CD90 ^L n=l 1). La probabilité p de rejet de H0 est déterminée par test de Mann-Whitney U-test.

Figure 5 : Différence de potentiels chondrogéniques entre les CSN de type CMH- I ^L /CD90 ^H et CMH-I ^H /CD90 ^l .

Une population CSN-l de phénotype CMH-I ^L /CD90 ^H et deux populations CSN-2 et CSN- 3 de phénotype CMH-I ^H /CD90 ^L ont été étudiées après 7 jours de différenciation chondrogénique. (A) Observation des micromasses au microscope photonique (grossissement x4). (B) Histogramme représentant la surface des micromasses analysée sous ImageJ et exprimées en pixels ² selon la population cellulaire. (C) Expression du gène Col2al dans les micromasses obtenues pour chaque population cellulaire après 7 jours de différenciation chondrogénique (traité) par rapport à cette même population cellulaire n’ayant pas subi de différenciation chondrogénique (Ctrl) : Les niveaux d’expression sont présentés en expression relative de l’ARNm Col2al. (D) Des CSN sont isolées de placenta canin et analysées en cytométrie en flux sur plusieurs passages entre P2 et P7. Une matrice d’analyse présentée en figure 18 est déterminée pour chaque population de CSN isolées ayant présenté les deux sous-populations CMH-I ^L /CD90 ^H et CMH-I ^H /CD90 ^L en cours de culture. Les CSN sont caractérisées comme CMH-I ^L /CD90 ^H lorsque la médiane d’analyse des pourcentages de la sous population CMH-I ^L /CD90 ^H (des passages entre P2-P7) représente à minima 75% de la population totale. Les résultats du potentiel chondrogénique déterminé tel que décrit dans l’invention sont présentés (CMH-I ^L /CD90 ^H n=3 ; CMH- I ^H /CD90 ^L n=5). La probabilité p de rejet de HO est déterminée par test de Mann-Whitney U-test. Figure 6 : Dosage du PGE2 dans les surnageants de culture des CSN CMH-F (2 lignées indépendantes) après 3 jours de culture en condition basale (CTRL) ou après 3 jours de traitement avec 5ng/ml d’interféron gamma (IFN)

Figure 7 : Evaluation de l’effet antiprolifératif des CSN sur les lymphocytes T in vitro

Cette figure illustre l’effet anti-prolifératif des CSN après 4 jours de co-culture de CSN avec des PBMC (ratio 1 : 10) en présence d’un agent mitogène (mitomycine). Le contrôle (CTRL) est une culture de PBMCs dans les mêmes conditions en présence d’agent mitogène mais sans CSN. L’analyse de la prolifération lymphocytaire est déterminée en évaluant le signal d’un marqueur fluorescent (Celltrace) dans la population marquée avec un anticorps anti-CD3 (marqueur spécifique des lymphocytes T) couplé à un fluorochrome. Un indice de prolifération (IP) est calculé pour chaque condition expérimentale en utilisant le logiciel d’analyse Modfit®. L’IP en présence de CSN est normalisé par rapport à l’IP en condition contrôle, fixé à 1.

Figure 8 : Evaluation des propriétés biologiques de la composition pharmaceutique cryoconservée post-décongélation

(A): Evaluation de la viabilité cellulaire des CSN avant cryoconservation (CTRL culture; n=3) et après décongélation des cellules cryoconservées maintenues 3, 6, 9, et 12 mois à - 80°C (3M, 6M, 9M, 12M; n=3 pour chaque condition),

(B-C): L’activité proliférative des CSN issues d’une sub-culture (CTRL culture; n=6) ou issues d’unités cryoconservées pendant 3, 6, 9, 12 mois (3M, 6M, 9M, 12M; n=3 pour chaque condition) a été évaluée en ensemençant 225.000 cellules en flasque T75, maintenues en culture en incubateur pendant 7 jours. Le milieu d’amplification est renouvelé une fois durant la culture. Le nombre et le temps de doublement sont calculés selon la formule décrite dans l’exemple. Les résultats ne montrent pas de différence significative du nombre et du temps de doublement entre les CSN maintenues en culture et les CSN cryoconservées, jusqu’à 12 mois de conservation à -80°C. (D): L’analyse de prolifération lymphocytaire en co-culture avec des CSN en culture (n=3) ou des CSN cryoconservées (n=6) ne met pas en évidence de différence significative de l’effet antiprolifératif des CSN.

Figure 9 : Evaluation de la mobilité des chiens avant et après administration de CSN cryoconservées basée sur le questionnaire LO AD. Deux chiens arthrosiques sont traités avec 1.10 ⁷ de CSN par articulations de phénotype CMH-I ^L /CD90 ^H cryoconservées et décongelées à température ambiante. L’évolution clinique des sujets est réalisé par analyse du score LO AD après traitement tels que décrit dans l’exemple E. Les deux sujets présentés ont montré une diminution du score LO AD suite au traitement par les cellules.

Figure 10

15 chiens arthrosiques sont traités avec 1.10 ⁷ de CSN par articulation de phénotype CMH- I ^L /CD90 ^H cryoconservées et décongelées à température ambiante. Le suivi clinique des chiens est réalisé six mois post-injection. 87% des cas ont montré une évolution satisfaisante suivant le traitement.

Figure 11

Un chien diagnostiqué comme ayant une thrombocytopénie est traité avec 1.10 ⁷ de CSN de phenotype CMH-I ^L /CD90 ^H cryoconservées et décongelées à température ambiante. Les cellules sont injectées par perfusion intra veineuse. Les résultats montrent une normalisation des concentrations plaquettaires sur 3 mois. Le traitement a également permis de s’affranchir des traitements corticoïdes.

Figure 12 : Exemples représentatifs des différents profils cytométriques et leurs caractéristiques associées.

Des CSN sont isolées de placenta canin et amplifiées sur plusieurs passages (2 à 5). Plusieurs échantillons de CSN sont analysés en cytométrie en flux pour évaluer l’expression du CD90 (FL2-PE) et du CMH-I (FL4-APC). En fonction du profil phénotypique CD90/CMH-I, les CSN peuvent être classées en plusieurs catégories suivant leurs caractéristiques biologiques et leur composition. La mise en place de la matrice d’analyse est présentée en figure 18.

Figure 13 : Hétérogénéité d’expression du CMH-I et du CD90 parmi les CSN amplifiées

Des CSN sont isolées de placenta canin, de sang de cordon ombilical équin et de matrice de cordon ombilical équin (respectivement n=l l, 13 et 18). Les CSN ont été amplifiées à minima sur un passage et analysées en cytométrie en flux pour évaluer leur pourcentage de positivité et la rMFI (« relative mean of fluorescence intensity ») pour le CMH-I et le CD90. Cette figure illustre les disparités de marquages et d’expression pour ces deux marqueurs parmi les CSN issues d’une même source.

Figure 14 : Exemple représentatif des fluctuations de positivité en fonction de différents seuils pour de faibles expressions de marqueurs.

Des CSN sont isolées de placenta canin, amplifiées et analysées par cytométrie en flux. L’expression du CD90 est évaluée par simple marquage en FL2 (Fluorescence PE). Les seuils de positivité sont placés à environ 2 (CD90pos_2SD) ou 3 (CD90pos_3SD) écart- types de la population isotypique PE, soit respectivement à 4,5% ou 0,3% de la population isotypique PE. Cette figure montre l’amplitude des résultats en fonction des deux seuils établis pour une même population de CSN exprimant faiblement le CD90 (entre 89,0 et 65,3%).

Figure 15 : Disparité de potentiel prolifératif parmi les populations de CSN issues de placentas canins. Des CSN sont isolées de placenta canin et amplifiées sur plusieurs passages jusqu’à obtenir un temps de doublement supérieur à lOOh. A chaque passage le nombre de doublement cellulaire et le temps de doublement cellulaire est calculé selon l’Exemple C, partie 1. Le nombre de doublement maximal est alors déterminé sur l’ensemble de la période d’amplification. La moyenne du temps de doublement est réalisée sur 3 passages entre P2 et P4 de manière à obtenir des données représentatives du potentiel de prolifération des CSN.

Figure 16 : Organigramme du procédé de fabrication de CSN CMH-I ^L /CD90 ^H à usage thérapeutique - procédé de fabrication assisté par matrice d’analyse.

Organigramme permettant à la fois de déterminer la matrice d’analyse CMH-I/CD90, de récolter les données d’analyse et permettant un double contrôle conditionnant l’industrialisation d’unités thérapeutiques et leur utilisation. La condition « Vrai » implique qu’une population de CSN est qualifiée comme CMH-I ^L /CD90 ^H selon l’invention.

Figure 17 : Organigramme du procédé de fabrication de CSN CMH-I ^L /CD90 ^H à usage thérapeutique - procédé de fabrication avec analyse conditionnelle. Organigramme permettant un double contrôle conditionnant l’industrialisation d’unités thérapeutiques et leur utilisation. A la différence du procédé de fabrication assisté par matrice d’analyse (Figure 16), la caractérisation des cellules se base sur une analyse conditionnelle : si la population de CSN analysée est hétérogène, la proportion de la sous population CMH-I ^L /CD90 ^H peut être évaluée à l’aide d’une matrice d’analyse. Si la population est homogène, la population doit répondre aux conditions de seuils.

Figure 18 : Exemples représentatifs d’établissement de matrices d’analyse des CSN avec l’outil de double marquage CMH-I et CD90.

Des CSN sont isolées de placenta canin ou décongelées en passage précoce et amplifiées sur plusieurs passages. Les cellules sont analysées par double marquage CMH-I et CD90. Ici les deux exemples montrent une individualisation des sous-populations CMH-I ^L /CD90 ^H et CMH-I ^H /CD90 ^L au cours de l’amplification. Les deux exemples ont permis d’établir une matrice d’analyse pour la quantification de ces deux types de sous-populations de CSN. Les CSN s’orientant vers un phénotype CMH-I ^L /CD90 ^H sont considérées comme industrialisables (CSN-2).

EXEMPLES

EXEMPLE A : Procédé d’obtention d’une population de CSN

1. Isolement des CSN de placenta canin

Les annexes extra embryonnaires canines (placenta, cordon ombilical) sont prélevées de manière aseptique lors de césariennes pratiquées chez des chiennes gestantes à terme. Dès que le chiot nouveau-né est sorti du sac amniotique et mis en sécurité, le tissu extra embryonnaire est immédiatement transféré dans une boite de transport contenant une solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (D-PBS) pour être acheminé au laboratoire. Le traitement du tissu extra embryonnaire est réalisé au maximum dans les 48h suivant le prélèvement. L’ensemble des étapes de traitement du tissu est réalisé dans un environnement contrôlé, sous un poste de sécurité microbiologique (PSM).

Le tissu est transféré dans une boite de Pétri de 100 cm2 et la membrane amniotique résiduelle est éliminée mécaniquement par dissection. Le placenta est placé face embryonnaire contre la surface plastique de la boite et l’utéroverdine présente sur la face d’origine maternelle est séparée du placenta par grattage du tissu. Le placenta est rincé 3 à 5 fois dans des bains successifs de D-PBS. Les vaisseaux sanguins et le cordon ombilical sont ensuite retirés mécaniquement du placenta. Le tissu placentaire est disséqué en fragments de 10-20 mm ² environ puis soumis à une digestion enzymatique en incubant les fragments de tissu dans une solution composée de DMEM (milieu de Eagle modifié de Dulbecco) contenant 0,5-4 mg/ml de collagénase de type I, et plus spécifiquement une concentration de 1 mg/ml de collagénase de type I. La digestion enzymatique se déroule à 37°C durant lh mais une digestion comprise entre 30 min et l6h peut être réalisée en diminuant la température d’incubation (température ambiante (l8-22°C ou 4°C). Au terme de la digestion, l’activité enzymatique est arrêtée par dilution, en ajoutant du DMEM contenant au moins 10% de sérum de veau fœtal (S VF) en quantité équivalente à la solution de digestion enzymatique. La solution est alors filtrée sur tamis de 70-100 mhi. Les cellules récupérées sont centrifugées à 800 g durant 10 min. Le culot cellulaire contenant les cellules stromales néonatales est rincé au DMEM et de nouveau centrifugé à 800 g durant 10 min. Le culot cellulaire est repris dans du milieu de culture constitué de

DMEM, 10% de S VF, 2 mM glutamine et de 0 à 20 ng/ml de facteur de croissance fïbroblast growth factor (FGF). Les cellules sont comptées et ensemencées dans des boites de culture à une densité comprise entre 10 ⁴ et 2.10 ⁴ cellules/cm ² . Les cellules sont alors cultivées dans le milieu de culture décrit ci-dessus en atmosphère contrôlé à 37°C et contenant 5% de C0 ₂ . Le milieu est changé au bout de 48h puis tous les 2-3 jours. Les cellules sont passées lorsque la confluence atteint 70-80%.

2. Isolement des CSN de sang de cordon ombilical équin

Le sang de cordon ombilical équin ou sang placentaire (SPL) est récupéré lors du poulinage. Il est réalisé de façon la plus aseptique possible par ponction du sang de cordon ombilical au niveau de la veine ombilicale à l’aide d’une aiguille connectée à une poche de prélèvement sanguin. Les poches de SPL sont acheminées au laboratoire en condition de température contrôlée (4-l2°C) et doivent être traitées dans les 48h suivant le prélèvement. L’ensemble des étapes de traitement de l’échantillon sont réalisées dans un environnement contrôlé, sous poste de sécurité microbiologique (PSM).

Le SPL est transféré dans un contenant stérile et dilué au demi avec du D-PBS ou toute autre solution physiologique. Le SPL ainsi dilué est déposé sur une solution de Ficoll (1.077 g/ml) contenue dans un tube, à raison de 2 volumes de sang dilué au demi pour 1 volume de Ficoll. Les tubes sont centrifugés pendant 20-45 min à 700-1000 g sans étape de freinage. Le SPL est alors séparé par gradient de densité et un anneau cellulaire se forme à l’interphase entre le plasma dilué et le Ficoll. L’anneau cellulaire est récupéré par aspiration et lavé au D-PBS dans un volume final de 50 ml. Les cellules sont alors centrifugées entre 300-500 g de 5 à 10 min. Une étape de lyse des érythrocytes peut être réalisée en incubant le culot cellulaire avec du tampon de lyse des érythrocytes pendant quelques minutes (3-10 min). Compléter à 50 ml par du D-PBS. Les cellules sont centrifugées entre 300-500 g de 5 à 10 min. Le culot cellulaire contenant les cellules stromales néonatales est repris dans du DMEM contenant 2 mM de glutamine, 10% de SVF et 0-20 ng/ml de FGF (milieu d’amplification). Les cellules sont comptées et ensemencées dans des boites de culture à une densité comprise entre 10 ⁵ et 2, 5.10 ⁵ cellules/cm ² . Les cellules sont alors cultivées en milieu d’amplification en atmosphère contrôlé à 37°C et contenant 5% de C0 ₂ . Le milieu est changé au bout de 48h puis tous les 2-3 jours. Les cellules sont passées après l’émergence de colonies fibroblastiques après 10- 15 jours.

3. Passage cellulaire et amplification

A sub-confluence, les cellules subissent un passage cellulaire et optionnellement, une procédure d’amplification. Les CSN sont rincées au D-PBS et traitées par 0,05% de trypsine-EDTA durant 2-5 min à 37°C. Cela permet de détacher les cellules et de former une population de cellules isolées. Les cellules sont ensuite reprises avec du milieu d’amplification constitué de DMEM, 10% de SVF, 2 mM glutamine et de 0 à 20 ng/ml de facteur de croissance fîbroblaste (FGF) et centrifugées entre 300-500 g durant 5 à 10 min. Les CSN sont reprises dans du milieu d’amplification, et comptées par comptage manuel (bleu tryan et cellules de Malassez) ou à l’aide d’un cytomètre. Elles sont ensuite ensemencées à hauteur de 1500 à 5000 cellules/cm ² et cultivées sur support plastique de culture cellulaire dans du milieu d’amplification et en atmosphère contrôlé à 37°C et contenant 5% de C0 ₂ . Au cours du processus d’amplification les cellules peuvent subir entre 0 et 15 passages cellulaires.

4. Congélation et cryoconservation des CSN

A l’issue du premier ou second passage cellulaire (P1-P2), les cellules peuvent être cryoconservées en unités cellulaires d’ensemencement (seed units). Pour ce faire, après comptage, les CSN sont centrifugées entre 300-500 g durant 5 à 10 min et le culot cellulaire est repris dans du milieu de congélation composé soit de milieu DMEM enrichi avec 5-20% de SVF et 5-10% (vol : vol) de DMSO ou dans un milieu de cryopréservation commercial, contenant ou non une fraction de DMSO. La concentration cellulaire est comprise entre 1.10 ⁶ et 15.10 ⁶ cellules par ml de milieu de congélation. La congélation des cellules est réalisée en condition de descente en température contrôlée, en utilisant par exemple un container CoolCell® Cell Freezing Containers (BioCision) et en suivant la procédure de congélation telle qu’elle est décrite par le fabricant. Les cellules sont alors transférées pour stockage en froid négatif à des températures comprises entre -70°C et - l96°C.

Les unités cellulaires d’ensemencement peuvent être utilisées pour générer des unités cellulaires à visée thérapeutique. Les unités cellulaires d’ensemencement sont décongelées à 37°C pendant 3-6 min et amplifiées in vitro. Les cellules sont ensemencées en milieu de culture à la densité de 1500-3000 cellules/cm2. Les cellules sont amplifiées par passage successif in vitro. Lorsqu’un nombre significatif de cellules est produit (par exemple >150.10 ⁶ cellules), les cellules sont congelées selon le protocole décrit précédemment. Les cellules sont distribuées dans des flacons operculables scellés hermétiquement à raison de 1.10 ⁶ - 15.10 ⁶ cellules/ml en milieu de congélation exempt en produit d’origine animale (comme par exemple le milieu de cryoconservation Recovery™ Cell culture freezing medium (Thermo Fisher), Cryostem™ freezing medium (Biological Industries). Les flacons sont descendus en température selon un protocole de descente en température contrôlée, à raison de -l°C/min jusqu’à -80°C. Les flacons sont ensuite transférés à -80°C pour stockage. Une fois obtenue, la population de CSN est caractérisée d’une part par ses caractéristiques structurales (présence/absence de marqueurs) et d’autre part par ses caractéristiques fonctionnelles (prolifération, différenciation etc.).

EXEMPLE B : Caractérisation structurale de la population de CSN

1. Analyse cytométrique des CSN

L’analyse cytométrique vise à déterminer la présence de marqueurs membranaires à la surface des CSN notamment le CDl lb, CD14, CD31, CD34, CD45, HLA-DR et plus précisément à déterminer les taux d’expression du CMH-I et du CD90, grâce à l’utilisation d’un panel d’anticorps spécifiques de chaque marqueur.

Après isolement des cellules et au cours de la période d’amplification, des CSN au passage P2 à P7 cultivées dans une T75 sont rincées avec 10 ml de D-PBS. 5 ml de trypsin/EDTA sont alors rajoutés et les cellules sont incubées 2 min à 37°C. Les cellules sont décollées et récupérées dans un tube 15 ml. Le volume est ajusté à 15 ml par ajout de milieu d’amplification. Les cellules sont centrifugées 10 min à 300-500 g. Le surnageant est aspiré puis le culot cellulaire est repris dans 2 ml de milieu d’amplification. 40 mΐ de la suspension sont dilués avec 40 mΐ de bleu de trypan. La dilution est alors comptée par dépôt sur lame de comptage et acquisition par un compteur cellulaire de type Luna.

De manière générale entre 10 ⁵ -5.10 ⁵ cellules sont récupérées pour l’analyse cytométrique. En particulier, 3 prélèvements de 2.10 ⁵ cellules sont transférés dans des eppendorfs de 1,5 ml. Les cellules sont reprises dans 1 ml de D-PBS et centrifugées à 500 g pendant 5 min. Un second lavage est réalisé dans les mêmes conditions expérimentales. Après élimination du surnageant, les cellules des trois tubes sont respectivement reprises dans 1 volume de 30-100 mΐ, en particulier 50 mΐ, de tampon de marquage. Ce tampon est composé de D-PBS et de 0,5-1% (v/v) d’albumine de sérum bovin (BSA) ou de 0.5-2% (v/v) de sérum de veau fœtal. 2,5 mΐ d’un anticorps primaire couplé ou non à un fluorochrome et ciblant spécifiquement le marqueur membranaire d’intérêt est ajouté aux 50 mΐ de tampon de marquage.

La concentration optimale d’anticorps utilisé pour le marquage doit être préalablement déterminée par un homme du métier. L’incubation nécessaire au marquage doit également être déterminée par l’homme du métier et comprise entre 15 min et lOh à 4°C à l’abri de la lumière. En particulier, les cellules sont incubées 20 min à 4°C à l’abri de la lumière.

Un marquage avec un anticorps secondaire ciblant l’anticorps primaire peut être réalisé, après lavage au D-PBS, dans le cas où l’anticorps primaire n’est pas directement couplé à un fluorochrome. Ainsi, dans le cas où l’anticorps primaire n’est pas couplé à un fluorochrome, 1 ml de D-PBS est rajouté et les cellules sont centrifugées 5 min à 500 g. Le surnageant est éliminé et 50 mΐ de tampon de marquage (D-PBS/ 2% de BSA) comprenant 1 mΐ de solution d’anticorps secondaire ciblant l’anticorps primaire et marqué par un fluorochrome phycoérythrine (PE) est ajouté. Les cellules sont incubées 20 min à 4°C à l’abri de la lumière. Par la suite 1 ml de tampon de marquage est rajouté et les cellules sont centrifugées 5 min à 500 g. Les cellules sont reprises dans 200 mΐ de tampon de marquage. Des contrôles isotypiques adaptés à chaque marquage doivent être utilisés comme contrôle négatif Suite à l’incubation avec les anticorps, les cellules sont lavées en D-PBS, centrifugées 5-10 min à 500 g et reprise dans un volume de 100 à 250 mΐ de tampon de marquage pour analyse au cytomètre de flux (Accuri C6, BD Biosciences). 2. Sélection sur la base de l’expression du CMH- et/ou du CD90

a. Analyse cytométrique sur anticorps validé avec seuils de

positivité/négativité définis

L’analyse cytométrique est réalisée de façon à garantir un signal issu de la fluorescence des anticorps couplés ou non à un fluorochrome qui se sont potentiellement fixés spécifiquement sur les épitopes d’intérêts (appartenant au CD90 ou au CMH-I). Pour ce faire, l’homme du métier devra correctement et minutieusement régler les photomultiplicateurs et les compensations de fluorescence. Par ailleurs la sélection minutieuse de la population cellulaire à analyser doit être réalisée. Il doit d’autre part utiliser des échantillons contrôles non marqués, utiliser des échantillons contrôles marqués par des IgG totaux adéquats couplés aux fluorochromes d’intérêts et ceci afin de garantir que le signal mesuré sur les échantillons analysés prenne à la fois en compte, l’auto fluorescence des cellules et les possibles liaisons non spécifiques des anticorps. Un traitement potentiel des cellules par des bloqueurs de récepteurs Fc peut également être envisagé.

Afin de déterminer les seuils de positivité/négativité des cellules, les bons contrôles isotypiques respectifs de chaque anticorps couplé à leur fluorochrome doivent être minutieusement sélectionnés.

En Figure 1, quatre populations de CSN ont été analysées en cytométrie. Une analyse des cellules non marquées est réalisée tout d’abord. Une fenêtre d’analyse basée sur les paramètres d’analyse FSC-A/SSC-A est définie pour sélectionner les évènements correspondant aux cellules et éliminer les débris cellulaires. Par la suite une fenêtre d’analyse basée sur les paramètres d’analyse FSC-H/FSC-A est définie pour l’analyse des cellules uniques (élimination des doublets cellulaires) (Figure 1 A).

Fe tube marqué par un isotype primaire est analysé suivant les paramètres précédents. Fe marquage PE est visualisé sur le canal de fluorescence adéquat correspondant à la fluorescence d’intérêt du cytomètre (dans la Figure 1B, le canal utilisé est FF2). F’analyse est réalisée sous forme d’une représentation en 2D (histogramme à 2 paramètres) sur la base de l’analyse de la fluorescence issue du fluorochrome utilisé (FF:2 pour PE) et de l’auto fluorescence des cellules en utilisant un canal de fluorescence avec un spectre d’excitation/émission non utilisé dans l’analyse (FF-4) (histogramme FF/comptage d’évènements). Fe seuil de positivité est placé de telle sorte à ce que moins de 0,5% et plus de 0,1% des cellules soient considérées comme positives. Cette même démarche est réalisée pour chacun des marqueurs CMH-I (Figure 1C) et CD90 (Figure 1D et 1E). Fes 4 échantillons analysés présentent des expressions variables mais homogènes du CMH-I (Figure 1C) tandis que l’analyse du CD90 met en évidence deux populations distinctes au sein des échantillons de CSN (Figure 1D), pour ce dernier marquage il est ainsi possible de déterminer la proportion de cellules exprimant ou non le CD90. Les populations CSN-l et CSN-2 répondent aux critères de sélection pour une expression de CMH-I inférieure à 10% et une expression du CD90 de plus de 80%. De ce fait CSN-l et CSN-2 sont considérées comme CMH-I ^L /CD90 ^H tandis que les populations CSN-3 et CSN-4 sont considérées comme CMH-I ^H /CD90 ^l .

b. Variations de taille/auto fluorescence et représentation 2D

Il est important de garder l’ensemble de ces paramètres fixes pour l’analyse des populations de CSN d’intérêt afin de déterminer la proportion de CSN exprimant ou non les marqueurs.

Il est possible que des variations de la taille des populations de CSN soient observables. Ainsi, les sélections des fenêtres d’analyse ou « gâte » des populations à analyser ne doivent pas varier entre les échantillons. Néanmoins, dans le cas où une population hétérogène en taille gêne l’analyse cytométrique, une séparation in silico des différentes sous-populations homogènes en taille peut être envisagée. Dans ce dernier cas de figure, de nouveaux seuils de positivité/négativité sont à déterminer pour chaque sous-population par l’homme du métier.

Il est possible qu’en parallèle d’une variation de taille, une variation de F auto fluorescence des cellules puisse être observable. Dans ce dernier cas, un mode de représentation des résultats sur deux canaux d’acquisitions (ex : FL-2/FL-4) est nécessaire afin de définir finement les variations d’expression des marqueurs entre les différentes sous-populations émettant des niveaux d’auto fluorescence variables. Là encore, la détermination de nouveaux seuils de positivité/négativité peut être à réaliser par l’homme du métier. Il est néanmoins à noter que dans le cas où la population de CSN analysée possède une morphologie ou autofluorescence trop éloignée des populations d’origines, cette dernière peut être considérée comme non conforme et de ce fait exclue.

c. Exemple de détermination de seuils de MFI relatives maximum pour le

CMH-I avec l’ utilisation de deux anticorps secondaires différents

Par seuil de MFI relatives (rMFI) maximum, nous entendons la valeur de MFI relative limite permettant de conserver, pour la procédure d’industrialisation, toutes les souches de CSN possédant une rMFI inférieure à cette valeur. Sur la base du paramétrage et de l’analyse présentée à la section B. 2 a) précédemment, plusieurs échantillons de CSN sont analysés.

Sept populations de CSN issues de sept placentas différents ont été analysées d’un point de vue prolifératif Deux d’entre elles ont permis une amplification supérieure à 20 doublements cellulaires. Ces cellules ont été analysées entre P3 et P4 selon la procédure décrites dans l’exemple B, partie 1).

A titre d’exemples nous détaillons ci-dessous la détermination de deux seuils de rMFI maximum pour deux stratégies d’immunomarquage différentes (Figure 2A et Figure 2B). Les caractéristiques des anticorps utilisés pour ces deux stratégies sont répertoriées dans la table 2 ci-dessous.

Table 2 : Caractéristiques des anticorps utilisés

L’isotype utilisé est un isotype souris e-COL2002/COLIS205C IgG2a primaire non couplé à un fluorochrome (Monoclonal Antibody Center Washington State University). Un anticorps anti-CMH-I canin de type souris DG-BOV2001/DG-H58A IgG2a a été utilisé pour le marquage primaire du CMH-I (Monocloal Antibody Center Washington State University).

Deux types d’anticorps secondaires lapin F(ab')2 anti souris IgG STAR12A (AbSerotec) et chèvre t F(ab')2 anti souris IgG secondaire (eBioscience) couplés respectivement à un fluorochrome de type PE (Figure 2A) et APC (Figure 2B) ont été utilisés pour cette étude et ont permis de déterminer deux seuils de rMFI maximums spécifiques à chaque anticorps secondaire.

Conformément à la partie Exemple B. 2)a) de la présente demande, les cellules marquées par l’isotype ou par le CMH-I sont analysées au cytomètre C6 Accuri. Les canaux utilisés pour l’analyse des fluorescences émises correspondent au canal FL-2 pour l’anticorps lapin F(ab’)2 anti souris IgG STAR12A (AbSerotec) et FL-4 pour l’anticorps chèvre F(ab’)2 anti souris IgG secondaire (eBioscience). Pour chaque anticorps et chaque souche de CSN (marquées à G isotype et au CMH-I), les valeurs des MFI sont extraites. Les rMFI de chaque échantillon marqué au CMH-I sont calculées par normalisation des valeurs de MFI des cellules marquées par rapport à celles des cellules incubées avec F isotype (MFI marqué/MFI isotype).

L’analyse de l’expression du CMH-I indique des expressions variables de ce marqueur entre les différents échantillons. La méthode analytique proposée consiste à normaliser les valeurs de fluorescence moyenne (MFI ; Mean Fluorescence Intensity) des cellules marquées avec l’anticorps d’intérêt (ici MFI FL2 (CMH-I-PE)) avec la MFI des cellules marquées avec l’isotype couplé au même fluorochrome (ici MFI FL2 _(isotype-PE) )· Un ratio (rMFI) est ainsi calculé MFI FL2 (CMH-I-PE)/ MFI FL2 _(isot y _pe -PE ₎ .

Pour chaque anticorps secondaire utilisé :

la valeur de rMFIla plus haute des souches répondants aux critères de nombre de doublement minimum, chondrogenèse positive, ostéogenèse négative et immunomodulation positive est prise pour le calcul du seuil maximal de rMFI ;

- et la valeur de rMFI la plus basse des souches dont le nombre de doublement est inférieur à 20 est également retenue.

Ainsi, pour l’anticorps lapin F(ab')2 anti souris IgG STAR12A (AbSerotec) marqué PE la moyenne de ces deux valeurs de rMFI est calculée et permet de déterminer un seuil de rMFI maximale de 2,5 (Figure 2A). Pour l’anticorps chèvre F(ab')2 anti souris IgG secondary (eBioscience) marqué APC, la moyenne de ces deux valeurs de rMFI est calculée et permet de déterminer un seuil de rMFI maximale de 10 (Figure 2B).

d. Exemple de détermination de seuils d’acceptation du CD90

La même démarche décrite en section 2) c). peut être réalisée pour la détermination du seuil de rMFI minimal pour le CD90 permettant d’exclure les cellules possédant un taux d’expression du CD90 trop faible. L’analyse du CD90 chez les CSN, celui-ci est exprimé de façon sensiblement hétérogène dans les différentes populations de CSN. A la différence du CMH-I, la perte de l’expression du CD90 se matérialise par l’émergence d’une sous population distincte. Deux niveaux d’expression du CD90 sont ainsi observables, une expression faible (CD90 ^L ) et une expression forte (CD90 ^H ). De ce fait, les deux populations normales mises en évidence ne permettent pas toujours la possibilité de déterminer une unique valeur de MFI. e. Exemple de détermination de seuils d’acceptation du CMH-I et du CD90 par une stratégie de double marquage sur population de CSN hétérogènes.

Afin de limiter les contraintes liées aux populations hétérogènes pour la détermination de seuils, la même démarche décrite en section 2) c). peut être réalisée pour la détermination du seuil de rMFI minimal pour le CD90 et maximal pour le CMH-I et ce à partir de populations hétérogènes (mixtes) isolées. Parmi 14 populations de CSN analysées en double marquage CD90 et CMH-I au cours de l’amplification cellulaire, seulement une population de CSN n’est pas passée par un stade de population hétérogène au regard du CD90 et du CMH-I. Sur les 13 autres, un stade de population mixte (c.a.d. représentées par la coexistence de deux populations CMH-I ^H /CD90 ^L et CMH-I ^L /CD90 ^h ) a pu être observé entre Pl et P4. Ces deux sous-populations ont toujours montré des différences d’expressions des deux marqueurs, mettant en évidence une population d’intérêt CMH- I ^L /CD90 ^H et une autre population CMH-I ^H /CD90 ^l . L’analyse des rMFI des deux sous populations respectives CMH-I ^H /CD90 ^L et CMH-I ^L /CD90 ^H permet d’établir des seuils de discriminations afin d’identifier la population d’intérêt CMH-I ^L /CD90 ^H (Figure 3). Concernant le CMH-I, le seuil permettant d’identifier une population CMH-I ^L /CD90 ^H et minimisant les faux positifs est une rMFI maximum de 15. Pour le CD90, la rMFI minimale est de 20.

EXEMPLE C : Caractérisation biologique de la population de CSN

1. Evaluation de l’activité proliférative des CSN

La prolifération des CSN est évaluée pendant 7 à 8 passages cellulaires consécutifs (si réalisable). A chaque passage cellulaire (1 fois par semaine ; soit tous les 6 à 8 jours), les cellules sont détachées de leur support de culture à l’aide de trypsine/EDTA 0.5% pendant 2 -3 minutes. Du milieu de culture est ajouté et les cellules sont centrifugées 5 min/300 g. Le culot cellulaire est repris dans un volume défini de milieu de culture et les cellules sont comptées par technique d’exclusion au bleu trypan à l’aide d’un compteur électronique. Le nombre de doublement à chaque passage cellulaire est calculé selon la formule suivante : Nb de doublements = LOG (Nf/Ni)/LOG(2) (Nf : nombre de cellules finales et Ni : nombre de cellules initiales). Le nombre total de doublements cellulaires est égal à la somme du nombre de doublements cumulés à chaque passage cellulaire. L’amplification cellulaire est arrêtée dès que le nombre de doublements est inférieur à 1, ce qui signifie que la population cellulaire n’est plus capable de doubler. L’activité proliférative d’une population de cellules CMH-I ^L /CD90 ^H est comparée à celle d’une population de cellules CMH-I ^H /CD90 ^L (Figure 4).

Une population cellulaire de CSN est jugée comme acceptable pour être industrialisée si le nombre total de doublements cellulaires consécutif des cellules est supérieur ou égal à 20. Comme le montre la table 3, les cellules de phénotype CMH-I ^L /CD90 ^H possèdent un nombre total de doublements cellulaires consécutif des cellules supérieur à 20, contrairement aux cellules CMH-I ^H /CD90 ^l . Cela démontre bien les CSN de phénotype CMH-I ^L /CD90 ^H possède une activité proliférative bien supérieure aux cellules CMH- I ^H /CD90 ^l , ce qui leur permet ainsi d’être utilisées pour une industrialisation contrairement aux cellules CMH-I ^H /CD90 ^l .

2. Différenciation chondro énique

La capacité de différenciation chondrogénique des CSN est vérifiée par incubation des cellules dans un milieu de différenciation spécifique de cette voie de différenciation.

Pour cela, les CSN sont détachées de leur support plastique par trypsination et comptées. Les cellules sont alors utilisées pour former des micromasses par gravitation dans une goutte de milieu d’amplification. Pour ce faire, une solution d’environ 7.10 ⁶ cellules/ml de milieu d’amplification est alors préparée. 35 mΐ de cette solution correctement homogénéisée sont alors déposés sous forme de goutte sur une surface plastique non traitée et non coatée. Cette surface est alors retournée en incubation 24h en atmosphère humide à 37°C et 5% de C0 ₂ . A titre d’exemple, le couvercle d’une boite de Pétri retourné sur son socle contenant du D-PBS peut être utilisé comme support de culture.

Après 24h d’incubation, une micromasse de CSN s’est formée à la base de la goutte. La micromasse est récupérée et transférée en plaque 6 puits de telle façon à déposer 5 micromasses par puits. 2 ml de milieu de différenciation chondro cytaire sont alors ajouté par puits afin d’induire la différenciation chondrogénique des CSN. Ce milieu se compose de DMEM 4,5 g/l de glucose, d’isuline-selenium-transferin IX, de dexamethasone 0,1 mM, de sodium pyruvate 1 mM, de 50 pg/ml d’acide ascorbique-2-phosphate, de 40 pg/ml de L-Proline, de 10 ng/ml de TGF- b3 (ou une combinaison de 10 ng/ml de TGF- bΐ et de 50 ng/ml de BMP-2). La différenciation chondrogénique est réalisée sous 7 jours en changeant le milieu de différenciation tous les 2-3 jours. Une acquisition au microscope photonique est réalisée au terme de la culture par un Nikon TS2 grossissement x4 couplé à une caméra TS2-P-CF.

Trois populations de CSN ont été analysées : CNS-l, CSN-2 et CSN-3. La population CSN-l est de phénotype CMH-I ^L /CD90 ^H tandis que les populations CSN-2 et CSN-3 sont de phénotype CMH-I ^H /CD90 ^l .

Au terme de la culture, les micromasses observées au microscope montrent une différence substantielle de taille (Figure 5). La surface occupée sur l’image par les micromasses est analysée sous ImageJ et exprimées en pixels ² . Les CSN CMH-I ^L /CD90 ^H forment une micromasse chondrogénique de plus grande surface que les CSN CMH-I ^H /CD90 ^L (Figure 5A et Figure 5B).

Le milieu est par la suite retiré des puits et le néo-tissu et utilisé pour une extraction ARN ou protéique afin d’analyser l’expression de marqueurs spécifiques du lignage chondrogénique tels que le collagène de type II, l’aggrécanne, les COMP, SOX9.

Les ARN totaux sont extraits par broyage des micromasses à l’aide d’un pilon plastique en présence de Trizol Reagent (Sigma). Le reste de la procédure d’extraction est réalisée dans les conditions du fabricant. Les ARN sont rétro-transcrits par l’utilisation d’une PrimeScript Reverse Transcriptase (Clonetech) selon les conditions du fabricant. L’analyse RTqPCR est réalisée à l’aide d’un thermocycleur Mx3000p ainsi que du logiciel MxPRO (Stratagene). Les résultats sont exprimés sous forme de taux d’expression relatif des gènes cibles par rapport à un gène de ménage (du type Gapdh) grâce à la méthode des 2-AACT. L’expression du gène Col2al a été analysée par RTqPCR et normalisée par l’expression du gène Gapdh. Cette expression du gène Col2al a été suivie dans les micromasses obtenues pour chaque population cellulaire (CSN-l, CSN-2 et CSN-3) après 7 jours de différenciation chondrogénique (traité) par rapport à cette même population cellulaire n’ayant pas subi de différenciation chondrogénique (Ctrl). Les données sont exprimées en expression relative de Col2al par rapport au contrôle (Figure 5C).

Nous considérons comme acceptable une valeur d’expression relative de Col2al par rapport aux cellules indifférenciées cultivées sur support plastique supérieure à 100.

L’expression de ces marqueurs permet de conclure à un potentiel de différenciation chondrogénique des CSN.

La figure 5D démontre que l’expression du gène Col2al chez la population CSN-l de phénotype CMH-I ^L /CD90 ^H est plus élevée que dans les populations CSN-2 et CSN-3 qui sont de phénotype CMH-I ^H /CD90 ^l . Cela permet de conclure à un potentiel de différenciation chondrogénique plus important chez des CSN CMH-I ^L /CD90 ^h . Sur l’analyse de 8 populations de CSN, les résultats ont montré une différence d’expression du Col2al entre les CSN CMH-I ^H /CD90 ^L et CMH-I ^L /CD90 ^H (Figure 5D).

3. Différenciation ostéogénique

La faible capacité de différenciation ostéogénique des CSN est vérifiée par incubation des cellules dans un milieu de différenciation spécifique de cette voie de différenciation.

Pour cela, les CSN sont détachées de leur support plastique par trypsination et comptées. Les CSN sont ensemencées à une densité comprise entre 1500 et 5000 cellules/cm ² en plaque 6 puits dans du milieu d’amplification sous atmosphère contrôlé à 37°C et contenant 5% de C0 ₂ . Lorsque les cellules atteignent 50-75% de confluence, le milieu de prolifération est retiré et remplacé par du milieu de différenciation ostéogénique composé de DMEM, 10% de SVF, 2 mM glutamine, 0,1 mM dexaméthasone (Sigma), 50 mM acide ascorbique 2-phosphate (Sigma) et 10 mM b-glycérophosphate (Sigma). Le milieu est renouvelé 2 fois/semaine, pour une période comprise entre 10 et 15 jours.

A l’issue du processus de différenciation, les puits sont lavés au D-PBS et les cellules sont fixées avec par exemple une solution de formaline tamponnée neutre 10% pendant lh au minimum. Une coloration avec une solution de rouge Alizarine 1% (poids/volume) est effectuée pour mettre en évidence la présence de dépôts calciques. Les puits sont ensuite rincés en H ₂ 0 et la coloration est analysée sous microscope.

L’absence de dépôts calciques permet de conclure à une absence de potentiel de différenciation ostéogénique.

4. Evaluation du potentiel immunomodulateur des CSN par l’expression de PGE2

Le potentiel des CSN à exprimer des molécules exerçant un effet immunomodulateur est évalué en dosant les molécules sécrétées par les CSN de phénotype CMH-I ^L /CD90 ^H en condition basale ou après stimulation avec une cytokine proinflammatoire.

Pour cela, les CSN CMH-I ^L /CD90 ^H ensemencées à 5.10 ⁴ cellules/cm ² sont cultivées en milieu de prolifération tel que décrit précédemment pendant 72h ou en milieu complémenté avec 5 ng/ml d’interféron gamma. A l’issue de cette incubation, le milieu de culture est centrifugé 10 min/500 g. Le surnageant est congelé à -80°C. L’analyse des facteurs d’intérêt est réalisée par test ELISA en suivant les instructions propres à chaque kit. Le dosage de la prostaglandine E2 (PGE2) est effectué à l’aide du kit KGE004B (R&D System). Les résultats en Ligure 6 mettent en évidence une augmentation de l’expression de PGE2 lorsque les CSN sont traitées avec une cytokine proinflammatoire telle que l’ILN, ce qui démontre un potentiel des CSN à exprimer des molécules, en particulier le PGE2, pouvant exercer un effet immunomodulateur.

5. Evaluation du potentiel immunomodulateur des CSN par leur effet antiprolifératif sur les lymphocytes

La capacité des CSN à inhiber la prolifération des lymphocytes in vitro est évaluée en co- cultivant les CSN de phénotype CMH-I ^L /CD90 ^H avec des cellules mononuclées sanguines (PBMCs) en présence d’un agent mitogène.

Pour cela, les PBMCs sont isolées à partir d’un prélèvement sanguin réalisé chez un chien donneur ou d’un cheval donneur sur un gradient de Ficoll. Les PBMCs sont ensuite incubés avec un colorant fluorescent (CellTrace CFSE, Thermo Fisher) qui permet de mesurer la prolifération cellulaire sur plusieurs générations. 0,2.10 ⁶ PBMCs marqués au Celltrace sont ajoutés dans les puits d’une plaque 96 puits dans lesquels ont été ensemencées la veille des CSN à la concentration (2.10 ⁴ CSN/puits) ; permettant ainsi d’obtenir un ratio CSN: PBMC équivalent à 1 :l0. Les CSN sont traitées à la mitomycine (10 pg/ml pendant l,5-2h à 37°C) et rincées 3 fois en milieu de culture avant l’ajout des PBMCs. Le milieu de prolifération des lymphocytes est ajouté (RPMI, 10% SVF, 2 mM glutamine, 10 mM hepes, 50 mM b-mercaptoethanol, 5 pg/ml concanavalin A). Les co- cultures PBMC/CSN et les cultures contrôle (PBMC sans CSN) sont incubées 4 jours en incubateur à 37°C. A l’issue de la culture, les cellules non adhérentes sont récupérées des puits, centrifugées et lavées au D-PBS. Les cellules sont ensuite marquées avec un anticorps anti-CD3 couplé à un fluorochrome FITC pendant 30 min à 4°C. Les cellules sont ensuite lavées au D-PBS avant analyse au cytomètre de flux (Accuri C6, BD Biosciences). L’analyse cytométrique consiste à évaluer le signal du Celltrace au sein de la population CD3+ viable. Un indice de prolifération (IP) est calculé en utilisant un logiciel d’analyse, comme par exemple Modfït®. L’indice de prolifération des PBMCs cultivés en présence d’agent mitogène sans CSN (IP Ctrl) est arbitrairement fixé à 1. L’indice de prolifération des PBMCs cultivées en présence d’agent mitogène et de CSN au ratio 1 :10 (IP 1 : 10) est normalisé par rapport à (IP Ctrl). La lignée de CSN est considérée comme exerçant une activité antiproliférative significative si le ratio (IP 1 :10)/ (IP Ctrl) est inférieur ou égal à 0.5. La diminution significative de l’index de prolifération dans les cocultures avec des CSN en Figure 7, démontre que les CSN de phénotype CMH- I ^L /CD90 ^H exercent une activité antiproliférative sur les lymphocytes. Les CSN ont donc un potentiel immunomodulateur in vitro, et dans ce cas un potentiel immunosuppresseur. EXEMPLE D : Evaluation des propriétés biologiques des CSN cryoconservées

L’activité biologique (viabilité, activité proliférative, potentiel immunomodulateur) des CSN de phénotype CMH-I ^L /CD90 ^H est évaluée in vitro et comparée aux propriétés des CSN maintenues en culture.

Les CSN cryoconservées à -80°C pendant plusieurs mois sont décongelées à température ambiante pendant 8-10 minutes. La suspension cellulaire dans son milieu cryoprotecteur est transférée dans un tube Falcon l5ml. Un aliquote (50m1) est prélevé pour réaliser un marquage au bleu Trypan. L’échantillon ainsi préparé est analysé à l’aide d’un compteur électronique qui estime la viabilité cellulaire en faisant le ratio du nombre de cellules marquées au bleu Trypan/ nombre total de cellules détectées. De manière alternative, un aliquote de 50m1 de suspension cellulaire est prélevé et mélangé à 50m1 de solution d’iodure de propidium (IP ; l0pg/ml). La solution ainsi préparée est immédiatement analysée sur un cytomètre de flux. Les cellules présentant un signal sur le canal de détection de l’IP correspondent aux cellules mortes.

La capacité des CSN CMH-I ^L /CD90 ^H à proliférer in vitro post-décongélation est évaluée en ensemençant une quantité définie de cellules sur un support de culture dans du milieu de prolifération pendant 7 jours. L’activité proliférative des CSN est évaluée selon la méthode décrite précédemment (paragraphe 1).

Le potentiel immunomodulateur des CSN cryoconservées est évalué selon la méthode décrite dans le paragraphe 5 des exemples.

Les résultats de la figure 8 montrent que la viabilité cellulaire des CSN de phénotype CMH-I ^L /CD90 ^H est supérieure à 80% jusqu’à 12 mois de conservation à -80°C (Figure 8A). L’activité proliférative des CSN cryoconservées à -80°C n’est pas signifîcativement modifiée par rapport à des CSN maintenues en culture, comme l’indiquent le nombre de doublements et le temps de doublement cellulaire qui sont similaires quel que soit le temps de stockage à -80°C (Figure 8B). L’activité immunomodulatrice des CSN cryoconservée est maintenue comme le montrent les résultats du test d’inhibition de prolifération lymphocytaire in vitro (Figure 8C et Figure 8D). EXEMPLE E : Evaluation in vivo de l’effet thérapeutique d’une injection de CSN cryoconservées prêtes à l’emploi pour la prise en charge de l’arthrose du chien

Cas clinique 1 (Chien 1) : Bulldog anglais âgé de 10 ans présentant une dysplasie des deux hanches ainsi qu’une rupture du ligament croisé antérieur entraînant une boiterie marquée chronique et une douleur quasi permanente au niveau des membres postérieurs, caractéristiques de l’arthrose. Un traitement par injection intra-articulaire de CSN cryoconservées provenant d’un placenta canin (individu différent de l’individu traité), est prescrit pour chaque articulation. Trois unités de 1.10 ⁷ CSN cryoconservées sont décongelée 24h avant administration. Les traitements sont acheminés à la clinique vétérinaire par un transporteur à température contrôlée (4-l2°C). Chacune des trois unités de CSN sont directement injectées, respectivement, dans chacune des hanches et dans le grasset, sans lavage préalable des cellules. L’évolution de l’animal est monitorée par un questionnaire développé et validé pour évaluer la mobilité des chiens (LO AD ; Liverpool Osteoarthritis In Dog). Ce document est remis aux propriétaires de l’animal pour évaluer de manière semi-quantitative l’évolution de la boiterie et du confort de l’animal grâce à 13 questions notées de 0 à 4. Le score varie donc entre 0 et 52, 0 correspondant au score d’un chien sain et 52 correspondant au score de douleur et d’inconfort le plus élevé.

Avant traitement, le score est évalué à 41/52, ce qui correspond à une douleur/gène articulaire pouvant être considérée comme extrême. Trois mois après l’injection, le score attribué par les propriétaires est évalué à 28/52, ce qui correspond à une évolution positive de la locomotion de l’animal de 32%.

Cas clinique 2 (Chien 2): Yorkshire de 10 ans présentant une boiterie marquée au niveau du coude et diagnostiqué avec une dysplasie du coude avec fragmentation du processus coronoïde médial associées à des lésions arthrosiques. Un traitement par injection intra- articulaire de CSN cryoconservées provenant d’un placenta canin (individu différent de l’individu traité), est prescrit pour le coude. Une unité de de 1.10 ⁷ CSN cryoconservées est décongelée 24h avant administration. Le traitement est acheminé à la clinique vétérinaire par un transporteur à température contrôlée (4-l2°C). L’unité de CSN est directement injectée dans le coude, sans lavage préalable des cellules. L’efficacité du traitement est évaluée 2 mois post-traitement au moyen d’une évaluation clinique effectuée par le vétérinaire et par le questionnaire LO AD rempli par les propriétaires. L’évaluation clinique de l’animal constitue à attribuer un score basé sur un examen de la mobilité de l’animal. Les critères suivants sont évalués : boiterie (1-5), douleur à la palpation (1-3), gonflement de l’articulation (1-3), crépitement (1-3) ; soit un score total de 14 (14 correspondant à l’état le plus critique).

Avant traitement par CSN, le score clinique attribué à l’animal est 10/14 ( boiterie à 3/5 (modéré) ; une douleur à la palpation à 3/3 (sévère), un gonflement de l’articulation à 2/3 (modéré) et un crépitement à 2/3 (modéré). Le score propriétaire avant traitement est évalué à 34/52.

Les résultats à 2 mois post-injection montrent un score clinique de 6/14 ; soit une amélioration clinique de 59% et un score propriétaire de 20/52 ; soit une amélioration de la mobilité de 41%.

La figure 9 représente l’évolution du score LOAD de chaque animal avant traitement et post-administration de CSN cryoconservées (chien H : 3 mois post-injection/ chien D : 2 mois post-injection)

EXEMPLE F : Evaluation de l’évolution de la mobilité de chiens souffrant d’arthrose suite à l’administration d’une préparation de CSN cryoconservées prêtes à l’emploi

Quinze chiens souffrant d’arthrose articulaire (genou, coude, hanche, ou grasset) ont été recrutés pour une injection intra-articulaire de 1.10 ⁷ CSN cryoconservées/articulation. Ces CSN proviennent d’un placenta canin (individu différent de l’individu traité). Le produit est décongelé 24h avant administration, acheminé à la clinique par un transporteur sous température contrôlée (4-l2°C) et injecté sans lavage des cellules.

Six mois post-injection, un questionnaire est remis aux vétérinaires pour évaluer l’efficacité du traitement. Un score de 1 à 3 est attribué correspondant à une évolution très satisfaisante (1) ; une évolution satisfaisante (2) ; une évolution non satisfaisante (3). L’évolution de la mobilité de l’animal est évaluée comme satisfaisante dans 87% des cas (80% avec une évolution jugée très satisfaisante) ; 13% des retours considèrent une évolution non satisfaisante de l’animal suite au traitement (Figure 10). EXEMPLE G: Evaluation in vivo de l’effet thérapeutique d’une injection de CSN cryoconservées sur la thrombocytopénie canine

Cas clinique : Teckel (5kg) âgé de 8 ans est présenté en consultation avec des ecchymoses sur l’abdomen. L’anamnèse de cet animal fait état de 2 épisodes de thrombocytopénie à l’âge de 6 mois et 6 ans. Durant ces deux épisodes, il a été nécessaire de recourir à un traitement corticoïde à dose immunosuppressive, laissant suspecter une cause auto-immune de la maladie. Des examens sanguins sont réalisés, écartant une maladie infectieuse. Des examens d’imagerie ne permettent pas d’identifier un processus néoplasique. La numération formule révèle un taux de plaquettes de 76.l0 ³ /mm ³ . Le volume moyen plaquettaire (VMP) est de 5,7 fl, proche de la limite basse (5 à 12 fl). Le nombre de neutrophiles est mesuré à 540/mm ³ , soit 8.8% du nombre total de leucocytes (6 000 /mm ³ ). Les autres constantes sont normales. Au regard des antécédents de l’animal et de l’absence de pathologie identifiée, l’hypothèse diagnostique est donc une thrombocytopénie à médiation immune idiopathique ou primaire.

Un traitement à base de corticoïdes et d’immunosuppresseur est prescrit permettant une normalisation du nombre de plaquettes temporaire, avec une rechute à 3 mois. Une perfusion de 1.10 ⁷ CSN cryoconservée est réalisée par voie intraveineuse. Ces CSN proviennent d’un placenta canin (individu différent de l’individu traité). Les cellules sont mises en suspension dans une perfusion de 50 ml de NaCl et sont administrées lentement sur une durée de 25 minutes. Un monitoring (fréquence cardiaque et respiratoire, température rectale, contrôle des muqueuses) est effectué durant la perfusion. Un suivi clinique est réalisé sur une période de 3 mois avec des dosages plaquettaires.

Durant la perfusion de CSN, l’animal ne présente aucune manifestation clinique ni effets secondaires dans les 72 heures suivant la perfusion. Dans le mois suivant l’administration des CSN, les traitements corticoïdes et immunosuppresseurs sont progressivement diminués. Un mois post-traitement par CSN, la concentration plaquettaire est évaluée à 200.l0 ³ /mm ³ . Le traitement corticoïde est suspendu. Deux mois post-traitement, la concentration plaquettaire est évaluée à 255.l0 ³ /mm ³ , 3 mois-post-traitement, la concentration plaquettaire est évaluée à 460.l0 ³ /mm ³ .

Les données mettent en évidence une normalisation des concentrations plaquettaires jusqu’à 3 mois post-injection sans prise de corticoïdes (Figure 11). EXEMPLE H: Evaluation in vivo de l’effet thérapeutique d’une injection de CSN cryoconservées pour le traitement de maladie inflammatoire chronique de l’intestin

Cas clinique : Chien de race Shar-pei femelle de 4 ans diagnostiquée avec une maladie inflammatoire chronique de l’intestin en février 2017. Le chien présente une entérite duodénale diffuse et modérée accompagnée d’une infiltration lymphoplasmocytaire. Ces différentes lésions entraînent des vomissements, diarrhées et douleurs abdominales chroniques. Le vétérinaire lui prescrit des doses croissantes de cortisone afin de déterminer la dose nécessaire pour garder l’animal stable. La dose de 2mg/kg/jour est choisie. Au cours des 3 années suivant le début du traitement par cortisone, le propriétaire consulte de nombreux vétérinaires avec l’objectif d’en diminuer la dose actuellement prescrite, pouvant être nocive à long terme. Aucun des traitements n’a permis de diminuer la dose et l’animal a dû rester en permanence sous traitement corticoïde.

Un traitement par injection intra-veineuse de CSN cryoconservées est prescrit. Ces CSN proviennent d’un placenta canin (individu différent de l’individu traité). Une unité de 1.10 ⁷ CSN cryoconservées est décongelée 24h avant administration. Le traitement est acheminé à la clinique vétérinaire par un transporteur à température contrôlée (4-l2°C). L’unité de CSN est directement injectée via une perfusion de soluté physiologique, sans lavage préalable des cellules.

Trois jours après l’administration des cellules, le vétérinaire diminue la dose de cortisone de moitié puis au bout de 10 jours diminue de nouveau la dose de moitié pour obtenir une dose de lmg/kg tous les 2 jours, soit une réduction de la dose en cortisone par 4. Vingt jours après le traitement, le chien reste stable et supporte parfaitement la diminution de cortisone.

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