本発明は、質量分析計を用いて2種以上の タンパク質含有試料を対比して、それぞれの 試料に含まれる同種のタンパク質の量比を分 析するタンパク質分析方法に関わる。本発明 は特に、上記式(I)で表される化合物又はその 塩(以下、これらを単に本発明の化合物とも� �する)の2種以上の安定同位体の組み合わせを 標識化合物として用いてそれぞれの試料に含 まれる同種のタンパク質に質量差を与えるこ とを含む、タンパク質分析方法を提供する。

 式(I)中のR ₁ 、R ₂ 及びR ₃ はそれぞれ同一又は異なって、水素、ハロゲ ン又はアルキルを示す。R ₁ 、R ₂ 及びR ₃ は、好ましくは水素、ハロゲン、又は炭素数 1~6のアルキル(例えば、メチル、エチル、プ� �ピル、イソプロピル、ブチル、sec-ブチル、� ��ソブチル、tert-ブチル、ペンチル、ヘキシ� �等)であり、より好ましくは炭素数1~3のアル� ��ル(例えば、メチル又はエチル)である。ま� �、前記ハロゲンとしては、例えばフッ素、� �素、臭素、ヨウ素などが挙げられる。

 式(I)の化合物の好ましい例としては、2,4, 6-トリメチルピリリウム、2-エチル-4,6-ジメチ ルピリリウム及び2,6-ジエチル-4-メチルピリ� �ウムなどが挙げられる。

 本発明の化合物は、通常、塩の形態で利� ��される。その場合、該塩は式(I)の化合物及� ��任意の陰イオン原子又は陰イオン分子から� ��る塩である。該陰イオン原子又は陰イオン� ��子としては、ヘキサフルオロリン酸、トリ� ��ルオロメタンスルホン酸、テトラフルオロ� ��ウ酸等の陰イオンが挙げられ、タンパク質� ��標識反応を妨げない限り特にその種類は限� ��されないが、好ましくはテトラフルオロホ� ��酸の陰イオンである。

 従って、好ましい本発明の化合物の例と� ��ては、2,4,6-トリメチルピリリウム・テトラ� ��ルオロホウ酸、2-エチル-4,6-ジメチルピリリ ウム・テトラフルオロホウ酸塩又は2,6-ジエ� �ル-4-メチルピリリウム・テトラフルオロホ� �酸などが挙げられる。

 本発明においては、質量の異なる本発明の� ��合物の安定同位体によりそれぞれの試料に� ��まれるタンパク質又はペプチドを標識する� ��とによって、同種のタンパク質又はペプチ� ��に質量差を与える。使用される安定同位体� ��の質量差は、質量分析計により質量差を与� ��られた同種のタンパク質又はペプチドを分� ��することが出来る限り特に限定されないが� ��通常2以上であり、好ましくは3以上である� �質量差の上限も、本発明の化合物が安定に� �在し得る限り特に限定されない。通常は化� �物間の質量差を ¹² Cと ¹³ Cとの間の質量差により与えるので、質量差� �上限は本発明の化合物中に含まれる炭素原� �の個数に等しい。

 本発明の化合物は、例えば
1) Balaban, A.T., Boulton A.J., Organic Synthesis, Co ll., vol.5, p.1112(1973);vol.49, p.121(1969). 
2) Balaban, A.T., Boulton A.J., Organic Synthesis, Co ll., vol.5, p.1114(1973)
3) Ghiviriga I., Czerwinski E. W., Balaban A.T., Cro atia Chemica Acta, vol.77(1-2), p.391-396 (2004)
等で教示されている方法に従って合成するこ とが出来る。

 次に、上に挙げた3つの化合物、2,4,6-トリ メチルピリリウム・テトラフルオロホウ酸塩 、2-エチル-4,6-ジメチルピリリウム・テトラ� �ルオロホウ酸塩及び2,6-ジエチル-4-メチルピ� ��リウム・テトラフルオロホウ酸塩を例とし� ��、標識化合物として用いられる好適な安定� ��位体について説明する。

 2,4,6-トリメチルピリリウム・テトラフル� ��ロホウ酸塩の好適な3種の安定同位体の組み 合わせの一例を式(II):

に示す。但し、 ¹³ Cに置換する炭素原子の位置は任意であり、� �化合物中に含まれる ¹³ C原子の数を変更しない範囲で式(II)に示され� ��位置以外の炭素原子が ¹³ Cに置換されていてもよい。上記3種の化合物� ��ら選択される2又は3種を組み合わせて本発� �の方法に用いることが出来る。なお、以後� �式(II)中に示すように、各同位体をそれぞれP y0、Py4又はPy8と呼称し、また、これらを総称� ��てPy化合物と呼ぶこととする。式(II)中、Cの 左肩に数字13がある炭素原子が質量数13の炭� �原子である。すなわち、最低質量の標識化� �物(化学式(Py0))の全ての炭素は質量数12で、� �間の質量数の標識化合物(化学式(Py4))は質量� ��12の炭素原子8個のうち4個を質量数13の炭素� ��子で置き換えている。第三番目の同位体化� ��物(化学式(Py8))はPy0の全ての炭素原子を質量 数13の炭素原子に置換してある。そのため、� ��種の標識化合物の質量差の関係はPy0、Py0+4(= Py4)、Py0+8(=Py8)となる。また、これらのPy化合� ��における前記安定同位体間の質量差は4であ る。

 同様に、2-エチル-4,6-ジメチルピリリウム ・テトラフルオロホウ酸塩の好適な4種の安� �同位体の組み合わせの一例を式(III):

に示す。但し、 ¹³ Cに置換する炭素原子の位置は任意であり、� �化合物中に含まれる ¹³ C原子の数を変更しない範囲で式(III)に示され た位置以外の炭素原子が ¹³ Cに置換されていてもよい。上記4種の化合物� ��ら選択される2、3又は4種を組み合わせて本� ��明の方法に用いることが出来る。なお、以� ��、式(III)中に示すように、各同位体をそれ� �れPyE0、PyE3、PyE6又はPyE9と呼称し、また、こ� ��らを総称してPyE化合物と呼ぶこととする。� ��(III)中、黒丸は質量13の炭素原子を表す。す なわち、最低質量の標識化合物(化学式(PyE0))� ��全ての炭素は質量数12で、第二番目の質量� �の標識化合物(化学式(PyE3))は質量数12の炭素� ��子9個のうち3個を質量数13の炭素原子で置き 換えている。第三番目の標識化合物(化学式(P yE6))はPyE3における ¹² Cを全て ¹³ Cに置換し、かつPyE3における ¹³ Cを全て ¹² Cに置換したもので、第四番目の標識化合物(� ��学式(PyE9))はPyE0の全ての炭素原子を ¹³ Cに置換してある。そのため、4種の標識化合� ��の質量差の関係はPyE0、PyE0+3(=PyE3)、PyE0+6(=PyE 6)、PyE0+9(=PyE9)となる。また、PyE化合物におけ る前記安定同位体間の質量差は3~9である。

 更に、同様に、2,6-ジエチル-4-メチルピリ リウム・テトラフルオロホウ酸塩の好適な4� �の安定同位体の組み合わせの一例を式(IV):

に示す。但し、 ¹³ Cに置換する炭素原子の位置は任意であり、� �化合物中に含まれる ¹³ C原子の数を変更しない範囲で式(IV)に示され� ��位置以外の炭素原子が ¹³ Cに置換されていてもよい。上記4種の化合物� ��ら選択される2、3又は4種を組み合わせて本� ��明の方法に用いることが出来る。なお、以� ��、式(IV)中に示すように、各同位体をそれぞ れPydE0、PydE4、PydE6又はPydE10と呼称し、また、 これらを総称してPydE化合物と呼ぶこととす� �。式(IV)中、黒丸は質量数13の炭素原子を表� �ている。4種の標識化合物の質量差の関係はP ydE0、PydE0+4(=PydE4)、PydE0+6(=PydE6)、PydE0+10(=PydE10) となっている。また、PydE化合物における前� �安定同位体間の質量差は、2~10である。
 なお、上記のPy化合物、PyE化合物及びPydE化� ��物において、質量数13の炭素原子の位置は� �成過程から論理的に帰納されたものであり� �質量数は質量分析装置で確認されている。

 本発明の化合物によるタンパク質又はペプ� ��ドの標識は、例えば以下の文献:Craig D.B., W etzl B.K., Duerkop A., and Wolfbeis O.S., Electrophor esis, vol.26, p.2208-2213(2005)等に記載された周知 の方法により行うことができる。
 また、本発明の化合物は例えば下記の反応:  

で、タンパク質又はペプチドのリジン残基 のε-アミノ基と結合する。稀にα-アミノ基と 反応することもある。この反応により、本発 明の化合物はタンパク質又はペプチドを標識 する。

 なお、本明細書において、ペプチドとい� ��用語は、アミノ酸の個数が数個から十数個� ��ものを指す事とする。当該分野で周知のよ� ��に、標的タンパク質を同定・定量するため� ��、通常、そのタンパク質をタンパク質分解� ��素で切断することにより得られるペプチド� ��質量分析に付される。

 本発明の化合物を標識として利用する利� ��は例えば次の通りである。すなわち、前記� ��識反応は温和かつ迅速であること;前記標識 反応により4級アミンを形成し、標的タンパ� �質の電荷に影響しないため、その後の電気� �動分離も可能であること;本発明の化合物は� ��温保存が可能であること;及び、本発明の化 合物の溶液も室温で安定であること、などで ある。また、例えば前記Py化合物、PyE化合物� ��びPydE化合物でそうであったように、本発明 の化合物は、3種以上の安定同位体の組み合� �せで標識化合物として用いることが出来る� �め、最大比較対象試料数は通常3種以上であ� ��、これは多種試料間での同種のタンパク質� ��量比の分析において高い効率性をもたらす� ��更にはまた、本発明の化合物は、タンパク� ��質量分析に用いられる前記試薬(ICAT試薬、NB S試薬、iTRAQ試薬及びICPL試薬)と比較して、サ� ��プルあたりの費用が安価であるという利点� ��有する。

 本発明の方法は、対比される2種以上のタ ンパク質含有試料に対して、本発明の化合物 の2種以上の安定同位体の組み合わせを標識� �合物として用いてそれぞれの試料に含まれ� �同種のタンパク質に質量差を与えることを� �む。標識された同種のタンパク質は、試料� �で化学的性質に違いは無く、質量数のみ異� �る。そのため、後述するように、化学的性� �による分離(例えば液体クロマトグラフ、SDS- PAGE又は2次元電気泳動)によって同種のペプチ ドを他の種類のペプチドから分離し、その後 の質量分析で同種のペプチドを質量差を利用 して互いに分離することが可能となる。

 前記2種以上のタンパク質含有試料として は、例えば、同種の生体組織について、健常 状態のサンプル及び疾病状態のサンプルから 採取した計2種類の試料の場合、或いは種々� �発生段階の、ある種の細胞培養由来の試料� �どが挙げられる。

 本発明の方法の実施に当たっては、タン� ��ム型の質量分析計を用いて、タンパク質の� ��定も定量と同時に行うことが通常想定され� ��。本発明の方法に利用される質量分析計と� ��ては、例えば、四重極飛行時間型のタンデ� ��型質量分析計(MS/MS)又はフーリエ変換質量分 析計(FT-MS)などが挙げられる。これらの装置� �成としては、従来と同様なものを利用する� �とが可能である。

 本発明の化合物を用いるタンパク質の分� ��は、当業者に周知の手順に従って実施され� ��る。以下に、本発明の方法を利用してタン� ��ク質を定量するための一般的な手順を簡単� ��説明する。以下の説明では、対比するタン� ��ク質含有試料の種類数に触れていないが、� ��際は標識に用いる安定同位体の種類までの� ��料を対比することが出来、更には、後述す� ��内部標準法を用いることにより、実質的に� ��料が何種類であってもそれらを対比するこ� ��が可能となる。

 本発明の方法を利用するタンパク質の定量� ��、通常、以下の工程:
 工程1)対比するタンパク質含有試料のそれ� �れを、同位体によって異なる質量数を持つ� �発明の化合物で標識し、それぞれのタンパ� �質含有試料に含まれる同種のタンパク質に� �量差を与える工程;
 工程2)各同位体標識したタンパク質含有試� �を混合する工程;
 工程3)工程2の混合物中のタンパク質を任意� ��相互に分離した後、制限酵素によりタンパ� ��質を特定アミノ酸部位で切断し、同位体標� ��したペプチド含有試料とする工程;及び
 工程4)前記同位体標識したペプチドのMSスペ クトルを測定し、同位体標識によって質量差 を与えられた同種のペプチドのそれぞれにつ いてMSスペクトル強度を得て、その強度比に� ��ってタンパク質の量比を求める工程;
を含む。

 以下に前記各工程について詳細に説明する� ��、以下の説明は本発明の実施態様を制限す� ��ものではない。なお、本発明の方法の大ま� ��な流れを図1に示したので、より良い理解の ために適宜参照されたい。図1の分析では、� �部由来のタンパク質含有試料(前記Py0化合物( 質量M)で標識)、正常部由来のタンパク質含有 試料(前記Py4化合物(質量M+4)で標識)及びそれ� �から作製される内部標準試料(前記Py8化合物( 質量M+8)で標識)からなる3種類の試料中のタン パク質の定量を行っている。
 工程1における標識は、例えば以下のように して行う。すなわち、前以て分析される試料 中の全タンパク質のSH基を還元・アルキル化� ��ておいてから、塩基性条件下で、適当な溶� ��中(例えば、トリス塩酸緩衝液を含む尿素中 )に溶解したタンパク質含有試料に本発明の� �合物を添加し、瞬時に混合し反応させる。� �応は室温下30分間で終えても良く、又は標識 効率を増大させるために12時間まで延長して� ��良い。
 工程2において、工程1で標識した各タンパ� �質含有試料を混合する。未反応の標識化合� �はゲルろ過法又はタンパク質沈殿試薬によ� �て除去し、標識タンパク質を集めて濃縮す� �。
 工程3は、大別して以下の2つの方法:
 (a)前記タンパク質混合液を1次元ゲル分離、 2次元ゲル分離又は適当なクロマトメディア� �大まかに分離するなどしたタンパク質をタ� �パク質分解酵素で加水分解し、ペプチドを� �離する;又は、
 (b)前以て(a)のように含有タンパク質を相互� ��離のためにゲル分離やクロマト展開するこ� ��なく、前記タンパク質混合物を直接タンパ� ��質分解酵素で分解する、
のいずれかに従う。タンパク質の分解のため には、一次選択のトリプシン以外に、Argペプ チダーゼやGluペプチダーゼなどを二次選択と して用いるが、Lysエンドペプチダーゼは用い ない。

 ペプチドを遊離した後、該ペプチドを質量� ��析に付すまでの流れは以下の通りである。� ��なわち、
 (a)の操作により分離したタンパク質から遊� ��した標識ペプチド及び非標識ペプチドにつ� ��ては、ペプチドの分離操作無しで直接MALDI-T OF/MSにより質量分析する場合もある。また、� ��体クロマトグラフによりペプチドを分離後� ��ESI/MS/MS分析することも可能である。
 一方(b)の操作により遊離したペプチドは、2 次元液体クロマトグラフシステムによって、 例えば、1次元分離をSCXカラムで行い、溶出� �た成分を第2の逆相樹脂カラムにより分離し� ��ESI/MS/MSに導入することで、標識ペプチドの� ��対強度とそのアミノ酸配列情報を一度の分� ��で獲得する。
 ここで、次工程のMSスペクトルの測定に用� �るペプチドの分子量は、特に限定されない� �、天然に存在する同位体元素の影響による� �析精度の低下を考慮すると、該分子量は好� �しくは1000~3000であり、より好ましくは1500~200 0である。従って、工程3は、好ましくは、タ� ��パク質の分解酵素分解産物から、上記範囲� ��分子量を有するペプチドを単離することを� ��む。

 次いで、周知の分析技術を用いて前記ペプ� ��ド由来のMSスペクトルを得ることが出来る� �同位体標識によって、異なる試料由来の同� �のペプチドは異なる質量を持つため、前記MS スペクトルデータにおいては、異なる試料由 来のペプチドは分離したピークとして現れる 。従って、それら分離したピークの強度を対 比することにより、前記ペプチドの試料間で の量比、すなわち前記タンパク質の試料間で の量比が求まる。
 但し、前述のMSスペクトルデータからのピ� �ク強度の対比においては、例えば特開2005-181 011に教示されているようにして、天然に存在 する同位体元素に起因するペプチドの同位体 ピークとの重なりを除去して量比の補正をす る必要がある。

 更に、前記工程1~4に引き続いて以下の工程:
工程5)工程4のMSスペクトルを参照して、各ペ� ��チドからアミノ酸配列を特定すべきペプチ� ��を選択し、該ペプチドから生成されるプロ� ��クトイオンのMS/MSスペクトルによって、該� �プチドのアミノ酸配列を定性する工程;及び
 工程6)前記ペプチドのアミノ酸配列に基づ� �、既知DNA配列より対応するタンパク質を同� �する工程;
も加えることにより、前記タンパク質を同定 することも可能である。タンパク質の同定は 、工程5及び6に示した手順に従って、周知の� ��法で行うことが出来る。

 本発明の実施態様の一つにおいて、上述� ��た本発明によるタンパク質分析方法であっ� ��、質量分析されるタンパク質を含有する内� ��標準試料もまた本発明の化合物の安定同位� ��の一つで標識して質量分析に付すこと、及� ��内部標準試料由来のMSスペクトル強度に対� �るタンパク質含有試料由来のMSスペクトル強 度の比を求めることにより、それぞれのタン パク質含有試料に含まれる同種のタンパク質 の量比を決定することを含む、タンパク質分 析方法もまた提供される。

 本明細書において、内部標準試料という� ��語は、同種のタンパク質の試料間での量比� ��分析するに当たって、内部標準試料以外の� ��試料中での該タンパク質の量と内部標準試� ��中の該タンパク質の量とを比較することに� ��り各試料中での含有量の相対値を求め、そ� ��相対値を試料間で対比することにより、分� ��される全試料間での該タンパク質の量比を� ��定するために利用される試料をいう。

 上記目的のために、内部標準試料は、分� ��される試料中に存在するあらゆるタンパク� ��を含むことが好ましい。そのため、例えば� ��下のようにして内部標準試料は作製される� ��すなわち、分析される全てのタンパク質含� ��試料から総タンパク質含有量が等しい出発� ��料をそれぞれ作製した後、該出発試料を等� ��混合する。

 内部標準試料を用いるタンパク質分析は� ��内部標準試料もまた本発明の化合物の安定� ��位体の一つで標識して、分析される他のタ� ��パク質含有試料と共に上述した本発明によ� ��タンパク質分析方法を適用することによっ� ��なされる。

 内部標準試料を使用することにより、本� ��明の方法に用いる標識化合物の安定同位体� ��種類数より多くの種類の試料を定量するこ� ��が可能となる。また、内部標準試料を利用� ��ることにより、複数試料間でのタンパク質� ��含有量の比較が高い精度で可能となる。

 図2に多種類試料間での同種のタンパク質の 量比を分析する手順の一例を示す。図2の分� �は、説明の便宜上、その試料数は6であり、� ��つ標識に用いる安定同位体の組み合わせは4 種である場合を想定している。
 まず、6種類の試料から前述のようにして内 部標準試料(図2ではISと表記)を作製する。ま� ��、6種類の試料をそれぞれ3種類の試料から� �るグループ1(試料A、B、Cを含む)及びグルー� �2(試料D、E、Fを含む)に分別する。前述した� �順に従って、標的タンパク質由来のペプチ� �のMSスペクトルの測定をグループ毎に行う。 その結果得られるのが、図2の下部にあるよ� �なMSスペクトルである。前述の通り、標識ペ プチドのMSスペクトルはペプチド中の天然同� ��体存在比を反映して質量1ずつ異なる複雑な ものであり、その補正をする必要がある。前 記補正後の最大強度のスペクトル(例えば図2� ��A1、B1及びC1について前記補正をしたもの)は 天然同位体の存在の影響が無く、ペプチドの 存在量を反映している。また、内部標準試料 由来の標識ペプチドのMSスペクトル強度を各� ��ループの分析での共通の比較の基準とする� ��めに、混合試料作製にあたって内部標準試� ��から分析毎に等量加える。内部標準試料由� ��のペプチドのMSスペクトル強度は理論的に� �両グループの測定で等しいので、前記補正� �たIS1の強度で前記補正したA、B及びCの強度� �規格化し、また同様に前記補正したIS2の強� �で前記補正したD、E及びFの強度を規格化し� �ものは、共通の基準で規格化したものとな� �相互に比較することが出来る。この比較か� �6種類の試料間での標的タンパク質の量比が� ��まる。

 本発明の化合物は、3種以上の安定同位体の 組み合わせで標識化合物として用いることが 出来るため、2種の安定同位体のみの標識化� �物と比較して、内部標準試料を利用する多� �試料間での同種のタンパク質の量比の分析� �おいて、顕著に向上した能率を示すことは� �らかである。それゆえ、本発明の方法は、� �えば以下の用途:
 (1)多数患者の臨床試料における病気のマー� ��ータンパク質の発見と変動の解析(臨床検査 );
 (2)ヒトや動物の様々の組織で発現している� ��ンパク質の存在比の網羅的比較解析(生化学 );
 (3)培養細胞や動物に薬剤を投与した後での� ��胞内での発現タンパク質の存在量の時系列� ��化の解析;及び
 (4)発生段階における発現タンパク質の詳細� ��時系列変動の解析(発生工学)、
など、他種試料の網羅的プロテオミクス解析 の必要な場合において、非常に有用である。

 別の局面において、本発明はまた、上述� ��たタンパク質分析方法に用いられる試薬キ� ��トであって、標識化合物として式(I)で表さ� ��る化合物又はその塩の2種以上の安定同位体 の組み合わせを含む、キットを提供する。式 (I)で表される化合物又はその塩に関する定義 、安定同位体や組み合わせの態様は上述の通 りである。

 前記キットに含まれる式(I)の化合物の例と� ��ては:
 (a)前記Py0化合物、Py4化合物及びPy8化合物か� ��選択される2又は3種の組み合わせ;
 (b)前記PyE0化合物、PyE3化合物、PyE6化合物及� ��PyE9化合物から選択される2、3又は4種の組み 合わせ;及び
 (c)前記PydE0化合物、PydE4化合物、PydE6化合物� ��びPydE10化合物から選択される2、3又は4種の� ��み合わせ
が挙げられる。

 本発明の一つの実施態様において、前記� ��ットに含まれる式(I)の化合物は、2,4,6-トリ� ��チルピリリウムである。

 本発明の別の実施態様において、前記キ� ��トにおける前記組み合わせに含まれる安定� ��位体間の質量差は2以上である。

 前記キットは、前記安定同位体の組み合� ��せ以外に、1種以上のタンパク質分解酵素、 反応緩衝液、洗浄溶液、又は本発明の化合物 との組み合わせ使用に必要若しくは好適なそ の他の成分を含んでいても良い。前記キット はまた、任意でその使用説明書を含む。また 、本発明のキットは、未反応成分除去試薬(� �浄試薬)、制限酵素、ペプチド精製用カラム� ��精製用溶媒などを更に含んでいてもよい。

 本明細書中で挙げられた特許及び特許出� ��明細書を含む全ての刊行物に記載された内� ��は、本明細書での引用により、その全てが� ��示されたと同程度に本明細書に組み込まれ� ��ものである。

 以下に実施例を挙げ、本発明を更に詳し� ��説明するが、本発明は下記実施例等に何ら� ��限されるものではない。