本発明は、HPV遺伝子増幅用のPCRプライマー� ��ット、特に型特異的なプライマーセットを� ��供する。プライマーセットとしては、以下( 1)~(23)に示すプライマーセットが挙げられる� �
(1)配列番号1で示される塩基配列からなるプ� �イマー又は配列番号1で示される塩基配列に� ��補的な塩基配列とストリンジェントな条件� ��ハイブリダイズする塩基配列を有し同様に� ��ライマーとしての機能を有するその変異体� ��、配列番号2で示される塩基配列からなるプ ライマー又は配列番号2で示される塩基配列� �相補的な塩基配列とストリンジェントな条� �でハイブリダイズする塩基配列を有し同様� �プライマーとしての機能を有するその変異� �とからなるプライマーセット1、
(2)配列番号3で示される塩基配列からなるプ� �イマー又は配列番号3で示される塩基配列に� ��補的な塩基配列とストリンジェントな条件� ��ハイブリダイズする塩基配列を有し同様に� ��ライマーとしての機能を有するその変異体� ��、配列番号4で示される塩基配列からなるプ ライマー又は配列番号4で示される塩基配列� �相補的な塩基配列とストリンジェントな条� �でハイブリダイズする塩基配列を有し同様� �プライマーとしての機能を有するその変異� �とからなるプライマーセット2、
(3)配列番号5で示される塩基配列からなるプ� �イマー又は配列番号5で示される塩基配列に� ��補的な塩基配列とストリンジェントな条件� ��ハイブリダイズする塩基配列を有し同様に� ��ライマーとしての機能を有するその変異体� ��、配列番号6で示される塩基配列からなるプ ライマー又は配列番号6で示される塩基配列� �相補的な塩基配列とストリンジェントな条� �でハイブリダイズする塩基配列を有し同様� �プライマーとしての機能を有するその変異� �とからなるプライマーセット3、
(4)配列番号7で示される塩基配列からなるプ� �イマー又は配列番号7で示される塩基配列に� ��補的な塩基配列とストリンジェントな条件� ��ハイブリダイズする塩基配列を有し同様に� ��ライマーとしての機能を有するその変異体� ��、配列番号8で示される塩基配列からなるプ ライマー又は配列番号8で示される塩基配列� �相補的な塩基配列とストリンジェントな条� �でハイブリダイズする塩基配列を有し同様� �プライマーとしての機能を有するその変異� �とからなるプライマーセット4、
(5)配列番号9で示される塩基配列からなるプ� �イマー又は配列番号9で示される塩基配列に� ��補的な塩基配列とストリンジェントな条件� ��ハイブリダイズする塩基配列を有し同様に� ��ライマーとしての機能を有するその変異体� ��、配列番号10で示される塩基配列からなる� �ライマー又は配列番号10で示される塩基配列 に相補的な塩基配列とストリンジェントな条 件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様 にプライマーとしての機能を有するその変異 体とからなるプライマーセット5、
(6)配列番号11で示される塩基配列からなるプ� ��イマー又は配列番号11で示される塩基配列� �相補的な塩基配列とストリンジェントな条� �でハイブリダイズする塩基配列を有し同様� �プライマーとしての機能を有するその変異� �と、配列番号12で示される塩基配列からなる プライマー又は配列番号12で示される塩基配� ��に相補的な塩基配列とストリンジェントな� ��件でハイブリダイズする塩基配列を有し同� ��にプライマーとしての機能を有するその変� ��体とからなるプライマーセット6、
(7)配列番号13で示される塩基配列からなるプ� ��イマー又は配列番号13で示される塩基配列� �相補的な塩基配列とストリンジェントな条� �でハイブリダイズする塩基配列を有し同様� �プライマーとしての機能を有するその変異� �と、配列番号14で示される塩基配列からなる プライマー又は配列番号14で示される塩基配� ��に相補的な塩基配列とストリンジェントな� ��件でハイブリダイズする塩基配列を有し同� ��にプライマーとしての機能を有するその変� ��体とからなるプライマーセット7、
(8)配列番号15で示される塩基配列からなるプ� ��イマー又は配列番号15で示される塩基配列� �相補的な塩基配列とストリンジェントな条� �でハイブリダイズする塩基配列を有し同様� �プライマーとしての機能を有するその変異� �と、配列番号16で示される塩基配列からなる プライマー又は配列番号16で示される塩基配� ��に相補的な塩基配列とストリンジェントな� ��件でハイブリダイズする塩基配列を有し同� ��にプライマーとしての機能を有するその変� ��体とからなるプライマーセット8、
(9)配列番号17で示される塩基配列からなるプ� ��イマー又は配列番号17で示される塩基配列� �相補的な塩基配列とストリンジェントな条� �でハイブリダイズする塩基配列を有し同様� �プライマーとしての機能を有するその変異� �と、配列番号18で示される塩基配列からなる プライマー又は配列番号18で示される塩基配� ��に相補的な塩基配列とストリンジェントな� ��件でハイブリダイズする塩基配列を有し同� ��にプライマーとしての機能を有するその変� ��体とからなるプライマーセット9、
(10)配列番号19で示される塩基配列からなるプ ライマー又は配列番号19で示される塩基配列� ��相補的な塩基配列とストリンジェントな条� ��でハイブリダイズする塩基配列を有し同様� ��プライマーとしての機能を有するその変異� ��と、配列番号20で示される塩基配列からな� �プライマー又は配列番号20で示される塩基配 列に相補的な塩基配列とストリンジェントな 条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同 様にプライマーとしての機能を有するその変 異体とからなるプライマーセット10、
(11)配列番号21で示される塩基配列からなるプ ライマー又は配列番号21で示される塩基配列� ��相補的な塩基配列とストリンジェントな条� ��でハイブリダイズする塩基配列を有し同様� ��プライマーとしての機能を有するその変異� ��と、配列番号22で示される塩基配列からな� �プライマー又は配列番号22で示される塩基配 列に相補的な塩基配列とストリンジェントな 条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同 様にプライマーとしての機能を有するその変 異体とからなるプライマーセット11、
(12)配列番号23で示される塩基配列からなるプ ライマー又は配列番号23で示される塩基配列� ��相補的な塩基配列とストリンジェントな条� ��でハイブリダイズする塩基配列を有し同様� ��プライマーとしての機能を有するその変異� ��と、配列番号24で示される塩基配列からな� �プライマー又は配列番号24で示される塩基配 列に相補的な塩基配列とストリンジェントな 条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同 様にプライマーとしての機能を有するその変 異体とからなるプライマーセット12、
(13)配列番号25で示される塩基配列からなるプ ライマー又は配列番号25で示される塩基配列� ��相補的な塩基配列とストリンジェントな条� ��でハイブリダイズする塩基配列を有し同様� ��プライマーとしての機能を有するその変異� ��と、配列番号26で示される塩基配列からな� �プライマー又は配列番号26で示される塩基配 列に相補的な塩基配列とストリンジェントな 条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同 様にプライマーとしての機能を有するその変 異体とからなるプライマーセット13、
(14)配列番号27で示される塩基配列からなるプ ライマー又は配列番号27で示される塩基配列� ��相補的な塩基配列とストリンジェントな条� ��でハイブリダイズする塩基配列を有し同様� ��プライマーとしての機能を有するその変異� ��と、配列番号28で示される塩基配列からな� �プライマー又は配列番号28で示される塩基配 列に相補的な塩基配列とストリンジェントな 条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同 様にプライマーとしての機能を有するその変 異体とからなるプライマーセット14、
(15)配列番号29で示される塩基配列からなるプ ライマー又は配列番号29で示される塩基配列� ��相補的な塩基配列とストリンジェントな条� ��でハイブリダイズする塩基配列を有し同様� ��プライマーとしての機能を有するその変異� ��と、配列番号30で示される塩基配列からな� �プライマー又は配列番号30で示される塩基配 列に相補的な塩基配列とストリンジェントな 条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同 様にプライマーとしての機能を有するその変 異体とからなるプライマーセット15、
(16)配列番号31で示される塩基配列からなるプ ライマー又は配列番号31で示される塩基配列� ��相補的な塩基配列とストリンジェントな条� ��でハイブリダイズする塩基配列を有し同様� ��プライマーとしての機能を有するその変異� ��と、配列番号32で示される塩基配列からな� �プライマー又は配列番号32で示される塩基配 列に相補的な塩基配列とストリンジェントな 条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同 様にプライマーとしての機能を有するその変 異体とからなるプライマーセット16、
(17)配列番号33で示される塩基配列からなるプ ライマー又は配列番号33で示される塩基配列� ��相補的な塩基配列とストリンジェントな条� ��でハイブリダイズする塩基配列を有し同様� ��プライマーとしての機能を有するその変異� ��と、配列番号34で示される塩基配列からな� �プライマー又は配列番号34で示される塩基配 列に相補的な塩基配列とストリンジェントな 条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同 様にプライマーとしての機能を有するその変 異体とからなるプライマーセット17、
(18)配列番号35で示される塩基配列からなるプ ライマー又は配列番号35で示される塩基配列� ��相補的な塩基配列とストリンジェントな条� ��でハイブリダイズする塩基配列を有し同様� ��プライマーとしての機能を有するその変異� ��と、配列番号36で示される塩基配列からな� �プライマー又は配列番号36で示される塩基配 列に相補的な塩基配列とストリンジェントな 条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同 様にプライマーとしての機能を有するその変 異体とからなるプライマーセット18、
(19)配列番号37で示される塩基配列からなるプ ライマー又は配列番号37で示される塩基配列� ��相補的な塩基配列とストリンジェントな条� ��でハイブリダイズする塩基配列を有し同様� ��プライマーとしての機能を有するその変異� ��と、配列番号38で示される塩基配列からな� �プライマー又は配列番号38で示される塩基配 列に相補的な塩基配列とストリンジェントな 条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同 様にプライマーとしての機能を有するその変 異体とからなるプライマーセット19、
(20)配列番号39で示される塩基配列からなるプ ライマー又は配列番号39で示される塩基配列� ��相補的な塩基配列とストリンジェントな条� ��でハイブリダイズする塩基配列を有し同様� ��プライマーとしての機能を有するその変異� ��と、配列番号40で示される塩基配列からな� �プライマー又は配列番号40で示される塩基配 列に相補的な塩基配列とストリンジェントな 条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同 様にプライマーとしての機能を有するその変 異体とからなるプライマーセット20、
(21)配列番号41で示される塩基配列からなるプ ライマー又は配列番号41で示される塩基配列� ��相補的な塩基配列とストリンジェントな条� ��でハイブリダイズする塩基配列を有し同様� ��プライマーとしての機能を有するその変異� ��と、配列番号42で示される塩基配列からな� �プライマー又は配列番号42で示される塩基配 列に相補的な塩基配列とストリンジェントな 条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同 様にプライマーとしての機能を有するその変 異体とからなるプライマーセット21、
(22)配列番号43で示される塩基配列からなるプ ライマー又は配列番号43で示される塩基配列� ��相補的な塩基配列とストリンジェントな条� ��でハイブリダイズする塩基配列を有し同様� ��プライマーとしての機能を有するその変異� ��と、配列番号44で示される塩基配列からな� �プライマー又は配列番号44で示される塩基配 列に相補的な塩基配列とストリンジェントな 条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同 様にプライマーとしての機能を有するその変 異体とからなるプライマーセット22、及び
(23)配列番号45で示される塩基配列からなるプ ライマー又は配列番号45で示される塩基配列� ��相補的な塩基配列とストリンジェントな条� ��でハイブリダイズする塩基配列を有し同様� ��プライマーとしての機能を有するその変異� ��と、配列番号46で示される塩基配列からな� �プライマー又は配列番号46で示される塩基配 列に相補的な塩基配列とストリンジェントな 条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同 様にプライマーとしての機能を有するその変 異体とからなるプライマーセット23。

 プライマーセット1における、「配列番号1� �示される塩基配列からなるプライマー」及� �「配列番号2で示される塩基配列からなるプ� ��イマー」とは、それぞれ「配列番号1で示さ れる塩基配列からなるオリゴヌクレオチド」 及び「配列番号2で示される塩基配列からな� �オリゴヌクレオチド」と同義であり、以下� �便宜上、それぞれ「配列番号1のプライマー� ��及び「配列番号2のプライマー」とも称する 。
 「配列番号1で示される塩基配列に相補的な 塩基配列とストリンジェントな条件でハイブ リダイズする塩基配列を有し同様にプライマ ーとしての機能を有するその変異体」とは、 上記配列番号1で示される塩基配列に相補的� �塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとス� �リンジェントな条件でハイブリダイズする� �リゴヌクレオチドであって、配列番号1で示� ��れる塩基配列からなるオリゴヌクレオチド� ��同様のプライマーとしての機能、すなわち� ��列番号2で示される塩基配列からなるプライ マーと組み合わせることによってHPV6遺伝子� �特定の領域をPCR増幅させることのできる機� �を有する。以下、当該変異体を、便宜上、� �配列番号1のプライマーの変異体」とも称す� ��。同様に「配列番号2で示される塩基配列に 相補的な塩基配列とストリンジェントな条件 でハイブリダイズする塩基配列を有し同様に プライマーとしての機能を有するその変異体 」とは、上記配列番号2で示される塩基配列� �相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオ� �ドとストリンジェントな条件でハイブリダ� �ズするオリゴヌクレオチドであって、配列� �号2で示される塩基配列からなるオリゴヌク� ��オチドと同様のプライマーとしての機能、� ��なわち配列番号1で示される塩基配列からな るプライマーと組み合わせることによってHPV 6遺伝子の特定の領域をPCR増幅させることの� �きる機能を有する。以下、便宜上、「配列� �号2のプライマーの変異体」とも称する。「� ��異体」は、プライマーとしての機能が維持� ��れる範囲で、もととなるオリゴヌクレオチ� ��から1個又は複数個のヌクレオチドが置換、 欠失、挿入又は付加されている。
 ハイブリダイゼーション時のストリンジェ� ��シーは、温度、塩濃度、プライマーの鎖長� ��プライマーのヌクレオチド配列のGC含量及� �ハイブリダイゼーション緩衝液中のカオト� �ピック剤の濃度の関数であることが知られ� �いる。ストリンジェントな条件としては、� �えば、Sambrook, J. et al. (1998) Molecular Cloning : A Laboratory Manual (2nd ed.), Cold Spring Harbor� �Laboratory Press, New Yorkに記載された条件など を用いることができる。ストリンジェントな 温度条件は、約30℃以上、より好ましくは約3 7℃以上、最も好ましくは約42℃以上である。 その他の条件としては、ハイブリダイゼーシ ョン時間、洗浄剤(例えば、SDS)の濃度、及び� ��ャリアDNAの存否等であり、これらの条件を� ��み合わせることによって、様々なストリン� ��ェンシーを設定することができる。当業者� ��、所望するHPV遺伝子増幅用のPCRプライマー� ��しての機能を有する変異体を得るための条� ��を適宜決定することができる。

 プライマーセット1は、「配列番号1のプ� �イマー」又は「配列番号1のプライマーの変� ��体」と「配列番号2のプライマー」又は「配 列番号2のプライマーの変異体」とから構成� �れ、好ましくは「配列番号1のプライマー」� ��「配列番号2のプライマー」から構成される 。

 プライマーセット1と同様にしてプライマー セット2~23における各プライマーを定義付け� �ことができる。すなわち、
プライマーセット2は「配列番号3のプライマ� ��」又は「配列番号3のプライマーの変異体」 と「配列番号4のプライマー」又は「配列番� �4のプライマーの変異体」とから、好ましく� ��「配列番号3のプライマー」と「配列番号4� �プライマー」とから構成され、HPV11遺伝子の 特定の領域を増幅することができ、
プライマーセット3は「配列番号5のプライマ� ��」又は「配列番号5のプライマーの変異体」 と「配列番号6のプライマー」又は「配列番� �6のプライマーの変異体」とから、好ましく� ��「配列番号5のプライマー」と「配列番号6� �プライマー」とから構成され、HPV16遺伝子の 特定の領域を増幅することができ、
プライマーセット4は「配列番号7のプライマ� ��」又は「配列番号7のプライマーの変異体」 と「配列番号8のプライマー」又は「配列番� �8のプライマーの変異体」とから、好ましく� ��「配列番号7のプライマー」と「配列番号8� �プライマー」とから構成され、HPV18遺伝子の 特定の領域を増幅することができ、
プライマーセット5は「配列番号9のプライマ� ��」又は「配列番号9のプライマーの変異体」 と「配列番号10のプライマー」又は「配列番� ��10のプライマーの変異体」とから、好まし� �は「配列番号9のプライマー」と「配列番号1 0のプライマー」とから構成され、HPV30遺伝子 の特定の領域を増幅することができ、
プライマーセット6は「配列番号11のプライマ ー」又は「配列番号11のプライマーの変異体� ��と「配列番号12のプライマー」又は「配列� �号12のプライマーの変異体」とから、好まし くは「配列番号11のプライマー」と「配列番� ��12のプライマー」とから構成され、HPV31遺伝 子の特定の領域を増幅することができ、
プライマーセット7は「配列番号13のプライマ ー」又は「配列番号13のプライマーの変異体� ��と「配列番号14のプライマー」又は「配列� �号14のプライマーの変異体」とから、好まし くは「配列番号13のプライマー」と「配列番� ��14のプライマー」とから構成され、HPV33遺伝 子の特定の領域を増幅することができ、
プライマーセット8は「配列番号15のプライマ ー」又は「配列番号15のプライマーの変異体� ��と「配列番号16のプライマー」又は「配列� �号16のプライマーの変異体」とから、好まし くは「配列番号15のプライマー」と「配列番� ��16のプライマー」とから構成され、HPV34遺伝 子の特定の領域を増幅することができ、
プライマーセット9は「配列番号17のプライマ ー」又は「配列番号17のプライマーの変異体� ��と「配列番号18のプライマー」又は「配列� �号18のプライマーの変異体」とから、好まし くは「配列番号17のプライマー」と「配列番� ��18のプライマー」とから構成され、HPV35遺伝 子の特定の領域を増幅することができ、
プライマーセット10は「配列番号19のプライ� �ー」又は「配列番号19のプライマーの変異体 」と「配列番号20のプライマー」又は「配列� ��号20のプライマーの変異体」とから、好ま� �くは「配列番号19のプライマー」と「配列番 号20のプライマー」とから構成され、HPV39遺� �子の特定の領域を増幅することができ、
プライマーセット11は「配列番号21のプライ� �ー」又は「配列番号21のプライマーの変異体 」と「配列番号22のプライマー」又は「配列� ��号22のプライマーの変異体」とから、好ま� �くは「配列番号21のプライマー」と「配列番 号22のプライマー」とから構成され、HPV40遺� �子の特定の領域を増幅することができ、
プライマーセット12は「配列番号23のプライ� �ー」又は「配列番号23のプライマーの変異体 」と「配列番号24のプライマー」又は「配列� ��号24のプライマーの変異体」とから、好ま� �くは「配列番号23のプライマー」と「配列番 号24のプライマー」とから構成され、HPV42遺� �子の特定の領域を増幅することができ、
プライマーセット13は「配列番号25のプライ� �ー」又は「配列番号25のプライマーの変異体 」と「配列番号26のプライマー」又は「配列� ��号26のプライマーの変異体」とから、好ま� �くは「配列番号25のプライマー」と「配列番 号26のプライマー」とから構成され、HPV45遺� �子の特定の領域を増幅することができ、
プライマーセット14は「配列番号27のプライ� �ー」又は「配列番号27のプライマーの変異体 」と「配列番号28のプライマー」又は「配列� ��号28のプライマーの変異体」とから、好ま� �くは「配列番号27のプライマー」と「配列番 号28のプライマー」とから構成され、HPV51遺� �子の特定の領域を増幅することができ、
プライマーセット15は「配列番号29のプライ� �ー」又は「配列番号29のプライマーの変異体 」と「配列番号30のプライマー」又は「配列� ��号30のプライマーの変異体」とから、好ま� �くは「配列番号29のプライマー」と「配列番 号30のプライマー」とから構成され、HPV52遺� �子の特定の領域を増幅することができ、
プライマーセット16は「配列番号31のプライ� �ー」又は「配列番号31のプライマーの変異体 」と「配列番号32のプライマー」又は「配列� ��号32のプライマーの変異体」とから、好ま� �くは「配列番号31のプライマー」と「配列番 号32のプライマー」とから構成され、HPV53遺� �子の特定の領域を増幅することができ、
プライマーセット17は「配列番号33のプライ� �ー」又は「配列番号33のプライマーの変異体 」と「配列番号34のプライマー」又は「配列� ��号34のプライマーの変異体」とから、好ま� �くは「配列番号33のプライマー」と「配列番 号34のプライマー」とから構成され、HPV54遺� �子の特定の領域を増幅することができ、
プライマーセット18は「配列番号35のプライ� �ー」又は「配列番号35のプライマーの変異体 」と「配列番号36のプライマー」又は「配列� ��号36のプライマーの変異体」とから、好ま� �くは「配列番号35のプライマー」と「配列番 号36のプライマー」とから構成され、HPV56遺� �子の特定の領域を増幅することができ、
プライマーセット19は「配列番号37のプライ� �ー」又は「配列番号37のプライマーの変異体 」と「配列番号38のプライマー」又は「配列� ��号38のプライマーの変異体」とから、好ま� �くは「配列番号37のプライマー」と「配列番 号38のプライマー」とから構成され、HPV58遺� �子の特定の領域を増幅することができ、
プライマーセット20は「配列番号39のプライ� �ー」又は「配列番号39のプライマーの変異体 」と「配列番号40のプライマー」又は「配列� ��号40のプライマーの変異体」とから、好ま� �くは「配列番号39のプライマー」と「配列番 号40のプライマー」とから構成され、HPV59遺� �子の特定の領域を増幅することができ、
プライマーセット21は「配列番号41のプライ� �ー」又は「配列番号41のプライマーの変異体 」と「配列番号42のプライマー」又は「配列� ��号42のプライマーの変異体」とから、好ま� �くは「配列番号41のプライマー」と「配列番 号42のプライマー」とから構成され、HPV61遺� �子の特定の領域を増幅することができ、
プライマーセット22は「配列番号43のプライ� �ー」又は「配列番号43のプライマーの変異体 」と「配列番号44のプライマー」又は「配列� ��号44のプライマーの変異体」とから、好ま� �くは「配列番号43のプライマー」と「配列番 号44のプライマー」とから構成され、HPV66遺� �子の特定の領域を増幅することができ、
プライマーセット23は「配列番号45のプライ� �ー」又は「配列番号45のプライマーの変異体 」と「配列番号46のプライマー」又は「配列� ��号46のプライマーの変異体」とから、好ま� �くは「配列番号45のプライマー」と「配列番 号46のプライマー」とから構成され、HPV68遺� �子の特定の領域を増幅することができる。

 各プライマーセットの一例を表1に示す。 なお、後述するように、本発明では、内部標 準として利用されるG3PDH(グリセルアルデヒド 三リン酸脱水素酵素)遺伝子を増幅するため� �プライマーセットを任意で用いることがで� �る。G3PDH遺伝子を増幅するためのプライマー セット(プライマーセット24)は、配列番号47で 示される塩基配列からなるプライマー又は配 列番号47で示される塩基配列に相補的な塩基� ��列とストリンジェントな条件でハイブリダ� ��ズする塩基配列を有し同様にプライマーと� ��ての機能を有するその変異体と、配列番号4 8で示される塩基配列からなるプライマー又� �配列番号48で示される塩基配列に相補的な塩 基配列とストリンジェントな条件でハイブリ ダイズする塩基配列を有し同様にプライマー としての機能を有するその変異体とからなる 。

 なお、上記表1において、各プライマーが 結合する、各ウイルスタイプ及びG3PDHのゲノ� ��上の位置(nt)は、表2に示す各遺伝子のGenBank( NCBI;National Center for Biotechnology Information)登� �番号の遺伝子配列における位置である。

 本発明のプライマーは、各HPV遺伝子との� ��異性が高くなるよう(100%の相補性)、他の型� ��HPVと相同性の高い配列を有さないよう、及� ��Tm値がプライマーセット間で近くなるよう� �設計されているため、これらを混合して1つ� ��試験管内でマルチプレックスPCRを行った場� ��に、試料中に存在する特定の型のHPV遺伝子� ��特異的に増幅することが可能である。

 各プライマーの変異体の配列は、表1に記 載される各プライマーの情報に基づいて設計 することができる。具体的には、配列番号1� �プライマーの変異体は、配列番号2のプライ� ��ー(又は配列番号2のプライマーの変異体)と� ��PCR反応によって、配列番号1のプライマーと 配列番号2のプライマーとのPCR反応によって� �られるPCR産物と同一の、或いは相同性の高� �PCR産物を得ることができるように設計され� �。相同性の高さは、80%以上、好ましくは90%� �上、特に好ましくは95%以上である。配列番� �1のプライマーの5’末端は、HPV6(GenBank登録番 号:AF092932)ゲノム上7251位に結合するが、±50位 、好ましくは±20位、特に好ましくは±10位に� ��合するようなプライマーも配列番号1のプラ イマーの変異体として本発明の範疇である。

 相同性(%)は、当該分野で慣用のホモロジ� ��検索プログラム(例えば、BLAST、FASTA等)を初� ��設定で用いて決定することができる。また� ��別の局面では、相同性(%)は、当該分野で公� ��の任意のアルゴリズム、例えば、Needlemanら( 1970)(J.Mol.Biol.48:444-453)、Myers及びMiller(CABIOS,1988 ,4:11-17)のアルゴリズム等を使用して決定する ことができる。Needlemanらのアルゴリズムは、 GCGソフトウェアパッケージ(www.gcg.comで入手可 能)のGAPプログラムに組み込まれており、相� �性(%)は、例えば、BLOSUM 62 matrix又はPAM250 mat rix、並びにgap weight:16、14、12、10、8、6若し� �は4、及びlength weight:1、2、3、4、5若しくは6� ��いずれかを使用することによって決定する� ��とができる。また、Myers及びMillerのアルゴ� �ズムは、GCG配列アラインメントソフトウェ� �パッケージの一部であるALIGNプログラムに組 み込まれている。アミノ酸配列を比較するた めにALIGNプログラムを利用する場合、例えば� ��PAM120 weight residue table、gap length penalty 12� ��gap penalty 4を用いることができる。

 本発明のプライマーセットの各ヌクレオ� ��ドは、例えば汎用のDNA合成装置(例えば、App lied Biosystems社製 Model 394)を用いて化学的に� ��成することが出来る。オリゴヌクレオチド� ��、当該技術分野において良く知られる他の� ��法のいずれかを用いて合成しても良い。

 本発明は、前記PCR増幅産物と特異的にハイ� ��リダイズするプローブも提供する。該プロ� ��ブは、各PCR増幅産物の塩基配列に含まれる� ��本鎖DNAであり、センス鎖DNA又はアンチセン� ��鎖DNAのいずれであっても良い。具体的には� ��以下(1)~(23)に示すプローブが挙げられる。
(1)配列番号49で示される塩基配列からなるプ� ��ーブ又は配列番号49で示される塩基配列に� �補的な塩基配列とストリンジェントな条件� �ハイブリダイズする塩基配列を有し同様に� �ローブとしての機能を有するその変異体、� �いは配列番号49で示される塩基配列に相補的 な塩基配列からなるプローブ又は配列番号49� ��示される塩基配列とストリンジェントな条� ��でハイブリダイズする塩基配列を有し同様� ��プローブとしての機能を有するその変異体( プローブ1)、
(2)配列番号50で示される塩基配列からなるプ� ��ーブ又は配列番号50で示される塩基配列に� �補的な塩基配列とストリンジェントな条件� �ハイブリダイズする塩基配列を有し同様に� �ローブとしての機能を有するその変異体、� �いは配列番号50で示される塩基配列に相補的 な塩基配列からなるプローブ又は配列番号50� ��示される塩基配列とストリンジェントな条� ��でハイブリダイズする塩基配列を有し同様� ��プローブとしての機能を有するその変異体( プローブ2)、
(3)配列番号51で示される塩基配列からなるプ� ��ーブ又は配列番号51で示される塩基配列に� �補的な塩基配列とストリンジェントな条件� �ハイブリダイズする塩基配列を有し同様に� �ローブとしての機能を有するその変異体、� �いは配列番号51で示される塩基配列に相補的 な塩基配列からなるプローブ又は配列番号51� ��示される塩基配列とストリンジェントな条� ��でハイブリダイズする塩基配列を有し同様� ��プローブとしての機能を有するその変異体( プローブ3)、
(4)配列番号52で示される塩基配列からなるプ� ��ーブ又は配列番号52で示される塩基配列に� �補的な塩基配列とストリンジェントな条件� �ハイブリダイズする塩基配列を有し同様に� �ローブとしての機能を有するその変異体、� �いは配列番号52で示される塩基配列に相補的 な塩基配列からなるプローブ又は配列番号52� ��示される塩基配列とストリンジェントな条� ��でハイブリダイズする塩基配列を有し同様� ��プローブとしての機能を有するその変異体( プローブ4)、
(5)配列番号53で示される塩基配列からなるプ� ��ーブ又は配列番号53で示される塩基配列に� �補的な塩基配列とストリンジェントな条件� �ハイブリダイズする塩基配列を有し同様に� �ローブとしての機能を有するその変異体、� �いは配列番号53で示される塩基配列に相補的 な塩基配列からなるプローブ又は配列番号53� ��示される塩基配列とストリンジェントな条� ��でハイブリダイズする塩基配列を有し同様� ��プローブとしての機能を有するその変異体( プローブ5)、
(6)配列番号54で示される塩基配列からなるプ� ��ーブ又は配列番号54で示される塩基配列に� �補的な塩基配列とストリンジェントな条件� �ハイブリダイズする塩基配列を有し同様に� �ローブとしての機能を有するその変異体、� �いは配列番号54で示される塩基配列に相補的 な塩基配列からなるプローブ又は配列番号54� ��示される塩基配列とストリンジェントな条� ��でハイブリダイズする塩基配列を有し同様� ��プローブとしての機能を有するその変異体( プローブ6)、
(7)配列番号55で示される塩基配列からなるプ� ��ーブ又は配列番号55で示される塩基配列に� �補的な塩基配列とストリンジェントな条件� �ハイブリダイズする塩基配列を有し同様に� �ローブとしての機能を有するその変異体、� �いは配列番号55で示される塩基配列に相補的 な塩基配列からなるプローブ又は配列番号55� ��示される塩基配列とストリンジェントな条� ��でハイブリダイズする塩基配列を有し同様� ��プローブとしての機能を有するその変異体( プローブ7)、
(8)配列番号56で示される塩基配列からなるプ� ��ーブ又は配列番号56で示される塩基配列に� �補的な塩基配列とストリンジェントな条件� �ハイブリダイズする塩基配列を有し同様に� �ローブとしての機能を有するその変異体、� �いは配列番号56で示される塩基配列に相補的 な塩基配列からなるプローブ又は配列番号56� ��示される塩基配列とストリンジェントな条� ��でハイブリダイズする塩基配列を有し同様� ��プローブとしての機能を有するその変異体( プローブ8)、
(9)配列番号57で示される塩基配列からなるプ� ��ーブ又は配列番号57で示される塩基配列に� �補的な塩基配列とストリンジェントな条件� �ハイブリダイズする塩基配列を有し同様に� �ローブとしての機能を有するその変異体、� �いは配列番号57で示される塩基配列に相補的 な塩基配列からなるプローブ又は配列番号57� ��示される塩基配列とストリンジェントな条� ��でハイブリダイズする塩基配列を有し同様� ��プローブとしての機能を有するその変異体( プローブ9)、
(10)配列番号58で示される塩基配列からなるプ ローブ又は配列番号58で示される塩基配列に� ��補的な塩基配列とストリンジェントな条件� ��ハイブリダイズする塩基配列を有し同様に� ��ローブとしての機能を有するその変異体、� ��いは配列番号58で示される塩基配列に相補� �な塩基配列からなるプローブ又は配列番号58 で示される塩基配列とストリンジェントな条 件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様 にプローブとしての機能を有するその変異体 (プローブ10)、
(11)配列番号59で示される塩基配列からなるプ ローブ又は配列番号59で示される塩基配列に� ��補的な塩基配列とストリンジェントな条件� ��ハイブリダイズする塩基配列を有し同様に� ��ローブとしての機能を有するその変異体、� ��いは配列番号59で示される塩基配列に相補� �な塩基配列からなるプローブ又は配列番号59 で示される塩基配列とストリンジェントな条 件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様 にプローブとしての機能を有するその変異体 (プローブ11)、
(12)配列番号60で示される塩基配列からなるプ ローブ又は配列番号60で示される塩基配列に� ��補的な塩基配列とストリンジェントな条件� ��ハイブリダイズする塩基配列を有し同様に� ��ローブとしての機能を有するその変異体、� ��いは配列番号60で示される塩基配列に相補� �な塩基配列からなるプローブ又は配列番号60 で示される塩基配列とストリンジェントな条 件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様 にプローブとしての機能を有するその変異体 (プローブ12)、
(13)配列番号61で示される塩基配列からなるプ ローブ又は配列番号61で示される塩基配列に� ��補的な塩基配列とストリンジェントな条件� ��ハイブリダイズする塩基配列を有し同様に� ��ローブとしての機能を有するその変異体、� ��いは配列番号61で示される塩基配列に相補� �な塩基配列からなるプローブ又は配列番号61 で示される塩基配列とストリンジェントな条 件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様 にプローブとしての機能を有するその変異体 (プローブ13)、
(14)配列番号62で示される塩基配列からなるプ ローブ又は配列番号62で示される塩基配列に� ��補的な塩基配列とストリンジェントな条件� ��ハイブリダイズする塩基配列を有し同様に� ��ローブとしての機能を有するその変異体、� ��いは配列番号62で示される塩基配列に相補� �な塩基配列からなるプローブ又は配列番号62 で示される塩基配列とストリンジェントな条 件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様 にプローブとしての機能を有するその変異体 (プローブ14)、
(15)配列番号63で示される塩基配列からなるプ ローブ又は配列番号63で示される塩基配列に� ��補的な塩基配列とストリンジェントな条件� ��ハイブリダイズする塩基配列を有し同様に� ��ローブとしての機能を有するその変異体、� ��いは配列番号63で示される塩基配列に相補� �な塩基配列からなるプローブ又は配列番号63 で示される塩基配列とストリンジェントな条 件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様 にプローブとしての機能を有するその変異体 (プローブ15)、
(16)配列番号64で示される塩基配列からなるプ ローブ又は配列番号64で示される塩基配列に� ��補的な塩基配列とストリンジェントな条件� ��ハイブリダイズする塩基配列を有し同様に� ��ローブとしての機能を有するその変異体、� ��いは配列番号64で示される塩基配列に相補� �な塩基配列からなるプローブ又は配列番号64 で示される塩基配列とストリンジェントな条 件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様 にプローブとしての機能を有するその変異体 (プローブ16)、
(17)配列番号65で示される塩基配列からなるプ ローブ又は配列番号65で示される塩基配列に� ��補的な塩基配列とストリンジェントな条件� ��ハイブリダイズする塩基配列を有し同様に� ��ローブとしての機能を有するその変異体、� ��いは配列番号65で示される塩基配列に相補� �な塩基配列からなるプローブ又は配列番号65 で示される塩基配列とストリンジェントな条 件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様 にプローブとしての機能を有するその変異体 (プローブ17)、
(18)配列番号66で示される塩基配列からなるプ ローブ又は配列番号66で示される塩基配列に� ��補的な塩基配列とストリンジェントな条件� ��ハイブリダイズする塩基配列を有し同様に� ��ローブとしての機能を有するその変異体、� ��いは配列番号66で示される塩基配列に相補� �な塩基配列からなるプローブ又は配列番号66 で示される塩基配列とストリンジェントな条 件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様 にプローブとしての機能を有するその変異体 (プローブ18)、
(19)配列番号67で示される塩基配列からなるプ ローブ又は配列番号67で示される塩基配列に� ��補的な塩基配列とストリンジェントな条件� ��ハイブリダイズする塩基配列を有し同様に� ��ローブとしての機能を有するその変異体、� ��いは配列番号67で示される塩基配列に相補� �な塩基配列からなるプローブ又は配列番号67 で示される塩基配列とストリンジェントな条 件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様 にプローブとしての機能を有するその変異体 (プローブ19)、
(20)配列番号68で示される塩基配列からなるプ ローブ又は配列番号68で示される塩基配列に� ��補的な塩基配列とストリンジェントな条件� ��ハイブリダイズする塩基配列を有し同様に� ��ローブとしての機能を有するその変異体、� ��いは配列番号68で示される塩基配列に相補� �な塩基配列からなるプローブ又は配列番号68 で示される塩基配列とストリンジェントな条 件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様 にプローブとしての機能を有するその変異体 (プローブ20)、
(21)配列番号69で示される塩基配列からなるプ ローブ又は配列番号69で示される塩基配列に� ��補的な塩基配列とストリンジェントな条件� ��ハイブリダイズする塩基配列を有し同様に� ��ローブとしての機能を有するその変異体、� ��いは配列番号69で示される塩基配列に相補� �な塩基配列からなるプローブ又は配列番号69 で示される塩基配列とストリンジェントな条 件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様 にプローブとしての機能を有するその変異体 (プローブ21)、
(22)配列番号70で示される塩基配列からなるプ ローブ又は配列番号70で示される塩基配列に� ��補的な塩基配列とストリンジェントな条件� ��ハイブリダイズする塩基配列を有し同様に� ��ローブとしての機能を有するその変異体、� ��いは配列番号70で示される塩基配列に相補� �な塩基配列からなるプローブ又は配列番号70 で示される塩基配列とストリンジェントな条 件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様 にプローブとしての機能を有するその変異体 (プローブ22)、及び
(23)配列番号71で示される塩基配列からなるプ ローブ又は配列番号71で示される塩基配列に� ��補的な塩基配列とストリンジェントな条件� ��ハイブリダイズする塩基配列を有し同様に� ��ローブとしての機能を有するその変異体、� ��いは配列番号71で示される塩基配列に相補� �な塩基配列からなるプローブ又は配列番号71 で示される塩基配列とストリンジェントな条 件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様 にプローブとしての機能を有するその変異体 (プローブ23)。

 プローブ1における、「配列番号49で示され� ��塩基配列からなるプローブ」とは、「配列� ��号49で示される塩基配列からなるオリゴヌ� �レオチド」と同義である。以下、便宜上、� �配列番号49のプローブ」とも称する。
 「配列番号49で示される塩基配列に相補的� �塩基配列とストリンジェントな条件でハイ� �リダイズする塩基配列を有し同様にプロー� �としての機能を有するその変異体」とは、� �記配列番号49で示される塩基配列に相補的な 塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとスト リンジェントな条件でハイブリダイズするオ リゴヌクレオチドであって、配列番号49で示� ��れる塩基配列からなるオリゴヌクレオチド� ��同様のプローブとしての機能、すなわちHPV6 遺伝子の特定の領域を検出することのできる 機能を有する。以下、当該変異体を、便宜上 、「配列番号49のプローブの変異体」とも称� ��る。「変異体」は、プローブとしての機能� ��維持される範囲で、もととなるオリゴヌク� ��オチドから1個又は複数個のヌクレオチドが 置換、欠失、挿入又は付加されている。
 「配列番号49で示される塩基配列に相補的� �塩基配列からなるプローブ」とは、「配列� �号49で示される塩基配列に相補的な塩基配列 からなるオリゴヌクレオチド」と同義である 。以下、便宜上、「配列番号49と相補的なプ� ��ーブ」とも称する。
 「配列番号49で示される塩基配列とストリ� �ジェントな条件でハイブリダイズする塩基� �列を有し同様にプローブとしての機能を有� �るその変異体」とは、上記配列番号49で示さ れる塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと ストリンジェントな条件でハイブリダイズす るオリゴヌクレオチドであって、配列番号49� ��示される塩基配列に相補的な塩基配列から� ��るオリゴヌクレオチドと同様のプローブと� ��ての機能、すなわちHPV6遺伝子の特定の領域 を検出することのできる機能を有する。以下 、当該変異体を、便宜上、「配列番号49と相� ��的なプローブの変異体」とも称する。「変� ��体」は、プローブとしての機能が維持され� ��範囲で、もととなるオリゴヌクレオチドか� ��1個又は複数個のヌクレオチドが置換、欠失 、挿入又は付加されている。

 ハイブリダイゼーション時のストリンジ� ��ンシーは、温度、塩濃度、プローブの鎖長� ��プローブのヌクレオチド配列のGC含量及び� �イブリダイゼーション緩衝液中のカオトロ� �ック剤の濃度の関数であることが知られて� �る。ストリンジェントな条件としては、例� �ば、Sambrook, J. et al. (1998) Molecular Cloning:  A Laboratory Manual (2nd ed.), Cold Spring Harbor La boratory Press, New Yorkに記載された条件などを 用いることができる。ストリンジェントな温 度条件は、約30℃以上、より好ましくは約37� �以上、最も好ましくは約42℃以上である。そ の他の条件としては、ハイブリダイゼーショ ン時間、洗浄剤(例えば、SDS)の濃度、及びキ� ��リアDNAの存否等であり、これらの条件を組� ��合わせることによって、様々なストリンジ� ��ンシーを設定することができる。当業者は� ��所望するHPV遺伝子検出用のプローブとして� ��機能を有する変異体を得るための条件を適� ��決定することができる。

 プローブ1は、「配列番号49のプローブ」、� ��配列番号49のプローブの変異体」、「配列� �号49と相補的なプローブ」、又は「配列番号 49と相補的なプローブの変異体」のいずれか� ��あり、好ましくは「配列番号49のプローブ� �又は「配列番号49と相補的なプローブ」であ る。
 プローブ1と同様にしてプローブ2~23を定義� �けることができる。すなわち、
プローブ2は、「配列番号50のプローブ」、「 配列番号50のプローブの変異体」、「配列番� ��50と相補的なプローブ」、又は「配列番号50 と相補的なプローブの変異体」のいずれかで あり、好ましくは「配列番号50のプローブ」� ��は「配列番号50と相補的なプローブ」であ� �、HPV11遺伝子の特定の領域を検出することが でき、
プローブ3は、「配列番号51のプローブ」、「 配列番号51のプローブの変異体」、「配列番� ��51と相補的なプローブ」、又は「配列番号51 と相補的なプローブの変異体」のいずれかで あり、好ましくは「配列番号51のプローブ」� ��は「配列番号51と相補的なプローブ」であ� �、HPV16遺伝子の特定の領域を検出することが でき、
プローブ4は、「配列番号52のプローブ」、「 配列番号52のプローブの変異体」、「配列番� ��52と相補的なプローブ」、又は「配列番号52 と相補的なプローブの変異体」のいずれかで あり、好ましくは「配列番号52のプローブ」� ��は「配列番号52と相補的なプローブ」であ� �、HPV18遺伝子の特定の領域を検出することが でき、
プローブ5は、「配列番号53のプローブ」、「 配列番号53のプローブの変異体」、「配列番� ��53と相補的なプローブ」、又は「配列番号53 と相補的なプローブの変異体」のいずれかで あり、好ましくは「配列番号53のプローブ」� ��は「配列番号53と相補的なプローブ」であ� �、HPV30遺伝子の特定の領域を検出することが でき、
プローブ6は、「配列番号54のプローブ」、「 配列番号54のプローブの変異体」、「配列番� ��54と相補的なプローブ」、又は「配列番号54 と相補的なプローブの変異体」のいずれかで あり、好ましくは「配列番号54のプローブ」� ��は「配列番号54と相補的なプローブ」であ� �、HPV31遺伝子の特定の領域を検出することが でき、
プローブ7は、「配列番号55のプローブ」、「 配列番号55のプローブの変異体」、「配列番� ��55と相補的なプローブ」、又は「配列番号55 と相補的なプローブの変異体」のいずれかで あり、好ましくは「配列番号55のプローブ」� ��は「配列番号55と相補的なプローブ」であ� �、HPV33遺伝子の特定の領域を検出することが でき、
プローブ8は、「配列番号56のプローブ」、「 配列番号56のプローブの変異体」、「配列番� ��56と相補的なプローブ」、又は「配列番号56 と相補的なプローブの変異体」のいずれかで あり、好ましくは「配列番号56のプローブ」� ��は「配列番号56と相補的なプローブ」であ� �、HPV34遺伝子の特定の領域を検出することが でき、
プローブ9は、「配列番号57のプローブ」、「 配列番号57のプローブの変異体」、「配列番� ��57と相補的なプローブ」、又は「配列番号57 と相補的なプローブの変異体」のいずれかで あり、好ましくは「配列番号57のプローブ」� ��は「配列番号57と相補的なプローブ」であ� �、HPV35遺伝子の特定の領域を検出することが でき、
プローブ10は、「配列番号58のプローブ」、� �配列番号58のプローブの変異体」、「配列番 号58と相補的なプローブ」、又は「配列番号5 8と相補的なプローブの変異体」のいずれか� �あり、好ましくは「配列番号58のプローブ」 又は「配列番号58と相補的なプローブ」であ� ��、HPV39遺伝子の特定の領域を検出すること� �でき、
プローブ11は、「配列番号59のプローブ」、� �配列番号59のプローブの変異体」、「配列番 号59と相補的なプローブ」、又は「配列番号5 9と相補的なプローブの変異体」のいずれか� �あり、好ましくは「配列番号59のプローブ」 又は「配列番号59と相補的なプローブ」であ� ��、HPV40遺伝子の特定の領域を検出すること� �でき、
プローブ12は、「配列番号60のプローブ」、� �配列番号60のプローブの変異体」、「配列番 号60と相補的なプローブ」、又は「配列番号6 0と相補的なプローブの変異体」のいずれか� �あり、好ましくは「配列番号60のプローブ」 又は「配列番号60と相補的なプローブ」であ� ��、HPV42遺伝子の特定の領域を検出すること� �でき、
プローブ13は、「配列番号61のプローブ」、� �配列番号61のプローブの変異体」、「配列番 号61と相補的なプローブ」、又は「配列番号6 1と相補的なプローブの変異体」のいずれか� �あり、好ましくは「配列番号61のプローブ」 又は「配列番号61と相補的なプローブ」であ� ��、HPV45遺伝子の特定の領域を検出すること� �でき、
プローブ14は、「配列番号62のプローブ」、� �配列番号62のプローブの変異体」、「配列番 号62と相補的なプローブ」、又は「配列番号6 2と相補的なプローブの変異体」のいずれか� �あり、好ましくは「配列番号62のプローブ」 又は「配列番号62と相補的なプローブ」であ� ��、HPV51遺伝子の特定の領域を検出すること� �でき、
プローブ15は、「配列番号63のプローブ」、� �配列番号63のプローブの変異体」、「配列番 号63と相補的なプローブ」、又は「配列番号6 3と相補的なプローブの変異体」のいずれか� �あり、好ましくは「配列番号63のプローブ」 又は「配列番号63と相補的なプローブ」であ� ��、HPV52遺伝子の特定の領域を検出すること� �でき、
プローブ16は、「配列番号64のプローブ」、� �配列番号64のプローブの変異体」、「配列番 号64と相補的なプローブ」、又は「配列番号6 4と相補的なプローブの変異体」のいずれか� �あり、好ましくは「配列番号64のプローブ」 又は「配列番号64と相補的なプローブ」であ� ��、HPV53遺伝子の特定の領域を検出すること� �でき、
プローブ17は、「配列番号65のプローブ」、� �配列番号65のプローブの変異体」、「配列番 号65と相補的なプローブ」、又は「配列番号6 5と相補的なプローブの変異体」のいずれか� �あり、好ましくは「配列番号65のプローブ」 又は「配列番号65と相補的なプローブ」であ� ��、HPV54遺伝子の特定の領域を検出すること� �でき、
プローブ18は、「配列番号66のプローブ」、� �配列番号66のプローブの変異体」、「配列番 号66と相補的なプローブ」、又は「配列番号6 6と相補的なプローブの変異体」のいずれか� �あり、好ましくは「配列番号66のプローブ」 又は「配列番号66と相補的なプローブ」であ� ��、HPV56遺伝子の特定の領域を検出すること� �でき、
プローブ19は、「配列番号67のプローブ」、� �配列番号67のプローブの変異体」、「配列番 号67と相補的なプローブ」、又は「配列番号6 7と相補的なプローブの変異体」のいずれか� �あり、好ましくは「配列番号67のプローブ」 又は「配列番号67と相補的なプローブ」であ� ��、HPV58遺伝子の特定の領域を検出すること� �でき、
プローブ20は、「配列番号68のプローブ」、� �配列番号68のプローブの変異体」、「配列番 号68と相補的なプローブ」、又は「配列番号6 8と相補的なプローブの変異体」のいずれか� �あり、好ましくは「配列番号68のプローブ」 又は「配列番号68と相補的なプローブ」であ� ��、HPV59遺伝子の特定の領域を検出すること� �でき、
プローブ21は、「配列番号69のプローブ」、� �配列番号69のプローブの変異体」、「配列番 号69と相補的なプローブ」、又は「配列番号6 9と相補的なプローブの変異体」のいずれか� �あり、好ましくは「配列番号69のプローブ」 又は「配列番号69と相補的なプローブ」であ� ��、HPV61遺伝子の特定の領域を検出すること� �でき、
プローブ22は、「配列番号70のプローブ」、� �配列番号70のプローブの変異体」、「配列番 号70と相補的なプローブ」、又は「配列番号7 0と相補的なプローブの変異体」のいずれか� �あり、好ましくは「配列番号70のプローブ」 又は「配列番号70と相補的なプローブ」であ� ��、HPV66遺伝子の特定の領域を検出すること� �でき、
プローブ23は、「配列番号71のプローブ」、� �配列番号71のプローブの変異体」、「配列番 号71と相補的なプローブ」、又は「配列番号7 1と相補的なプローブの変異体」のいずれか� �あり、好ましくは「配列番号71のプローブ」 又は「配列番号71と相補的なプローブ」であ� ��、HPV68遺伝子の特定の領域を検出すること� �できる。

 各プローブの一例(プローブがセンス鎖DNAの 場合)を表3に示す。なお、後述するように、� ��発明では、内部標準として利用されるG3PDH� �伝子を検出するためのプローブを任意で用� �ることができる。G3PDH遺伝子を検出するため のプローブ(プローブ24)は、配列番号72で示さ れる塩基配列からなるプローブ又は配列番号 72で示される塩基配列に相補的な塩基配列と� ��トリンジェントな条件でハイブリダイズす� ��塩基配列を有し同様にプローブとしての機� ��を有するその変異体、或いは配列番号72で� �される塩基配列に相補的な塩基配列を有す� �プローブ又は配列番号72で示される塩基配列 とストリンジェントな条件でハイブリダイズ する塩基配列を有し同様にプローブとしての 機能を有するその変異体である。
 各プローブの塩基配列、Tm値、サイズ、及� �ゲノム上の位置を表3に示す。

 位置(nt)は、センス鎖DNAであるプローブの 、各ウイルスタイプ及びG3PDHのゲノム上の位� ��(5’→3’)を示している。なお、位置は、表 2に示す各遺伝子のGenBank登録番号の遺伝子配� ��における位置で示している。

 該プローブは、長さが69~71bpと比較的短く 、かつ、他の型のHPVと相同性の高い配列を有 さないように設計されているため、各PCR増幅 産物と非常に高い特異性でハイブリダイズす る。例えば、PCR増幅産物を各HPVに特異的なプ ローブが支持体上に固定されている検出用DNA マイクロアレイとハイブリダイズさせること により、試料中における各HPVの存在又は非存 在を検出することが出来る。

 各プローブの変異体の配列は、表3に記載さ れる各プローブの情報に基づいて設計するこ とができる。具体的には、配列番号49のプロ� ��ブの変異体は、HPV6のゲノム上7519位~7588位の 塩基配列に相補的な塩基配列を有するオリゴ ヌクレオチドとストリンジェントな条件下で ハイブリダイズし得る程度に相同性の高いオ リゴヌクレオチドとなるように設計される。 相同性の高さは、80%以上、好ましくは90%以上 、特に好ましくは95%以上である。配列番号49� ��プローブは、HPV6(GenBank登録番号:AF092932)ゲノ ム上7519位~7588位領域に相当するが、HPV6遺伝� �を特異的に検出することができる場合には� �5’末端側及び3’末端側のいずれも±50位、� �ましくは±20位、特に好ましくは±10位変動し てもよい。
 プローブがアンチセンス鎖DNAの場合は、表3 に記載される各HPV遺伝子特異的配列に相補的 な配列に基づいて、所望するHPV型特異的なプ ローブを設計することができる。

 相同性(%)は、当該分野で慣用のホモロジ� ��検索プログラム(例えば、BLAST、FASTA等)を初� ��設定で用いて決定することができる。また� ��別の局面では、相同性(%)は、当該分野で公� ��の任意のアルゴリズム、例えば、Needlemanら( 1970)(J.Mol.Biol.48:444-453)、Myers及びMiller(CABIOS,1988 ,4:11-17)のアルゴリズム等を使用して決定する ことができる。Needlemanらのアルゴリズムは、 GCGソフトウェアパッケージ(www.gcg.comで入手可 能)のGAPプログラムに組み込まれており、相� �性(%)は、例えば、BLOSUM 62 matrix又はPAM250 mat rix、並びにgap weight:16、14、12、10、8、6若し� �は4、及びlength weight:1、2、3、4、5若しくは6� ��いずれかを使用することによって決定する� ��とができる。また、Myers及びMillerのアルゴ� �ズムは、GCG配列アラインメントソフトウェ� �パッケージの一部であるALIGNプログラムに組 み込まれている。アミノ酸配列を比較するた めにALIGNプログラムを利用する場合、例えば� ��PAM120 weight residue table、gap length penalty 12� ��gap penalty 4を用いることができる。

 該プローブの各ヌクレオチドは、例えば� ��用のDNA合成装置(例えば、Applied Biosystems社� � Model 394)を用いて化学的に合成することが� ��来る。オリゴヌクレオチドは、当該技術分� ��において良く知られる他の方法のいずれか� ��用いて合成しても良い。

 本発明の一つの側面として、HPVの型特異� ��なプライマーセットとプローブとの組み合� ��せを1種類以上、好ましくは2種類以上含有� �る、HPV検出用のキットが提供される。該キ� �トを用いたHPVの検出は、型特異的なプライ� �ーセットを用いて対応する型のHPV遺伝子をPC Rにより増幅すること、及び各増幅産物に特� �的にハイブリダイズするプローブを用いてHP Vの存在を検出すること、を含む。本発明の� �ライマーセットはそれぞれのTm値が近似する ように設計されており、従って、特に複数の プライマーセットを混合して用いるマルチプ レックスPCR反応を行なうのに好適である。

 プライマーセット1~23によって得られるPCR 増幅産物は、それぞれプローブ1~23によって� �特異的に検出される。例えばプライマーセ� �ト1を用いた場合にはそのPCR増幅産物の検出� ��はプローブ1が用いられる。

 本発明のキットを用いたHPVの検出のため� ��、試料中のDNAが抽出され、該DNAが前記プラ� ��マーセットを用いたPCRに付される。試料と� ��ては、HPVに感染していると疑われる被験者� ��ら得られた組織試料、生検、スメア等を用� ��ることが出来る。更に、採取した細胞から� ��度勾配遠心操作により、通常HPVが感染する� ��宮頸部扁平上皮細胞を濃縮して用いること� ��出来る。或いは、培養細胞、例えばHeLa細胞 等を用いても良い。本発明に従ってHPV遺伝子 の存在を検出することが有用であると考えら れる対象疾病には、疣、上皮内新生物、皮膚 癌、口腔・口咽頭癌、性器新生物、子宮頸癌 、コンジローム、乳頭種等が含まれる。

 試料からDNAを抽出する方法は当該技術分� ��において良く知られており、例えば、フェ� ��ール・クロロホルムによる抽出や、市販のD NA抽出試薬を用いる抽出により行うことが出� ��る。或いは、カラムキット(GENERATION(登録商� ��) Capture Column Kit Gentra)による抽出を行っ� �も良い。

 このようにして試料から抽出されたDNAを� ��ンプレートとして、前記プライマーセット� ��用いてPCRを行い、各型のHPV遺伝子を増幅す� ��。PCRの方法自体は、当該技術分野において� ��知であり(Saiki et al., Science,239:487-491, 1988)� ��センス鎖にハイブリダイズするプライマー( リバースプライマー)とアンチセンス鎖にハ� �ブリダイズするプライマー(フォワードプラ� ��マー)とを用い、これらのプライマー、鋳型 DNA(即ち、HPV遺伝子)及び耐熱性DNAポリメラー� ��の存在下で、アニーリング、伸長、変性の� ��程から成るサイクルを20回ないし40回程度繰 り返すことにより行うことができる。本発明 のキットを用いたHPV検出において、前記DNAポ リメラーゼとしては、例えば、FastStart Taq DN A Polymerase(Roche)、Ex Taq(登録商標)(Takara)、Z-Taq 、AccuPrime Taq DNA Polymerase、M-PCRキット(QIAGEN)� ��含まれるポリメラーゼ等を用いることが出� ��る。プライマーのTm値に基づいて適当なPCR� �応条件を選択する方法は当該技術分野にお� �て良く知られており、当業者は、プライマ� �の長さやGC含量、目的とする特異性や感度、 用いるポリメラーゼの特性等に基づいて、最 適な条件を選択することが出来る。例えば、 下記の実施例においては、95℃で4分間、次に 95℃で30秒間、60℃で30秒間、72℃で1分間を30� �イクル、次に72℃で7分間でPCRを実施した。� �た、所定の検出感度を達成し、かつ、ウイ� �スの型による検出感度のばらつきが少なく� �るように、PCR溶液に含めるプライマーの量� �適宜調節することが出来る。

 PCRによって増幅されたDNA産物に対して、対� ��する型特異的にHPVを検出することができる� ��発明のプローブを用いてハイブリダイゼー� ��ョン反応を実施する。ハイブリダイゼーシ� ��ンは、例えば、標識プローブやマイクロア� ��イを用いて簡便かつ高精度で行うことがで� ��る。標識DNAプローブを用いたハイブリダイ� ��ーション法としては、具体的には、例えばA llele-specific Oligonucleotide Probe法、Oligonucleotide� �Ligation Assay法、Invader法等の公知の方法を採� ��することができる。また、マイクロアレイ� ��の診断は、例えば以下のとおりに行うこと� ��できる。すなわち、被験者の生体試料(例え ば血液等)から単離したDNAを各型特異的なプ� �イマーセットを用いてPCR増幅する(DNA増幅産� ��)。その際に、標識dNTPを取り込ませて標識DN Aとする。この標識DNAをマイクロアレイに接� �させ、マイクロアレイにあらかじめ固定化� �れているプローブにハイブリダイズしたDNA� �検出する。ハイブリダイゼーションは、0.2ml 若しくは1.5mlプラスチックチューブに分注し� ��標識DNA水溶液を、マイクロアレイ上に点着� ��ることによって実施することができる。点� ��の量は、5~100μl程度とすることができる。� �イブリダイゼーションは、室温~70℃の温度� �囲で、0.5~20時間の範囲で実施することが好� �しい。ハイブリダイゼーション終了後、界� �活性剤と緩衝液との混合溶液を用いて洗浄� �行い、未反応の標識DNAを除去する。界面活� �剤としては、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)又 はポリエチレン20ソルビタンモノラウレート( Tween20)を用いることが好ましい。緩衝液とし� ��は、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ� ��緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液等を� ��いることができるが、クエン酸緩衝液を用� ��ることが好ましい。
 複数のDNA増幅産物を同時にプローブ生体高� ��子とハイブリダイズさせるための方法とし� ��は、例えば特許第3860174号で開示された方法 を用いることができる。

 本発明は、プローブ1~23からなる群から選 択される少なくとも1種、好ましくは2又はそ� ��以上が固定化されている、HPVを検出するた� ��のDNAマイクロアレイを提供する。該DNAマイ� ��ロアレイは任意で内部標準としてプローブ2 4を固定化していてもよい。

 マイクロアレイの作製方法としては、支持� ��表面で直接オリゴヌクレオチドを合成する� ��法(オン・チップ法)と、予め調製したオリ� �ヌクレオチドを支持体表面に固定する方法� �が知られている。本発明のマイクロアレイ� �、このいずれの方法でも作製することがで� �るが、簡便には後者である。オン・チップ� �としては、光照射で選択的に除去される保� �基の使用と、半導体製造に利用されるフォ� �リソグラフィー技術及び固相合成技術とを� �み合わせて、微少なマトリックスの所定の� �域での選択的合成を行う方法(マスキング技� ��:例えば、Fodor, S.P.A. Science 251:767, 1991)等� �よって行うことができる。一方、予め調製� �たオリゴヌクレオチドを固相担体表面に固� �する場合には、表面処理した支持体表面に� �リゴヌクレオチドを点着し、イオン結合又� �共有結合させる(例えば、Lamture, J.B. et al.  Nucl. Acids Res. 22:2121-2125, 1994; Guo, Z. et al.� �Nucl. Acids Res. 22:5456-5465, 1994)。オリゴヌク� ��オチドは、一般的には、表面処理した支持� ��にスペーサーやクロスリンカーを介して共� ��結合させる。ガラス表面にポリアクリルア� ��ドゲルの微小片を整列させ、そこに合成オ� ��ゴヌクレオチドを共有結合させる方法も知� ��れている(Yershov, G. et al. Proc. Natl. Acad. S ci. USA 94:4913, 1996)。
 また、ポリ-L-リジン又はアミノプロピルシ� ��ンをコーティングしたガラス表面を支持体� ��して用いることもできる。支持体としては� ��例えば、ナイロン膜、ニトロセルロース膜� ��ガラス、シリコンチップ等が挙げられる。� ��た、プローブの固定は、当該技術分野で利� ��される任意の方法に従ってなされ得るが、� ��常、スポッター等を用いて支持体上にDNAを� ��定すれば良い。

 本発明のキットを用いてHPVを検出するた� ��にDNAマイクロアレイを用いる場合には、ハ� ��ブリダイゼーションに供する前に増幅DNA産� ��を予め標識しておくことが好ましく、増幅� ��に標識を行うことが特に好ましい。該標識� ��法としては、PCR増幅産物を作製する際、DNA� ��リメラーゼ酵素の基質となるATCG4種のデオ� �シヌクレオチド(dATP、dCTP、dGTP、dTTP:総称し� �dNTP)と標識付きデオキシヌクレオチド(例え� �、Cy3-dUTP)をそれぞれ調製して、各dNTPの終濃� ��を揃えることで、作製される増幅産物中に� ��識付きデオキシヌクレオチドを取り込ませ� ��方法、及び予め標識されたプライマーを用� ��てPCR反応を行いDNAを標識する方法の二つを� ��げることが出来る。

 標識物質としては、蛍光物質又はビオチ� ��のいずれか一つを含んでいることが、検出� ��度及び標識の簡便さの点から好ましい。好� ��しい蛍光物質としては、例えば、FITC、FAM、 Cy3、Cy5、Cy5.5、Cy7、TAMRA、Dabcyl、ROX、TET、Rhoda mine、Texas Red、HEX、Cyber Green等が挙げられ、� ��に好ましい蛍光物質はCy3である。ビオチン� ��びジゴキシゲニンの場合は、各種ビオチン� ��合型の標識酵素タンパク質を反応させ、か� ��る標識酵素タンパク質の酵素活性を指標と� ��て、検出を可能とする。蛍光標識して利用� ��れる各種蛍光物質は、かかる蛍光物質に由� ��する蛍光強度を観測する光学的検出手段を� ��用することで、高感度の検出を可能とする� ��また、前記標識酵素タンパク質の酵素活性� ��指標とする検出法も、酵素活性は、各種発� ��反応を利用するものとすることで、光学的� ��出手段の利用が可能であり、高感度の検出� ��可能とする。該光学的検出手段としては、� ��焦点、非共焦点レーザースキャナー又はCCD� ��キャナーを用いて蛍光強度値を読み取れば� ��い。

 増幅産物をDNAマイクロアレイとハイブリ� ��イズさせるに当たって、二本鎖DNA産物をDNA� ��イクロアレイとのハイブリダイゼーション� ��応に供しても良いし、ハイブリダイゼーシ� ��ン反応前に増幅二本鎖DNA産物から一本鎖DNA� ��単離する工程を加えても良いが、検出感度� ��観点から、一本鎖DNAに単離する工程を加え� ��ことが好ましい。

 二本鎖DNAからの一本鎖DNAの単離の方法は� ��に限定されないが、例えば、特開2006-230342� �開示された方法を挙げることが出来る。即� �、以下の手順に従って一本鎖DNAは単離され� �。検出しない側のタグ鎖を合成するための� �ライマーの5’端にビオチンを標識しておく� ��増幅後、ビオチンをストレプトアビジンが� ��定化されている磁気ビーズと結合させ、増� ��DNA産物-磁気ビーズの複合体を形成させる。 複合体にNaOH水溶液などのアルカリ溶液を加� �て反応させることにより、増幅DNA産物の二� �鎖を一本鎖に乖離させる。その後、磁気ビ� �ズをマグネットに吸着させることにより、� �オチン標識されていないプライマーにより� �長した一本鎖DNAのみを選択的に単離するこ� �が出来る。なお、磁気ビーズを用いてアン� �センス鎖DNAを単離する工程の概要を図1に示� ��た。図1記載の工程において、5’末端をビ� �チン修飾したフォワードプライマーの代わ� �に、5’末端をビオチン修飾したリバースプ� ��イマーを用いれば、磁気ビーズを用いたセ� ��ス鎖DNAの単離も同様になされ得る。

 HPV遺伝子検査は、臨床サンプルを用いた検� ��であるため、実験的な精度管理が非常に重� ��である。そのために、内部標準となる遺伝� ��(内部標準遺伝子)を設定することが望まし� �。本明細書において内部標準遺伝子とは、� �体由来のDNAと共にマルチプレックスPCRに供� �れ、該増幅産物を認識するプローブとハイ� �リダイズさせて検出することにより、偽の� �の反応を検出するために利用される遺伝子� �言う。この目的のために、細胞内での発現� �が比較的多く、またその変動が少ない、ハ� �スキーピング遺伝子が利用されることが多� �。具体的には、例えば、G3PDH、β-アクチン等 が挙げられる。
 本発明のキットは内部標準としてG3PDHを採� �しており、G3PDH用のプライマーセット(プラ� �マーセット24)とプローブ(プローブ24)との組� ��合わせを任意で含む(上記表1及び表3を参照) 。該プライマーセットとプローブとの組み合 わせは、様々な型のHPV遺伝子に対する増幅反 応若しくはハイブリダイゼーション反応と同 時かつ同じ効率で増幅若しくはハイブリダイ ズするように設計されている。

 一つの実施態様において、本発明のキッ� ��は、前記24種類のプライマーセットとプロ� �ブとの組み合わせのうち、プライマーセッ� �3とプローブ3との組み合わせ、プライマーセ ット4とプローブ4との組み合わせ、及び任意� ��プライマーセット24とプローブ24との組み合 わせを含有する。この場合、該キットは、HPV 16及びHPV18の検出を可能とするが、これらのHP Vサブタイプは、子宮頸癌の発症について特� �ハイリスクである。

 別の実施態様において、本発明のキット� ��、前記24種類のプライマーセットとプロー� �との組み合わせのうち、プライマーセット3� ��プローブ3との組み合わせ、プライマーセッ ト4とプローブ4との組み合わせ、プライマー� ��ット5とプローブ5との組み合わせ、プライ� �ーセット6とプローブ6との組み合わせ、プラ イマーセット7とプローブ7との組み合わせ、� ��ライマーセット9とプローブ9との組み合わ� �、プライマーセット10とプローブ10との組み� ��わせ、プライマーセット13とプローブ13との 組み合わせ、プライマーセット14とプローブ1 4との組み合わせ、プライマーセット15とプロ ーブ15との組み合わせ、プライマーセット18� �プローブ18との組み合わせ、プライマーセッ ト19とプローブ19との組み合わせ、プライマ� �セット20とプローブ20との組み合わせ、プラ� ��マーセット23とプローブ23との組み合わせ、 及び任意でプライマーセット24とプローブ24� �の組み合わせを含有する。この場合、該キ� �トは、HPV16、HPV18、HPV30、HPV31、HPV33、HPV35、HP V39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59及びHPV 68の検出を可能とするが、これらのHPVサブタ� ��プは、子宮頸癌の発症についてハイリスク� ��に分類される。

 更なる実施態様において、本発明のキッ� ��は、HPVを検出するための前記23種類のプラ� �マーセットとプローブとの組み合わせの全� �、及び任意でプライマーセット24とプローブ 24との組み合わせを含有する。

 本発明のキットは、前記各プライマーセ� ��トとプローブとの組み合わせ以外に、以下� ��試薬全て、又はそれらの任意の組み合わせ� ��及びその他の試薬を含有し得る:緩衝液、耐 熱性DNAポリメラーゼ、ポジティブコントロー ルHPV DNA、非HPV DNA、内部標準G3PDH DNA、dNTP、 蛍光色素標識塩基(例、Cy3-dUTP)、及びストレ� �トアビジンが固定されている磁気ビーズ。

 本発明の別の側面として、上述した本発� ��のキットを用いて検体中のHPVの存在又は非� ��在を型特異的に検出するための方法が提供� ��れる。該方法は、検体中から抽出したDNAを� ��型として、前記プライマーセットを用いてP CRを行う工程及び増幅されたDNA産物を検出す� ��工程を含む。

 別の実施態様において、該方法は、検体� ��から抽出したDNAを鋳型として、前記プライ� ��ーセットを用いてPCRを行う工程、増幅したD NA産物を一本鎖にする工程、及び一本鎖DNAを� ��記プローブとハイブリダイズさせて検出す� ��工程を含む。各工程における実際の手順は� ��特に限定されないが、キットの説明におい� ��記述した方法を適宜用いることが好ましい� ��

 以下、実施例を挙げて本発明を更に詳し� ��説明するが、本発明は下記実施例等に何ら� ��限されるものではない。