La présente invention concerne un procédé de préparation d'une protéine d'intérêt dans le lait d'un animal transgénique. Elle concerne également les constructions permettant d'obtenir ces animaux, les animaux obtenus ainsi que les cellules contenant les constructions permettant

5 l'expression d'une protéine hétérologue.

Plusieurs voies ont été poursuivies pour obtenir des protéines présentant un intérêt biologique, thérapeutique, ou industriel, et produites naturellement en petites quantités ou sous une forme difficile à purifier.

Des protéines ont ainsi pu être produites grâce à des

10 techniques de recombinaison génétique, par des microorganismes, comme des bactéries ou des levures. Cependant, la plupart des protéines requièrent, après leur synthèse, un stade de maturation consistant en modifications chimiques de certains groupements réactionnels, glycosy- lation, etc. Les cellules procaryotes ne disposent pas de l'équipement

15 enzymatique adéquat pour effectuer cette maturation, d'où l'obtention de protéines inactives et/ou à fort pouvoir antigénique.

Il est donc préférable de synthétiser ces protéines dans des cellules eucaryotes, qui réaliseront les transformations enzymatiques appropriées. Cependant, la culture à grande échelle de cellules tissulaires pose un ^2u certain nombre de difficultés techniques et économiques.

Une autre approche consiste donc à faire produire ces protéines par des cellules in vivo, par l'intermédiaire d'animaux trans¬ géniques . Il est souhaitable que le système utilisé permette la production de protéines en grande quantité, et facilement récupérable. Il est donc 2-5 intéressant que la protéine recombinante soit produite au niveau de la glande mammaire d'animaux transgéniques, et excrétée dans le lait. Il s'agit en effet d'un fluide biologique aisément collectable, ayant une complexité relativement limitée et une faible activité protéolytique ; en outre, les processus de maturation des protéines recombinantes seront 30 probablement assurés (glycosylation, phosphorylation, clivage, etc.).

On a ainsi réussi à faire synthétiser par la glande mammaire de souris ou de brebis des protéines du lait d'une autre espèce ou des protéines normalement absentes du lait (Réf. 1 à 15).

35

Toutefois, le taux de protéines ainsi produites est extrême¬ ment variable. II est différent d'un animal transgénique à l'autre, dans la mesure où il est fonction du processus d'intégration du transgène qui est lui-même variable d'un animai à l'autre. La nature des constructions de gène est également essentielle, les éléments régulant l'expression des gènes des protéines du lait pouvant être multiples et situés en divers points de la région promotrice et de la partie transcrite du gène. Ainsi, les promoteurs de la béta-lactoglobuline ovine, de la WAP de rat et de la caséine-béta de rat sont capables de faire synthétiser ces protéines chez des souris transgéniques. Les taux ne sont toutefois systématiquement élevés que dans le cas de la béta-lactoglobuline. De même, le promoteur de la béta-iactoglobuline dirige la synthèse de l'alpha. -antitrypsine humaine qui atteint la valeur de 7 mg/ml de lait dans le lait d'une souris transgénique. Le promoteur de la caséine-alpha^ . permet la synthèse de l'urokinase humaine, mais les promoteurs des gènes de la caséine-béta de rat et de la caséine-béta de lapin utilisés jusqu'à ce jour, sont d'une activité limitée. Le promoteur du gène de la WAP de souris dirige la synthèse de plusieurs protéines étrangères (activateur de plasminogène, CD ) qui sont sécrétées dans le lait de souris transgéniques. Les quantités de protéines obtenues avec ce promoteur sont toutefois relativement modestes.

De plus, il arrive que la spécificité du promoteur soit modifiée par son association à un gène étranger. C'est ainsi que Gϋnzburg et al . (Moiecular Endocrinology 1991) obtiennent la sécrétion d'hormone de croissance à l'aide d'un ADN recombinant sous la dépendance du promoteur de la WAP de souris, chez des animaux transgéniques ; mais l'hormone de croissance est alors également produite dans le cervelet, dans les cellules gliales de Bergman. De tels phénomènes peuvent résulter dans une toxicité et dans la mort prématurée de l'animai.

La présente invention repose sur la mise en évidence de l'intérêt particulier du promoteur du gène de la WAP de lapin. En effet, la WAP de lapin ("whey acidic protein") est une protéine relativement abondante du lait de lapin (15 mg/ml de lait), et le lapin est potentielle¬ ment un animal transgénique utilisable à grande échelle.

La présente invention concerne un procédé de préparation d'une protéine hétérologue d'intérêt sous forme mature ou sous forme fusionnée dans le lait d'une femelle de mammifère, procédé dans lequel :

on élève ladite femelle et, on récupère le lait d'où l'on récupère ladite protéine que l'on sépare si nécessaire, caractérisé en ce que ladite femelle est un animal transgénique dans le génome duquel a été intégrée une séquence codant pour ladite protéine d'intérêt sous le contrôle d'au moins une séquence figurant parmi les éléments d'expression de la protéine WAP de lapin et se trouvant sur le fragment d'une longueur d'au moins 3 Kb à partir de l'extrémité 3' du promoteur WAP complet. De préférence, la présente invention concerne un procédé dans lequel la séquence contrôlant l'expression de la protéine d'intérêt comprend en outre des éléments d'expression situés sur le fragment compris entre 3 Kb et 6,3 Kb à partir de l'extrémité 3' du promoteur WAP.

L'obtention d'animaux transgéniques est connue et a été largement décrite avec des constructions voisines dans les documents cités précédemment mais également dans Gϋnzburg et al., Hennighausen et al., Burdon et al., Reddy et al. ainsi que dans le brevet WO 90 05188.

La description détaillée des méthodes de transgénèse ne sera pas rappelée en détail, les documents ci-dessus sont incorporés dans la présente description par référence expresse.

Par "protéine hétérologue d'intérêt", on entend désigner essentiellement une protéine qui n'est pas naturellement sous le contrôle du promoteur WAP de lapin.

Dans le procédé selon l'invention, la femelle de mammifère utilisée est de préférence une lapine mais ces constructions sont efficaces également dans d'autres mammifères, par exemple les souris.

Le lait obtenu contient la protéine d'intérêt qui peut être isolée ou non puis, suivant qu'elle est sous forme mature ou fusionnée, elle peut subir une scission chimique ou enzymatique si nécessaire. Les constructions d'ADN utilisées sont de préférence introduites par microinjection - niveau de l'oeuf fécondé au stade une

cellule jusqu'à 8 cellules puis on sélectionne les animaux répondant aux critères décrits précédemment, c'est-à-dire transgéniques et exprimant ladite protéine dans le lait.

La région promotrice de ce gène WAP greffée au gène rapporteur de la chloramphenicol acétyl transferase (CAT) bactérienne contient les éléments sensibles aux deux hormones lactogènes les plus importantes, la prolactine et les glucocorticoîdes. Ces hormones stimulent de manière intense l'expression du gène CAT lorsque le gène hybride est transfecté dans des cellules épithéliales primaires mammaires de lapine. La réponse aux hormones dépend de la longueur du promoteur utilisé. Le promoteur du gène de la WAP de lapin est donc beaucoup plus efficace que les promoteurs des gènes de la WAP de souris et de rat, utilisés jusqu'à ce jour. '

En particulier, dans le procédé selon la présente invention, la séquence codant pour la protéine d'intérêt peut être précédée vers son extrémité 5', d'une séquence correspondant au promoteur du gène WAP de lapin complet, ou d'une séquence équivalente, assurant la fonction de promoteur. Il est même possible, dans ce cas, d'utiliser la totalité du gène WAP et un promoteur WAP dudit gène ou d'une séquence équivalente. La figure 5 annexée à la présente demande représente ledit gène WAP de lapin.

Par "séquence équivalente", on entend désigner de préférence une séquence ayant au moins une longueur de 3 Kb à partir de l'extrémité 3' du promoteur WAP et en particulier comportant les éléments d'expres- sion situés sur le fragment d'une longueur d'au moins 6,3 Kb à partir de l'extrémité 3' du promoteur WAP de lapin complet, notamment située entre les sites HindIII et BamHI (figure 1).

Le promoteur peut comporter une séquence de 17 Kb, comprise entre les sites HindIII et Eco RI, ou une séquence comportant les éléments d'expression situés sur ce fragment. Les éléments essentiels des construc¬ tions selon l'invention se trouvent sur le fragment d'une longueur de 17,6 Kb à partir de l'extrémité 3' du promoteur.

Ce long promoteur est susceptible d'apporter des éléments qui favorisent encore l'expression du gène étranger qui lui est lié, ou de rendre son expression plus régulièrement élevée en la rendant plus indépendante du site d'insertion du transgène dans le génome. Le promoteur court de 6,3 Kb donnera une réponse aux hormones lactogènes pratiquement identique à celle obtenue avec le promoteur long de 17 Kb, et peut diriger la synthèse de protéines dont les gènes lui sont associés dans un vecteur à des taux très élevés.

L'invention concerne également des constructions telles que définies ci-dessus mais dans lesquelles, dans la séquence correspondant au gène de la protéine WAP de lapin, le codon AUG initiateur est délété.

Cette modification peut être obtenue notamment par mutagénèse dirigée.

Lorsque la séquence codant pour la protéine d'intérêt est sous forme fusionnée avec la séquence de tout ou partie du gène WAP, il est possible de supprimer la séquence ATG de cette protéine.

La protéine WAP de lapin pourra ainsi, avec ce type de construction, être exprimée par exemple chez des souris transgéniques.

Dans ce type de construction comprenant le gène de la protéine WAP de lapin, ayant éventuellement perdu le codon AUG initiateur, le gène ou l'ADN de la protéine d'intérêt peut être placé en différents sites qui pourront conduire à des niveaux et des types de constructions différents, comme cela ressortira des exemples.

Selon un autre de ses aspects, la présente invention fournit un procédé pour récupérer le lait produit par une femelle de mammifère et la protéine qu'il contient, caractérisé en ce que, pour récupérer la protéine d'intérêt dans le lait de ladite femelle de mammifère, a) on recueille les glandes mammaires, b) on laisse incuber les glandes mammaires à une température d'environ o°C pendant une durée variant de deux heures à 18 heures, c) on récupère le lait ayant spontanément exsudé des glandes, d) on isole la protéine d'intérêt à partir du lait et on obtient ladite protéine purifiée.

Ce procédé a été mis au point dans le cadre de la production de protéine hétéroiogue par un animal transgénique ayant intégré dans son génome des fragments du gène de la protéine WAP, mais il peut être appliqué à la purification de toute protéine que l'on désire isoler du lait. II représente un avantage considérable par rapport aux procédés classiques de traite des mammifères non-ruminants, sur le plan des quantités obtenues, surtout pour des petits animaux comme la souris (2k).

La composition du lait recueilli est identique à celle du lait produit naturellement. Ce procédé permet en outre un transfert plus aisé des produits obtenus du lieu de production au lieu de purification et de traitement, par transport des glandes mammaires dans de la glace.

Le procédé de préparation de protéine hétéroiogue de la présente invention, selon l'une quelconque de ses variantes, permet d'obtenir un grand nombre de protéines. Parmi ces protéines, il faut citer : - les facteurs de croissance, les interleukines, les facteurs de stimulation, les kinases, les facteurs de coagulation, _ l'alpha-antitrypsine, l'hirudine. et en particulier : l'érythropolétine, - le G-CSF, - l'alpha-antitrypsine, l'urokinase, le facteur VIII.

On peut citer les constructions suivantes :

- construction WAP-alpha . -antitrypsine humaine (analogue Arg 358) : le gène entier alpha . -antitrypsine humaine ayant l'Arg 358 à la place de la Meth 358 (Courtney, Bull. Inst. Pasteur (1988) 8 , 85-9 ) a été fusionné au promoteur long (17,6 Kb) du gène de la WAP de

lapin au site Hind III de la séquence 5'P non traduite, sur le modèle des constructions WAP-GH. Plusieurs lignées de souris expriment le gène humain à la concentration de 2 et 5 mg/ml de lait.

- construction WAP-érythropoïétine humaine : le gène entier de l'érythropoïétine humaine (Semenza et ai., Proc. Natl. Acad. Sa.

USA ( 1989) 86, 2301-2305) est fusionné au promoteur (6,3 Kb et 17,6 Kb) du gène de la WAP de lapin.

- construction WAP-facteur VlII-deltalI humain : l'ADNc du facteur VlII-deltalI humain (délété de la région B [Meulien et al., Prot. Engin (1988) 2, 301-306]) précédé du premier intron du gène du facteur VIII et dépourvu de sa séquence de polyadénylation, a été introduit à l'intérieur du gène WAP de lapin entier au site Hind III introduit par mutagénèse dirigée et qui précède l'AUG naturel.

Les constructions selon l'invention permettent d'obtenir des résultats tout à fait inattendus, notamment le promoteur de 6,3 Kb de la WAP associé aux gènes de l'hormone de croissance humaine et bovine est capable de diriger la synthèse de ces protéines dans le lait de souris transgéniques à des taux très élevés (1-21 mg/ml).

L'hGH contenue dans le lait des souris transgéniques est structuralement intacte. L'hGH a également conservé son activité biologique (évaluée non par son activité hormone de croissance mais par son activité prolactine). Le test biologique indique que la concentration de l'hormone est de 10 mg/ml, une valeur en accord avec les valeurs trouvées par le test radioimmunologique et par l'électrophorèse. Le promoteur du gène de la WAP de lapin est donc beaucoup plus efficace que les promoteurs des gènes de la WAP de souris et de rat, utilisés jusqu'à ce jour.

Le tableau 1 suivant donne un résumé des résultats des publications 2 à 15 et met donc en valeur les résultats obtenus avec les constructions selon l'invention, par rapport à ceux publiés dans l'art antérieur.

a o σ Oι -n

Tableau 1 : récapitulatif des différentes protéines recombinantes exprimées ^d ans le lait d'animaux transgéniques.

Une des raisons essentielles peut tenir dans le fait que le fragment d'ADN de lapin (6,3 Kb) était beaucoup plus long que son homologue de souris et de rat (2,6 Kb et 0,9 Kb). Des éléments régulateurs essentiels peuvent manquer dans les fragments d'ADN de souris et de rat utilisés.

La présente invention concerne également des constructions permettant d'obtenir des animaux transgéniques selon l'invention.

La présente invention concerne notamment les séquences d'ADN et les vecteurs permettant la mise en oeuvre du procédé ; en

10 particulier les séquences d'ADN comportant au moins un gène hétéroiogue codant pour une protéine d'intérêt, sous le contrôle d'au moins une séquence figurant parmi les éléments d'expression de la protéine WAP de lapin et se trouvant sur le fragment d'une longueur d'au moins 3 Kb à partir de l'extrémité 3' du promoteur WAP complet. -^ La présente invention concerne également des animaux transgéniques utilisables dans le procédé selon la présente invention, ainsi que des cellules transformées contenant les constructions selon l'invention.

Bien que les animaux en cause puissent être très divers, le lapin est un animal potentiellement utilisable pour obtenir des protéines 20 recombinantes en abondance. Jusqu'à 100 ml de lait peuvent être collectés chaque jour. Ce lait est très riche en protéines (beaucoup plus riche que le lait des ruminants). Il est par ailleurs plus facile et moins onéreux d'obtenir des lapins que des gros animaux transgéniques. Le promoteur du gène de la WAP de lapin a, de plus, toutes les chances de diriger au mieux la synthèse ~-^ de protéines recombinantes chez le lapin.

D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention invention apparaîtront à la lecture des exemples ci-après dans lesquels on se référera aux figures suivantes :

FIGURE 1 : cartographie du gène de la WAP de lapin.

30 FIGURE 2a: schéma de la construction du plasmide pW,. FIGURE 2b: poiylin er du plasmide p-polyIII-I FIGURE 3 : schéma de la construction du plasmide pJ. .

5

FIGURE : production d'hormone de croissance humaine et bovine dans des lignées de souris transgéniques abritant les constructions pW ₃ et pJ^.

FIGURE 5 : séquence du gène WAP de lapin.

FIGURE 6 : schémas des différentes constructions utilisées in vivo.

FIGURE 7 : schémas des constructions contenant le gène rapporteur CAT et des longueurs variables du promoteur WAP.

FIGURE 8 : efficacité des constructions décrites dans la figure 7.

EXEMPLE 1 : CONSTRUCTION DU PLASMIDE pW3

On prépare tout d'abord le plasmide p26C. Le plasmide p26C a été obtenu en introduisant la séquence Bam H.-Hmd III du gène WAP (fragment 6,3 Kb de la Fig. 1) dans le poly linker du vecteur p-poly III— I (entre les sites Bam H. et Hind III). Au cours de ce clonage, le site Bam H. a été supprimé et remplacé par le site Cla I qui figure dans le vecteur p26C (Fig.2). Le vecteur p26C est donc un plasmide capable de recevoir un gène étranger placé sous la dépendance du promoteur WAP 6,3 Kb. L'introduction du gène étranger peut se faire par exemple dans le site Sal I du poly linker (Fιg.2). Les inserts contenant la totalité du promoteur et des gènes étrangers peuvent être isolés du plasmide après une coupure aux deux sites Not 1 qui sont aux extrémités du poly linker du plasmide p-poly III— I.

Le plasmide pW,, obtenu à partir du plasmide p26C (selon la figure 2), contient le promoteur du gène de la WAP de lapin (6,3 Kb) et le gène de l'hormone de croissance humaine (hGH). Le fragment utilisé pour obtenir les souris transgéniques est compris entre les deux sites Notl.

Un site Hind III a été introduit dans la séquence de tête du gène (leader) par mutagénèse dirigée pour servir de site de clonage.

EXEMPLE 2 : CONSTRUCTION DU PLASMIDE p3fr

Le plasmide pJ. , obtenu à partir du plasmide p26 (selon la figure 3), contient le promoteur du gène de la WAP de lapin (6,3 Kb) et le

gène de l'hormone de croissance bovine (bGH). Le fragment utilisé pour obtenir les souris transgéniques est compris entre les deux sites Notl.

La souche d'E. Coli contenant le plasmide p26 a été déposée le 12 juin -- 1991, sous le n° 1-1 1 16 à la collection nationale de culture de microor¬ ganismes de l'Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 PARIS CEDEX 15.

EXEMPLE 3 : OBTENTION DE SOURIS TRANSGENIQUES

Les fragments pW, et pJ. ont été utilisés pour obtenir des animaux transgéniques. Les souris transgéniques ont été obtenues par la technique classique de microinjection (Brinster et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) S2, 38-44 2). 1-2-pl contenant 500 copies du gène ont été injectés dans le pronucleus mâle d'embryons de souris. Les constructions ont été réalisées dans le vecteur p-poly III— I (Lathe et al., Gène (1987) _5_7, 193-201 ). Les fragments Not 1 - Not 1 de ce vecteur contenant les gènes recombinés ont été microinjectés. Les embryons ont ensuite été transférés dans l'oviducte de femelles adoptives hormonalement préparées. Environ 10% des embryons manipulés ont donné naissance à des souriceaux et 2-5 % des embryons manipulés à des souriceaux transgéniques. La présence des transgènes a été révélée par la technique de transfert de Southern à partir de l'ADN extrait des queues des souris. Les concentrations de l'hormone de croissance dans le sang et dans le lait des animaux ont été évaluées à l'aide de tests radioimmunologiques spécifiques.

L'activité biologique de l'hGH a été évaluée en ajoutant du lait au milieu de culture de cellules ou d'expiants mammaires de lapin. L'hGH contenue dans le lait a induit l'expression du gène de la évaluée par la mesure des ARNm et de la protéine.

EXEMPLE 4 : PRODUCTION D'HORMONE DE CROISSANCE HUMAINE OU BOVINE DANS LE LAIT DE SOURIS TRANSGENIQUES AYANT INCORPORE LES CONSTRUCTIONS pW3 ET p34

Les concentrations d'hormones ont été déterminées par des tests radioimmunologiques spécifiques.

L'identification de l'hGH dans le lait d'une souris transgénique est réalisée de la façon suivante. Le lait de souris est centrifugé à 150.000g pendant une heure pour sédimenter les miceiies de caséine. Le surnageant (1 μl par puits) a été récupéré et examiné par une électrophorèse en gel de polyacrylamide, en présence d'hormone de croissance humaine témoin et d'un lait contrôle. Les résultats sont rapportés sur la figure 4.

Les animaux ayant intégré la construction pW, donnent des concentrations d'hGH de l'ordre de 10 mg/ml de lait et peuvent atteindre 21 mg/ml.

Les animaux ayant intégré la construction pJ _ώ produisent de l'ordre de 5 mg/ml de lait de bGH et jusqu'à 17 mg/ml.

Le procédé selon la présente invention permet de récolter

1,5 ml de lait/glande mammaire de souris (en mettant la glande mammaire dans la glace). 200 souris allaitantes exprimant une protéine étrangère à la concentration de 3 - 5 mg/ml fournissent donc 1 g de la protéine brute.

EXEMPLE 5 : CONSTRUCTIONS DE GENE

Les constructions des gènes utilisés pour exprimer des protéines recombinantes dans le lait d'animaux transgéniques contiennent dans tous les cas la région régulatrice du gène WAP de lapin : fragment BamHl-HindlII (6,3 Kb) ou fragment EcoRl-HindlII (17,6 Kb). Les plasmides WAP-hGH, WAP bGH, WAPO -AT, et WAP-EPO contiennent respectivement les gènes entiers (séquence de tête, exons, introns et terminateur de transcription) de l'hormone de croissance humaine (hGH), de l'hormone de

croissance bovine (bGH), de l'o . -antitrypsine humaine mutée en Arg358 et d'érythropoeïtine humaine. Dans ces constructions les gènes ont été associés à la région régulatrice du gène WAP au site HindIII. La construction WAP-FVIII-ΔlI contient l'ADNc du facteur VIII humain dans sa forme Δ II précédée d'un intron du gène du facteur VIII humain. Cet ensemble intron-ADNc a été introduit dans le site HindIII du gène WAP de lapin entier (figure 6).

EXEMPLE 6 : IDENTIFICATION DE L'ACTIVITE DE LA REGION REGU-

10 LATRICE DU GENE WAP DE LAPIN IN VITRO

Des longueurs variables de la région située en amont du site d'initiation de la transcription du gène WAP ont été associées à un gène rapporteur (le gène CAT : chloramphenicol acetyi transferase) (figure 7).

- -" Ces constructions ont été introduites dans des cellules épithéliales mammaires cultivées sur un gel de coliagène I de queue de rat par une transfection à l'aide de lipofectine. Les cellules ont ensuite été maintenues pendant trois jours en présence d'hormones (insuline, cortisol, prolactine). L'enzyme a alors été mesurée dans les extraits cellulaires. Les cons¬ 0 tructions ne contenant que 1806 pb ou moins de la région régulatrice n'expriment pas le gène CAT. La construction contenant 3000 bp est faiblement active, tandis que les constructions contenant 6300 et 17600 bp sont franchement exprimées en présence des hormones. La prolactine seule exerce un rôle inducteur faible mais significatif sur le gène CAT. L'insuline 5 et surtout le cortisol, inactifs seuls, amplifient l'action de la prolactine. La sensibilité du gène vis-à-vis des hormones est exactement identique à celle du gène WAP endogène des cellules. Les régions -3000-1806 bp et -6300-3000 bp contiennent donc des éléments régulateurs essentiels pour que le gène WAP s'exprime de manière intense (figure 8). Le fragment 0 17600-6300 bp n'apporte pas de stimulation supplémentaire in vitro ce qui n'exclut pas qu'il puisse avoir une telle action in vitro chez les animaux transgéniques. Ces expériences révèlent pour la première fois l'activité des régions régulatrices du gène WAP in vitro par des transfections des cellules.

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LEGENDE RELATIVE AUX FIGURES

FIGURE 6 :

Les constructions utilisées pour obtenir l'expression de protéines recom¬ binantes dans le lait d'animaux transgéniques.

FIGURE 7 :

Schéma des différentes constructions comportant le gène CAT placé sous la dépendance de longueurs variables du gène de la WAP de lapin.

FIGURE 8 :

Représentation de la variation de l'activité CAT dans des extraits de cellules epitheliales primaires mammaires de lapin transfectees par différents plasmides.