Estado de la técnica P. chrysogenum y A. chrysogenum son hongos filamentosos industrialmente interesantes debido a su capacidad para pro- ducir penicilina y cefalosporina respectivamente. El desa- rrollo de técnicas de manipulación genética aplicables en ambos microorganismos ha sido potenciado durante la última década. Entre las técnicas de manipulación genética de P. chrysogenum y A. chrysogenum se encuentran la transformación de protoplastos con vectores que utilizan como marcador de

selección el gen de resistencia a fleomicina (a partir de ahora denominado gen bleR) (Kolar, M. et al. (1988). Gene 62, 127-134), así como la expresión de copias adicionales intac- tas de genes de interés y la sustitución del promotor del gen en cuestión por otro promotor capaz de mejorar su expre- sión. La expresión en hongos como P. chrysogenum o A. chrysogenum de genes homólogos puede estar regulada negati- vamente, mientras que en el caso de genes heterólogos, su promotor puede no ser reconocido eficientemente por dichos hongos. Con la finalidad de evitar estos problemas, se ha procedido a la identificación y clonación de genes que se expresen constitutivamente y en los que preferiblemente di- cha expresión no presente regulación catabólica negativa, son los denominados a partir de ahora promotores fuertes. En general, se considera que los genes de alta expresión poseen señales en la región promotora que facilitan unos elevados niveles de transcripción y que fundamentalmente participan en funciones implicadas en el metabolismo primario celular.

Entre estos genes se pueden citar : los genes que codifican para glutamato deshidrogenasa NADP dependiente (EC. 1. 4. 1. 4) (a partir de ahora denominado gen gdh), P-N-acetilhexosami- nidasa (EC. 3. 2. 1. 52) (a partir de ahora denominado gen hex) y y-actina (a partir de ahora denominado gen act).

Existen citas previas de los genes gdh, hex y act proce- dentes de microorganismos diferentes a los que se utilizan en la presente invención. Entre la bibliografía más relevan- te cabe citar : (I) la secuencia nucleotídica del gen gdh del hongo Neurospora crassa (Kinnaird, J. H. and Fincham, J. R. S.

(1983). Gene 26, 253-260) así como la regulación de la ex- presión del gen gdhA de Aspergillus nidulans (Hawkins, A. R. et al. (1989). Mol. Gen. Genet. 418, 105-111), (II) la clo-

nación y expresión del gen hexl de Candida albicans (Cannon, R. D. et al. (1994). J. Bacteriol. 2640-2647) y (III) la ca- racterización del gen act de A. nidulans (Fidel, S. et al.

(1988). Gene 70, 283-293). La expresión de genes heterólogos en P. chrysogenum utilizando los promotores de los genes pcbC o penDE fue descrita por Cantwell, C. A. et al. en 1992 (Proc. R. Soc. London Ser. B 248, 283-289). Asimismo, tam- bien ha sido descrita la expresión de genes heterólogos en A. chrysogenum utilizando los promotores del gen P-isopropil malato deshidrogenasa (Japanese Patent Laid Open Publication No. 80295/1989) y gliceraldehido 3-fosfato deshidrogenasa (European Patent Application 0376226A1/1989).

La inactivación de la expresión génica en cepas indus- triales es en ocasiones necesaria para la eliminación de ac- tividades enzimáticas indeseables. Debido a que el nivel de ploidia de muchas cepas industriales dificulta en la mayor parte de los casos el bloqueo de la expresión mediante dis- rupción génica directa, es necesaria la utilización de sis- temas de inactivación de expresión independientes del nivel de ploidia. El desarrollo de construcciones antisentido ex- presadas bajo el control de promotores fuertes posibilita la interrupción de la expresión génica. Este tipo de construc- ciones es especialmente útil en cepas industriales debido a que sus niveles de ploidia (Künkel et al. (1992) Appl.

Microbiol. Biotech. 36, 499-502) dificultan la obtención de inactivaciones génicas completas. La utilización de cons- trucciones antisentido para el bloqueo de actividades enzi- máticas ha sido descrita en levaduras (Atkins, D. et al.

(1994). Biol. Chem. H-S 375, 721-729) y plantas (Hamada, T.

(1996). Transgenic Research 5, 115-121 ; John, M. E. (1996) Plant Mol. Biol. 30, 297-306). El promotor hex posee la

particularidad de codificar para una enzima extracelular, lo cual permite su utilización para la expresión de proteins extracelulares.

Sin embargo, en el estado de la técnica no existen citas que describan ni las secuencias de los genes de los hongos filamentosos utilizados en la presente invención, ni de las enzimas sintetizadas por la expresión de los mismos. Tampoco se describe en dicho Estado de la Técnica la utilización de los promotores fuertes de los genes de los hongos descritos en la presente invención, para la expresión, secreción o inactivación de la expresión génica.

Descripción detallada de la invención La utilización de promotores fuertes para superexpre- sar ciertos genes puede conducir a la mejora de la produc- ción de penicilina o cefalosporina, asi como a la síntesis de nuevos antibióticos derivados de estos últimos.

Esta invención describe un nuevo procedimiento para la obtención de cepas de P. chrysogenum y A. chrysogenum con capacidad de expresión de genes homólogos o heterólogos bajo el control de promotores fuertes. Se describe la ca- racterización y posterior utilización de los promotores correspondientes a los genes que codifican para glutamato deshidrogenasa NADP dependiente (EC. 1. 4. 1. 4)-gen gdh-de P. chrysogenum, ß-N-acetilhexosaminidasa (EC. 3. 2. 1. 52)-gen hex- de P. chrysogenum y y-actina-gen act-de P. chrysogenum y A. chrysogenum. La utilización de los citados promotores para superexpresar genes relacionados con la biosíntesis de peni- cilina y/o cefalosporina en las cepas anteriormente mencio- nadas es una de las finalidades de la presente invención.

Asimismo, estos promotores pueden utilizarse para el bloqueo de la expresión génica mediante construcciones antisentido.

La presente invención parte de P. chrysogenum y A. chrysogenum como donadores de los ácidos nucleicos. Una vez purificado el DNA genómico se construyeron sendas genotecas de ambos microorganismos tal y como se describe en los ejem- plos 1 y 4, las cuales fueron rastreadas con : (I) oligonu- cleótidos sintéticos correspondientes al gen gdh de N. crassa para clonar el gen homologo de P. chrysogenum, (II) combinaciones de oligonucleótidos sintetizados en base a la secuencia amino terminal de la enzima P-N-acetilhexosamini- dasa para clonar el gen hex de P. chrysogenum y (III) un fragmento del gen act de A. nidulans para clonar los genes homólogos de P. chrysogenum y A. chrysogenum. Los clones pu- rificados en virtud de su capacidad para generar hibridación positiva con la sonda correspondiente fueron posteriormente analizados, determinándose la presencia de los genes busca- dos.

E1 gen gdh de P. chrysogenum se identificó en un frag- mento EcoRI de 7, 2 kb y en dos fragmentos BamHI de 2, 9 y 1, 5 kb respectivamente. El mapa de restricción de la región de DNA que lo incluye aparece en la figura 1. Posteriormente se determinó la secuencia de 2. 816 nucleótidos (SEQ ID NO : 1), la cual incluye un marco abierto de lectura (ORF) con un pa- trón preferencial de utilización de codones muy marcado cuyo codón ATG de inicio de traducción se encontró en la posición 922 y su codón de terminación de la traducción TAA en la 2. 522. Asimismo se determinó la presencia de 2 intrones de 159 pb y 56 pb entre las posiciones 971-1130 y 1262-1318 respectivamente. Dicho ORF codifica para una proteina de 49. 837 Da y un punto isoeléctrico de 6. 18 cuya secuencia de

461 aminoácidos (SEQ ID NO : 5) posee un 72, 4 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de la enzima glutamato des- hidrogenasa NADP dependiente de N. crassa. En la región pro- motora se encuentran zonas ricas en pirimidinas similares a las que aparecen en genes altamente expresados, así como dos presuntas cajas TATA (esta caja se encuentra en ciertos pro- motores de hongos de 30 a 50 pb por encima del lugar de inicio de la transcripción) (Davis, M. A. and Hynes, M. J.

(1991). More Gene Manipulations in Fungi, Academic Press, San Diego, California) y una caja CCAAT (la cual se encuen- tra en alrededor del 30% de promotores de genes eucariotas de 50 a 200 pb por encima del lugar de inicio de la trans- cripción) (Bucher, P. (1990) J. Mol. Biol. 212 : 563-578).

Seguidamente se utilizó este promotor para expresar en P. chrysogenum y A. chrysogenum el gen que codifica para- galactosidasa (a partir de ahora denominado gen lacZ) de E. coli y el gen bleu de S. hindustanus. Para ello se constru- yeron los plásmidos pSKGSu y pALfleo7 (figura 5) tal y como se describe en el ejemplo 1. De los resultados obtenidos se deduce que el promotor gdh (a partir de ahora denominado Pgdh) es capaz de controlar la expresión tanto en P. chryso- genum y A. chrysogenum como en E. coli de los genes heteró- logos iacZ y bleR.

El desarrollo de construcciones antisentido expresadas bajo el control de promotores fuertes posibilita la inte- rrupcion de la expresión génica. Con esta finalidad se cons- truyó el plásmido pALP888 (figura 5) tal y como se describe en el apartado 1. 3 del ejemplo 1. Los resultados obtenidos confirman la posibilidad de bloquear, total o parcialmente, en P. chrysogenum actividades enzimáticas indeseables me-

diante la utilización de construcciones antisentido utili- zando el Pgdh.

El gen hex de P. chrysogenum se identificó en un f ragmento SacI de 3, 2 kb y en otro SalI de 2, 1 kb. El mapa de restricción de la región de DNA que incluye el gen hex aparece en la figura 2. Seguidamente se determinó la secuen- cia de 5. 240 nucleótidos (SEQ ID NO : 2), confirmando la exis- tencia de dos ORFs con un patrón preferencial de utilización de codones muy marcado, una de las cuales se correspondía con el gen hex. El codón ATG de inicio de traducción del gen hex se encontró en la posición 1. 324 y el codón de termina- ción TGA en la 3. 112. Dicho ORF carece de intrones y codifi- ca para una proteina de 66. 545 Da y un punto isoeléctrico de 5, 34 cuya secuencia de 596 aminoácidos (SEQ ID NO : 6) posee un 49, 0 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de la enzima ß-N-acetilhexosaminidasa de Candida albicans. Asimis- mo, la secuencia de aminoácidos deducida incluye los poli- péptidos determinados químicamente a partir de la enzima purificada en las posiciones 19-40 y 99-120. En la región promotora se encuentran dos zonas ricas en pirimidinas, una presunta caja TATA y la caja CAAT. Seguidamente se utilizó este promotor para expresar en P. chrysogenum el gen bleR de S. hindustanus. Para ello se construyó el plásmido pALP480 (figura 6) tal y como se describe en el ejemplo 2. De los resultados obtenidos se deduce que el promotor hex (a partir de ahcra denominado Phex) es capaz de controlar la expresión del gen heterólogo bleu en P. chrysogenum. Asimismo, el hecho de que la enzima P-N-acetilhexosaminidasa sea una proteina abundantemente secretada por P. chrysogenum al medio de cultivo, posibilita la utilización del gen hex para la expresión y secreción de proteins homologuas o heterólogas

en P. chrysogenum u hongos filamentosos relacionados. Los genes a expresar pueden ser fusionados en marco de lectura con la región promotora, incluyendo la secuencia señal de secreción del gen hex o bien ser fusionados en marco de lec- tura con el gen hex completo.

El gen act de P. chrysogenum (a partir de ahora denomi- nado actPc) se identificó en fragmentos BamHI de 5, 2 kb, EcoRI de 4, 9 kb y HindIII de 5, 9 kb. El mapa de restricción de la región de DNA que incluye el gen actPc aparece en la figura 3. Una vez determinada la secuencia de 2. 994 nucleó- tidos (SEQ ID NO : 3), se confirmó la existencia de un ORF con un patróm preferencial de utilización de codones muy marca- do. El codón ATG de inicio de traducción se encontró en la posición 494 y el codón de terminación TAA en la 2. 250.

Dicho ORF posee 5 intrones y codifica para una proteina de 41. 760 Da y un punto isoeléctrico de 5, 51 cuya secuencia de 375 aminoácidos (SEQ ID NO : 7) posee un 98, 1 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de la proteina y-actina de A. nidulans. En la región promotora se encuentran dos zonas ricas en pirimidinas, una presunta caja TATA y cuatro cajas CAAT. Seguidamente se utilizó este promotor para expresar en P. chrysogenum el gen bleR de S. hindustanus. Para ello se construyó el plásmido pALPfleol (figura 6) tal y como se describe en el ejemplo 3. De los resultados obtenidos se deduce que el promotor act de P. chrysogenum (a partir de ahora denominado PactPc) es capaz de controlar la expresión en P. chrysogenum del gen heterólogo bleR. gen act de A. chrysogenum (a partir de ahora deno- minadc actAc) se identificó en fragmentos SalI de 2, 4 y 1, 1 kb, Serrai de 3, 9 kb y HindIII de 8, 7 kb. El mapa de res- tricc-_n de la región de DNA que incluye el gen actAc apa-

rece en la figura 4. La secuencia de 3. 240 nucleótidos determinada (SEQ ID NO : 4) confirmó la existencia de un ORF con un patrón preferencial de utilización de codones muy marcado. El codón ATG de inicio de traducción se encontró en la posición 787 y el codón de terminación TAA en la 2. 478.

Dicho ORF posee 5 intrones y codifica para una proteina de 41. 612 Da y un punto isoeléctrico de 5, 51 cuya secuencia de 375 aminoácidos (SEQ ID NO : 8) posee un 98, 4 % y un 98, 1 % de identidad con las secuencias de aminoácidos correspondientes a las proteins y-actina de A. nidulans y P. chrysogenum respectivamente. En la región promotora se encuentran zonas ricas en pirimidinas y una caja CAAT, no apreciándose la existencia de caja TATA. Seguidamente se utilizó este pro- motor para expresar en A. chrysogenum el gen bleR de S. hindustanus. Para ello se construyó el plásmido pALCfleol (figura 6) tal y como se describe en el ejemplo 4. De los resultados obtenidos se deduce que el promotor act de A. chrysogenum (a partir de ahora denominado PactAc) es capaz de controlar la expresión en A. chrysogenum del gen heteró- logo bleR.

En todos los casos, la expresión en P. chrysogenum o A. chrysogenum del gen heterólogo bajo el control del promotor fúngico se realizó fusionando dicho gen en el marco de lec- tura correcto. A pesar de que a modo de ejemplo se han expresado los genes lacZ y bleR, del mismo modo podrían ex- presarse genes que codifican para enzimas implicadas en la biosíncesis de penicilina : pcbAB (a-aminoadipil-cistenil-va- lina sintetasa), pcbC (isopenicilina N sintasa), penDE (acil-CoA : 6-APA aciltransferasa), pcl (fenilacetil-CoA liga- sa), etc. o cefalosporina : pcbAB (a-aminoadipil-cistenil- valina sintetasa), pcbC (isopenicilina N sintasa), cefD

(isopenicilina N isomerasa), cefEF (desacetoxicefalosporina C sintasa/hidroxilasa), cefG (desacetilcefalosporina C ace- tiltransferasa), etc. El gen a expresar puede haber sido obtenido por diferentes métodos : aislado a partir de DNA cromosómico, cDNA sintetizado a partir de mRNA, sintetizado químicamente, etc. Los procedimientos fundamentales para la correcta fusión promotor-gen están descritos en Sambrook, J. et al. (1989). Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, USA y Ausubel et al. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, USA.

Como cepas hospedadoras se han utilizado P. chrysogenum y A. chrysogenum, no obstante, cualquier cepa relacionada o mutante derivado de ellas puede ser usada. El procedimiento empleado para la obtención de protoplastos y transformación de P. chrysogenum se basó en el descrito por Cantoral et al. en 1987 (Biotechnology 5 : 494-497) y Diez et al. en 1987 (Curr. Genet. 12 : 277-282) y se describe en el ejemplo 1. La obtención de protoplastos y transformación de A. chrysogenum se describe en el ejemplo 4. En ambos casos se utilizaron el antibiótico fleomicina como marcador de selección y los plasmids pALfleo7, pALP480, pALPfleol o pALCfleol, los cuales son portadores del gen bleR expresado bajo el control del Pgdh, Phex, PactPc y PactAc respectivamente. Sin embar- go, podría utilizarse cualquier marcador que pueda separar selectivamente las cepas transformantes de aquellas otras que no lo son.

El transformante puede ser crecido en medios de cultivo que incluyan fuentes de carbono y nitrógeno capaces de ser asimiladas. Como ejemplos de fuentes de carbono pueden ci- tarse glucosa, sacarosa, lactosa, almidón, glicerina, ácidos

orgánicos, alcoholes, ácidos grasos, etc., utilizadas solas o en combinación. Ejemplos de fuentes de nitrógeno serían peptona, extracto de malta, extracto de levadura, líquido de maceración de maíz, gluten, urea, sales de amonio, nitratos, NZ-amina, sulfato amónico, etc., utilizadas solas o en com- binación. Como sales inorgánicas utilizables como componen- tes del medio de cultivo pueden citarse fosfatos (por ejem- plo fosfato potásico), sulfatos (por ejemplo sulfato sodi- co), cloruros (por ejemplo cloruro magnésico), etc. y como iones hierro, magnesio, calcio, manganeso, cobalto, etc. Las condiciones de cultivo como temperatura de incubación, pH del medio de cultivo, aireación, tiempo de incubación, etc. deben ser seleccionadas y ajustadas de acuerdo con la cepa utilizada. No obstante, en términos generales, la fermenta- ción se realiza durante un periodo de 4 a 14 días en condi- ciones aeróbicas a una temperatura entre 20°C y 30°C y un pH entre 5 y 9.

En resumen, la presente invención incluye (I) frag- mentos de DNA que contienen los promotores de los genes gdh, hex y act de P. chrysogenum y del gen act de A. chrysogenum, (II) plásmidos que incorporan los anteriormente citados pro- motores junto con su lugar de inicio de traduccion, (III) plásmidos en los que un gen estructural homólogo o heteró- logo o un fragmento de DNA antisentido es situado bajo el control de dichos promotores, (IV) cepas de P. chrysogenum o A. chrysogenum transformadas con dichos plásmidos, (VI) ce- pas transformantes capaces de expresar el gen estructural o el DNA antisentido situado en el plásmido bajo el control del promotor y (VII) cepas transformantes capaces de secre- tar proteins extracelulares, homologuas o heterólogas, bajo el control del Phex.

Los siguientes ejemplos describen en detalle la presente invención sin limitar su alcance.

EJEMPLO 1 1. 1. Clonación y caracterización del gen gdh de P. chrysogenum.

Con la finalidad de clonar el gen gdh de P. chryso- genum, se construyó una genoteca en el vector fágico AGEM12 siguiendo procedimientos establecidos (Sambrook, J. et al.

(1989). Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, USA). Para ello, el DNA total del hongo (purificado según el método descrito por Barredo et al. (1994) Patente española P9400931) fue parcialmente digerido con Sau3AI y los frag- mentos de alrededor de 20 kb se purificaron en un gradiente de sacarosa (10-40%). Estos fragmentos se ligaron con los brazos del vector previamente digeridos con BamHI y puri- ficados y seguidamente la mezcla de ligación se encapsidó in vitro utilizando el sistema Gigapack II Gold (Stratagene) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Con la reac- ción de encapsidación resuspendida en 500 pl de SM se rea- lizaron infecciones de E. coli LE392 para titular el número de fagos presentes y de E. coli NM539 con la finalidad de determinar el porcentaje de fagos recombinantes. E. coli NM539 es una cepa lisógena del fago P2 y sólo origina placas de lisis cuando el fago que la infecta carece de la región central dispensable. El titulo fágico resultó ser de 132 ufp/pl (66. 000 ufp totales) en E. coli LE392 y de 113 ufp/1 (56. 500 ufp totales) en E. coli NM539. Esto significaba que

alrededor del 85 % de los fagos eran portadores de un inser- to de DNA exógeno. El cálculo del número de fagos recombi- nantes necesarios para constituir una genoteca completa se realizó con la ecuación : N= ln (1-p)/ln (1-f) ; donde"p"es la probabilidad deseada,"f"la proporción del genoma del orga- nismo elegido contenida en un recombinante y"N"el número necesario de recombinantes. Asumiendo que el genoma de P. chrysogenum está contenido en alrededor de 30. 000 kb (Fierro et al. (1993). Mol. Gen. Genet. 241 : 573-578) y que el pro- medio de los insertos encapsidados fuera de 18 kb (a pesar de que se habían seleccionado tamaños alrededor de 20 kb), con el número de fagos recombinantes obtenidos se había ob- tenido una genoteca de P. chrysogenum con una probabilidad del 99. 999 %. Una vez realizadas esta serie de comprobacio- nes teóricas, se infectó E. coli NM539 y la genoteca com- pleta se extendió sobre 5 placas Petri de 150 mm de diámetro (alrededor de 11. 300 ufp/placa Petri), se recogió en 50 ml de SM más 2. 5 ml de cloroformo y se guardó a 4°C. De esta forma se disponía de un volumen suficientemente amplio y re- presentativo de fagos recombinantes (5. 300 ufp/pl) listos para ser plaqueados en cualquier momento.

Alrededor de 60. 000 ufps fueron extendidas sobre 3 pla- cas Petri de 150 mm de diámetro y seguidamente se transfi- rieron a filtros de nitrocelulosa (BA85, 0, 45 pm, Schleicher & Schuell). Dichos filtros se hibridaron utilizando protoco- los estándar (Sambrook, J. et al. (1989). Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, USA) con oligonucleótidos sinté- ticos correspondientes al gen gdh de N. crassa. Un total de 10 clones positivos fueron purificados a través de un segun- do y tercer ciclo de hibridación y seguidamente su DNA fue

digerido con una serie de endonucleasas de restricción y analizado por el método de Southern. De esta forma, se iden- tificó el gen gdh en un fragmento EcoRI de 7, 2 kb y en dos fragmentos BamHI de 2, 9 y 1, 5 kb respectivamente. Una vez realizadas las correspondientes subclonaciones en los plás- midos pBluescript I KS (+) (Stratagene) y pUC13, se constru- yeron los plásmidos pALP784 y pALP785, los cuales se corres- ponden con ambas orientaciones de un fragmento de 2, 9 kb Sau3AI-XbaI que incluye el gen gdh. El mapa de restricción de la región de DNA que incluye dicho gen aparece en la fi- gura 1.

Con la finalidad de determinar la secuencia de nucleó- tidos del gen gdh, se construyeron una serie de clones a partir de los plásmidos pALP784 y pALP785 por el método "Borrar una base-Erase a base-" (Promega) y posteriormente se secuenciaron por el método del didesoxinucleótido utili- zando el dispositivo de ensayo-kit-"Sequenase" (USB) en ambos casos de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

La secuencia de 2. 816 nucleótidos obtenida (SEQ ID NO : 1) se analizó con el programa Geneplot (DNASTAR) confirmando la existencia de un ORF con un patrón preferencial de utiliza- ción de codones muy marcado. El codón ATG de inicio de tra- ducción se encontró en la posición 922 y el codón de termi- nación TAA en la 2. 522. Asimismo se determinó la presencia de 2 intrones de 159 pb y 56 pb entre las posiciones 971- 1130 y 1262-1318 respectivamente. Dicho ORF codifica para una proteína de 49. 837 Da y un punto isoeléctrico de 6. 18 cuya secuencia de 461 aminoácidos (SEQ ID NO : 5) posee un 72, 4 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de la enzima glutamato deshidrogenasa NADP dependiente de N. crassa.

En la región promotora se encuentran varias zonas ricas en pirimidinas, si bien la localizada entre las posiciones 766-796 es la más extensa. Estas zonas aparecen en genes altamente expresados y se localizan inmediatamente por enci- ma del lugar de inicio de la transcripción. Adicionalmente existen dos presuntas cajas TATA (cuya secuencia consenso en hongos es TATAAA) en las posiciones 752 (TATATAATT) y 852 (TATAATTT). Estas cajas TATA se encuentran en hongos de 30 a 50 pb por encima del lugar de inicio de la transcripción, por lo que lo más probable es que la auténtica caja TATA sea la situada en la posición 752, es decir 42 pb por encima del lugar de inicio de la transcripción. La secuencia CCAAT se encuentra en la región promotora de alrededor del 30% de los genes eucariotas conocidos situada entre 50 y 200 pb por encima del lugar de inicio de la transcripción. En la región promotora del gen gdh existe la caja CCAAT en la posición 691, es decir en torno a 105 pb por encima del presumible lugar de inicio de la transcripción.

1. 2. Expression de genes testigo en P. chrysogenum y A. chrysogenum bajo el promotor gdh.

El proceso de transformación y selección de transfor- mantes de P. chrysogenum y A. chrysogenum se realizó, tal y como se describe a continuación, en función de su resisten- cia al antibiótico fleomicina. Para ello fue preciso cons- truir el plásmido pALfleo7, el cual posee un tamaño de 5. 4 kb y es portador del gen bleR de S. hindustanus expresado bajo el control del Pgdh como marcador en hongos, del gen de resistencia a cloranfenicol como marcador en E. coli y del polilinker del plásmido pBC KS (+) (Stratagene).

El procedimiento empleado para la obtención de proto- plastos y transformación de P. chrysogenum fue el descrito por Cantoral et al. en 1987 (Biotechnology 5 : 494-497) y Diez et al. en 1987 (Curr. Genet. 12 : 277-282) con ligeras modificaciones. En primer lugar se creció P. chrysogenum en el medio definido PM (Anné, J., (1997). Agricultura 25) con adición de extracto de levadura al 10% durante 18-21 horas a 25°C, se recuperó el micelio por filtración a través de un filtro de nylon y se lavó con 3-5 volúmenes de NaCl 0. 9%.

Tras secarlo entre papel de filtro, se resuspendió (100 mg/ml) en tampón de protoplastos. Cuando se consideró que la suspensión miceliar era homogénea, se le anadio un volumen de una solución de Caylasa (Cayla) 4 mg/ml en tampón de pro- toplastos y se incubó durante 3 horas a 25°C con agitacion a 100 r. p. m. La aparición de protoplastos se siguió microscó- picamente. En el momento en que la mayor parte de ellos se habain liberado, se separaron del micelio mediante filtra- ción a través de un filtro de nylon de 30 pm de poro. La suspensión de protoplastos se lavó 3 veces con KC1 0. 7 M centrifugando a 400xg durante 3 minutos entre cada lavado.

Los protoplastos precipitados se resuspendieron en 10 ml de solución KCM y tras estimar su concentración mediante con- taje en cámara Thoma, se ajustaron a 1-5 x 108 protoplas- tos/ml con KCM. Seguidamente, se mezclaron cuidadosamente 100 pl de esta solución con 1-10 pg de DNA más 10 pu de PCM y la mezcla se incubó en baño de agua-hielo durante 20 minutos. A continuación se añadieron 500 ml de PCM y la mezcla se mantuvo a temperatura ambiente durante 20 minutos tras los cuales se adicionaron 600 p1 de KCM. La selección de transformantes se realizó en base a la capacidad conferi- da por el gen de resistencia a fleomicina presente en los

plásmidos pALfleo7, pALP480 y pALPfleol para crecer en 30 ig/ml de fleomicina. Para ello, se mezclaron 200 pu de la reacción de transformación con 5 ml del medio Czapeck con adición de sorbitol (1 M) y fleomicina (30 pg/ml), exten- diéndose seguidamente sobre una placa Petri con 5 ml del mismo medio. Las placas se incubaron a 25°C hasta ver la aparición de transformantes (4-8 dias).

El procedimiento empleado para la obtención de proto- plastos y transformación de A. chrysogenum fue el descrito por Gutiérrez et al. (1991). Mol. Gen. Genet. 225 : 56-64. En primer lugar se creció la cepa de A. chrysogenum en el medio definido MMC durante 20-24 horas a 28°C, se recuperó el micelio por filtración a través de un filtro de nylon y se lavó con 3-5 volúmenes de NaCl 0. 9%. Tras secarlo entre pa- pel de filtro, se resuspendió (50 mg/ml) en tampon de proto- plastos. Cuando se consideró que la suspensión miceliar era homogénea, se le anadio DTT 10 mM final y se incubó a 28°C y 150 r. p. m. durante 1 hora. Seguidamente se centrifugó a 12. 000xg durante 15 minutos y el precipitado se resuspendió en 20 ml de tampón de protoplastos. Posteriormente se anadio un volumen de una solución de Caylasa (Cayla) 4 mg/ml en tampon de protoplastos y se incubó durante 3 horas a 25°C con agitación a 100 r. p. m. La aparición de protoplastos se siguió microscópicamente. En el momento en que la mayor par- te de ellos se habían liberado, se separaron del micelio me- diante filtracion a través de un filtro de nylon de 25 pm de poro. La suspensión de protoplastos se lavó 3 veces con KC1 0. 7 M centrifugando a 1. 000xg durante 3 minutos entre cada lavado. Los protoplastos precipitados se resuspendieron en 10 ml de tampón NCM y tras estimar su concentración mediante contaje en cámara Thoma, se ajustaron a 1-5 x 10a proto-

plastos/ml. Seguidamente, se mezclaron cuidadosamente 100 µl de esta solución con 1-10 pg de DNA y la mezcla se mantuvo en un banao de agua-hielo durante 20 minutos tras los cuales se adicionó 1 ml de CCM y se incubó a temperatura ambiente durante 20 minutos más. La mezcla se centrifugó a 1. 000xg durante 5 minutos y se resuspendió el sedimento en 800 µl de tampon NCM. La selección de transformantes se realizó en base a la capacidad conferida por el gen de resistencia a fleomicina presente en los plásmidos pALfleo7 y pALCfleol para crecer en 10 µg/ml de fleomicina. Para ello, se mez- claron 200 µl de la reacción de transformación con 5 ml del medio TSA con adición de sacarosa (0, 3 M) y fleomicina (10 pg/ml), extendiéndose seguidamente sobre una placa Petri con 5 ml del mismo medio. Las placas se incubaron a 28°C hasta ver la aparición de transformantes (5-8 días).

En los transformantes obtenidos se analizó (I) la pre- sencia de DNA correspondiente al plasmido utilizado en la transformación, (II) la existencia de transcrito correspon- diente al gen testigo y (III) la actividad enzimática correspondiente al gen expresado. La obtención de DNA total se realizó de acuerdo con las condiciones descritas por Barredo et al. en 1994 (Patente española P9400931) y su pos- terior analisis se llevó a cabo por el método de Southern, según el procedimiento descrito por Sambrook et al. en 1989 (Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, USA). La purifi- cación de RNA total se realizó según el método el descrito por Ausubel et al. en 1987 (Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, USA). El RNA obtenido se almacenó precipitado en etanol a-20°C. Para su utiliza-

ción, se recuperó por centrifugación a 4°C y 10. 000xg duran- te 20 minutos. La separación de las moléculas de RNA en base a su tamaño molecular se realizó por electroforesis en agarosa-formaldehído. Seguidamente el RNA se transfirió a filtro de nitrocelulosa y se hybrid6 con la sonda deseada, todo ello según el método descrito por Sambrook et al. en 1989 (Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, USA). La aparición de bandas de hibridación reveló la existencia de transcritos y por tanto la capacidad de expresión de un gen bacteriano en el hongo hospedadora : P. chrysogenum o A. chrysogenum. La actividad enzimática ß-galactosidasa se va- loró en los transformantes de acuerdo con el método descrito por Sambrook et al. en 1989 (Molecular Cloning : A Labora- tory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, USA). La expresión del gen de resistencia a fleomicina se valoró en función del nivel de resistencia conferida a P. chrysogenum o A. chrysogenum en el medio sólido Czapeck tras su incubación a 25°C durante 7 días.

1. 2. 1. Expresión del gen lacZ de E. coli en P. chrysogenum y E. coli bajo el Pgdh.

El gen lacZ de E. coli se fusionó traduccionalmente con el Pgdh con la finalidad de expresarlo en P. chrysogenum.

Para ello, entre los sitios EcoRI y SalI del plásmido pML1 (Carramolino et al. 1989. Gene 77 : 31-38) se subclonó el gen lacZ, generando el plásmido pMLac. Seguidamente, el Pgdh se introdujo entre los sitios EcoRI y SmaI de pMLac originando el plásmido pSKG (figura 5). Por último, el gen de resis- tencia a sulfonamida (Carramolino et al. 1989. Gene 77 : 31-

38) se introdujo en el sitio EcoRI de pSKG dando lugar al plásmido pSKGSu (figura 5). En los transformantes de P. chrysogenum con el plásmido pSKGSu seleccionados por su re- sistencia a sulfonamida se analizó la presencia del plásmido por Southern y la existencia de transcrito correspondiente al gen lacZ por Northern. Posteriormente se midió la acti- vidad enzimática ß-galactosidasa en aquellos transformantes positivos en los dos analisis anteriores. Los transformantes expresaron eficientemente el gen lacZ de E. coli, observán- dose que los niveles de actividad ß-galactosidasa en aque- llos que contenían una copia del plásmido integrada en su genoma eran superiors a los encontrados en transformantes monocopia que expresaban el gen lacZ bajo el control del promotor de gen triptófano C (trpC).

El plásmido pSKG se introdujo en E. coli DH5α (#lacZ) con la finalidad de comprobar si el Pgdh de P. chrysogenum era también capaz de dirigir la expresión del gen lacZ en E. coli. Los transformantes obtenidos poseían la capacidad de generar colonias de color azul tras 10 días de incubación a 25°C en medio LB al que se había adicionado isopropil-D-D- galactósido (IPTG) y 5-bromo-4-cloro-3-indolil--D-galactó- sido (X-gal). Este resultado confirmó que la construcción Pgdh-lacZ expresa la actividad enzimática (3-galactosidasa en E. coli, si bien con menor eficiencia que el gen endógeno lacZ de E. coli.

1. 2. 2. Expression del gen bleR de S. hindustanus en P. chrysogenum y A. chrysogenum bajo el Pgdh.

El gen bleR carente de su región promotora se obtuvo a partir del plásmido pUT737 (Mullaney et al. (1985). Mol.

Gen. Genet. 199 : 37-45) como un fragmento NcoI-ApaI de 1. 100 pb. Seguidamente este fragmento se subclonó en el plásmido pUT713 previamente digerido NcoI-ApaI obteniéndose el plás- mido pALfleo5. El Pgdh se recuperó a partir de pALP25 como un fragmento EcoRI-BamHI de 726 pb, el cual fue seguidamente subclonado en pALfleo5 (previamente digerido EcoRI-BamHI) para generar pALfleo6. Este último plásmido posee un tamaño de 4, 2 kb, el gen bleR expresado bajo el control del Pgdh y el gen de resistencia a ampicilina como marcador en E. coli.

Con la finalidad de sustituir este último marcador por el gen de resistencia a cloranfenicol, a partir de pALfleo6 se purificó un fragmento de 1. 900 pb EcoRI-NotI que incluía el Pgdh, bye'y el terminador del gen trpC (TtrpC) y se ligó al plásmido pBC KS (+) (Stratagene) digerido EcoRI-NotI. Como resultado se obtuvo el plásmido pALfleo7 (figura 5), el cual posee un tamaño de 5, 4 kb y es portador del gen bleR de S. hindustanus bajo el Pgdh como marcador de selección en hon- gos, del gen de resistencia a cloranfenicol como marcador en E. coli y del polilinker del plásmido pBC KS (+). La se- cuenciación de la región de fusión entre Pgdh y bleR confirmó la disposición de este último gen en el marco de lectura correcto.

Con el plásmido pALfleo7 se realizaron transformaciones de P. chrysogenum y A. chrysogenum, seleccionándose los transformantes en función de su capacidad de resistencia a 30 µg/ml y 10 pg/ml de fleomicina respectivamente. Seguida- mente se estableció el máximo nivel de resistencia a fleomi- cina de los transformantes en medio sólido, obteniéndose al- gunos capaces de crecer en presencia de más de 100 pg/ml de fleomicina. En los transformantes seleccionados por su re- sistencia a fleomicina se analizó por Southern la presencia

del plásmido y por Northern la existencia de transcrito correspondiente al gen bleR, obteniéndose resultados posi- tivos en ambos casos. Estos resultados confirmaron la posi- bilidad de expresar genes heterólogos en P. chrysogenum y A. chrysogenum bajo el control del Pgdh.

El plásmido pALfleo7 se introdujo en E. coli con la finalidad de comprobar si el Pgdh de P. chrysogenum era tam- bien capaz de dirigir la expresión del gen bleu en E. coli.

Los transformantes obtenidos poseían la capacidad de crecer en LB con 0, 2 pg/ml de fleomicina, siendo menor de 0, 025 pg/ml la concentración minima inhibitoria de la fleomicina para E. coli. Este resultado confirmaba que el Pgdh se expresaba en E. coli, si bien con menor eficiencia que en P. chrysogenum. Un transformante de E. coli DH5a con el plás- mido pALfleo7 está depositado en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) con el número de acceso CECT4849. La obtención de otros plásmidos como pALP784 y pALP785 a partir del plásmido depositado simplemente consiste en seleccionar por hibridación con el promotor del gen gdh incluido en pALfleo7, el fragmento de 2, 9 kb Sau3AI-XbaI y subclonarlo en pBluescript I KS (+) o pUC13, respectivamente.

1. 3. Expression antisentido en P. chrysogenum y A. chrysogenum bajo el promotor gdh.

La inactivación de la expresión génica en cepas in- dustriales es en ocasiones necesaria para la eliminación de actividades enzimáticas indeseables. Debido a que el nivel de ploidía de muchas cepas industriales dificulta en la ma- yor parte de los casos el bloqueo de la expresión mediante disrupción génica directa, es necesaria la utilización de

sistemas de inactivación de expresión independientes del nivel de ploidia. El desarrollo de construcciones antisen- tido expresadas bajo el control de promotores fuertes posi- bilita la interrupción de la expresión génica.

A modo de ejemplo, a continuación se describe la utili- zación del Pgdh para la inactivación de la expresión del gen que codifica para fenilacetato 2-hidroxilasa (pahA) en P. chrysogenum. En primer lugar se construyó el plásmido pALP873, el cual es portador del Pgdh y del TtrpC fusionados mediante un sitio único BamHI. El plásmido pALP873 se digi- rió BamHI, se rellenaron sus extremos con el fragmento Klenow de la DNA polimerasa I y se ligó con un fragmento de cDNA 1. 053 pb interno al gen pahA obtenido a partir del plásmido pALP555 mediante digestión EcoRV. El plásmido re- sultante, denominado pALP874, se seleccionó por ser portador del fragmento del gen pahA antisentido respecto del Pgdh. A partir de este plásmido se purificó un fragmento EcoRI-XbaI de 2,5 kb portador del cassette antisentido, el cual se re- llenó con Klenow y se subclonó en el sitio EcoRV del plás- mido pALfleo7 originando el plásmido pALP888. Este último plásmido se caracteriza por poseer un tamaño de 7, 9 kb y ser portador de (I) el cassette antisentido del gen pahA bajo el <BR> <BR> <BR> <BR> control del Pgdh, (II) el gen bleu compo marcador de selección en hongos, (III) el gen de resistencia a cloranfenicol como marcador en E. coli y (IV) el polilinker del plásmido pBC KS (+).

Con el plásmid pALP888 se realizaron transformaciones de P. chrysogenum, seleccionándose los transformantes en funcion de su resistencia a 30 µg/ml de fleomicina. Entre los transformantes seleccionados, alrededor del 20 % mostra- ban una a capacidad de oxidación de ácido fenilacético reduci-

da, careciendo algunos de ellos de niveles detectables de dicha actividad. En estos transformantes se analizó por Southern la presencia del plásmido y por Northern, utili- zando como sonda un oligonucleótido correspondiente a la ca- dena codificante, la existencia de transcrito antisentido correspondiente al gen pahA. En ambos casos se obtuvieron resultados positivos, confirmando la posibilidad de blo- quear, total o parcialmente, en P. chrysogenum actividades enzimáticas indeseables mediante la utilización de construc- ciones antisentido. Estos resultados son extrapolables a hongos filamentosos relacionados y a cualquier actividad en- zimática, utilizando alguno de los promotores descritos en la presente patente (Pgdh, Phex, PactPc y PactAc) o cual- quier otro disponible.

EJEMPLO 2 2. 1. Clonación y caracterización del gen hex de P. chrysogenum.

En el micelio de P. chrysogenum procedente de fermenta- ciones industriales en condiciones de producción de penici- lina G, se determinó la presencia de una proteína mayorita- ria que una vez purificada y caracterizada resultó ser la enzima-N-acetilhexosaminidasa. La secuencia de aminoácidos del extremo amino terminal de la proteina purificada se de- terminó por el método de degradación de Edman, obteniéndose dos secuencias diferentes : (A) Ala-Pro-Ser-Gly-Ile-His-Asn-Val-Asp-Val- (His)-Val-Val- - (Asp)-Asn- (Asp)-Ala- (Asp)-Leu-Gln-Tyr- (Gly)

(B) Val-Gln-Val-Asn-Pro-Leu-Pro-Ala-Pro- (Arg)- (Arg)-Ile- (Thr)- ? ? ?- (Gly)- (Ser)- (Ser)- (Gly)- (Pro)- (Ile/Thr)- ? ? ?- (Val) En función de estas secuencias y asumiendo la tendencia de utilización de codones existente en una serie de genes de P. chrysogenum, se diseñaron las siguientes combinaciones de oligonucleótidos sintéticos : <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> (I) 5 TCGACGACGTGSACGTCSACGTTGTGGATGCC 3<BR> <BR> <BR> <BR> <BR> (11) 5 CCGTAYTGSAGGTCRGCGTCGTTGTCGACGAC 3' (III) 5'GGGGCVGGSAGVGGGTTGACYTG 3 El gen hex de P. chrysogenum se clonó utilizando la genoteca y los procedimientos descritos en el ejemplo 1. Un total de 11 clones positivos fueron purificados y seguida- mente su DNA fue digerido con una serie de endonucleasas de restricción y analizado por el método de Southern. De esta forma, se identificó el gen hex en un fragmento SacI de 3, 2 kb y en otro SalI de 2, 1 kb. La subclonación en ambas orientaciones del fragmento SalI en el plásmido pBC KS (+) (Stratagene) generó los plásmidos pALP295 y pALP303. El mapa de restricción de la región de DNA que incluye el gen hex aparece en la figura 2.

Con la finalidad de determinar la secuencia de nucleó- tidos del gen hex se utilizaron los plásmidos pALP295 y pALP303 anteriormente citados, así como pALP319 y pALP461 (ambas orientaciones de un fragmento BamHI de 2, 8 kb), pALP388 y pALP389 (ambas orientaciones de un fragmento SalI de 2, 4kb) y pALP377 y pALP378 (ambas orientaciones de un fragmento PstI de 1, 2 kb) (figura 2). A partir de dichos plásmidos se construyeron una serie de clones por el método

"Borrar una base-Erase a base-" (Promega) y posteriormente se secuenciaron por el método del didesoxinucleótido utili- zando el dispositivo de ensayo-kit-"Sequenase" (USB) en ambos casos de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

La secuencia de 5. 240 nucleótidos obtenida (SEQ ID NO : 2) se analizó con el programa Geneplot (DNASTAR) confirmando la existencia de dos ORFs con un patrón preferencial de utili- zación de codones muy marcado. El codón ATG de inicio de traducción del gen hex se encontró en la posición 1. 324 y el codón de terminación TGA en la 3. 112. Dicho ORF carece de intrones y codifica para una proteina de 66. 545 Da y un punto isoeléctrico de 5, 34 cuya secuencia de 596 aminoácidos (SEQ ID NO : 6) posee un 49, 0 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de la enzima P-N-acetilhexosaminidasa de Can- dida albicans. Asimismo, la secuencia de aminoácidos deduci- da incluye, en las posiciones 19-40 y 99-120, las secuencias de aminoácidos determinadas químicamente a partir de la en- zima purificada. Un lugar de reconocimiento de proteasa (Lys-Arg) aparece en las posiciones inmediatamente adya- centes a la secuencia de aminoácidos (A) anteriormente des- crita (aminoácidos 97-98).

En la region promotora se encuentran dos zonas ricas en pirimidinas entre las posiciones 1. 106-1. 128 y 1. 182-1. 200, una presunta caja TATA en la posición 1. 258 (ATAA. ATA) y una caja CAAT en la posición 1. 163.

2. 2. Expression del gen bleR de S. hindustanus en P. chrysogenum bajo el Phex.

Los procesos de : (I) transformación y selección de transformantes de P. chrysogenum, (II) analisis de DNA,

(III) análisis de RNA y (IV) mediciones enzimáticas se rea- lizaron tal y como se describe en el apartado 1. 2 del ejemplo 1.

Para expresar el gen bleR bajo el Phex, en primer lugar se construyó un sitio NcoI sobre el codón ATG que codifica para la metionina iniciadora del gen hex. Esto se realizó mediante PCR utilizando como"primers"los siguientes oligo- nucleótidos : 5' CTCCATGGTGATAAGGTGAGTGACGATG 3' 5'GTALAAACGACGGCCAGTG 3 (Primer-20) El fragmento de DNA obtenido por PCR se subclonó en ambas orientaciones en el sitio SmaI del plásmido pBC KS (+) (Stratagene) dando lugar a pALP427 y pALP428. Los insertos de ambos plásmidos fueron secuenciados utilizando los"dis- positivo de ensayo-kit-s""Borrar una base-Erase a base-" (Promega) y"Sequenase" (USB) en ambos casos de acuerdo con las instrucciones del fabricante. De esta forma se comprobó que el Phex obtenido carecía de mutaciones e incluía el si- tio NcoI sobre el ATG que codifica para la metionina inicia- dora de la protein. pALP427 fue el plásmido elegido para realizar la subclonación del gen bleR. El gen bleR carente de su región promotora se obtuvo a partir del plásmido pUT737 (Mullaney et al. (1985). Mol. Gen. Genet. 199 : 37-45) como un fragmen- to NcoI-ApaI de 1. 100 pb. Seguidamente este fragmento se subclonó en el plásmido pALP427 (portador del Phex) pre- viamente digerido NcoI-ApaI obteniéndose el plásmido pALP480 (figura 6). Este último plásmido posee un tamaño de 5, 4 kb, el gen bleR expresado bajo el control del Phex, el terminador del gen trpC bajo el gen bleR, el gen de resistencia a clo-

ranfenicol como marcador en E. coli y el polilinker del plásmido pBC KS (+). La secuenciación de la región de fusión entre Phex y bleR confirmó la disposición de este último gen en el marco de lectura correcto.

Con el plásmido pALP480 se realizaron transformaciones de P. chrysogenum, seleccionándose los transformantes en función de su capacidad de resistencia a 30 pg/ml de fleo- micina. Seguidamente se estableció el máximo nivel de resis- tencia a fleomicina de los transformantes en medio sólido, obteniéndose algunos capaces de crecer en presencia de más de 100 pg/ml de fleomicina. En los transformantes seleccio- nados por su resistencia a fleomicina se analizó la presen- cia del plásmido por Southern y la existencia de transcrito correspondiente al gen bleR por Northern, obteniéndose resul- tados positivos en ambos casos. Estos resultados confirmaron la posibilidad de expresar genes heterólogos en P. chryso- genum bajo el control del Phex. Un transformante de E. coli DH5a con el plásmido pALP480 está depositado en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) con el número de acceso CECT4852. La obtención de los plásmidos pALP295, pALP319, pALP377 y pALP388 a partir del plásmido depositado simple- mente consiste en seleccionar por hibridación, con el promo- tor del gen hex incluido en pALP480, los siguientes fragmen- tos de ADN : 2, 1 kd SalI, 2, 8 kb BamHI, 1, 2 kb PstI y 2, 4 kb SalI, respectivamente y, a continuación, subclonarlos en pBluescript I KS (+).

2. 3. Production extracelular de proteins en P. chrysogenum utilizando el gen hex.

La enzima ß-N-acetilhexosaminidasa es una proteina abundantemente secretada por P. chrysogenum al medio de cul- tivo en fermentadores industriales en condiciones de produc- ción de penicilina G. La capacidad de esta enzima para ser secretada posibilita la utilización del gen hex para la expresión y secreción de proteins homologuas o heterólogas en P. chrysogenum u hongos filamentosos relacionados.

La enzima posee una secuencia señal de secreción com- puesta por los siguientes aminoácidos : Met-Lys-Phe-Ala-Ser- Val-Leu-Asn-Val-Leu-Gly-Ala-Leu-Thr-Ala-Ala-Ser-Ala (amino- ácidos 1 a 18 de SEQ ID NO : 6). En general, los péptidos señal poseen tres dominios estructurales conservados (Taki- zawa, N. et al. (1994) Recombinant microbes for industrial and agricultural applications. Murooka, Y. And Imanaka, T.

(eds). Marcel Dekker, Inc. New York) : (I) una región amino terminal cargada positivamente denominada"n", la cual ge- neralmente posee de 1 a 5 residuos y se requiere para la traslocación eficiente de la proteina a través de la mem- brana (Met-Lys), (II) una región hidrofóbica denominada "h", compuesta por 7 a 15 residuos (Phe-Ala-Ser-Val-Leu- Asn-Val-Leu) y (III) una región polar en el extremo car- boxilo denominada"c", compuesta por 3 a 7 residuos (Gly- Ala-Leu-Thr-Ala-Ala-Ser-Ala). La preproteína sintetizada in- tracelularmente se procesa por un sitio de corte compuesto por dos residuos básicos (Lys-Arg, aminoácidos 97 y 98 de SEQ ID NO : 6) generando una proteina madura.

Existen dos posibilidades a la hora de expresar y se- cretar proteins utilizando el gen hex : (I) fusionar en mar- co de lectura la región promotora, incluyendo la secuencia señal de secreción, a la region codificante del gen a expre- sar y (II) fusionar en marco de lectura el gen hex completo

a la región codificante del gen a expresar. Utilizando téc- nicas estándar de biología molecular (Sambrook, J. et al.

(1989). Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, USA ; Ausubel et al. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, USA), cualquier ex- perto en el arte podría utilizar el promotor, incluyendo la secuencia de secreción del gen hex, o bien el gen completo, para la expresión y secreción de proteins de interés en P. chrysogenum u hongos filamentosos relacionados.

EJEMPLO 3 3. 1. Clonación y caracterización del gen act de P. chrysogenum.

El gen act de P. chrysogenum se clonó utilizando la genoteca y los procedimientos descritos en el ejemplo 1. En este caso la hibridación se realizó con un fragmento NcoI- ClaI de 888 pb procedente del gen act de A. nidulans (Fidel et al. (1988). Gene 70 : 283-293). Un total de 10 clones po- sitivos fueron purificados y seguidamente su DNA fue digeri- do con una serie de endonucleasas de restricción y analizado por el método de Southern. De esta forma, se identificó el gen act en fragmentos BamHI de 5, 2 kb, EcoRI de 4, 9 kb y HindIII de 5, 9 kb. El fragmento HindIII fue subclonado en ambas orientaciones en el plásmido pBluescript I KS (+) (Stratagene) generando los plásmidos pALP298 y pALP299. La subclonación en ambas orientaciones del fragmento EcoRI en_ el plásmido pBluescript I KS (+) (Stratagene) generó los plásmidos pALP315 y pALP316. El mapa de restricción de la región de DNA que incluye el gen act aparece en la figura 3.

Con la finalidad de determinar la secuencia de nucleó- tidos del gen act se utilizaron los plásmidos pALP315 y pALP316 anteriormente citados. A partir de dichos plásmidos se construyeron una serie de clones por el método"Borrar una base-Erase a base-" (Promega) y posteriormente se se- cuenciaron por el método del didesoxinucleótido utilizando el dispositivo de ensayo-kit-"Sequenase" (USB) en ambos casos de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La secuencia de 2. 994 nucleótidos obtenida (SEQ ID NO : 3) se analizó con el programa Geneplot (DNASTAR) confirmando la existencia de un ORF con un patrón preferencial de utiliza- ción de codones muy marcado. El codón ATG de inicio de traducción del gen act se encontró en la posición 494 y el codón de terminación TAA en la 2. 250. Dicho ORF posee 5 intrones en las posiciones 501-616, 649-845, 905-1046, 1078- 1180 y 1953-2021 y codifica para una proteina de 41. 760 Da y un punto isoeléctrico de 5. 51 cuya secuencia de 375 amino- ácidos (SEQ ID NO : 7) posee un 98, 1 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de la proteina y-actina de A. nidulans. En la región promotora se encuentran dos extensas zonas ricas en pirimidinas entre las posiciones 356-404 y 418-469, una presunta caja TATA en la posición 259 (TATAAAAAT) y cuatro cajas CAAT en las posiciones 174, 217, 230 y 337.

3. 2. Expression del gen bleR en P. chrysogenum bajo el PactPc.

Para expresar el gen bleR bajo el PactPc, en primer lugar se construyó un sitio NcoI sobre el codón ATG que co- difica para la metionina iniciadora del gen hex. Esto se

realizó mediante PCR utilizando como"primers"los siguien- tes oligonucleótidos : 5' CTCCATGGTGACTGATTAAACAAGGGAC 3' 5 GTAAAACGACGGCCAGTG 3 (Primer-20) E1 fragmento de DNA obtenido por PCR se subclonó en ambas orientaciones en el sitio SmaI del plásmido pBC KS (+) (Stratagene) dando lugar a pALPactl y pALPact2. Los insertos de ambos plásmidos fueron secuenciados utilizando los"dis- positivo de ensayo-kit-s""Borrar una base-Erase a base-" (Promega) y"Sequenase" (USE) en ambos casos de acuerdo con las instrucciones del fabricante. De esta forma se comprobó que el PactPc obtenido carecía de mutaciones e incluía el sitio NcoI sobre el ATG que codifica para la metionina ini- ciadora de la protein. pALPactl fue el plásmido elegido para realizar la subclonación del gen bleR. El gen bleR carente de su región promotora se obtuvo a partir del plásmido pUT737 (Mullaney et al. (1985). Mol. Gen. Genet. 199 : 37-45) como un fragmen- to NcoI-ApaI de 1. 100 pb. Seguidamente este fragmento se subclonó en el plásmido pALPactl (portador del PactPc) pre- viamente digerido NcoI-ApaI obteniéndose el plásmido pALPfleol (figura 6). Este último plásmido posee el gen bleR expresado bajo el control del PactPc, el terminador del gen trpC bajo el gen bleR, el gen de resistencia a cloranfenicol como marcador en E. coli y el polilinker del plásmido pBC KS (+). La secuenciación de la región de fusión entre PactPc y bleR confirmó la disposición de este último gen en el marco de lectura correcto.

Con el plásmido pALPfleol se realizaron transformacio- nes de P. chrysogenum, seleccionándose los transformantes en

función de su capacidad de resistencia a 30 µg/ml de fleomi- cina. Seguidamente se estableció el maximo nivel de resis- tencia a fleomicina de los transformantes en medio sólido, obteniéndose algunos capaces de crecer en presencia de más de 100 µg/ml de fleomicina. En los transformantes seleccio- nados por su resistencia a fleomicina se analizó la presen- cia del plásimdo por Southern y la existencia de transcrito correspondiente al gen bleR por Northern, obteniéndose re- sultados positivos en ambos casos. Estos resultados confir- maron la posibilidad de expresar genes heterólogos en P. chrysogenum bajo el control del PactPc. Un transformante de E. coli DH5a con el plásmido pALP315, el cual es portador del gen act, está depositado en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) con el número de acceso CECT4851. La obtención del plásmido pALP316 a partir del plásmido depo- sitado pALP315 simplemente consiste en subclonar el inserto pALP315 en el lugar EcoRI de pBluescript I KS (+) en la orientación opuesta.

EJEMPLO 4 4. 1. Clonación y caracterización del gen act de A. chrysogenum.

Con la finalidad de clonar el gen gdh de A. chryso- genum, se construyó una genoteca en el vector fágico 'GEM12 tal y como se describe en el apartado 1. 1 del ejemplol. El título fágico obtenido fue de 50 ufp/ul (25. 000 ufp totales) en E. coli LE392 y de 41 ufp/41 (20. 500 ufp totales) en E. coli NM539. Esto significaba que alrededor del 82 % de los

fagos eran portadores de un fragmento de DNA exógeno y que se habia obtenido una genoteca A. chrysogenum con una proba- bilidad del 99. 999 %. Una vez realizadas esta serie de com- probaciones teóricas, se infectó E. coli NM539 y la geno- teca complet se extendió sobre 3 placas Petri de 150 mm de diámetro (alrededor de 7. 000 ufp/placa Petri), se recogió en 50 ml de SM más 2. 5 ml de cloroformo y se guardó a 4°C. De esta forma se disponía de un volumen suficientemente amplio y representativo de fagos recombinantes (2. 100 ufp/pl) listos para ser plaqueados en cualquier momento.

Alrededor de 20. 000 ufps fueron extendidas sobre 2 placas Petri de 150 mm de diámetro y seguidamente se trans- firieron a filtros de nitrocelulosa (BA85, 0, 45 pm, Schleicher & Schuell). Dichos filtros se hibridaron utili- zando protocolos estándar (Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, USA) con un fragmento NcoI-ClaI de 888 pb corres- pondiente al gen act de A. nidulans. Un total de 5 clones positivos fueron purificados y seguidamente su DNA fue dige- rido con una serie de endonucleasas de restricción y anali- zado por el método de Southern. De esta forma, se identificó el gen act en un fragmento HindIII de 8, 7 kb. Este fragmento fue subclonado en ambas orientaciones en el plásmido pBluescript I KS (+) (Stratagene) generando los plásmidos pALC52 y pALC53. E1 mapa de restricción de la región de DNA que incluye el gen act aparece en la figura 4.

Con la finalidad de determinar la secuencia de nucleó- tidos del gen act se utilizaron los plásmidos pALC52 y pALC53 anteriormente citados. A partir de dichos plásmidos se construyeron una serie de clones por el método"Borrar una base-Erase a base-" (Promega) y posteriormente se se-

cuenciaron por el método del didesoxinucleótido utilizando el dispositivo de ensayo-kit-"Sequenase" (USB) en ambos casos de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La secuencia de 3. 240 nucleótidos obtenida (SEQ ID NO : 4) se analizó con el programa Geneplot (DNASTAR) confirmando la existencia de un ORF con un patrón preferencial de utili- zación de codones muy marcado. El codón ATG de inicio de traducción del gen act se encontró en la posición 787 y el codón de terminación TAA en la 2. 478. Dicho ORF posee 5 in- trones en las posiciones 794-920, 952-1. 123, 1. 180-1. 289, 1. 321-1. 410 y 2. 183-2. 249 y codifica para una proteína de 41. 612 Da y un punto isoeléctrico de 5. 51 cuya secuencia de 375 aminoácidos (SEQ ID NO : 8) posee un 98, 4 % y un 98, 1 % de identidad con las secuencias de aminoácidos de las proteins y-actina de A. nidulans y P. chrysogenum respectivamente. En la región promotora se encuentra una zona rica en pirimidi- nas entre las posiciones 607-654, una presunta caja TATA en la posición 747 (TTATAAAA) y una caja CAAT en la posición 338.

4. 2. Expression del gen bleR en A. chrysogenum bajo el PactAc.

Con la finalidad de expresar el gen bleR bajo el control del PactAc, se construyó el plásmido pALCfleol (figura 6), el cual incluye el gen bleR expresado bajo el control del PactAc, el terminador del gen trpC bajo el gen bleR, el gen de resistencia a cloranfenicol como marcador en E. coli y el polilinker del plásmido pBC KS (+).

El gen bleR carente de su región promotora se obtuvo a partir del plásmido pUT737 (Mullaney et al. (1985). Mol.

Gen. Genet. 199 : 37-45) como un fragmento NcoI-ApaI de 1. 100

pb. Seguidamente este fragmento se fusionó en marco de lec- tura con el PactAc aprovechando que el gen act posee un si- tio NcoI sobre el ATG que codifica para la metionina ini- ciadora de la protein. Para ello, el gen bleR se subclonó en el plásmido pALCactl (portador del PactAc) previamente dige- rido NcoI-ApaI obteniéndose el plásmido pALCfleol (figura 6). La secuenciación de la región de fusión entre PactAc y bleR confirmó la disposición de este último gen en el marco de lectura correcto.

Con el plásmido pALCfleol se realizaron transforma- ciones de A. chrysogenum, seleccionándose los transformantes en función de su capacidad de resistencia a 10 llg/ml de fleomicina. Seguidamente se estableció el máximo nivel de resistencia a fleomicina de los transformantes en medio só- lido, obteniéndose algunos capaces de crecer en presencia de más de 30 µg/ml de fleomicina. En los transformantes selec- cionados por su resistencia a fleomicina se analizó la presencia del plásmido por Southern y la existencia de transcrito correspondiente al gen bleR por Northern, obte- niéndose resultados positivos en ambos casos. Estos resul- tados confirmaron la posibilidad de expresar genes heteró- logos en A. chrysogenum bajo el control del PactAc. Un transformante de E. coli DH5a con el plásmido pALC52, el cual es portador del gen act, está depositado en la Colec- ción Española de Cultivos Tipo (CECT) con el número de ac- ceso CECT4850. La obtención del plásmido pALC53 a partir del plásmido depositado pALC52 simplemente consiste en subclo- nar el inserto pALC52 en el lugar HindIII de pBluescript I KS (+) en la orientación opuesta.

La introducción en actinomicetos, Penicillium, Asper- gillus, Acremonium o Saccharomyces de los insertos presentes en los plásmidos depositados utilizando de hospedador a E.

Coli, es tan solo cuestión de rutina técnica y de la elec- ción de los vectores más apropiados para la transformación de dichos géneros o familias.

DESCIPCIÓN DETALLADA DE LAS FIGURAS Figura 1.-Mapa de restricción del gen gdh de P. chrysogenum, el cual codifica para la actividad enzimática glutamato deshidrogenasa NADP dependiente (EC. 1. 4. 1. 4).

Figura 2.-Mapa de restricción del gen hex de P. chrysogenum, el cual codifica para la actividad enzimática (3-N-acetilhexosaminidasa (EC. 3. 2. 1. 52).

Figura 3.-Mapa de restricción del gen act de P. chrysogenum, el cual codifica para y-actina.

Figura 4.-Mapa de restricción del gen act de A. chrysogenum, el cual codifica para y-actina.

Figura 5.-Vectores para la expresión del gen lacZ de E. coli, del gen bleR de S. hindustanus y del fragmento antisentido del gen pahA de P. chrysogenum en P. chrysogenum y/o A. chrysogenum bajo el promotor Pgdh.

Figura 6.-Vectores para la expresión del gen bleR de S. hindustanus en P. chrysogenum y/o A. chrysogenum bajo los promotores Phex, PactPc, PactAc.

LISTADO DE SECUENCIAS INFORMACION GENERAL : SOLICITANTE : NOMBRE : ANTIBIOTICOS, S. A. U.

CALLE : Avda. de Burgos, 8-A CIUDAD : Madrid ESTADO O PROVINCIA : Madrid PAIS : España CODIGO POSTAL : 28036 TELEFONO : 91-3841200 FACSIMIL : 91-3841220 TITULO :"PROMOTORES DE LOS GENES GLUTAMATO DESHIDROGENASA, P-N-ACETILHEXOSAMINIDASA Y y-ACTINA Y SU UTILI- ZACION EN SISTEMAS DE EXPRESION, SECRECION Y ANTISENTIDO DE HONGOS FILAMENTOSOS".

NUMERO DE SECUENCIAS : 8 DIRECCION PARA CORRESPONDENCIA : DESTINATARIO : ANTIBIOTICOS, S. A. U.

CALLE : Avda. de Burgos, 8-A CIUDAD : Madrid ESTADO O PROVINCIA : Madrid PAIS : España CODIGO POSTAL : 28036 FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR : TIPO DE MEDIO : DISCO 3. 5" ORDENADOR : PC SISTEMA OPERATIVO : WINDOWS SOPORTE LOGICO : WORD INFORMACION SOBRE EL ABOGADO/AGENTE : NOMBRE : ALBERTO DE ELZABURU NUMERO DE REGISTRO : 232/1 DIRECCION : Miguel Angel, 21 28010-Madrid INFORMACION SOBRE TELECOMUNICACIONES : TELEFONO : 3085900 FACSIMIL : 3193810 TELEX O CORREO ELECTRONICO : elzaburu@elzaburu. es INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO. : 1 CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA : LONGITUD : 2816 pares de bases TIPO : nucléotidos NÚMERO DE HEBRAS : 2 CONFIGURACIÓN : lineal TIPO DE MOLÉCULA : ADN genómico HIPOTETICA : NO ANTI-SENTIDO : NO FUENTE DE ORIGEN : Penicillium chrysogenum FUENTE INMEDIATA : plásmidos pALP784 y pALP785 POSICION EN EL GENOMA : desconocida CARACTERISTICA : NOMBRE/CLAVE : secuencia codificante SITUACIÓN : unión (922... 970, 1131... 1261, 1319... 2521 CARACTERISTICA : NOMBRE CLAVE : intrón SITUACION : 971... 1130 CARACTERÍSTICA : NOMBRE/CLAVE : intrón SITUACION : 1262... 1318 CARACTERISTICA : OTRAS INFORMACIONES : gen gdh DESCRIPCION DE LA SECUENCIA : SEQ ID NO : 1 GATCGCCGTT TATGGGATAG TGGGCACGTG ACAGAGCCTG CAGCCGAGTC AAATTGCCGA 60 AGTTGGCAGT TGGTGGCGGA GAACTCGAGA TTTTATTTGC GTTTATTTCG TTTATTTCGA 120 TTTTAGTTTT CCTATTTTTC CTATTTTGGT TGATTCCATC CAACTTTATA GGATACTACT 180 TCATAATAGG TCGATCATAG TACAAGCACC AACTCGTCGC ATCATGCATT TTCTGGGGTT 240 CGAATTCTTT ACTTAGAGTA AGGTTTCTCT CAGCCTCCTA ATAAACTACC TAGGTAGGTT 300 AAATTTACTT TTTAACATTT TATTTATTCA GAAGATTGTC GGAGAGGACC GATCCGAAGG 360 ACACGAATTG AACACGGAAG GGATATTAGG GACAAGGAAG ATTTAGGGAT AAAAAAACGA 420 GCTGTGATTG ATGGGAAGGT TAAAGTGTAG TAATGAAGGT GATGGGACCA AAAGGAGTGG 480 GAGAGATAAG CCAAATTCTG TGCAAATTCT GTGACCTTAA ACCATAAGAT AACATTGTTC 540 GGGCCCCGAA CTTCGGACGT TCTTCCCACG GAAAGGCAAA TCATTGGGTT TCATCGATTC 600 TCTTGGATCT TTATCCTAAT TCCCCGTGCA ACCTGGTCTT GGGGATTATT GTCGACTTGT 660 AGGCGCATTA ACCCATCTCC CGTCTTCCCT CCAATCAATC CCGGATTCTC TCGTCCGACT 720 CCGGCTTCGA CTCTCTCTCT CTCCACATCT CTATATAATT GTACACTCCC CCATCCCATT 780 CTTTTCTTCT CTTCTCATCT ACTCTCTTGA ATCTCAATTG TCTTAATACT CTCTCTGCTC 840 TTGTCTTTAT TTATAATTTA TTAGATCACT GCTTAGCATT GATCTACTTA CCTAAAAGCA 900 GAGTTAACAG TACCGGCCGA A ATG ATG CAA AAC CTT CCC TTC GAG CCT GAG 951 Met Met Gln Asn Leu Pro Phe Glu Pro Glu 1 5 10 TTC GAG CAG GCC TAC AAG G GTATGTCTCT TTTAATTTTT CCCTTTCTTA TTTCAA 1006 Phe Glu Gln Ala Tyr Lys 15 TTCCATATCG TCCATATCAC ACACTATTTC CCGACTCAAT TCCTTTACCC ATCGGCATCT 1066 TCCCGGCCTT TGGCTCCACC GGGGGCATAA TTTCGGGGTG ACTCAGCTAA CAATCCCGAA 1126 ACAG AG CTC GCC TCC ACT CTC GAG AAC TCC ACT CTT TTC CAG AAG AAG 1174 Glu Leu Ala Ser Thr Leu Glu Asn Ser Thr Leu Phe Gln Lys Lys 20 25 30 CCC GAG TAC CGC AAG GCT CTT CAG GTC GTC TCT GTC CCC GAG CGT GTT 1222 Pro Glu Tyr Arg Lys Ala Leu Gln Val Val Ser Val Pro Glu Arg Val 35 40 45 ATT CAG TTC CGT GTT GTC TGG GAA GAT GAC AAA GGC CAG GTAAGACCTT 1271 Ile Gln Phe Arg Val Val Trp Glu Asp Asp Lys Gly Gln 50 55 60 TCTTTTTGAA AATGTCTAAT TAATTGCCAC ATGCTAATTC CGTTCAG GTC CAA ATC 1327 Val Gln Ile AAC CGT GGA TAC CGT GTC CAG TTC AAC TCC GCT CTT GGC CCC TAC AAG 1375 Asn Arg Gly Tyr Arg Val Gln Phe Asn Ser Ala Leu Gly Pro Tyr Lys 65 70 75 GGT GGC CTC CGG TTC CAC CCC ACG GTG AAC CTT TCC ATC CTC AAG TTC 1423 Gly Gly Leu Arg Phe His Pro Thr Val Asn Leu Ser Ile Leu Lys Phe 80 85 90 95 CTC GGT TTC GAG CAG ATC TTC AAG AAT GCC CTC ACC GGC CTG AAC ATG 1471 Leu Gly Phe Glu Gln Ile Phe Lys Asn Ala Leu Thr Gly Leu Asn Met 100 105 110 GGC GGT GGT AAG GGT GGA TCC GAC TTC GAC CCC AAG GGC AAG ACC GAT 1519 Gly Gly Gly Lys Gly Gly Ser Asp Phe Asp Pro Lys Gly Lys Thr Asp 115 120 125 AAC GAG ATC CGC CGC TTC TGT GTC TCC TTC ATG ACC GAG CTG TGC AAG 1567 Asn Glu Ile Arg Arg Phe Cys Val Ser Phe Met Thr Glu Leu Cys Lys 130 135 140 CAC ATC GGT GCC GAC ACC GAT GTT CCC GCC GGT GAT ATC GGT GTG ACC 1615 His Ile Gly Ala Asp Thr Asp Val Pro Ala Gly Asp Ile Gly Val Thr 145 150 155 GGC CGC GAG GTT GGT TTC ATG TTC GGC CAG TAC AAG AAG ATC CGC AAC 1663 Gly Arg Glu Val Gly Phe Met Phe Gly Gln Tyr Lys Lys Ile Arg Asn 160 165 170 175 CAG TGG GAG GGT GTC CTC ACC GGT AAG GGT GGC AGC TGG GGT GGT TCC 1711 Gln Trp Glu Gly Val Leu Thr Gly Lys Gly Gly Ser Trp Gly Gly Ser 180 185 190 CTC ATC CGC CCC GAG GCC ACC GGC TAC GGT GTC GTC TAC TAC GTC GAG 1759 Leu Ile Arg Pro Glu Ala Thr Gly Tyr Gly Val Val Tyr Tyr Val Glu 195 200 205 CAC ATG ATC CAG CAC GCC TCC GGC GGC AAG GAA TCC TTC GCT GGT AAG 1807 His Met Ile Gln His Ala Ser Gly Gly Lys Glu Ser Phe Ala Gly Lys 210 215 220 CGC GTC GCC ATC TCC GGT TCC GGA AAC GTC GCC CAG TAC GCC GCT CTC 1855 Arg Val Ala Ile Ser Gly Ser Gly Asn Val Ala Gln Tyr Ala Ala Leu 225 230 235 AAG GTC ATC GAG CTC GGT GGC TCC GTC ATC TCC CTC TCC GAC TCC CAG 1903 Lys Val Ile Glu Leu Gly Gly Ser Val Ile Ser Leu Ser Asp Ser Gln 240 245 250 255 GGT GCT CTC GTC CTG AAC GGC GAG GAG GGC TCC TTC ACC GCT GAG GAG 1951 Gly Ala Leu Val Leu Asn Gly Glu Glu Gly Ser Phe Thr Ala Glu Glu 260 265 270 ATC AAC ACC ATC GCT GAG ATC AAG GTC CAG CGC AAG CAG ATC GCC GAG 1999 Ile Asn Thr Ile Ala Glu Ile Lys Val Gln Arg Lys Gln Ile Ala Glu 275 280 285 CTC GCT ACC CAG GAC GCC TTC AGC TCC AAG TTC AAG TAC ATC CCC GGT 2047 Leu Ala Thr Gln Asp Ala Phe Ser Ser Lys Phe Lys Tyr Ile Pro Gly 290 295 300 GCC CGC CCC TGG ACC AAC ATC GCC GGC CGC ATC GAT GTC GCT CTC CCC 2095 Ala Arg Pro Trp Thr Asn Ile Ala Gly Arg Ile Asp Val Ala Leu Pro 305 310 315 TCC GCC ACC CAG AAC GAG GTC TCC GGC GAT GAG GCC AAG GCT CTC ATC 2143 Ser Ala Thr Gln Asn Glu Val Ser Gly Asp Glu Ala Lys Ala Leu Ile 320 325 330 335 GCC GCT GGC TGC AAG TTC ATC GCT GAG GGC TCC AAC ATG GGT TCC ACC 2191 Ala Ala Gly Cys Lys Phe Ile Ala Glu Gly Ser Asn Met Gly Ser Thr 340 345 350 CAG GAG GCT ATC GAT GTC TTC GAG GCC CAC CGT GAT GCC AAC CCT GGT 2239 Gln Glu Ala Ile Asp Val Phe Glu Ala His Arg Asp Ala Asn Pro Gly 355 360 365 GCC GCT GCC ATC TGG TAC GCC CCT GGT AAG GCC GCC AAC GCT GGT GGT 2287 Ala Ala Ala Ile Trp Tyr Ala Pro Gly Lys Ala Ala Asn Ala Gly Gly 370 375 380 GTT GCC GTC TCT GGT CTC GAG ATG GCC CAG AAC TCT GCC CGT GTC AAC 2335 Val Ala Val Ser Gly Leu Glu Met Ala Gln Asn Ser Ala Arg Val Asn 385 390 395 TGG TCC CGT GAG GAG GTT GAC TCC CGT CTT AAG AAG ATT ATG GAG GAC 2383 Trp Ser Arg Glu Glu Val Asp Ser Arg Leu Lys Lys Ile Met Glu Asp 400 405 410 415 TGC TTC AAC AAC GGT CTC TCT ACT GCT AAG GAG TAT GTC ACC CCT GCT 2431 Cys Phe Asn Asn Gly Leu Ser Thr Ala Lys Glu Tyr Val Thr Pro Ala 420 425 430 GAG GGT GTT CTT CCT TCC CTC GTG GCT GGC TCC AAC ATT GCT GGT TTC 2479 Glu Gly Val Leu Pro Ser Leu Val Ala Gly Ser Asn Ile Ala Gly Phe 435 440 445 ACC AAG GTC GCT GAG GCC ATG AAG GAG CAC GGT GAC TGG TGG TAAATTAGTC 2531 Thr Lys Val Ala Glu Ala Met Lys Glu His Gly Asp Trp Trp 450 455 460 GCATCCCCAT TTATTCTGGG AGGTGTTCTG TGACGATTTC TGTCCTCTCT TAAGGAGAGG 2591 CAGCTTTGAT GCATTTTCTT TTCATTTAAA TAGCTTTTTA CCCTTTTTGT CAAGCGGGTT 2651 ACGGATAGAG GCGCTTGGTT TTCTCCACTG TTGCATTCGA TTGATATCCC CACTTGAGCA 2711 CCGCTGTTTG TTTTGGTTCT GCACTTGGGA CTGTCATGAT GATAATGAGA TACAATGAAT 2771 AACTTAAAAA TAATTGTGTG GTCTCGTAAA GTTGTAAACT CTAGA 2816 INFORMACION PARA LA SEQ ID NO. : 2 CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA : LONGITUD : 5240 pares de bases TIPO : nucléotidos NÚMERO DE HEBRAS : 2 CONFIGURACIÓN : lineal TIPO DE MOLÉCULA : ADN genómico HIPOTETICA : NO ANTI-SENTIDO : NO FUENTE DE ORIGEN : Penicillium chrysogenum FUENTE INMEDIATA : plásmidos pALP295 y pALP388 POSICION EN EL GENOMA : desconocida CARACTERISTICA : NOMBRE/CLAVE : secuencia codificante SITUACIÓN : 1324... 3111 CARACTERISTICA : OTRAS INFORMACIONES : gen hex DESCRIPCION DE LA SECUENCIA : SEQ ID NO : 2 GTCGACCTCG CAACAGTCGA GAAGCACGCC GCCTATCTCG CCCGCAGCGG GGTAACCGGC 60 CTAGTAACCC AGGGTAGCAA TGGCGAAGCC GTCCACCTAG ACCGGGAAGA ACGCAAGGCC 120 ATCACAGCCG CCACACGCCG CGCCGTGGAC GCAGCCGGCT ACAGCAACAT GCCGGTGATT 180 GCCGGCTGTG GCGCCGCCTC AACCCGTGAG ACCATCCAAT TCTGCCAGGA CTCCGGTGCA 240 GCAGGCGCCG ACGCTGTCCT CGTGCTCCCA CCCAGCTACT ACAAGTCCCT CGTGAGCACC 300 GAGTCCATGC ACGCCCACTT CCGGGCTGTG GCCGATGCCT CGCCCGTCCC TGTCCTCATC 360 TACAACTTCC CCGGCGTGCA GTCCGGCCTC GATCTCAGCT CAGATGATAT CTTAACTCTC 420 GCAGAACACC CCAATATCAT CGGCTGTAAG CTCACGTGCG GCAACACGGG TAAGTTGGCT 480 CGTGTTGCGG CGGCCAAGCC GGATTTCTTG ACTTTTGGTG GCTCGGCCGA TTTCACGCTG 540 CAGACGCTGG TTGTTGGTGG GGCGGGGATT ATCGGTGGCG TGGCTAACAT GATTCCTCGC 600 TCGTGTGTGC GTCTGATGGA GTTGTATCGT GCTGGGAAGG TTCAGGAGGC GCAGAAGGTG 660 CAGGCTATTG TTGCGCGCGC TGACTGGGCT GCTATCCATG GTGGCTTTAT CGCTGTTAAG 720 ACGGGCCTCC AAGCCTACCA CGGTTACGGT GGTCTTCCTC GGCGGCCTTG TGTCGTGCCT 780 TCTGCTAAGG ATGCGGCAGC CATTCAGGAG GAGTTCCGGG AGGGAATGGA GCTGGAGAAG 840 TCGTTGGAGT CCTAATGGAT ATAGTAGATT AAATCATGAT TACCAGAGAT CCCATGTGGA 900 GATTTCTATT CCTTTCCAGG GGTTTTCCAG GGGTTTTCCA GATGTTTTCC AGGTGTTTTC 960 CAAATGTTTC AGGTTGCTTC ATAGATCGAC AGACCGGTGT GACTGTGTCA TTTGCCAGTA 1020 GATCCGGAGA TCCCGTAGCT TTCCCCCTCT TTATCTTTTA ATATTTGTTG TTATATGGGA 1080 GTTCAAGTTG CATGTAGAGG TTGCACTCTC TCTCTCTCTC TTTCCCTTGA ATTATTTGAG 1140 TCCAAGGTGT GTTAGTTGTA TGCAATGTAA CTAGGGAGCT GTTTGTTTTT CCCCTTCCCC 1200 AGGGTTGCAT CCTGGGCCAT TCCCCATTCC GATGAAAGAT CGACAATGCA GCTAAACATA 1260 AATAGTTCTG GTTATCTCCT GGCCACAGTT TCTCTACTTT TCATCGTCAC TCACCTTATC 1320 AAC ATG AAG TTC GCC TCG GTG TTG AAT GTG CTC GGG GCC CTG ACG GCT 1368 Met Lys Phe Ala Ser Val Leu Asn Val Leu Gly Ala Leu Thr Ala 15 10 15 GCG TCC GCC GTC CAA GTG AAT CCA CTT CCC GCC CCC CGT AAC ATC ACC 1416 Ala Ser Ala Val Gln Val Asn Pro Leu Pro Ala Pro Arg Asn Ile Thr 20 25 30 TGG GGA TCC TCC GGT CCA ATC CAA GTC AAC AAC TTG AAT CTC AAC GGT 1464 Trp Gly Ser Ser Gly Pro Ile Gln Val Asn Asn Leu Asn Leu Asn Gly 35 40 45 CCT CAC TCC CCT TTG CTC ACT CAA GCT TGG GAG CGA GCA TGG GAA ACC 1512 Pro His Ser Pro Leu Leu Thr Gln Ala Trp Glu Arg Ala Trp Glu Thr 50 55 60 ATC ACC ACC CTG CAA TGG GTT CCT GCT GCT GTT GAA TCC CCA ATC GCC 1560 Ile Thr Thr Leu Gln Trp Val Pro Ala Ala Val Glu Ser Pro Ile Ala 65 70 75 TCC TAT CCG GCC TTC CCC ACC TCG ACC CCT GTC TCC TCT GCC CCC AAG 1608 Ser Tyr Pro Ala Phe Pro Thr Ser Thr Pro Val Ser Ser Ala Pro Lys 80 85 90 95 GCC AAA CGC GCG CCC TCC GGA ATC CAT AAC GTC GAT GTT CAT GTG GTG 1656 Ala Lys Arg Ala Pro Ser Gly Ile His Asn Val Asp Val His Val Val 100 105 110 GAC AAC GAT GCC GAT CTC CAA TAC GGT GTG GAT GAA TCC TAT ACA CTG 1704 Asp Asn Asp Ala Asp Leu Gln Tyr Gly Val Asp Glu Ser Tyr Thr Leu 115 120 125 GTA GTG AGC GAT GGT GGC ATC AGG ATC AAT TCT CAG ACG GTC TGG GGT 1752 Val Val Ser Asp Gly Gly Ile Arg Ile Asn Ser Gln Thr Val Trp Gly 130 135 140 GTG TTG CAG GCA TTC ACC ACC CTG CAG CAG ATT ATC ATC TCG GAT GGG 1800 Val Leu Gln Ala Phe Thr Thr Leu Gln Gln Ile Ile Ile Ser Asp Gly 145 150 155 AAG GGC GGT TTG ATC ATT GAA CAG CCC GTC AAG ATC AAG GAT GCC CCG 1848 Lys Gly Gly Leu Ile Ile Glu Gln Pro Val Lys Ile Lys Asp Ala Pro 160 165 170 175 CTG TAC CCC CAT CGT GGT ATC ATG ATA GAC ACC GGG CGC AAC TTC ATT 1896 Leu Tyr Pro His Arg Gly Ile Met Ile Asp Thr Gly Arg Asn Phe Ile 180 185 190 ACC GTT CGC AAG CTC CTT GAG CAG ATC GAC GGT ATG GCC CTG TCC AAG 1944 Thr Val Arg Lys Leu Leu Glu Gln Ile Asp Gly Met Ala Leu Ser Lys 195 200 205 CTC AAT GTT CTC CAC TGG CAC TTG GAC GAT TCT CAG TCG TGG CCC ATG 1992 Leu Asn Val Leu His Trp His Leu Asp Asp Ser Gln Ser Trp Pro Met 210 215 220 CAG ATG AGC TCC TAC CCG GAG ATG ACC AAA GAT GCT TAC TCG CCT CGC 2040 Gln Met Ser Ser Tyr Pro Glu Met Thr Lys Asp Ala Tyr Ser Pro Arg 225 230 235 GAA ATC TAC ACC GAG CAC GAC ATG CGC CGC GTG ATT GCC TAC GCA CGC 2088 Glu Ile Tyr Thr Glu His Asp Met Arg Arg Val Ile Ala Tyr Ala Arg 240 245 250 255 GCG CGA GGT GTC CGC GTC ATC CCC GAG GTC GAC ATG CCC GCC CAC TCA 2136 Ala Arg Gly Val Arg Val Ile Pro Glu Val Asp Met Pro Ala His Ser 260 265 270 GCC TCC GGC TGG CAG CAG GTC GAC CCG GAG ATC GTG GCA TGT GCC GAA 2184 Ala Ser Gly Trp Gln Gln Val Asp Pro Glu Ile Val Ala Cys Ala Glu 275 280 285 TCC TGG TGG TCG AAC GAC GTT TGG GCG GAG CAC ACC GCC GTC CAG CCG 2232 Ser Trp Trp Ser Asn Asp Val Trp Ala Glu His Thr Ala Val Gln Pro 290 295 300 AAC CCT GGC CAG CTC GAC ATT ATC TAC CCC AAG ACC TAC GAA GTT GTC 2280 Asn Pro Gly Gln Leu Asp Ile Ile Tyr Pro Lys Thr Tyr Glu Val Val 305 310 315 AAC AAT GTC TAC CAG GAA TTG TCT CGC ATC TTC AGC GAC AAC TTG TTC 2328 Asn Asn Val Tyr Gln Glu Leu Ser Arg Ile Phe Ser Asp Asn Leu Phe 320 325 330 335 CAC GTT GGT GCA GAC GAG ATC CAG CCC AAC TGC TAC AAC TAC AGC ACC 2376 His Val Gly Ala Asp Glu Ile Gln Pro Asn Cys Tyr Asn Tyr Ser Thr 340 345 350 CAT ATC ACT AAG TGG TTT GCC GAG GAT CCC TCG CGC ACC TAC AAC GAC 2424 His Ile Thr Lys Trp Phe Ala Glu Asp Pro Ser Arg Thr Tyr Asn Asp 355 360 365 CTT GCG CAG TAC TGG GTT GAC CAT TCC ATG CCC ATC TTC CGT AGT GTC 2472 Leu Ala Gln Tyr Trp Val Asp His Ser Met Pro Ile Phe Arg Ser Val 370 375 380 GGC GAC CAC CGC CGT CTT ATG ATG TGG GAG GAC ATA GCT ATC GCG ACT 2520 Gly Asp His Arg Arg Leu Met Met Trp Glu Asp Ile Ala Ile Ala Thr 385 390 395 GAA AGC GCC CAC GAC GTG CCC AAA GAC GTC ATC ATG CAG ACC TGG AAC 2568 Glu Ser Ala His Asp Val Pro Lys Asp Val Ile Met Gln Thr Trp Asn 400 405 410 415 AGC GGC GAG GGT GAG GGT AAC ATC AAG AAA CTC ACC TCC GCC GGC TAC 2616 Ser Gly Glu Gly Glu Gly Asn Ile Lys Lys Leu Thr Ser Ala Gly Tyr 420 425 430 GAC GTT GTC GTT TCG ACC TCC GAT TTC CTC TAC CTC GAC TGC GGG CGC 2664 Asp Val Val Val Ser Thr Ser Asp Phe Leu Tyr Leu Asp Cys Gly Arg 435 440 445 GGC GGC TAT GTC ACC AAC GAC GCC CGC TAC AAC GTG CAG AGC AAC ACC 2712 Gly Gly Tyr Val Thr Asn Asp Ala Arg Tyr Asn Val Gln Ser Asn Thr 450 455 460 GAC GGC GGA GTG AAC TTC AAC TAC GGC GGC GAC GGT GGC TCC TGG TGC 2760 Asp Gly Gly Val Asn Phe Asn Tyr Gly Gly Asp Gly Gly Ser Trp Cys 465 470 475 GCC CCC TAC AAG ACC TGG CAG CGC ATC TAC GAC TAC GAC TTC CTC ACG 2808 Ala Pro Tyr Lys Thr Trp Gln Arg Ile Tyr Asp Tyr Asp Phe Leu Thr 480 485 490 495 AAT CTC ACT TCC TCC GAA GCG AAG CAC ATT ATC GGC GCC GAG GCT CCT 2856 Asn Leu Thr Ser Ser Glu Ala Lys His Ile Ile Gly Ala Glu Ala Pro 500 505 510 TTG TGG TCG GAG CAG GTC GAC GAT GTG ACC GTC TCC AGC GTG TTC TGG 2904 Leu Trp Ser Glu Gln Val Asp Asp Val Thr Val Ser Ser Val Phe Trp 515 520 525 CCT CGC GCT GCT GCT CTG GGT GAG CTT GTC TGG TCT GGT AAC CGT GAC 2952 Pro Arg Ala Ala Ala Leu Gly Glu Leu Val Trp Ser Gly Asn Arg Asp 530 535 540 GCT GCG GGT AGA AAG CGT ACC ACC AGC TTT ACT CAG CGT ATT CTG AAC 3000 Ala Ala Gly Arg Lys Arg Thr Thr Ser Phe Thr Gln Arg Ile Leu Asn 545 550 555 TTC CGT GAA TAC CTC GTT GCC AAT GGT GTG ATG GCT ACT GCT CTT GTG 3048 Phe Arg Glu Tyr Leu Val Ala Asn Gly Val Met Ala Thr Ala Leu Val 560 565 570 575 CCG AAG TAT TGT CTG CAG CAC CCT CAT GCT TGC GAC CTC TAT AAA AAC 3096 Pro Lys Tyr Cys Leu Gln His Pro His Ala Cys Asp Leu Tyr Lys Asn 580 585 590 CAG ACT GTA ATG TCT TGATTGTGGT TAAGCTGGAC TGCTAGTGAG CCTTACAACT 3151 Gln Thr Val Met Ser 595 GCCTGTTCGT CTGTATATAC TTATTCTATC TTCGATACCC AATTCCATTG GAATTTCTTC 3211 CAGGATACAT GTCCCTGATC AGTATACCAT TTCACGTCCA CATTCAATCT TCAGCAACAC 3271 GAATTTATCC AAACCAATCA CCACCCTAGA TCTACCACAA CACTACCTTT ATACATATCT 3331 ACTTGATACC CAATCCCATT CCAACCAGGC GCAAAAGGCG TGCCCAGTCC AAATCAAAAT 3391 CAGCCCCCCG AGCCCAACCC TCTCCACATA TCCATACCCT AATCAAAATC ACCTTAATCT 3451 AAACAAATCC ATCACGCCCA AGGACCCCAC AGACCTCCCC TTCCCAACCC ACCCAGTCCA 3511 CCTCCACAAA CCAAACCCCA AATCAGAACT GCCGTGCAAC TCTCCGTCTT AGAACTCGCC 3571 CTTCGGTCCC GTCCCGAACT TAGATGGGCT TCGGGACGGC TTGCTGTATG CACTATGCAT 3631 GTAGTACGGA GTACGCCGTA CACATGTAGT AGGGGATATA TGTATGTACT ATGTACGCAT 3691 GTTCGAGTAC GCAGTACGTA GTGTGGCATG CAGGTCAGCT AGCATTGGCA GTAGCATATA 3751 CGGCATAACC TACGCTATGC ATCTAATATT CTTCGGTATA TACCACATGG TACGGAATTA 3811 GATGCAATAC ATGTACATGT ACATGTGCAT ACCTAGGTAC AAAGTGAATC TCGTTATTGT 3871 ATGTCTAGTC GTGTATAAGT GTAGTCCCAT GTCATATATA CAAGCCCATA CCGCATCGGA 3931 GCAAACCAGC CCATTCAGAC ATCCCTGCTC GAAACCCAGT CTACGGATTG AGACCGGGCT 3991 GAGCTGGGGT TTGGGTGTTG CTGCATGCGT ACGCCTACAT ACGTAGGGAG ATATGTTGCA 4051 CAGGATGCAG GGAATGACAA ATTGACGAAT TGAGAAATAC GCGAGTGGTT AGATGTTAAT 4111 TCTCGTTCGG GATGTTTATG TTTACCTAGG TATACTGGCT GGGGGGTCGT CATACACGTG 4171 GGAATTTGTG GCAATCTGTC AGTGGCCAGG TCCTTGTTTG ATTTATATGT TTGGGATGGG 4231 GATGGTCAAT GGGTATTCCA AGGAGGATGT ATCATCTGCT TTACACCGTC CCTTGCCTGG 4291 GATTTGGATT GAATTCTTCT TTCCACGTCG ATGTAGATTC TTCCCCGGAG CTATTCGGGT 4351 ACAACCCTGG CTTCCATATA TCATGTGTCC ATACTAAGTA CAGACGCTTC GATTTCCGGT 4411 GCTGCGAGTA GATCGGGAAC TGATCTCGCA TGTCTGTACA CGAAGGGTTG TACAAGCACG 4471 CGGTCGTTCT GCGTAACCGG TTGTTTATGT TATTGGATTT GGTATTCGTC TAATATGGAT 4531 GATTTGGGAT AAGCTTCTAT CCTGGGAATG GGTGCTTGGT ATAGTTCAGC CTAGTACTTC 4591 GTCTTCTATG TGATATTTCC AAAATAGTAG TTTTCGGTAA GTATATCTCC TACCTTTGAC 4651 TTTGGTTTGT GGTTTACGTC TTACCTGGCG TTTAGAGGGA GGGATAGGTT TCTGTATCAC 4711 CGTCGTGTTT CAACGTGGAT CGGGGTCCTT TCCCTGATAT ATATCTTGGC TTATGTTTCG 4771 TGCGGTAGTG CGGGTTCGTA TAATGCATGT CTGGTATATC ATACGGCATT AGTGACTGGG 4831 ACGTTGAGGT CGAGCTTGGT TTGAGGTTAC ATATATTGAG CCAAAATGGT CGAAAATATA 4891 TATCAACATT GCCAAAACAG AACTTCATTC GTTGGATGCC ATGCCAAATT GCTAATAGGT 4951 CTTGATCTTA CTCTGACTCC TATCTCATCT CACCTTGGTT ATTCGTTACA CAGCATTAAC 5011 CCCAAGAACC AGGTATAGTC TGATCGTGGA TGTGGGCCAC GACAAAATAG AAGGTCTCGT 5071 GTTTAGGGCG ACGAATCTGG GACTGCATTC CAGACGGGCC TGCGGAGAAT TTGCAGCATT 5131 TTATATCTAC ATGGTTGTTC CCTGGTGTGT GTGGGTGTTT CATGATATAT CCTGGTCGAT 5191 TCTGACGTGC GTATGTATCG CTGGAAAGGC TCGTAGGGGC TGCGTCGAC 5240 INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO. : 3 CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA : LONGITUD : 2994 pares de bases TIPO : nucléotidos NÚMERO DE HEBRAS : 2 CONFIGURACIÓN : lineal TIPO DE MOLÉCULA : ADN genómico HIPOTETICA : NO ANTI-SENTIDO : NO FUENTE DE ORIGEN : Penicillium chrysogenum FUENTE INMEDIATA : plásmidos pALP315 y pALP316 POSICION EN EL GENOMA : desconocida CARACTERÍSTICA : NOMBRE/CLAVE : secuencia codificante SITUACIÓN : unir (494.. 500, 617.. 647, 846.. 901, 1047.. 1077, 1181.. 1952, 2022.. 2249) CARACTERISTICA : NOMBRE CLAVE : intrón SITUACION : 501.. 616 CARACTERISTICA : NOMBRE/CLAVE : intrón SITUACION : 648.. 845 CARACTERISTICA : NOMBRE/CLAVE : intrón SITUACION : 902.. 1046 CARACTERISTICA : NOMBRE/CLAVE : intrón SITUACION : 1078.. 1180 CARACTERISTICA : NOMBRE/CLAVE : intrón SITUACION : 1953.. 2021 CARACTERÍSTICA : OTRAS INFORMACIONES : gen act DESCRIPCION DE LA SECUENCIA SEQ ID NO : 3 GAATTCAGCA GCCTACGGAG TCCATAAGAC ACCAAGACAC AGCCATTGTA TGGATTATAT 60 ATGCCATGTA TGCCTGACAA TGCTGTATAA GTACTGTAAT ACAAGGTAAA CCCCCAACCC 120 GGTCAAGGTA CGTGTTCCCG CCGTACCCAA AAGGGTCCCC AAGAATGTCC ACGCAATACT 180 TTTAGGTAGA CATTGAAGGA ATCCAAGTGA GAAATTCAAT GAACATGAAC AATAGTTCTG 240 CCTTATAATC TTTATAAGTA TAAAAATCAG AAAGAGAATT ATATACAAAA GGGTAGATCT 300 GGAGGGGGTT CAGAGTTAAG GCCTCAGGCA GGCGCACAAT CCCAGCCATC ACAAACCCCT 360 CTCCACTCTT CCCTCTCTCT CTCTTCCTTC TTCCTTTCTC CCCTAATCCC AACTATATCC 420 CCTCTAACCT CTTTCCATCT TTCTTTTCTT TTTTCCCCTC TTCTCCCCTA AGTCCCTTGT 480 TTAATCAGTC ACA ATG GAG G GTATGTTATT CCAGTTGTGG CCACATCAGC AGCTTCCC 538 Met Glu 1 CGGAAGCTCC CCCCCCTGTT GGCCACAGCT TCGATTCCAT ATTTGCGAAT GACAACTAAC 598 CCGTATATCT CATTATAG AA GAA GTT GCT GCT CTC GTC ATC GAC AAT GG 647 Glu Glu Val Ala Ala Leu Val Ile Asp Asn Gly 5 10 GTATGTGCTA TACTTTTCCC CGGAGCTTCT GGCTTGTGTT GGGGTCGCCA ACTCAGCCCC 707 GGTCGCAGTC GTTGCCACCC CTAATCCGCC CGCGACGGCA GATGGAATCC ATCCCAATGG 767 CTTTCCATCT CGCTCCACAA CTACCAGAGG GTGATCCAAA GACTACAAGA ACTATGATAC 827 TGATTATTTG CGATATAG T TCG GGT ATG TGT AAG GCC GGT TTC GCC GGT GAC 879 Ser Gly Met Cys Lys Ala Gly Phe Ala Gly Asp 15 20 GAC GCA CCA CGA GCT GTT TTC C GTAAGTCCA ACCCCACAGA ATATGACACC 930 Asp Ala Pro Arg Ala Val Phe 25 30 CCTCCTGTGC GAAGGCCGCC ATCCCACCAA CCCTTGCGTC GGATGGCTTC CCCTCTTTTG 990 CTTGGCTAGG AGGAACCTGG AACCTAGGAA ATCAAATAAC TGACAAAATT CAACAG 1046 CT TCC ATT GTC GGT CGT CCC CGC CAC CAT GG GTAAATGATC CCCCCTTTTT 1097 Pro Ser Ile Val Gly Arg Pro Arg His His Gly 35 40 TTTCCGGCTC GTTTCGGCTG TATACGCTAT ACGCAGCCAA TTTGATCCCT AATGAACCAA 1157 AAAGAATACT AACATGGGCG CAG T ATT ATG ATT GGT ATG GGT CAG AAG GAC 1208 Ile Met Ile Gly Met Gly Gln Lys Asp 45 50 TCG TAC GTT GGT GAT GAG GCA CAG TCG AAG CGT GGT ATC CTC ACG CTC 1256 Ser Tyr Val Gly Asp Glu Ala Gln Ser Lys Arg Gly Ile Leu Thr Leu 55 60 65 CGT TAC CCT ATT GAG CAC GGT GTT GTC ACC AAC TGG GAC GAC ATG GAG 1304 Arg Tyr Pro Ile Glu His Gly Val Val Thr Asn Trp Asp Asp Met Glu 70 75 80 AAG ATC TGG CAC CAC ACC TTC TAC AAC GAG CTC CGT GTT GCC CCC GAA 1352 Lys Ile Trp His His Thr Phe Tyr Asn Glu Leu Arg Val Ala Pro Glu 85 90 95 GAG CAC CCC ATT CTC TTG ACC GAA GCT CCC ATC AAC CCC AAG TTC AAC 1400 Glu His Pro Ile Leu Leu Thr Glu Ala Pro Ile Asn Pro Lys Phe Asn 100 105 110 115 CGT GAG AAG ATG ACC CAG ATC GTG TTC GAG ACC TTC AAC GCC CCC GCC 1448 Arg Glu Lys Met Thr Gln Ile Val Phe Glu Thr Phe Asn Ala Pro Ala 120 125 130 TTC TAC GTC TCC ATC CAG GCC GTT CTG TCC CTG TAC GCC TCC GGT CGT 1496 Phe Tyr Val Ser Ile Gln Ala Val Leu Ser Leu Tyr Ala Ser Gly Arg 135 140 145 ACC ACT GGT ATC GTT CTC GAC TCC GGT GAC GGT GTC ACC CAC GTC GTC 1544 Thr Thr Gly Ile Val Leu Asp Ser Gly Asp Gly Val Thr His Val Val 150 155 160 CCC ATC TAC GAG GGT TTC TCT CTG CCC CAC GCT ATC TCG CGT GTC GAC 1592 Pro Ile Tyr Glu Gly Phe Ser Leu Pro His Ala Ile Ser Arg Val Asp 165 170 175 ATG GCT GGC CGT GAT CTG ACC GAC TAC CTG ATG AAG ATC CTC GCT GAG 1640 Met Ala Gly Arg Asp Leu Thr Asp Tyr Leu Met Lys Ile Leu Ala Glu 180 185 190 195 CGT GGT TAC ACT TTC TCC ACC ACC GCC GAG CGT GAA ATC GTC CGT GAC 1688 Arg Gly Tyr Thr Phe Ser Thr Thr Ala Glu Arg Glu Ile Val Arg Asp 200 205 210 ATC AAG GAG AAG CTT TGC TAC GTC GCC CTC GAC TTC GAG CAG GAG ATC 1736 Ile Lys Glu Lys Leu Cys Tyr Val Ala Leu Asp Phe Glu Gln Glu Ile 215 220 225 CAG ACC GCT TCC CAG AGC TCC AGC CTC GAG AAG TCC TAC GAG CTT CCC 1784 Gln Thr Ala Ser Gln Ser Ser Ser Leu Glu Lys Ser Tyr Glu Leu Pro 230 235 240 GAT GGA CAG GTC ATC ACT ATT GGC AAC GAG CGC TTC CGT GCT CCT GAG 1832 Asp Gly Gln Val Ile Thr Ile Gly Asn Glu Arg Phe Arg Ala Pro Glu 245 250 255 GCT CTG TTC CAG CCT AAC GTT CTT GGC CTC GAG TCT GGC GGT ATC CAC 1880 Ala Leu Phe Gln Pro Asn Val Leu Gly Leu Glu Ser Gly Gly Ile His 260 265 270 275 GTC ACC ACC TTC AAC TCC ATC ATG AAG TGT GAT GTT GAT GTC CGT AAG 1928 Val Thr Thr Phe Asn Ser Ile Met Lys Cys Asp Val Asp Val Arg Lys 280 285 290 GAT CTC TAC GGC AAC ATT GTC ATG GTAAGAAAAA AGCCTCCAGA GCTGATGTTG 1982 Asp Leu Tyr Gly Asn Ile Val Met 295 CGCAAAGATC CCCACTAACA TACAACTCCT TTTTTTTAG TCT GGT GGT ACC ACC 2036 Ser Gly Gly Thr Thr 300 ATG TAC CCC GGT ATC TCC GAC CGT ATG CAG AAG GAG ATC ACT GCT CTT 2084 Met Tyr Pro Gly Ile Ser Asp Arg Met Gln Lys Glu Ile Thr Ala Leu 305 310 315 320 GCT CCT TCT TCC ATG AAG GTC AAG ATC ATC GCT CCC CCC GAG CGC AAG 2132 Ala Pro Ser Ser Met Lys Val Lys Ile Ile Ala Pro Pro Glu Arg Lys 325 330 335 TAC TCC GTC TGG ATC GGT GGA TCC ATT CTG GCC TCC CTG TCG ACC TTC 2180 Tyr Ser Val Trp Ile Gly Gly Ser Ile Leu Ala Ser Leu Ser Thr Phe 340 345 350 CAG CAG ATG TGG ATC TCC AAG CAG GAG TAC GAC GAG AGC GGT CCT TCC 2228 Gln Gln Met Trp Ile Ser Lys Gln Glu Tyr Asp Glu Ser Gly Pro Ser 355 360 365 ATC GTT CAC CGC AAG TGC TTC TAAGCTTCTT GCAGCACTTT ACTACTCGTA 2279 Ile Val His Arg Lys Cys Phe 370 375 TTCGCTCGTA CTTTCCTGGT GTATCAAAAA GCAGGATGGA GGCACTGGTG GATTGCAAGC 2339 GTTGTTGGAC TCGCATTATC AAGCGGATAG CCTGAAAATG GAATCTCGAT TTTAGTGGAA 2399 TAGAGTCGGT CGTTTTCTTT TTGTTACTCT TTACCTTACT CTTTACTCGA TCTCTATCCA 2459 TCCATTTCTG CTTTGAACCA TTTCACCTTT ACTCCATCTT TTTCCCTTTC CTCATTCGAA 2519 TCCGCTGTCC CGTCCACCTC TCTGATTGTT TTGCCTGGAC GGGTCTCTGG CGATGCGGCA 2579 TCAACAGTGT ACCTGTAGGG CAAGGATGTA TATGGAGTTG GTTGGCTATA GGGATTAGGT 2639 TGCGTTGTCC TTTTCGACGT CTTCTACGTC TTTGTTCTAG CCCCTTGCGT TGTCTTCAAC 2699 TAAACTGCCC TTGTCCGTAG CTTTTAACGT GACTTTGACT TCAAATATTC CACTGGTTCC 2759 TTGTATTCTG CTAGAAACGC TGGTTCAACG CTTGTTGAAT GTCTTCTATG TCCAACATCT 2819 ACAAGACGTA TCCGAGAAGA CAACAAAAAG GCTCTGAGGA AAGTCTACTA AAAACTTGGC 2879 CAGGCCGGAT TAGGCCTTTG TCATGGTTAT TGTACTGTCA TTCGATCAGT CCATATTGAT 2939 ATTCTGGGAA TATGTAGGCT GACGAGATAA ATGGCACGCA TTGGGTGTGT ATCTT 2994 INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO. : 4 CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA : LONGITUD : 3240 pares de bases TIPO : nucléotidos NUMERO DE HEBRAS : 2 CONFIGURACIÓN : lineal TIPO DE MOLÉCULA : ADN genómico HIPOTETICA : NO ANTI-SENTIDO : NO FUENTE DE ORIGEN : Penicillium chrysogenum FUENTE INMEDIATA : plásmidos pALC52 y pALC53 POSICION EN EL GENOMA : desconocida CARACTERÍSTICA : NOMBRE/CLAVE : secuencia codificante SITUACIÓN : unir (787.. 793, 921.. 951, 1124.. 1179, 1290.. 1320, 1411.. 2182, 2250.. 2477) CARACTERISTICA : NOMBRE/CLAVE : intrón SITUACION : 794.. 920 CARACTERISTICA : NOMBRE/CLAVE : intrón SITUACION : 952.. 1123 CARACTERISTICA : NOMBRE/CLAVE : intrón SITUACION : 1180.. 1289 CARACTERISTICA : NOMBRE/CLAVE : intrón SITUACION : 1321.. 1410 CARACTERISTICA : NOMBRE/CLAVE : intrón SITUACION : 2183.. 2249 CARACTERISTICA : OTRAS INFORMACIONES : gen act DESCRIPCION DE LA SECUENCIA : SEQ ID NO : 4 GCCAGGCTGG CACCGGCCTG CCTTGATGCG AGATGCCTAC TCGTACTATG CCTACAGGTA 60 TGGGCTTTCC GCGTGTCGTC AGCTTGCGAC CGCGCGGCTG CTGACGACCC AAGGCAAGCT 120 GGTAACATGG CGGCACGAAA TTTCTCTCTG CCTGCTCGTC CTCTTGGTGT GGAGGGGTAC 180.

GAGTGCAGGT ATGATGGGAC GGCAGAGGAG TGACGGAGGC TGTGCGGTTG GCACGAGTAC 240 TGTACGAGTA CTCGTACTGT AGGTGCAGCG ACTGTGGTGG TACTGCTAGG TGGAATTGGG 300 TCCAGCAGGC ATGCAGCTCC CAGCCACCGT CGTTAACCAA TCAGTTAAAG CAGCAACGCA 360 ACCCGCCCCC GTTTTTCTGC CAGAAATTTG GGCGGTGTCG TGCCCCCAGT CGCTGTTGCC 420 CGCCCTTGTC TGGTCGCCTA CAGGCTGCAC CACAGGTAAC AACAGCCCGC CCCAGGTCCT 480 TGTAGGTGCC CAGTGAGTGC CCGGTGCCCA CAAGTTTCTC GTGGCATCCA CTGGCGGACT 540 TGGAAGCCCA TCAGTGATGC TTCCCTCCTT TCCCCCTCCA CATCTCACTC AGCTCACGCA 600 AGCCAACCCT CTCTCCCCCC GTCTCCATTC CATCTTCTTC TCTCCACGAC CCTTAAGAGT 660 CCCTCCTGCT CACGTCGACC ATCCTTCGCT CCCAGCCCCA CGACATCTGC ATCGTCTGGG 720 CTTCTTGACA CTCTGTCATT TCTTCCTTAT AAAACCTCTT TACCGCTCTT CCCGTAATCC 780 GACGCC ATG GAG G GTACGTGTCG CCGCAACGCA CTCCCGCTTC CCCTACTACC CCTA 837 Met Glu 1 TCGCGC ATCCACACGG CGCCGCGATG CCTAGCCATC GCGAGGGTGC ATCGCAACGA CTT 896 GGCTAAC TGTTCTTCGC TTCACAG AG GAG GTC GCC GCC CTC GTT ATC GAC 946 Glu Glu Val Ala Ala Leu Val Ile Asp 5 10 AAT GG GTAAGCTCGC CCGCTGTCTC ACCGACATCC ATCGTCCCCC TGGCCTCTGT 1001 Asn Gly CGAGATGGGA GCCTCCAGGG GTCCCTTCGA CGAGCGCGTC GATTGCCAAA ATCCAACGAG 1061 ATCGGGCCAT ACTGAGCCGA CACTCGTGTG TTTTCTGGAC ATTAGGACTG ACTTGATTCT 1121 AG T TCG GGT ATG TGC AAG GCC GGT TTC GCC GGT GAT GAT GCT CCC CGA 1169 Ser Gly Met Cys Lys Ala Gly Phe Ala Gly Asp Asp Ala Pro Arg 15 20 25 GCT GTT TTC C GTAAGTACCC CACTTCCACC CGTCGAGCTC CCCAATTGTC CACCGCCAGG 1229 Ala Val Phe 30 GCGAGAAGGG GGCAGAACGG GGCAAACTGC ATCGCAAACA TGGCTAATTC GATGCGACAG 1289 CG TCC ATT GTC GGT CGT CCC CGC CAC CAT GG GTAAGTTTCC GGCCGCAGCC 1340 Pro Ser Ile Val Gly Arg Pro Arg His His Gly 35 40 GACACCTCTC ACCCCCCCCC GGGGGGCTCC TAAGCGAGTC AGCGCTGGTT CTGACCGCTG 1400 GATACTATAG C ATC ATG ATC GGC ATG GGC CAG AAG GAC TCG TAC GTC GGT 1450 Ile Met Ile Gly Met Gly Gln Lys Asp Ser Tyr Val Gly 45 50 55 GAC GAG GCT CAG TCC AAG CGT GGT ATC CTC ACC CTG CGC TAC CCC ATT 1498 Asp Glu Ala Gln Ser Lys Arg Gly Ile Leu Thr Leu Arg Tyr Pro Ile 60 65 70 GAG CAC GGT GTT GTC ACC AAC TGG GAC GAC ATG GAG AAG ATC TGG CAC 1546 Glu His Gly Val Val Thr Asn Trp Asp Asp Met Glu Lys Ile Trp His 75 80 85 CAC ACC TTC TAC AAC GAG CTG CGT GTT GCC CCC GAG GAG CAC CCG GTC 1594 His Thr Phe Tyr Asn Glu Leu Arg Val Ala Pro Glu Glu His Pro Val 90 95 100 CTG CTC ACC GAG GCG CCC ATC AAC CCC AAG TCC AAC CGT GAG AAG ATG 1642 Leu Leu Thr Glu Ala Pro Ile Asn Pro Lys Ser Asn Arg Glu Lys Met 105 110 115 ACC CAG ATC GTC TTC GAG ACC TTC AAC GCC CCT GCC TTC TAC GTC TCC 1690 Thr Gln Ile Val Phe Glu Thr Phe Asn Ala Pro Ala Phe Tyr Val Ser 120 125 130 135 ATC CAG GCC GTC CTG TCA CTG TAC GCC TCC GGC CGT ACG ACC GGT ATC 1738 Ile Gln Ala Val Leu Ser Leu Tyr Ala Ser Gly Arg Thr Thr Gly Ile 140 145 150 GTC CTG GAC TCT GGT GAT GGT GTC ACC CAC GTT GTC CCC ATC TAC GAG 1786 Val Leu Asp Ser Gly Asp Gly Val Thr His Val Val Pro Ile Tyr Glu 155 160 165 GGT TTC GCC CTG CCC CAC GCC ATT GCC CGT GTC GAC ATG GCT GGT CGT 1834 Gly Phe Ala Leu Pro His Ala Ile Ala Arg Val Asp Met Ala Gly Arg 170 175 180 GAT CTC ACC GAC TAC CTC ATG AAG ATC CTG GCC GAG CGC GGC TAC ACC 1882 Asp Leu Thr Asp Tyr Leu Met Lys Ile Leu Ala Glu Arg Gly Tyr Thr 185 190 195 TTC TCC ACC ACG GCC GAG CGT GAG ATT GTC CGT GAC ATC AAG GAG AAG 1930 Phe Ser Thr Thr Ala Glu Arg Glu Ile Val Arg Asp Ile Lys Glu Lys 200 205 210 215 CTC TGC TAC GTC GCC CTC GAC TTC GAG CAG GAG ATC CAG ACT GCC GCC 1978 Leu Cys Tyr Val Ala Leu Asp Phe Glu Gln Glu Ile Gln Thr Ala Ala 220 225 230 CAG AGC TCC AGC CTG GAG AAG TCC TAC GAG CTT CCC GAC GGC CAG GTC 2026 Gln Ser Ser Ser Leu Glu Lys Ser Tyr Glu Leu Pro Asp Gly Gln Val 235 240 245 ATC ACC ATT GGC AAT GAG CGC TTC CGT GCT CCC GAG GCT CTC TTC CAG 2074 Ile Thr Ile Gly Asn Glu Arg Phe Arg Ala Pro Glu Ala Leu Phe Gln 250 255 260 CCC TCC GTC CTG GGT CTC GAG AGC GGC GGC ATC CAC GTC ACC ACC TTC 2122 Pro Ser Val Leu Gly Leu Glu Ser Gly Gly Ile His Val Thr Thr Phe 265 270 275 AAC TCC ATC ATG AAG TGC GAC GTC GAT GTC CGT AAG GAT CTG TAC GGC 2170 Asn Ser Ile Met Lys Cys Asp Val Asp Val Arg Lys Asp Leu Tyr Gly 280 285 290 295 AAC ATT GTC ATG GTAAGTCAGA TGCCGGGCCT GGAAGACACC TCATTTAGGA TCT 2225 Asn Ile Val Met TGCTAAC ACCAATTTTT TTTTTAG TCT GGT GGT ACC ACC ATG TAC CCT GGC 2276 Ser Gly Gly Thr Thr Met Tyr Pro Gly 300 305 CTC TCT GAC CGT ATG CAG AAG GAG ATC ACT GCT CTT GCT CCT TCT TCC 2324 Leu Ser Asp Arg Met Gln Lys Glu Ile Thr Ala Leu Ala Pro Ser Ser 310 315 320 ATG AAG GTC AAG ATC ATT GCT CCC CCG GAG CGC AAG TAC TCC GTC TGG 2372 Met Lys Val Lys Ile Ile Ala Pro Pro Glu Arg Lys Tyr Ser Val Trp 325 330 335 340 ATC GGT GGT TCC ATT CTG GCG TCT CTG TCC ACC TTC CAG CAG ATG TGG 2420 Ile Gly Gly Ser Ile Leu Ala Ser Leu Ser Thr Phe Gln Gln Met Trp 345 350 355 ATC TCG AAG CAG GAG TAC GAC GAG AGC GGC CCC TCC ATC GTC CAC CGC 2468 Ile Ser Lys Gln Glu Tyr Asp Glu Ser Gly Pro Ser Ile Val His Arg 360 365 370 AAG TGC TTC TAAGGTATGT TGTCGTCGGG AAGCCGGATA CCCGAATGTA AGGTTGACAG 2527 Lys Cys Phe 375 GTTCGAAAAG ACAAGGCAAC CGGCCAGAAC CAAATCCTTC CACCCTCCGC AAAAGAACGC 2587 CAAGATGTCG GAGTCGGTGG CGACCGATGC AACGTCTACT CACGTGCGCG CGTATCCCAC 2647 TCAAGTCTCA TATTTACGAA AAGTTATTTC ACATGGTCAG GCGGTGGTGG GCGTTGCCTT 2707 TTCTCGGAAC AGACATGACG GCGGCCACTT TTGTAGTCGG ATGCGTTTAG GGATGCGAGC 2767 CTAGGGGTGT AGGAAGCTGA GGTTGATATA CAATAACTTT TTTTGCTTTC CGTTCTAGAC 2827 TCGTTCAATG GGAAGACGTG ACGGAATCGC TTGGCTGTCT AATAGCCAGC TTGATCAGGC 2887 GAGTCGGGTT GTTGTGTTTC GATGTTGAGA GGTGCACCAG CGTATTTGTA TGGCCGAGGT 2947 AGGTATTATG GTCTCGTATT TGCAACACTA GAGCTCGCTT GCTCGTTTTT ACCAGCAGTG 3007 TCCTCTGCCA TGCCGCGGCT CCGACTCTCG TCTGGCTTCT CAGACCGTGC CTCGTCAATA 3067 GTATTATCCC CCGTAGTAAC CTCCGCACTA GCCGGTTCTT TGTCGTCTTC CTGCTCGCCG 3127 ATGAGCTTCC TGTACTTGCG CCTCTTCTTC TTGTCGGCGC TGGCAGCCCT CTTCTGCTTG 3187 ATGCGCCCGA CCATGGCGGA CCGGCTCTGC TCCCCGTTGA GCAGCTCGTC GAC 3240 INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO. : 5 CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA : LONGITUD : 461 aminoácidos TIPO : aminoácidos NÚMERO DE HEBRAS : 1 CONFIGURACIÓN : lineal TIPO DE MOLÉCULA : péptido FUENTE DE ORIGEN : Penicillium chrysogenum CARACTERÍSTICA : OTRAS INFORMACIONES : secuencia de aas del enzima glutamato deshidrogenasa (EC. 1. 4. 1. 4) de 49837 Da de peso molecular DESCRIPCION DE LA SECUENCIA : SEQ ID NO : 5 Met Met Gln Asn Leu Pro Phe Glu Pro Glu Phe Glu Gln Ala Tyr 1 5 10 15 Lys Glu Leu Ala Ser Thr Leu Glu Asn Ser Thr Leu Phe Gln Lys 20 25 30 Lys Pro Glu Tyr Arg Lys Ala Leu Gln Val Val Ser Val Pro Glu 35 40 45 Arg Val Ile Gln Phe Arg Val Val Trp Glu Asp Asp Lys Gly Gln 50 55 60 Val Gln Ile Asn Arg Gly Tyr Arg Val Gln Phe Asn Ser Ala Leu 65 70 75 Gly Pro Tyr Lys Gly Gly Leu Arg Phe His Pro Thr Val Asn Leu 80 85 90 Ser Ile Leu Lys Phe Leu Gly Phe Glu Gln Ile Phe Lys Asn Ala 95 100 105 Leu Thr Gly Leu Asn Met Gly Gly Gly Lys Gly Gly Ser Asp Phe 110 115 120 Asp Pro Lys Gly Lys Thr Asp Asn Glu Ile Arg Arg Phe Cys Val 125 130 135 Ser Phe Met Thr Glu Leu Cys Lys His Ile Gly Ala Asp Thr Asp 140 145 150 Val Pro Ala Gly Asp Ile Gly Val Thr Gly Arg Glu Val Gly Phe 155 160 165 Met Phe Gly Gln Tyr Lys Lys Ile Arg Asn Gln Trp Glu Gly Val 170 175 180 Leu Thr Gly Lys Gly Gly Ser Trp Gly Gly Ser Leu Ile Arg Pro 185 190 195 Glu Ala Thr Gly Tyr Gly Val Val Tyr Tyr Val Glu His Met Ile 200 205 210 Gln His Ala Ser Gly Gly Lys Glu Ser Phe Ala Gly Lys Arg Val 215 220 225 Ala Ile Ser Gly Ser Gly Asn Val Ala Gln Tyr Ala Ala Leu Lys 230 235 240 Val Ile Glu Leu Gly Gly Ser Val Ile Ser Leu Ser Asp Ser Gln 245 250 255 Gly Ala Leu Val Leu Asn Gly Glu Glu Gly Ser Phe Thr Ala Glu 260 265 270 Glu Ile Asn Thr Ile Ala Glu Ile Lys Val Gln Arg Lys Gln Ile 275 280 285 Ala Glu Leu Ala Thr Gln Asp Ala Phe Ser Ser Lys Phe Lys Tyr 290 295 300 He Pro Gly Ala Arg Pro Trp Thr Asn Ile Ala Gly Arg Ile Asp 305 310 315 Val Ala Leu Pro Ser Ala Thr Gln Asn Glu Val Ser Gly Asp Glu 320 325 330 Ala Lys Ala Leu Ile Ala Ala Gly Cys Lys Phe Ile Ala Glu Gly 335 340 345 Ser Asn Met Gly Ser Thr Gln Glu Ala Ile Asp Val Phe Glu Ala 350 355 360 His Arg Asp Ala Asn Pro Gly Ala Ala Ala Ile Trp Tyr Ala Pro 365 370 375 Gly Lys Ala Ala Asn Ala Gly Gly Val Ala Val Ser Gly Leu Glu 380 385 390 Met Ala Gln Asn Ser Ala Arg Val Asn Trp Ser Arg Glu Glu Val 395 400 405 Asp Ser Arg Leu Lys Lys Ile Met Glu Asp Cys Phe Asn Asn Gly 410 415 420 Leu Ser Thr Ala Lys Glu Tyr Val Thr Pro Ala Glu Gly Val Leu 425 430 435 Pro Ser Leu Val Ala Gly Ser Asn Ile Ala Gly Phe Thr Lys Val 440 445 450 Ala Glu Ala Met Lys Glu His Gly Asp Trp Trp 455 460 INFORMACION PARA LA SEQ ID NO. : 6 CARACTERISTICA DE LA SECUENCIA : LONGITUD : 596 aas TIPO : Aminoácidos NUMERO DE HEBRAS : 1 CONFIGURACION : Lineal TIPO DE MOLECULA : Péptido FUENTE DE ORIGEN : Penicillium chrysogenum CARACTERISTICA : OTRA INFORMACION : Secuencia de aas del enzima (3-N- acetilhexosaminidasa (EC. 3. 2. 1. 52) de 66545 Da de peso molecular.

DESCRIPCION DE LA SECUENCIA : SEQ ID NO : 6 Met Lys Phe Ala Ser Val Leu Asn Val Leu Gly Ala Leu Thr Ala 1 5 10 15 Ala Ser Ala Val Gln Val Asn Pro Leu Pro Ala Pro Arg Asn Ile 20 25 30 Thr Trp Gly Ser Ser Gly Pro Ile Gln Val Asn Asn Leu Asn Leu 35 40 45 Asn Gly Pro His Ser Pro Leu Leu Thr Gln Ala Trp Glu Arg Ala 50 55 60 Trp Glu Thr Ile Thr Thr Leu Gln Trp Val Pro Ala Ala Val Glu 65 70 75 Ser Pro Ile Ala Ser Tyr Pro Ala Phe Pro Thr Ser Thr Pro Val 80 85 90 Ser Ser Ala Pro Lys Ala Lys Arg Ala Pro Ser Gly Ile His Asn 95 100 105 Val Asp Val His Val Val Asp Asn Asp Ala Asp Leu Gln Tyr Gly 110 115 120 Val Asp Glu Ser Tyr Thr Leu Val Val Ser Asp Gly Gly Ile Arg 125 130 135 Ile Asn Ser Gln Thr Val Trp Gly Val Leu Gln Ala Phe Thr Thr 140 145 150 Leu Gln Gln Ile Ile Ile Ser Asp Gly Lys Gly Gly Leu Ile Ile 155 160 165 Glu Gln Pro Val Lys Ile Lys Asp Ala Pro Leu Tyr Pro His Arg 170 175 180 Gly Ile Met Ile Asp Thr Gly Arg Asn Phe Ile Thr Val Arg Lys 185 190 195 Leu Leu Glu Gln Ile Asp Gly Met Ala Leu Ser Lys Leu Asn Val 200 205 210 Leu His Trp His Leu Asp Asp Ser Gln Ser Trp Pro Met Gln Met 215 220 225 Ser Ser Tyr Pro Glu Met Thr Lys Asp Ala Tyr Ser Pro Arg Glu 230 235 240 Ile Tyr Thr Glu His Asp Met Arg Arg Val Ile Ala Tyr Ala Arg 245 250 255 Ala Arg Gly Val Arg Val Ile Pro Glu Val Asp Met Pro Ala His 260 265 270 Ser Ala Ser Gly Trp Gln Gln Val Asp Pro Glu Ile Val Ala Cys 275 280 285 Ala Glu Ser Trp Trp Ser Asn Asp Val Trp Ala Glu His Thr Ala 290 295 300 Val Gln Pro Asn Pro Gly Gln Leu Asp Ile Ile Tyr Pro Lys Thr 305 310 315 Tyr Glu Val Val Asn Asn Val Tyr Gln Glu Leu Ser Arg Ile Phe 320 325 330 Ser Asp Asn Leu Phe His Val Gly Ala Asp Glu Ile Gln Pro Asn 335 340 345 Cys Tyr Asn Tyr Ser Thr His Ile Thr Lys Trp Phe Ala Glu Asp 350 355 360 Pro Ser Arg Thr Tyr Asn Asp Leu Ala Gln Tyr Trp Val Asp His 365 370 375 Ser Met Pro Ile Phe Arg Ser Val Gly Asp His Arg Arg Leu Met 380 385 390 Met Trp Glu Asp Ile Ala Ile Ala Thr Glu Ser Ala His Asp Val 395 400 405 Pro Lys Asp Val Ile Met Gln Thr Trp Asn Ser Gly Glu Gly Glu 410 415 420 Gly Asn Ile Lys Lys Leu Thr Ser Ala Gly Tyr Asp Val Val Val 425 430 435 Ser Thr Ser Asp Phe Leu Tyr Leu Asp Cys Gly Arg Gly Gly Tyr 440 445 450 Val Thr Asn Asp Ala Arg Tyr Asn Val Gln Ser Asn Thr Asp Gly 455 460 465 Gly Val Asn Phe Asn Tyr Gly Gly Asp Gly Gly Ser Trp Cys Ala 470 475 480 Pro Tyr Lys Thr Trp Gln Arg Ile Tyr Asp Tyr Asp Phe Leu Thr 485 490 495 Asn Leu Thr Ser Ser Glu Ala Lys His Ile Ile Gly Ala Glu Ala 500 505 510 Pro Leu Trp Ser Glu Gln Val Asp Asp Val Thr Val Ser Ser Val 515 520 525 Phe Trp Pro Arg Ala Ala Ala Leu Gly Glu Leu Val Trp Ser Gly 530 535 540 Asn Arg Asp Ala Ala Gly Arg Lys Arg Thr Thr Ser Phe Thr Gln 545 550 555 Arg Ile Leu Asn Phe Arg Glu Tyr Leu Val Ala Asn Gly Val Met 560 565 570 Ala Thr Ala Leu Val Pro Lys Tyr Cys Leu Gln His Pro His Ala 575 580 585 Cys Asp Leu Tyr Lys Asn Gln Thr Val Met Ser 590 595 INFORMACION PARA LA SEQ ID NO. : 7 CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA : LONGITUD : 375 aas TIPO : aminoácidos NUMERO DE HEBRAS : 1 CONFIGURACION : Lineal TIPO DE MOLECULA : Péptido FUENTE DE ORIGEN : Penicillium chrysogenum CARACTERISTICA : OTRAS INFORMACIONES : Secuencia de aas de la proteína y-actina de 41760 Da de peso molecular.

DESCRIPCION DE LA SECUENCIA : SEQ ID NO : 7 Met Glu Glu Glu Val Ala Ala Leu Val Ile Asp Asn Gly Ser Gly 1 5 10 15 Met Cys Lys Ala Gly Phe Ala Gly Asp Asp Ala Pro Arg Ala Val 20 25 30 Phe Pro Ser Ile Val Gly Arg Pro Arg His His Gly Ile Met Ile 35 40 45 Gly Met Gly Gln Lys Asp Ser Tyr Val Gly Asp Glu Ala Gln Ser 50 55 60 Lys Arg Gly Ile Leu Thr Leu Arg Tyr Pro Ile Glu His Gly Val 65 70 75 Val Thr Asn Trp Asp Asp Met Glu Lys Ile Trp His His Thr Phe 80 85 90 Tyr Asn Glu Leu Arg Val Ala Pro Glu Glu His Pro Ile Leu Leu 95 100 105 Thr Glu Ala Pro Ile Asn Pro Lys Phe Asn Arg Glu Lys Met Thr 110 115 120 Gln Ile Val Phe Glu Thr Phe Asn Ala Pro Ala Phe Tyr Val Ser 125 130 135 Ile Gln Ala Val Leu Ser Leu Tyr Ala Ser Gly Arg Thr Thr Gly 140 145 150 Ile Val Leu Asp Ser Gly Asp Gly Val Thr His Val Val Pro Ile 155 160 165 Tyr Glu Gly Phe Ser Leu Pro His Ala Ile Ser Arg Val Asp Met 170 175 180 Ala Gly Arg Asp Leu Thr Asp Tyr Leu Met Lys Ile Leu Ala Glu 185 190 195 Arg Gly Tyr Thr Phe Ser Thr Thr Ala Glu Arg Glu Ile Val Arg 200 205 210 Asp Ile Lys Glu Lys Leu Cys Tyr Val Ala Leu Asp Phe Glu Gln 215 220 225 Glu Ile Gln Thr Ala Ser Gln Ser Ser Ser Leu Glu Lys Ser Tyr 230 235 240 Glu Leu Pro Asp Gly Gln Val Ile Thr Ile Gly Asn Glu Arg Phe 245 250 255 Arg Ala Pro Glu Ala Leu Phe Gln Pro Asn Val Leu Gly Leu Glu 260 265 270 Ser Gly Gly Ile His Val Thr Thr Phe Asn Ser Ile Met Lys Cys 275 280 285 Asp Val Asp Val Arg Lys Asp Leu Tyr Gly Asn Ile Val Met Ser 290 295 300 Gly Gly Thr Thr Met Tyr Pro Gly Ile Ser Asp Arg Met Gln Lys 305 310 315 Glu Ile Thr Ala Leu Ala Pro Ser Ser Met Lys Val Lys Ile Ile 320 325 330 Ala Pro Pro Glu Arg Lys Tyr Ser Val Trp Ile Gly Gly Ser Ile 335 340 345 Leu Ala Ser Leu Ser Thr Phe Gln Gln Met Trp Ile Ser Lys Gln 350 355 360 Glu Tyr Asp Glu Ser Gly Pro Ser Ile Val His Arg Lys Cys Phe 365 370 375 INFORMACION PARA LA SEQ ID NO. : 8 CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA : LONGITUD : 375 aas TIPO : Aminoácidos NUMERO DE HEBRAS : 1 CONFIGURACION : Lineal TIPO DE MOLECULA : Péptido FUENTE DE ORIGEN : Acremonium chrysogenum CARACTERISTICA : OTRAS INFORMACIONES : Secuencia de aas de la proteína y-actina de 41612 Da de peso molecular.

DESCRIPCION DE LA SECUENCIA : SEQ ID NO : 8 Met Glu Glu Glu Val Ala Ala Leu Val Ile Asp Asn Gly Ser Gly 1 5 10 15 Met Cys Lys Ala Gly Phe Ala Gly Asp Asp Ala Pro Arg Ala Val 20 25 30 Phe Pro Ser Ile Val Gly Arg Pro Arg His His Gly Ile Met Ile 35 40 45 Gly Met Gly Gln Lys Asp Ser Tyr Val Gly Asp Glu Ala Gln Ser 50 55 60 Lys Arg Gly Ile Leu Thr Leu Arg Tyr Pro Ile Glu His Gly Val 65 70 75 Val Thr Asn Trp Asp Asp Met Glu Lys Ile Trp His His Thr Phe 80 85 90 Tyr Asn Glu Leu Arg Val Ala Pro Glu Glu His Pro Val Leu Leu 95 100 105 Thr Glu Ala Pro Ile Asn Pro Lys Ser Asn Arg Glu Lys Met Thr 110 115 120 Gln Ile Val Phe Glu Thr Phe Asn Ala Pro Ala Phe Tyr Val Ser 125 130 135 Ile Gln Ala Val Leu Ser Leu Tyr Ala Ser Gly Arg Thr Thr Gly 140 145 150 Ile Val Leu Asp Ser Gly Asp Gly Val Thr His Val Val Pro Ile 155 160 165 Tyr Glu Gly Phe Ala Leu Pro His Ala Ile Ala Arg Val Asp Met 170 175 180 Ala Gly Arg Asp Leu Thr Asp Tyr Leu Met Lys Ile Leu Ala Glu 185 190 195 Arg Gly Tyr Thr Phe Ser Thr Thr Ala Glu Arg Glu Ile Val Arg 200 205 210 Asp Ile Lys Glu Lys Leu Cys Tyr Val Ala Leu Asp Phe Glu Gln 215 220 225 Glu Ile Gln Thr Ala Ala Gln Ser Ser Ser Leu Glu Lys Ser Tyr 230 235 240 Glu Leu Pro Asp Gly Gln Val Ile Thr Ile Gly Asn Glu Arg Phe 245 250 255 Arg Ala Pro Glu Ala Leu Phe Gln Pro Ser Val Leu Gly Leu Glu 260 265 270 Ser Gly Gly Ile His Val Thr Thr Phe Asn Ser Ile Met Lys Cys 275 280 285 Asp Val Asp Val Arg Lys Asp Leu Tyr Gly Asn Ile Val Met Ser 290 295 300 Gly Gly Thr Thr Met Tyr Pro Gly Leu Ser Asp Arg Met Gln Lys 305 310 315 Glu Ile Thr Ala Leu Ala Pro Ser Ser Met Lys Val Lys Ile Ile 320 325 330 Ala Pro Pro Asp Gly Lys Tyr Ser Val Trp Ile Gly Gly Ser Ile 335 340 345 Leu Ala Ser Leu Ser Thr Phe Gln Gln Met Trp Ile Ser Lys Thr 350 355 360 Glu Tyr Asp Glu Glu Arg Pro Ser Ile Val His Arg Lys Cys Phe 365 370 375 A. Las indicaciones se refieren al microorganismo mencionado en la descripción página 2 2, línea 16 B. IDENTIFICACION DEL DEPOSITO Otros depósitos estran identificados en una hoja suplementaria Escherichia coli DH2X/pALfle07 Nombre de la institución de depósito Colección Espanola de Cultivos Tipo (CECT) Dirección de la institución de depósito (comprendidos el distrito postal y el país) Universidad de Valencia Edificio de Investigación 46100 BURJASOT (Valencia) Fecha de depósito n° de orden CECT 4849 20. 02. 1997 CECT 4849 C. INDICACIONES SUPLEMENTARIAS (en caso necesario) Se adjunta una hoja separada para la continuación de estos datos D. ESTADOS DESIGNADOS PARA LOS QUE SE FACILITAN LAS INDICACIONES (caso de que las indicaciones no se faciliten para todos los estados designados) E. INDICACIONES SUMINISTRADAS POR SEPARADO (en caso necesario) Las indicaciones numeradas a continuación serin presentadas posteriormente en la Oficina intemacional (especificar la naturaleza general de las indicaciones por ejem."n° de orden del dep6sito") Reservado a la oficina receptora Reservado a la Oficina intemacional Esta hoja ha sido recibida al mismo tiempo que la Esta hoja se ha recibido en la Oficina intemacional el : solicitud intemacional Funcionario autorizado Funcionario autorizado INDICACION RELATIVA AL DEPOSITO DE UN MICRO-ORGANISMO (Regla 13 bis del PCT) A. Las indicaciones se refieren al microorganismo mencionado en la descripción página 28, línea 20 B. IDENTIFICACION DEL DEPOSITO Otros depósitos estran identificados en una hoja suplementaria rl Escherichia coli DH5</pALP480 Ln Nombre de la institución de depósito Colección Espanola de Cultivos Tipo (CECT) Dirección de la institución de deposit (comprendidos el distrito postal y el pais) Universidad de Valencia Edificio de Investigación 46100 Burjasot (Valencia) Fecha de depósito n° de orden 20. 02. 1997 CECT 4852 C. INDICACIONES SUPLEMENTARIAS (en caso necesario) Se adjunta una hoja separada para la continuación de estos datos l_ D. ESTADOS DESIGNADOS PARA LOS QUE SE FACILITAN LAS INDICACIONES (caso de que ias indicaciones no se facilite para todos los estados designados) E. INDICACIONES SUMINISTRADAS POR SEPARADO (en caso necesario) Las indicaciones numeradas a continuación serán presentadas posteriormente en la Oficina intemacional (especificar la naturaleza general de las indicaciones por ejem."n° de orden del dep6sito") Reservado a la oficina receptora Reservado a la Oficina internacional 53 Esta hoja ha sido recibida al mismo tiempo que la zesta hoja se ha recibido en la Oficina internacional el : solicitud internacional Funcionario autorizado Funcionario autorizado INDICACION RELATIVA AL DEPOSITO DE UN MICRO-ORGANISMO (Regla 13 bis del PCT) A. Las indicaciones se refieren al microorganismo mencionado en la descripción página 33 Jínea 14 B. IDENTIFICACION DEL DEPOSITO Otros depósitos estran identificados en una hoja suplementaria Escherichia coli DH5 «/DALP315 Nombre de la institución de depósito Colección Espanola de Cultivos Tipo (CECT) Dirección de la institución de depósito (comprendidos el distrito postal y el país) Universidad de Valencia Edificio de Investigación 46100 Burjasot (Valencia) Fechadedepósito 20-02-1997 n°deorden CECT 4851 C. INDICACIONES SUPLEMENTARIAS (en caso necesario) Se adjunta una hoja separada para la continuación de estos datos 1 D. ESTADOS DESIGNADOS PARA LOS QUE SE FACILITAN LAS INDICACIONES (caso de que las indicaciones no se faciliten para todos los estados designados) E. INDICACIONES SUMINISTRADAS POR SEPARADO (en caso necesario) Las indicaciones numeradas a continuación serán presentadas posteriormente en la Oficina intemacional (especificar la naturaleza general de las indicaciones por ejem."n° de orden del depósito") Reservado a la oficina receptora Reservado a la Oficina internacional zesta hoja ha sido recibida al mismo tiempo que la Esta hoja se ha recibido en la Oficina internacional el : sollcatd internacional Funcionario autorizado Funcionario autorizado INDICACION RELATIVA AL DEPOSITO DE UN MICRO-ORGANISMO (Regla 13 bis del PU'IN A. Las indicaciones se refieren ai microorganismo mencionado en la descripción Pagina 3 6. línea 2 6 rr B. IDENTIFICACION DEL DEPOSITO Otros depósitos están identificados en una hoja suplementaria Escherichia coli DH5K/pALC52 LJ Nombre de la institución de depósito Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) Dirección de la institución de depósito (comprendidos el distrito postal y el país) Universidad de Valencia Edificio de Investigación 46100 Burjasot (Valencia) Fecha de depósito 2 00 2-19 9 7 | n° de orden C ECT 4850 C. INDICACIONES SUPLEMENTARIAS (en caso necesario) Se adjunta una hoja separada para la continuación de estos datos D. ESTADOS DESIGNADOS PARA LOS QUE SE FACILITAN LAS INDICACIONES (caso de que las indicaciones no se faciliten para todos los estados designados) E. INDICACIONES SUMINISTRADAS POR SEPARADO (en caso necesario) Las indicaciones numeradas a continuación serán presentadas posteriormente en la Oficina internacional (especificar la naturaleza general de las indicaciones por ejem."n° de orden del depósito") Reservado a la oficina receptora Reservado a la Oficina internacional Esta hoja ha sido recibida al mismo tiempo que la Esta hoja se ha recibido en la Oficina internacional el : solicitud internacional Funcionario autoriza Funcionario autorizado