Humanes zirkulierendes Virus inhibierendes Peptid (VIRIP) und seine Verwendung Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Polypeptid (Eiweißstoff) mit in- hibierenden Eigenschaften auf die virale Infektion von Zellen : Humanes Virus inhibierendes Peptid (VIRIP) und seine therapeutische und diagnostische Ver- wendung. Die Erfindung umfasst die natürlich vorkommende Form des VIRIP sowie abgeleitete Fragmente und/oder Analoga bzw. Derivate sowie schließlich ein Arzneimittel enthaltend die natürlichen, rekombinanten und synthetischen Peptide zur Verwendung für medizinische Indikationen und zur Verwendung als ein Diagnosemittel. Die Erfindung umfasst darüber hinaus modifizierte Formen des VIRIP, die eine besonders günstige therapeutische Wirksamkeit aufweisen.

Des weiteren eine Nukleinsäuresonde hybridisierend für VIRIP oder eines sei- ner Fragmente und/oder Derivate und Antikörper bzw. Antagonisten gerichtet gegen VIRIP oder eines seiner Fragmente und/oder Derivate zu diagnostischen oder therapeutischen Zwecken, insbesondere bei viralen Erkrankungen und zur Behandlung von Infektionen mit HIV-1 und HIV-2.

Die VIRIP konnte überraschenderweise mit Hilfe von chromatographischen Methoden und mit Hilfe eines biologischen Assays aus humanem Hämofiltrat isoliert werden. Die biochemische Charakterisierung des erfindungsgemäßen Peptids erfolgte durch Massenspektrometrie und vollständigen Sequenzierung aller Aminosäuren.

Das Peptid besitzt die folgende Aminosäuresequenz : Z1-LEAIPMSIPPEVKFNKPFVF-Z2, worin Z11 Z2 unabhängig voneinander eine Anzahl von 0 bis zu 10 Aminosäureresten, und falls Z, oder Z2=° Aminosäu- rereste bedeutet, dann Z1=H und/oder Z2=COOH repräsentieren.

Die Molekularmasse des erfindungsgemäßen Peptids VIRIP beträgt 2303 Da, wenn Z1 und Z2 keine Aminosäurereste bedeuten.

Als Derivate des VIRIP sind insbesondere amidierte, acetylierte, sulfatierte, Polyethylenglycol (PEG) modifizierte, phosphorylierte und/oder glykosylierte Derivate, sowie die durch multiple Synthese darstellbaren Peptide, welche die biologische Aktivität von VIRIP besitzen, zu nennen.

Das erfindungsgemäße Peptid umfasst ein 20 Aminosäuren umfassendes Fragment des bekannten humanen Proteins Alpha-1-Antitrypsin (Accession No.

P01009), welches in seiner prozessierten Form aus 394 Aminosäuren besteht.

Die Funktion des Alpha-1-Antitrypsin wird vornehmlich als Hemmstoff für die Enzyme Elastase sowie Thrombin und Plasmin beschrieben. Die erfindungsge- mäße Peptidsequenz des VIRIP beginnt vorzugsweise hinter der Aminosäure 352 des Alpha-1-Antitrypsin und umfasst somit die Aminosäuren 353 bis 372 des Alpha-1-Antitrypsin.

Überraschenderweise bewirkt das erfindungsgemäße Peptid eine Unter- drückung der HIV-1-Infektion und/oder-Replikation von bzw. in humanen Blutzellen.

Das erfindungsgemäße Peptid ist durch ein Reinigungsverfahren ausgehend von humanem Hämofiltrat erhältlich. Dieses Hämofiltrat fällt bei der Ultrafiltra- tion des Blutes von Nierenkranken in großen Mengen an.

Gegenstand der Erfindung sind auch Polynukleotide, die für das erfindungsge- mäße Peptid kodieren, wobei diese Polynukleotide bevorzugt aus DNA-RNA genomischer DNA oder PNA aufgebaut sind. Ein weiterer Aspekt der Erfindung sind Vektoren, die die erfindungsgemäßen Polynukleotide enthalten sowie gentechnisch manipulierte Wirtszellen, die den erfindungsgemäßen Vektor enthalten. Auch Polynukleotide, die mit den erfindungsgemäßen Polynukleoti- den hybridisieren (Antisense-Nukleotide) sind Gegenstand der Erfindung.

Weitere Aspekte der Erfindung sind Antikörper, die gegen die erfindungsgemä- ßen Peptide gerichtet sind sowie Antagonisten und Inhibitoren, die die Wirkung der erfindungsgemäßen Peptide hemmen.

Das erfindungsgemäße Peptid kann auch mit einem Adapterprotein gekoppelt sein, das die Aufnahme in virusinfizierbare Zellen gewährleistet.

Gegenstand der Erfindung sind auch Verfahren zur Behandlung von Patienten, die VIRIP benötigen durch Gabe therapeutischer Mengen der erfindungsgemä- ßen Polypeptide sowie Verfahren zur Behandlung von Patienten, die eine Inhi- bition des VRIP benötigen durch Gabe therapeutischer Mengen eines Antagoni- sten/Inhibitors.

Alternativ kann die therapeutische Wirkung des erfindungsgemäßen Polypepti- des durch Gabe von Polynukleotiden kodierend für VIRIP und anschließende Expression in vivo beim Patienten erreicht werden.

Das humane Hämofiltrat wird gegebenenfalls mit Wasser verdünnt und ange- säuert. Der pH-Wert beträgt vorzugsweise 1,5 bis 3,5, insbesondere 2,5 bis 3,0. Danach wird das Hämofiltrat über einen Kationenaustauscher geleitet, beispielsweise einem mit Sulfonsäuregruppen modifizierenden Trägermaterial (Fraktogel SP-650 (M), Merck, Darmstadt). Die an den Kationenaustauscher gebundenen Peptide werden mit einer relativ hoch konzentrierten Satzfösung eluiert. Die Ionenstärke der Elutionslösung entspricht dabei ungefähr einer 0,5 bis 1 molaren Ammoniumacetatlösung.

Das aufgefangene Eluat wird einer weiteren Kationenaustauscher- Chromatographie unterzogen. Diese Chromatographie ist vorzugsweise eine Stufenelution mit Puffern von ansteigenden pH-Werten.

Die das erfindungsgemäße Peptid enthaltenen Fraktionen werden mittels prä- parativer Umkehrphasen-Chromatographie und nachfolgender semipräparati- ver Umkehrphasen-Chromatographie beispielsweise an mit C18 modifizierten Trägermaterialien weitergereinigt. Der Aufreinigungsgrad wird vorzugsweise mittels analytischer Umkehrphasen-Chromatographie beispielsweise an mit C18 modifizierten Trägermaterialien überprüft.

Die durch die chromatographische Reinigung erhaltene Substanz wurde der Strukturaufklärung zugeführt. Die Bestimmung der Molekülmassen des gerei- nigten Peptids erfolgte mittels eines Elektrospray Massenspektrometers (ESI- MS). Die Sequenzanalyse des nativen Peptids erfolgte über einen Edman- Abbau mit einem ABI 473 A Sequenzer. Die erfindungsgemäße Peptidsequenz wurde chemisch synthetisiert und die Struktur des synthetisch hergestellten Peptids wurde ebenfalls aufgeklärt. Dieses synthetisch hergestellte VIRIP be- wirkt ebenfalls eine dosis-abhängige Unterdrückung der HIV-1-Infektion und/oder-Replikation von bzw. in humanen Blutzellen.

Das erfindungsgemäße Peptid sowie seine cDNA, sein Gen und Analoga, Frag- mente und Derivate zu dem Peptid, der cDNA und dem Gen sowie Antikörper, welche die Wirkung des VIRIP aufheben, können als Arzneimittel Verwendung finden. Seine biologische Aktivität entspricht der virus-inhibierender Substan- zen. Dabei kann vermutet werden, dass VIRIP aufgrund seiner kurzen, hydro- phoben Sequenz in die Blutzellen aufgenommen wird und dort als Hemmstoff von Virus-Enzymen oder als Hemmstoff von Enzymen der Blutzellen wirkt oder dass VIRIP an Rezeptoren bindet, welche für den Eintritt von Viren von Be- deutung sind. Somit verhindert VIRIP die Infektion von Zellen mit dem Virus.

Das erfindungsgemäße Peptid kann dabei in für Peptide üblicher Weise paren- teral, intravenös, intramuskulär, intranasal, lokal-topisch, subkutan oder bukal verabreicht werden. Die Menge an zu verabreichendem Peptid beträgt 1 mg bis 1 g pro Darreichungseinheit pro Tag. Die Wirkung des erfindungsgemäßen Peptids kann durch Gabe geeigneter Inhibitoren/Antagonisten gehemmt wer- den.

Das erfindungsgemäße Diagnostikmittel enthält poly-oder monoklonale Anti- körper gegen das erfindungsgemäße Peptid gegebenenfalls in fluoreszenz- oder radioaktiv-markierter Form, um in einem an sich bekannten ELISA oder RIA eingesetzt zu werden. Die Antikörper gegen ein erfindungsgemäßes Peptid können durch Immunisierung von Säugetieren erhalten werden. Das erfin- dungsgemäße Diagnostikmittel enthält DNA, RNA und/oder PNA gegebenen- falls in modifizierter und/oder markierter Form zum Einsatz in dem Fachmann bekannten Testsystemen wie PCR oder Fingerprinting.

Figur 1 : Aufreinigung von VIRIP. Die Aufreinigungsschritte sind im Text be- schrieben. (b) Inhibition der Replikation von HIV-1 NL43 in humanen Blutlym- phozten durch die Fraktion 1-20. Die Zellen wurden 2 Tage mit PHA stimuliert, mit Virusstocks die 10 ng p24 enthalten infiziert und die Reverse Transkripta- se-Aktivität im Kulturüberstand 9 Tage nach Infektion bestimmt. Dargestellt ist das Ergebnis der Infektionsexperimente.

Figur 2 : Einfluss von synthethischem VIRIP auf die Infektion von CEMx174- SEAP Indikatorzellen (links) und die Replikation in humanen PBMCs (rechts).

Die Zellen wurden in Gegenwart der aufgeführten Mengen an VIRIP infiziert und kultiviert. Zur Bestimmung des viralen Eintritts wurde die Aktivität der se- kretierten Alkalinen Phosphatase in Kulturüberstand der CEMx174-SEAP Zellen drei Tage nach der Infektion bestimmt.

Figur 3 : Die V3-Schleife des X4-tropen NL43 Klons wurde gegen die entspre- chenden Sequenzen der dargestellten HIV-1 Isolate ausgetauscht. Die rekom- binanten Viren unterscheiden sich somit ausschließlich in der V3-Schleife. Im rechten Panel ist der beobachtete inhibitorische Effekt (%), die Gesamtladung der V3-Region und der Korezeptortropismus dargestellt.

Figur 4 : Dosis-abhängige Hemmung der X4-tropen P59S und der R5- topen 92TH HIV-1 NL4-3 Rekombinanten durch VIRIP. P4R5 Indikatorzellen wurden in Gegenwart der dargestellten Konzentrationen an VIRIP infiziert und die ß-Galaktosidase-Aktivität im Zellextrakt 2 Tage nach Infektion gemessen.

Figur 5 : VIRIP hemmt die Vermehrung verschiedener HIV-Isolate mit unter- schiedlichem Zell-und Korezeptor-Tropismus in humanen PBMC. Vorstimu- lierte PBMC wurden in Gegenwart der dargestellten VIRIP Konzentrationen mit den diversen HIV-1 Isolaten (10 ng p27 antigen) oder einem chimären Onko- Lentivirus (Mu-HIV). Die Virusvermehrung wurde durch die Messung der Re- verse Transkriptase-Aktivität im Zelikulturüberstand bestimmt.

Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele näher beschrieben.

Beispiel 1 Isolierung des antiviral wirksamen VIRIP 1. Schritt : Hämofiltrat-Batch-Extraktion 800-1000 L Hämofiltrat werden mit HCI auf einen pH-Wert von 2.7 eingestellt und mit Wasser auf eine Leitfähigkeit von 5.5 mS/cm verdünnt und mit einer Flussrate von 3 L/min auf einen starken Kationenaustauscher aufgetragen.

Chromatographiebedingungen : Saute : Vantage VA 250 (Amicon, Witten) Säulenmaterial : Fractogel TSK SP 650 (M), 25 cm x 20 cm Fluss : 3 L/min Detektion : 280 nm, pH, Leitfähigkeit Puffer A : Hämofiltrat pH 2.7, Leitfähigkeit 5.5 mS/cm Puffer B : 0.5 M Ammoniumacetat Anlage : Autopilot Chromatographiesystem, (PerSeptive Bio systems, Wiesbaden) Nach Auftrag der insgesamt 1.000 L Flüssigkeit über Nacht wird mit mehreren Säulenvolumina 5 mM HCI gespült. Die Elution der gebundenen Peptide erfolgt als Batch-Elution mit 0.5 M Ammoniumacetat. Hierbei wird eine komplette Elu- tion der Peptide über steigenden pH-Wert (6.8-7.2) und steigende Leitfähig- keit (56 mS/cm) in etwa 5 L Eluat erreicht.

2. Schritt : Erste präparative Auftrennung (Charge 01/1998) Die Ammoniumacetat-Eiuate der Batch-Extraktion werden in einer Menge von 10.000 L Hämofiltrat-Peptid vereinigt. Nach pH-Einstellung auf 2.7 wird das Peptidextrakt unter Zumischung von VE-Wasser mit einer Leitfähigkeit von 5.5 mS/cm auf den präparativen Kationenaustauscher aufgetragen.

Chromatographiebedingungen : Saule : Vantage 250 VA Säulenmaterial : Fractogel TSK SP 650 (M), 25 cm x 20 cm Fluss : bis zu 3 L/min während des Auftrages 0.5 bis 1 L während der Elution Detektion : 280 nm, pH, Leitfähigkeit Probe : Hämofiltrat pH 2.7, Leitfähigkeit 5.5 mS/cm Anlage : Autopilot Chromatographiesystem, (PerSeptive Bio systems, Wiesbaden) Nach Auftrag des Rohextraktes über 240 min wird die Saute mit 0.01 M HCI gespült, bis die Leitfähigkeit unter 1 mS/cm ist. Die Elution erfolgt dabei in mehreren Stufen mit den im folgenden angegebenen Puffern Puffer pH-Wert Puffersubstanzen Leitfähigkeit (mS/cm) Waschpuffer : 2.0 0.01 M HCI 1 Elutionspuffer 1 : 3. 6 0.1 M Zitronensäure-1-hydrat 2.9 Elutionspuffer 2 : 4. 5 0.1 M Essigsäure + 0. 1 M Natriumacetat 4.0 Elutionspuffer 3 : 5. 0 0. 1 M Äpfelsäure 6.2 Elutionspuffer 4 : 5. 6 0.1 M Bernsteinsäure 6.1 Elutionspuffer 5 : 6.6 0.1 M NaH2PO4 4.9 Elutionspuffer 6 : 7.4 0.1 M NaH2P04 6.7 Elutionspuffer 7 : 9. 0 0. 1 M Ammoniumcarbonat 6.7 Die Eluate 1-7 werden als pH-Pool I-VII bezeichnet (s. Fig. la). Sie werden separat gesammelt und abschließend mit VE-Wasser gespült. Die Elution er- folgt bis zum Erreichen einer neuen Basislinie, wobei für die einzelnen pH-Pools I bis VII Elutionsvolumina von 10 bis 25 L erreicht werden.

3. Schritt : Zweite präparative Auftrennung : Die einzelnen pH-Pools werden zur Fraktionierung und gleichzeitigen Entsal- zung über eine Reversed Phase Chromatographie getrennt Chromatographiebedingungen : Saute : FineLine 100 (Pharmacia, Freiburg) Säulenmaterial : Source RPC, 15 um 10 x 12.5 cm (FineLine 100) Fluss : 150 mL/min (FineLine 100) Detektion : 280 nm, Leitfähigkeit, pH Puffer A : 10 mM HCI Puffer B : 80% Acetonitril in 10 mM HCI Gradient : 0-60% Puffer B in 5 Säulenvolumen Nach Auftrag der einzelnen pH-Pools wird die Saule mit Puffer A gespült.

Während der Elution werden Fraktionen zu 200 ml gesammelt. Die Fraktionen werden gefriergetrocknet und bei-20°C gelagert. Aliquots der entstandenen Fraktionen werden im Bioassay getestet. Die Fraktion 20 aus pH-Pool I enthielt das erfindungsgemäße Peptid (s. Fig. lb, c).

4. Schritt : Semipräparative Reverse-Phase C18-Chromatographie : Insgesamt 500 mg der im Assay bioaktiven Fraktion 20 aus pH-Pool I wurden über eine semipräparative Reverse-Phase Saule aufgetrennt. Die Fraktion 27 enthielt die erfindungsgemäße Substanz (s. Fig. ld).

Chromatographiebedingungen : Saule : 4,7 cm x 30 cm Stahisäule Füllmaterial : Vydac RP-C18 15-20 um, A Puffer A : 30% Methanol, 70% Wasser, 0.1% TFA Puffer B : 100% Methanol, 0.1% TFA Gradient : 0-60% B in 2100 ml Fluss : 40 ml/min Detektion : 214 nm und 280 nm Chromatographieanlage : BioCad 250, Perseptive Biosystems Fraktionen : á 50 ml ab Start des Gradienten 5. Schritt : Analytische Reverse-Phase C4-Chromatographie : Die bioaktive Fraktion 27 aus der vorhergehenden Chromatographie wurde über eine analytische Reverse-Phase Saule aufgetrennt. Aliquots wurden im Bioassay getestet. Die Fraktionen 33+34 enthielten die erfindungsgemäße Substanz in aufgereinigter Form.

Chromatographiebedingungen : 5 pm, 100 A, 20 x 250 mm ; Seule : 2 cm x 25 cm Stahtsäute Füllmaterial : RP-C4,5 um, 100 A, Biotek Silica, Östringen, Germany Puffer A : Wasser, 0.1 % TFA Puffer B : 80 % Acetonitril, 20% Wasser, 0.1 % TFA, Gradient : 20-60% B in 80 min, 60-100% B in 2 min Fluss : 8 ml/min Detektion : 214 nm und 280 nm Chromatographieanlage : Kontron Fraktionen : á 1.5 min ab Start des Gradienten Die erfindungsgemäße Reinsubstanz wurde daraufhin in dosisabhängiger Weise im Bioassay untersucht und peptidchemisch charakterisiert.

Beispiel 2 Massenbestimmungen Die Massenbestimmungen des aus Hämofiltrat isolierten Peptids (aus den Fraktionen 33+34 des 5. Schritts in Beispiel 1) und des chemisch syntheti- sierten Peptids (Beispiel 3) wurden auf einem ESI Massenspektrometer durch- geführt (s. Fig. lof). Die Molekülmasse der Peptide wurden entsprechend der nachfolgend gezeigten Massenzahlen (MW) bestimmt : VIRIP, isioliert aus humanem Hämofiltrat : 2303 Da VIRIP, chemisch synthetisiertes Peptid : 2303 Da Sequenzbestimmung Die aufgereinigten nativen und chemisch synthetisierten Peptide werden mit- tels Edman-Abbau auf einem ABI 473 A Sequenzer unter Verwendung des Standard-Programms analysiert. Die Proben werden auf eine Polybrene- Membran in Mengen zwischen 100 und 400 pmol aufgetragen. Es ergaben sich sowohl für das aus Hämofiltrat isolierte Peptid (aus den Fraktionen 33+34 des 5. Schritts in Beispiel 1) und das chemisch synthetisierte Peptid (Beispiel 3) folgende identische vollständige Aminosäuresequenz : LEAIPMSIPPEVKFNKPFVF Datenbankvergleich Ein Datenbankvergleich wurde mit Hilfe des HUSAR-Programmpakets an den SwissProt und EMBL-Nukleinsäure Datenbanken durchgeführt. Die Peptidse- quenz besitzt eine hundertprozentige Identität zu dem aus der cDNA abgelei- teten Aminosäuren 353-372 des humanen Proteins Alpha-1-Antitrypsin (Accession No. P01009).

Beispiel 3 Chemische Synthese von VIRIP Die chemische Synthese von VIRIP wurde mittels konventioneller Festphasen- synthese auf einem Peptid-Synthesizer 9050 unter Verwendung der bekannten Fmoc-Chemie durchgeführt. Das erhaltene Peptid wurde über Reverse-Phase Chromatographie aufgereinigt, seine Identität und Reinheit wurde mittels ana- lytischer RP-HPLC sowie der unter Beispiel 2 beschriebenen Massen-und Se- quenzbestimmung festgestellt.

Beispiel 4 Bestimmung der antiviralen Aktivität von VIRIP Die Isolierung der VIRIP erfolgte aufgrund ihrer inhibitorischen Wirkung auf die Vermehrung von HIV-1 in einem Assay, der die Replikation von HIV-1 in peri- pheren humanen Blutlymphozyten (PBMCs) misst. Dazu wurden jeweils Ali- quots der unter Beispiel 1 beschriebenen einzelnen Chromatographiestufen gefriergetrocknet und anschließend dem biologischen Assay in Mengen von 10 ml bis zu 1 L Hämofiltrat-Aquivalent zugeführt. Die Fraktionen, die jeweils ein positives Signal ergaben, wurden der weiteren Aufreinigung unterzogen.

Humane periphere Blutlymphozyten (PBMCs) wurden aus Vollblut mittels Dichtegradienten-Zentrifugation in Ficoll gewonnen. Die Zellen wurden für zwei Tage vorstimuiiert (RPMI-Medium, 20% FKS, 100 U/ml IL-2,5 ug/mi Phyto- hämagglutinin [PHA]). Anschließend wurden die PBMCs durch Zentrifugation für 5 min bei 1200 rpm sedimentiert, in PHA-freiem RPMI-Medium aufgenom- men (20% FKS, 100 U/ml IL-2) und in einer Konzentration von etwa 150.000 Zellen pro Loch in 96-Well-Flachboden-Platten in einem Volumen von 80 NI ausgesät.

Am folgenden Tag wurden Aliquots der unter Beispiel 1 beschriebenen einzel- nen Chromatographiestufen in Mengen von 10 ml bis zu 1 L Hämofiltrat- Äquivalent zugeführt. Dazu wurden die gefriergetrockneten Chromatographie- stufen in Wasser aufgenommen und in verschiedenen Konzentrationen in ei- nem Gesamtvolumen von 10 NI zu den PBMCs pipettiert. Nach 2stündiger In- kubation bei 37°C wurden die Zellen durch die Zugabe von 10 NI HIV-1 Virus- stock, der 0,1 bis 10 ng p24 Antigen enthält, infiziert. Im folgenden wurden 50 pi des Kulturmediums alle 2 Tage durch frisches Medium ersetzt, welches zu- sätzlich die korrespondierenden Peptid-Fraktionen enthält. Die Produktion an HIV-Partikeln zu verschiedenen Zeitpunkten (9,12 und 18 Tage) nach der In- fektion der Zellen wurde im Reverse-Transkriptase (RT)-Test quantifiziert. Der RT-Test misst die Aktivität der Reversen-Transkriptase im zellfreien Kultur- überstand und ist somit ein Maß für die Produktion an Viruspartikeln und die virale Vermehrung in den PBMC-Kulturen. Alternativ wurde die Virusproduktion im p24 Antigen-ELISA bestimmt. Fraktionen, die im Vergleich zu Ansätzen oh- ne potentiel stimulierende oder inhibitorische Peptide zu einer mindestens 90% igen Reduktion der RT-Produktion führten (s. z. B. Fig. lb) und somit die Vermehrung von HIV-1 in humanen PBMC effizient hemmten, wurden weiter aufgereinigt.

Das aus Hämofiltrat aufgereinigte VIRIP (Beispiel 1) als auch das chemisch synthetisierte VIRIP (Beispiel 3) zeigten eine dosisabhängige Inhibition der HIV-1 Infektion von CEMx174-SEAP Indikatorzelien und der Replikation in PBMCs (Fig. 2). Das erfindungsgemäße VIRIP besitzt dagegen keine zyto- toxische Wirkung auf die Blutzellen.

Beispiel 5. Die Effizienz der VIRIP-spezifischen Inhibition ist abhängig von der Sequenz der V3-Schleife im HIV-1 Hüllprotein.

Die Ergebnisse belegten, dass sowohl VIRIP aus Hämofiltrat, als auch das synthetisch hergestelite Peptid die Replikation von HIV-1 NL43 wirksam blok- kieren. Um herauszufinden, ob VIRIP spezifisch für X4-trope Varianten ist oder auch andere Formen inhibiert, welche den Korezeptor CCR5 benutzen oder dual-trop (X4/R5) sind, wurde eine Reihe von V3-Varianten des moleku- laren NL4-3 Klons untersucht (Fig. 3). Der V3-Loop des X4-tropen NL4-3 Klons wurde durch die entsprechende Region einer Reihe von primären HIV-1 Isola- ten ersetzt. Funktionelle Tests mit verschiedenen Indikatorzellinien zeigten, dass diese V3-Rekombinanten einen unterschiedlichen Zell-und Korezeptor- Tropismus aufweisen. Um den inhibitorischen Einfluss von VIRIP auf diese Va- rianten zu untersuchen wurden P4R5 Indikatorzelien verwendet. P4R5-Zellen exprimieren sowohl CCR5 ais auch CXCR4 und enthalten das Luziferasegen unter der Kontrolle der HIV-1 LTR. Diese Zellinie wurde in Gegenwart und Ab- wesenheit von VIRIP mit den diversen rekombinanten Viren infiziert (50 ng p24) und die Infektion mit Hilfe des Luziferasetest quantifiziert. Wie in der Fi- gur 3 dargestellt inhibierte VIRIP sowohl X4-, als auch R5-und X4/R5-trope Varianten. Insgesamt wurden jedoch X4-trope Varianten mit stark positiv ge- ladenem V3-Loop effizienter gehemmt als R5-oder dual-trope Isolate.

Um den inhibitorischen Effekt der erfindungsgemäßen Substanz genauer zu quantifizieren, wurden P4R5 Indikator Zellen in Gegenwart verschiedener Do- sen von VIRIP mit dem X4-tropen HIV-1 P59S und dem R5-tropen 92TH Isolat infiziert. Wir in der Fig. 4 dargestellt, inhibierte VIRIP das HIV-1 P59S Isolat bei einer Konzentration von 40 aug/ml um 50%, und bei einer Konzentration von 180 ug/ml um 90%. Zur Hemmung des X-tropen 92TH Isolates waren et- wa 2-fach höhere Konzentrationen an VIRIP erforderlich (Fig. 4).

In weiteren Experimenten wurde gezeigt, dass VIRIP die Replikation von X4- tropen und dual-tropen HIV-Varianten in humanen PBMC bei Konzentrationen von 1000 lug/ml komplett und bei Konzentrationen von 100 ug/ml zumindest partiell unterdrückt (Fig. 5, oben). Die inhibitorischen Effekte auf R5-trope Formen waren geringer. Ein chimäres Onko-Lentivirus (Mu-HIV), welches das MLV-Hüllprotein trägt, wurde nicht inhibiert (Fig. 5, unten).