Die Erfindung betrifft insbesondere neue hochselektive und hochaktive Inhibitoren des Urokinase-Plasminogenaktivators (uPA, EC 3.4. 21. 31) vom Arylguanidintyp.

Der Plasminogenaktivator von Urokinase-Typ (uPA) spielt eine Schlüsselrolle bei der Tumorinvasion und Metastasenbildung (Schmitt et al., J. Obst. Gyn. 21 (1995), 151-165). uPA wird in verschiedenen Arten von Tumorzellen überexprimiert (Kwaan, Cancer Metastasis Rev. 11 (1992), 291-311) und bindet an den Tumor-assoziierten uPA-Rezeptor (uPA-R), wo die Aktivierung von Plasminogen zu Plasmin stattfindet.

Plasmin ist in der Lage, verschiedene Komponenten der extrazellulären Matrix (ECM) wie Fibronectin, Laminin und Kollagen Typ IV abzubauen. Es aktiviert auch einige andere ECM-abbauende Enzyme, insbesondere Matrix-Metalloproteinasen. Hohe Mengen an Tumor-assoziiertem uPA korrelieren mit einem höheren Metastasierungsrisiko für Krebspatienten (Stephens et al., Breast Cancer Res. & Treat. 52 (1998), 99-111). Eine Hemmung der proteolytischen Aktivität von uPA ist daher ein guter Ansatzpunkt für eine anti-metastatische Therapie.

Ein gemeinsames Merkmal vieler bekannter synthetischer uPA-Inhibitoren ist ein basischer Rest, der Amidino-oder Guanidino-Gruppen enthält, und an Asp'89 in der S1-Spezifitätstasche von uPA binden kann und dort als Arginin-Mimetikum wirkt (Spraggon et al., Structure 3 (1995), 681-691).

Die meisten der bekannten Inhibitoren sind jedoch nicht selektiv für uPA, sondern hemmen auch andere Serinproteasen wie Trypsin, Thrombin, Plasmin oder Gewebs-Plasminogenaktivator (tPA). p-Aminobenzamidin ist ein moderat selektiver uPA-Inhibitor mit einer Hemmkonstante von 82 uM. Billstroem et al. (Int. J. Cancer 61 (1995), 542-547) konnten eine deutliche Abnahme der Wachstumsrate von DU 145 Tumoren (eine Prostata-Adenokarzinom-Zellinie) in SCID Mäusen bei oraler Verabreichung in einer Tagesdosis von 125 bis 250 mg p-Aminobenzami- din/kg/Tag zeigen. Die Nebenwirkungen waren vernachlässigbar gering.

Einige monosubstituierte Phenylguanidine haben sich als wirksame und selektive uPA Inhibitoren in vitro erwiesen. Diese kleinen Moleküle zeigen Inhibierungskonstanten im Mikromolarbereich, sie binden jedoch nur in der S1 Tasche von uPA (Yang et al., J. Med. Chem. 33 (1990), 2956-2961).

Biologische Untersuchungen mit diesen Verbindungen wurden nicht durchgeführt.

Das Diuretikum Amilorid ist ein selektiver uPA-Inhibitor (Ki, uPA = 7, uM), der die Bildung von Lungenmetastasen nach i. v. Inokulation von Ratten-Brustadenokarzinomzellen verhindert (Kellen et al., Anticancer Res.

8 (1988), 1373-1376). Einige Derivate von 3-Amidino-phenylalanin haben sich ebenfalls als wirksame Inhibitoren von Serinproteasen erwiesen, diese Verbindungen weisen jedoch im allgemeinen nur eine geringe Selektivität für uPA auf (Stürzebecher et al., J. Med. Chem. 40 (1997), 3091-3099 ; Stürzebecher et al., J. Enzyme Inhib. 9 (1995), 87-99).

Bekannte uPA-Inhibitoren sind Derivate von Benzo [b] thiophen-2-carboxamidin (B428 und B623 : Kj, uPA = 0,32 bzw.

0, 07, uM ; US-Patent 5,340, 833). Rabbani et al. (Int. J. Cancer 63 (1995), 840-845) sowie Xing et al. (Cancer Res. 57 (1997), 3585-3593) konnten nach Verabreichung von 4-lod-benzo [b]-thiophen-2-carboxamidin (B428)

eine Abnahme des Tumorwachstums und der Metastasenbildung in einem syngenen Modell für Ratten-Prostatakarzinom bzw. Maus-Mammakarzinom zeigen. Letztere Untersuchungen zeigten eine weitere Abnahme des Primärtumorwachstums bei gemeinsamer Verabreichung von B428 mit dem Antiöstrogen Tamoxifen.

Die deutsche Patentanmeldung 199 40 389.9 schlägt die Verwendung von Arylguanidin-und insbesondere Phenylguanidin-Derivaten als selektive uPA-Inhibitoren vor. Diese Verbindungen enthalten einen weiteren Substituenten am aromatischen Ringsystem, vorzugsweise in Para-Position zur Guanidingruppe, der eine gegebenenfalls substituierte Methylengruppe gefolgt von Wasserstoffdonor/Akzeptorfunktionalitäten enthält. Aufgrund dieses Substitutionsmusters weisen die Verbindungen eine besonders hohe Wirksamkeit und Selektivität für uPA auf. Von diesen Verbindungen wird angenommen, dass sie als Arginin-Mimetikum mit dem Aminosäurerest Asp189 in der S1-Tasche von uPA wechselwirken und eine Wechselwirkung mit der S2-und/oder S3-Tasche von uPA eingehen können.

Die deutsche Patentanmeldung 100 13 715.6 beschreibt weitere Aryl- Guanidin-Derivate, die eine noch spezifischere Wechselwirkung mit uPA, insbesondere mit den Aminosäureresten Gln'92 und/oder Ser2'4 eingehen können. Diese Verbindungen enthalten neben der Guanidin-Gruppe einen weiteren Substituenten am aromatischen Ringsystem, der eine gegebenenfalls substituierte Methylengruppe gefolgt von einer Wasserstoffdonor-, einer Wasserstoffakzeptor-und wiederum einer Wasserstoffdonorfunktionalität enthält.

Die internationale Patentanmeldung WO 00/04954 beschreibt Arylamidin- Derivate, insbesondere Amidinophenylalanin-Derivate als Urokinaseinhibitoren.

Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung war die Bereitstellung neuer hochselektiver und hochaktiver Inhibitoren des Urokinase- Plasminogenaktivators.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch die Verwendung von Verbindungen der allgemeinen Formel 1 worin Ar ein aromatisches oder heteroaromatisches Ringsystem bedeutet, E bedeutet oder Ar und E zusammen einen Rest bilden, worin Z 0, NH oder C=0 und X4 C = 0, HN oder CH2 sein kann und W N, CR3 oder CR und X'CH, CR, CR oder N sein kann, B-SO2-,-CR32-,-NR3-oder-NH-bedeutet,

X'NR'3R4, OR3, SR3, COOR3, CONR3R4 oder COR5 bedeutet, R'H, einen gegebenenfalls substituierten Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Aryl-, Heteroarylrest oder COOR, CoNR3R4 oder COR5 bedeutet, R2 Halogen, C (R6) 3, C2 (R5) 5, OC (R6) 3 oder OC2 (R6) 5 bedeutet, R3 jeweils unabhängig H oder einen beliebigen organischen Rest bedeutet, R'3 eine Gruppe der allgemeinen Formel (fla) oder (IIb) bedeutet, X2 NH, NR4, 0 oder S bedeutet, X3 NH, NR4, O, S, CO, COO, CONH oder CONR4 bedeutet, Y C (R8) 2, NH oder NR3 bedeutet, R4 H oder einen verzweigt oder unverzweigten, gegebenenfalls substituierten Alkyl-, Alkenyl-oder Alkinylrest bedeutet, R5 H, einen Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Carboxy-alkyl-, Carboxy-alkenyl-, Carboxyl-alkinyl-, Carboxy-aryl-, Carboxy-heteroaryl-,- (CO) NR3R4 oder -COO-R3 bedeutet, wobei die Alkyl-, Aryl-und Heteroarylreste gegebenenfalls substituiert sein können, R6 jeweils unabhängig H oder Halogen, insbesondere F, ist, R7 H oder einen gegebenenfalls substituierten Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Aryl-oder Heteroarylrest oder -COR9 bedeutet,

R8 jeweils unabhängig H, oder einen verzweigten oder unverzweigten, gegebenenfalls substituierten Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Aryl-, Heteroaryl-, Aralkyl-, Alkylaryl-, Heteroaralkyl-Rest oder/und einen substituierten oder unsubstituierten bi-oder polycyclischen Rest bedeutet, R9 H oder einen verzweigten oder unverzweigten, gegebenenfalls substituierten Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Aryl-oder/und Heteroarylrest bedeutet, R'° einen Rest (C(R1)2)o-X3R5 bedeutet, insbesondere -CH2-OH, R"H, einen Carbonylrest-CO-R'2, einen Carbonamidrest-CONR'22, einen Oxycarbonylrest-COO-R'2 oder besonders bevorzugt einen Sulfonylrest-SO2R'2 bedeutet, R12 H, einen verzweigten oder unverzweigten, substituierten oder unsubstituierten Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Aryl-oder Heteroarylrest oder einen substituierten oder unsubstituierten cyclischen Alkylrest oder einen substituierten oder unsubstituierten Aralkyl-, Alkylaryl- oder Heteroaralkylrest oder einen substituierten oder unsubstituierten bi-oder polycyclischen Rest bedeutet, R'5 C = X2, NR3 oder CR32 darstellt, n eine ganze Zahl von 0 bis 2 ist, m eine ganze Zahl von 0 bis 5 ist, o eine ganze Zahl von 1 bis 5 ist, p eine ganze Zahl von 1 bis 5 ist, oder Salzen dieser Verbindungen zur Herstellung eines Mittels zur Hemmung des Urokinase-Plasminogenaktivators.

Bevorzugt sind Verbindungen der allgemeinen Formel 111

worin Ar ein aromatisches oder heteroaromatisches Ringsystem bedeutet, X1 NR13R4, OR3, SR3, COOR3, CONR3R4 oder COR5 bedeutet, R'H, einen gegebenenfalls substituierten Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Aryl-, Heteroarylrest oder COOR, CONR3R4 oder COR5 bedeutet, R2 Halogen, C (R6) 3, C2(R6)5, OC (R6) 3 oder OC2 (R6) 5 bedeutet, R3 H oder einen beliebigen organischen Rest bedeutet, R'3 eine Gruppe der allgemeinen Formel (IVa) oder (IVb) bedeutet,

X2 NH, NR4, 0 oder S bedeutet, X3 NH, NR4, O, S, CO, COO, CONH oder CONR bedeutet, Y C (R3) 2, NH oder NR3 bedeutet, R4 H oder einen verzweigt oder unverzweigten, gegebenenfalls substituierten Alkyl-, Alkenyl-oder Alkinylrest bedeutet, R5 H, einen Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Carboxy-alkyl-, Carboxy- alkenyl-, Carboxyl-alkinyl-, Carboxy-aryl-, Carboxy-heteroaryl-, - (CO) NR3R4 oder-COO-R3 bedeutet, wobei die Alkyl-, Aryl- und Heteroarylreste gegebenenfalls substituiert sein können, R6 jeweils unabhängig H oder Halogen, insbesondere F, ist, R'H oder einen gegebenenfalls substituierten Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Aryl-oder Heteroarylrest oder-COR9 bedeutet, R8 jeweils unabhängig H, Halogen oder einen verzweigten oder unverzweigten, gegebenenfalls substituierten Alkyl-, Alkinyl-, Aryl-, Heterarylrest oder/und ein (CH2) m-OH bedeutet, R9 H oder einen verzweigten oder unverzweigten, gegebenenfalls substituierten Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Aryl-oder/und Heteroarylrest bedeutet, R'° einen Rest (C (R') o-X3R5 bedeutet, insbesondere -CH2-OH, R"H, einen Carbonylrest-CO-R'2, einen Oxycarbonylrest-COO- R12 oder besonders bevorzugt einen Sulfonylrest -SO2R12 bedeutet, R12 einen verzweigten oder unverzweigten, substituierten oder unsubstituierten Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Aryl-oder Heteroarylrest oder einen substituierten oder unsubstituierten cyclischen Alkylrest oder einen substituierten oder unsubstituierten Aralkyl-, Alkylaryl-oder Heteroaralkylrest oder einen substituierten oder unsubstituierten bi-oder polycyclischen Rest bedeutet,

n eine ganze Zahl von 0 bis 2 ist, m eine ganze Zahl von 0 bis 5 ist, o eine ganze Zahl von 1 bis 5 ist, oder Salzen dieser Verbindungen zur Herstellung eines Mittels zur Hemmung des Urokinase-Plasminogenaktivators.

Die Verbindungen können als Salze, vorzugsweise als physiologisch verträgliche Säuresalze, z. B. als Salze von Mineralsäuren, besonders bevorzugt als Hydrochloride oder als Salze von geeigneten organischen Säuren vorliegen. Die Guanidiniumgruppe kann gegebenenfalls Schutzfunktionen tragen, die vorzugsweise unter physiologischen Bedingungen abspaltbar sind. Die Verbindungen können als optisch reine Verbindungen oder als Gemische von Enantiomeren oder/und Diastereoisomeren vorliegen.

Das Ringsystem Ar enthält vorzugsweise 4 bis 30, insbesondere 5 bis 10 C-Atome. In den Verbindungen der allgemeinen Formel (I) oder (III) ist Ar vorzugsweise ein aromatisches oder heteroaromatisches Ringsystem mit einem Ring. Weiterhin bevorzugt sind Verbindungen, in denen Ar und E zusammen ein bicyclisches System bilden. Heteroaromatische Systeme enthalten bevorzugt ein oder mehrere O-, S-oder/und N-Atome. Ein bevorzugtes aromatisches Ringsystem ist ein Benzolring, bevorzugte heteroaromatische Ringsysteme sind Pyridinyl, Pyrimidinyl oder Pyrazinyl, insbesondere mit Stickstoff an Position 2. Bevorzugte bicyclische Ringsysteme sind solche mit Stickstoff oder Sauerstoff an den Positionen Z oder W. Am meisten bevorzugt ist Ar ein Benzolring.

Besonders bevorzugt sind Verbindungen mit den Strukturelementen

(R < NH\/NH2 % < NH2 , I NH NH ftl oder O (R2) m 9 insbesondere Z\rNH NH NH 0 0-- 7 HN\ -NH oder N H lu NH NH zizi oder Il I NH NH In den Verbindungen der allgemeinen Formel (I) oder (III) sind in dem Ringsystem Ar die Substituenten B, z. B. CHX'R'und E, z. B. NHC (NH) NH2 (Guanidino) oder NH2CNH (Amidino) vorzugsweise in Meta-oder Para-Position und besonders bevorzugt in Para-Position zueinander angeordnet. Darüber hinaus kann Ar noch ein oder mehrere weitere von Wasserstoff verschiedene Substituenten R2 enthalten. Vorzugsweise ist die

Anzahl der Substituenten R2 O, 1,2 oder 3, besonders bevorzugt 0 oder 1 und am meisten bevorzugt 0. R2 kann Halogen, C (R6)3, C2(R6)5, OC (R6) 3 oder OC2 (R6) 5 bedeuten ; wobei R6 jeweils unabhängig H oder Halogen, insbesondere F ist. Bevorzugte Beispiele für R2 sind Halogenatome (F, Cl, Br oder 1), CH3, CF3, OH, OCH3 oder OCF3.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen, enthaltend eine Guanidinogruppe, sind durch eine hohe Selektivität ausgezeichnet. Deshalb ist oftmals E vorzugsweise-NH-C (NH)-NH2.

Für die Inhibitoraktivität ist der Substituent B in Formel (I) bzw.-CHX'R'in Formel (III) von Bedeutung. Vorzugsweise wird B aus-SO2-,-NR3-,-NH- oder/und-CR32-, insbesondere-CR'2-ausgewählt.

R1 kann H oder ein gegebenenfalls substituierter Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Aryl-oder/und Heteroarylrest oder COOR3, CONR3R4 oder COR5 sein. Am meisten bevorzugt ist R'H.

Soweit nicht anders angegeben, ist ein Alkylrest wie hierin verwendet, bevorzugt eine geradkettige oder verzweigte C,-C30-Alkylgruppe, bevorzugt eine C,-C, o-Alkylgruppe, insbesondere eine C1-C4-Alkylgruppe, oder eine C3- C30-Cycloalkylgruppe, insbesondere eine C3-C8-Cycloalkylgruppe, die beispielsweise mit C1-C3-Alkoxy, Hydroxyl, Carboxyl, Amino, Sulfonyl, Nitro, Cyano, Oxo oder/und Halogen, aber auch mit Aryl-oder Heteroarylresten substituiert sein kann. Alkenyl-und Alkinylreste sind hierin, soweit nicht anders angegeben, vorzugsweise C2-C1O-Gruppen, insbesondere C2-C4-Gruppen, die gegebenenfalls wie zuvor angegeben substituiert sein können. Aryl-und Heteroarylreste können beispielsweise mit C1-C6-Alkyl, C1-C3-Alkoxy-Hydroxyl, Carboxyl, Sulfonyl, Nitro, Cyano oder/und Oxo substituiert sein. Aryl-bzw. Heteroarylreste enthalten vorzugsweise 3 bis 30, insbesondere 4 bis 20, bevorzugt 5 bis 15, am meisten bevorzugt 6 bis 10 C-Atome.

X'steht bevorzugt für NR'3R.

R3 kann H oder einen beliebigen organischen Rest bedeuten. Bei dem organischen Rest handelt es sich insbesondere um einen Rest mit 1 bis 30 Kohlenstoffatomen. Dieser Rest kann gesättigt oder ungesättigt, linear, verzweigt oder cyclisch sein und gegebenenfalls Substituenten enthalten.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist R3 = H, insbesondere in der Gruppe B =-CR32-.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform stellt B die Gruppierung -SO2-dar, sodass es sich um Sulfoverbindungen handelt. Die Gruppe ist dabei isoster zur CH2-Gruppe. Durch den Austausch der CH2-Gruppe durch die isostere SO2-Gruppe werden zusätzliche H-Brücken zu NH- Gruppen von Gly 193, Asp 194 und Ser 195 von Urokinase möglich, was zu einer weiteren Verbesserung der inhibitorischen Aktivität führt (vgl.

Abbildung 1).

R13 stellt eine Gruppe der Formel (Ila) oder (IIb) dar. In Formel (IIa) bedeutet R15 C=X2 oder CR3, wobei X2 NH, NR4, O oder S ist und X3 NH, NR4, O, S, CO, COO, CONH oder CONR4. Y stellt C (R8) 2, NH oder NR3 dar. R4 wiederum bedeutet H oder einen verzweigten oder unverzweigten, gegebenenfalls substituierten Alkyl-, Alkenyl-oder

Alkinylrest. R7 bedeutet H oder einen gegebenenfalls substituierten Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Aryl-oder Heteroarylrest oder-COR9, wobei R9 wiederum H oder einen verzweigten oder unverzweigten, gegebenenfalls substituierten Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Aryl-oder/und Heteroarylrest darstellt.

Bevorzugt stellt R13 eine Gruppe der Formel (IIb dar.

Weiterhin bevorzugt, insbesondere in Verbindungen der Formel (III) stellt R13 eine Gruppe der Formel (Vla) oder (Vlb) dar. In Formel (IVa) bedeutet x2 vorzugsweise NH, NR4, 0 oder S, insbesondere O und X3 NH, NR4, O, S, CO, COO, CONH oder CONR4. Y stellt C (R8) 2, NH oder NR3 dar. R4 wiederum bedeutet H oder einen verzweigten oder unverzweigten, gegebenenfalls substituierten Alkyl-, Alkenyl-oder Alkinylrest. R'bedeutet H oder einen gegebenenfalls substituierten Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Aryl-oder Heteroarylrest oder- COR9, wobei R9 wiederum H oder einen verzweigten oder unverzweigten, gegebenenfalls substituierten Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Aryl-oder/und

Heteroarylrest darstellt. Bevorzugt stellt R'3 in Verbindungen der Formel (III) eine Gruppe der Formel (IVb) dar.

R8 ist bevorzugt Wasserstoff oder (CH2) m-OH, besonders bevorzugt H. R10 stellt einen Rest (CRR1) 2) o-X3R5 dar. In diesem Fall ist R'besonders bevorzugt Wasserstoff, X3 besonders bevorzugt Sauerstoff, R5 besonders bevorzugt Wasserstoff und o besonders bevorzugt 1.

R"stellt besonders bevorzugt einen Sulfonylrest -SO2-R12 dar, wobei R12 bevorzugt ein Aralkylrest, insbesondere ein Benzylrest ist. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist der Benzylrest an meta- und/oder para-Position und Halogen substituiert, am meisten bevorzugt mit Cl-. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist R12 ein Adamantyl- oder Kampferrest.

R'5 stellt besonders bevorzugt einen Carbonylrest-CO, Aminrest-NR3- oder/und Alkylrest-CR32, bevorzugt-CR'2-und am meisten bevorzugt-CH2- dar. Verbindungen, in denen Rls CH2 darstellt, zeichnen sich insbesondere durch eine einfache Synthese aus. Da diese Position nicht in die Bildung von H-Brücken mit der Urokinase involviert ist, kann anstelle eines Carbonyls ohne weiteres eine CH2-Gruppe vorhanden sein, ohne dass damit ein Verlust an inhibitorischer Aktivität verbunden wäre.

Weiterhin bevorzugt sind Verbindungen, welche als Baustein eine nicht natürliche Aminosäure enthalten, welche insbesondere den Rest R'° ausmacht. Weiterhin bevorzugt sind Azaverbindungen mit der Gruppierung NH-NH, in denen z. B. Y=NH und n=1 (Verbindungen der Formel IIb).

Weitere besonders bevorzugte Verbindungen sind Bisulfonamide, also Verbindungen, welche zweimal das Element-S02-NH-enthalten. Weiterhin bevorzugt sind Verbindungen, in denen R'3 eine Gruppe der Formel Ilb

darstellt und Y für-C (R3) 2-steht, wobei R8 einmal H darstellt und einmal einen Rest darstellt, welcher eine aromatische Gruppe enthält, insbesondere-CH2-CH2-C6H5.

Weiterhin bevorzugt sind Verbindungen, in denen X'die Bedeutung hat.

Am meisten bevorzugt sind die Verbindungen N- [2- (4-Guanidino- benzolsulfonylamino)-ethyl]-3-hydroxy-2-phenylmethansulfonyl amino- propionamid Hydrochlorid, Bz-S02- (D)-Ser- (Aza-Gly)-4-Guanidino- benzylamid Hydrochlorid oder N- (4-Guanidino-benzyl)-2- (3-hydroxy-2- phenylmethan-sulfonylamino-propionylamino)-4-phenyl-butyrami d Hydrochlorid sowie N- [ (4-Guanidino-benzylcarbamoyl)-methyl]-3-hydroxy-2- phenylmethansulfonylaminopropionamid (siehe auch Figur 2 : WX-508).

Weitere bevorzugte Verbindungen sind 3-Nitrobenzyl-sulfonyl- (D)-Ser-Gly- (4-Guanidinobenzyl) amid Hydrochlorid (WXC-316), 3-Chlorbenzyl-sulfonyl- (D)-Ser-Gly- (4-Guanidinobenzyl) amid Hydrochlorid (WXC-318), 4- Chlorbenzyl-sulfonyl- (D)-Ser-Gly- (4-Guanidinobenzyl) amid Hydrochlorid (WXC-340), Benzylsulfonyl- (D)-Ser-Ala- (4-Guanidinobenzyl) amid Hydrochlorid (WX-532), 4-Chlorbenzylsulfonyl- (d)-Ser-N-Me-Ala- (4- Guanidinobenzyl) amid (WX-582) oder Benzylsulfonyl- (D)-Ser-N-Me-Gly- (4- Guanidinobenzylamid (WX-538).

Die Verbindungen der allgemeinen Formel (1) können beispielsweise wie in den Syntheseschemata in Figur 2 und Figur 3 a, b und c am Beispiel der besonders bevorzugten Verbindungen gezeigt, hergestellt werden.

Die erfindungsgemäßen Urokinaseinhibitoren können gegebenenfalls zusammen mit geeigneten pharmazeutischen Hilfs-oder Trägerstoffen zur Herstellung von Arzneimitteln oder in der Diagnostik verwendet werden.

Dabei ist eine Verabreichung in Kombination mit anderen Wirkstoffen, z. B. anderen Urokinaseinhibitoren, wie etwa Antikörpern oder/und Peptiden, aber auch mit Chemotherapeutika und Zytostatika oder/und zytostatischen Wirkstoffen möglich.

Die Arzneimittel können bei Menschen und Tieren topisch, oral, rektal oder parenteral, z. B. intravenös, subkutan, intramuskulär, intraperitoneal, sublingual, nasal oder/und inhalativ, z. B. in Form von Tabletten, Dragees, Kapseln, Pellets, Suppositorien, Lösungen, Emulsionen, Suspensionen, Liposomen, Inhalationssprays oder transdermalen Systemen, wie Pflastern, verabreicht werden.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind zur Bekämpfung von Krankheiten geeignet, die mit einer pathologischen Überexpression von uPA oder/und Urokinase-Plasminogenaktivatorrezeptor (uPAR) assoziiert sind.

Sie sind beispielsweise in der Lage, hocheffizient das Wachstum oder/und die Ausbreitung der malignen Tumoren sowie die Metastasierung von Tumoren zu hemmen. Dabei können die uPA-Inhibitoren gegebenenfalls zusammen mit anderen Tumormitteln oder mit anderen Behandlungsarten, z. B. Bestrahlung oder chirurgischen Eingriffen, eingesetzt werden.

Weiterhin sind die erfindungsgemäßen Inhibitoren auch für andere uPA-assoziierte oder/und uPAR-assoziierte Erkrankungen wirksam.

Erfindungsgemäße uPA-Inhibitoren sind vorzugsweise dadurch gekennzeichnet, daß sie mindestens einen zweifach, vorzugsweise mindestens einen fünffach und besonders bevorzugt einen mindestens 10- und bis zu 1. 000-fach geringeren Kj-Wert für uPA gegenüber tPA, Plasmin oder/und Thrombin aufweisen. Weiterhin ist bemerkenswert, dass die erfindungsgemäßen Verbindungen die Blutgerinnung nur geringfügig

beeinflussen, da sie für eine effektive Hemmung von Thrombin, Plasmin und Faktor Xa zu hohe K,-Werte haben.

Die erfindungsgemäßen Substanzen der Formel (I) bzw. Formel (III) können in Kombination mit physiologisch wirksamen Substanzen eingesetzt werden, z. B. mit Radiomarkierungen oder mit zytotoxischen Mitteln, z. B.

Chemotherapeutika wie cis-Platin oder 5-Fluor-uracil, oder Peptiden.

Weiterhin können die Substanzen auch in die Membran von Trägervesikeln, z. B. Liposomen, eingebaut werden oder/und zusammen mit in den Trägervesikeln eingeschlossenen Wirksubstanzen, z. B. zytotoxischen Mitteln, wie etwa Doxorubicin, verabreicht werden.

Durch die Erfindung wird ein Verfahren zur Urokinasehemmung bei Lebewesen, insbesondere bei Menschen, durch Verabreichung einer wirksamen Menge mindestens einer Verbindung der allgemeinen Formel (1) bereitgestellt. Die Dosierung der Verbindung liegt üblicherweise im Bereich von 0,01 bis 100 mg/kg Körpergewicht pro Tag. Die Dauer der Behandlung hängt von der Schwere der Erkrankung ab und kann von einer einmaligen Gabe bis zu einer mehrwöchigen oder sogar mehrmonatigen Behandlung, die gegebenenfalls in Intervallen wiederholt werden kann, reichen.

Schließlich betrifft die Erfindung neue basische Phenylalaninderivate der allgemeinen Formeln (I) bzw. (III).

Die Erfindung soll durch die folgenden Beispiele und die beigefügten Figuren näher erläutert werden.

Figur 1 zeigt die Wechselwirkungen zwischen erfindungsgemäßen Inhibitoren, in denen B eine Gruppe darstellt mit Urokinase. Zu sehen sind die ausbildeten Wasserstoffbrücken zwischen der Gruppe und den NH-Gruppen im Grundgerüst der Urokinase von Gly 193, Asp 194 und Ser 195.

Figur 2 zeigt ein Syntheseschema zur Herstellung der besonders bevorzugten Verbindung N- [ (4-Guanidino-benzylcarbamoyl)-methyl]-3- hydroxy-2-phenylmethansulfonylaminopropionamid (WX-508). Die Verbindungen der Formel (I) können gemäß diesem allgemeinen Reaktionsschema, ausgehend von p-Amino-benzylamin, hergestelltwerden.

In Figur 2 bedeutet Z die Schutzgruppe Benzyloxycarbonyl und Boc die Schutzgruppe tert-Butyloxycarbonyl.

Figur 3 zeigt Syntheseschemata zur Herstellung der besonders bevorzugten Verbindungen WX-550 (Figur 3a), WX-544 (Figur 3b) und WX-568 (Figur 3c). Die Verbindungen der Formel (I) können gemäß diesem allgemeinen Reaktionsschema, ausgehend von p-Amino-benzylamin, hergestellt werden. In Figur 3 bedeutet Z die Schutzgruppe Benzyloxycarbonyl und Boc die Schutzgruppe tert-Butyloxycarbonyl.

Figur 4 zeigt ein Syntheseschema zur Herstellung der Verbindung WX-600.

Beispiele Hierin werden die folgenden Abkürzungen verwendet : H BTU 2- (1 H-Benzotriazol-1-yl)-1, 1,3, 3- tetra methyl u ro n iumhexaf luo ro- phosphat HOBt N-Hydroxybenzotriazol Py BOP Benzotriazol-1-yl-oxy-tris- pyrrolidino-phosphonium- hexafluorophosphat DCC N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid tBu tert-Butyl BOC tert-Butyloxycarbonyl- Schutzgruppe Z Benzyloxycarbonyl-Schutzgruppe

Z-OSu N- (Benzyloxycarbonyloxy) succinimid TEA Triethylamin DIPEA Diisopropylethylamin Z-Gly-OSu Na-Benzyloxycarbonylglycin-N- hydroxysuccinimidester TFA Trifluoressigsäure 4M 4 molar N-Z-N-Me-Gly Na-Benzyloxycarbonyl- -Na-Methyl-Glycin N-Z-N-Me-Ala Na-Benzyloxycarbonyl-Na-methyl- alanin Z-HomoPhe-OH Na-Benzyloxycarbonyl- Homophenylalanin Fmoc- (D) Dap (Z)-OH Na-Fluorenyloxycarbonyl-N- Benzyloxycarbonyl- (D)-Diamino- propionsäure BOC- (D)-Ser (tBu) -OH Na-tert-Butyloxycarbonyl-O-tert- butyl- (D)-Serin

Beispiel 1 : Synthesebeschreibung N- [2- (4-Guanidino-benzenesulfonylamino)-ethyl]-3- hydroxy-2-phenylmethansulfonylamino-propionamide Hydrochloride [WX- 568] (vgl. Fig. 3c) 4-Nitrophenylsulfonylchlorid (1) wird in einem inerten organischen Lösungsmittel (z. B. Dichlormethan) unter Zugabe einer organischen Base (z. B. TEA, DIPEA) mit N-Z-Diaminoethan Hydrochlorid (2) zur Verbindung 3 umgesetzt. Katalytische Hydrierung von 3 an einem Pd-Aktivkohle- Katalysator wandelt die Nitrogruppe zum korrespondierenden Amin um und spaltet zugleich die Z-Schutzgruppe ab (4). Die Aminoethylgruppe von Verbindung 4 lässt sich mit in der Peptidchemie üblichen Kupplungsreagenzien (z. B. PyBOP, HBTU oder DCC und HOBt) zusammen mit Z- (D)-Ser (tBu) -OH zum entsprechenden Amid 5 umsetzen. Die

Umsetzung zum vollgeschützten Intermediat 6 erfolgt mit einem geeigneten Guanidinylierungsreagens wie z. B. N, N'-Bis (tert-butoxycarbonyl)-1 H- pyrazol-1-carboxamidin. Anschließende Abspaltung der Z-Schutzgruppe durch katalytische Hydrierung am Pd-Aktivkohle-Katalysator (7) und Umsetzung mit Benzylsulfonylchlorid in einem inerten organischen Lösungsmittel (z. B. Dichlormethan) unter Zugabe einer organischen Base liefert das voligeschützte Produkt 8. Die Abspaltung der Schutzgruppen (BOC und t-Butylether) erfolgt durch Lösen der Verbindung 8 in Säure (z. B.

Trifluoressigsäure oder 4M HCIg in Dioxan), wodurch das korrespondierende Salz der Zielverbindung N- [2- (4-Guanidino- <BR> <BR> <BR> <BR> benzenesulfonylamino)-ethyl]-3-hydroxy-2-phenylmethanesulfon ylamino- propionamide (9) erhalten wird.

Beispiel 2 : Synthesebeschreibung Bz-S02- (D)-Ser- (Aza-Gly)-4-Guanidinobenzylamid Hydrochlorid [WX-544] (vgl. Fig. 3b) Die Aminomethylgruppe des Edukts 4-Aminobenzylamin (10) wird zunächst mit einer geeigneten Schutzgruppe versehen, etwa durch Umsetzen von 10 mit Chlorameisensäurebenzylester oder Z-OSu zu Verbindung 11. Die Umsetzung mit einem geeignet geschützten Guanidinylierungsreagens wie z. B. N, N'-Bis (tert-butoxy-carbonyl)-1 H-pyrazol-1-carboxamidin liefert Verbindung 12, deren Z-Schutzgruppe durch katalytische Hydrierung an einem Pd-Aktivkohle-Katalysator abgespalten werden kann (13). Die somit freigesetzte Aminofunktion wird unter Kühlung und Zugabe von einem Äquivalent organischer Base mit Triphosgen (einem festen und somit weniger giftigen Phosgenersatz) und anschließend in situ mit Benzylcarbazat zu Verbindung 14 [Z-AzaGly-4- (N, N'-Bis-BOC- Guanidinobenzyl) amid] umgesetzt. Die Z-Schutzgruppe wird wie für Verbindung 13 beschrieben durch Hydrieren abgespalten (15) und mit Z- (D) -Ser (tBu) -OH und in der Peptidchemie üblichen Kupplungsreagenzien (z. B. PyBOP, HBTU oder DCC und HOBt) zum Amid 16 umgesetzt. Die Z-

Schutzgruppe wird erneut katalytisch abgespalten (17) und das resultierende freie Amin mit Benzylsulfonylchlorid in einem inerten organischen Lösungsmittel (z. B. Dichlormethan) unter Zugabe einer organischen Base zum korrespondierenden Sulfonamid 18 umgesetzt. Die Abspaltung der verbliebenen Schutzgruppen erfolgt durch Reaktion in saurer Lösung (z. B. in Trifluoressigsäure oder in 4M HCIg/Dioxan) zum entsprechenden Salz der Zielverbindung Bz-S02- (D)-Ser- (Aza-Gly)-4- Guanidinobenzylamid (19).

Beispiel 3 : Synthesebeschreibung N- (4-Guanidino-benzyl)-2- (3-hydroxy-2- phenylmethane-sulfonylamino-propionylamino)-4-phenyl-butyram ide Hydrochlorid [WX-550] (vgl. Fig. 3a) 4-Aminobenzylamin (20) wird mit Z- (L)-Homophenylalanin und in der Peptidchemice üblichen Kupplungsreagenzien (z. B. PyBOP, HBTU oder DCC und HOBt) zum Amid 21 umgesetzt. Durch katalytische Hydrierung an einem Pd-Aktivkohle-Katalysator wird die Z-Schutzgruppe abgespalten (22) und die freie Aminogruppe wie für 21 beschrieben mit Z- (D)-Ser (tBu) OH zum Amid 23 umgesetzt. Die Umsetzung mit einem geeignet geschützten Guanidinylierungsreagens wie z. B. N, N'-Bis (tert-butoxycarbonyl)-1 H- pyrazol-1-carboxamidin liefert Verbindung 24. Die N-terminale Z- Schutzgruppe wird wie für 22 beschrieben abgespalten und die resultierende Verbindung 25 mit Benzylsulfonylchlorid zum Sulfonamid 26 umgesetzt. Im letzten Schritt werden die verbliebenen Schutzgruppen in saurem Medium (z. B. in Trifluoressigsäure oder in 4M HCIg/Dioxan) zum entsprechenden Salz der Zielverbindung 27 abgespalten.

Beispiel 4 : Synthese von N- [ (4-Guanidino-benzylcarbamoyl)-methyl]-3-hydroxy-2- phenyl-methansulfonylamino-propionamid Hydrochlorid bzw. Benzylsulfonyl- (D)-Ser-Gly- (4-Guanidinobenzyl) amid Hydrochlorid (WX-508) (vgl. Fig. 2)

Kommerziell erhältliches 4-Aminobenzylamin wird in einem inerten Lösungsmittel mit Z-Gly-OSu zu Z-Gly- (4-Aminobenzyl) amid umgesetzt.

(Alternativ können auch Z-Gly-OH und in der Peptidchemie übliche Kupplungsreagenzien (z. B. DCC oder HBTU und HOBt) verwendet werden.

Nach Abspalten der Z-Schutzgruppe durch katalytische Hydrierung an einem Palladium/Aktivkohle-Katalysator, wird die freie Aminogruppe mit Hilfe von in der Peptidchemie üblichen Kupplungsreagenzien (z. B. DCC oder HBTU oder HOBt) mit Z- (D)-Ser (tBu)-OH zum entsprechenden Z- (D)- Ser (tBu)-Gly- (4-Aminobenzyl) amid umgesetzt. Der Aufbau der BOC- geschützten Guanidinofunktion kann z. B. auf dieser Stufe durch Reaktion mit N, N'-Bis-BOC-1 H-pyrazol-1-carboxamidin in einem möglichst unpolaren und inerten Lösungsmittel (z. B. Dichlormethan) erfolgen. Nach erneuter katalytischer Abspaltung der Z-Schutzgruppe erfolgt die Umsetzung mit Phenylmethansulfonylchlorid zum voligeschützten Produkt BzS02- (D)- Ser (tBu)-Gly- (4-N, N'-Bis-BOC-Guanidinobenzyl) amid. im letzten Syntheseschritt werden die BOC-Schutzgruppen und die tert- Butylethergruppe durch 4M HCIg in Dioxan abgespalten, wodurch direkt das Hydrochlorid von N- [ (4-Guanidino-benzylcarbamoyl)-methyl]-3-hydroxy-2- phenyl-methansulfonylamino-propionamid erhalten wird. Alternativ können die Schutzgruppen auch durch TFA abgespalten werden. Das entstandene TFA-Salz des Produkts wird anschließend durch lonenaustausch in das korrespondierende Hydrochlorid überführt.

Beispiel 5 : Synthese des gemeinsamen Buildingblocks H- (D)-Ser (tBu)-Gly- (4, N, N'-Bis- BOC-Guanidino-Benzyl) amid (1) :

Kommerziell erhältliches 4-Aminobenzylamin wird in einem inerten Lösungsmittel mit Z-Gly-OSu zu Z-Gly- (4-Aminobenzyl) amid umgesetzt.

[Alternativ können auch Z-Gly-OH und in der Peptidchemie übliche Kupplungsreagenzien (z. B. DCC oder HBTU und HOBt) verwendet werden].

Der Aufbau der BOC-geschützten Guanidinofunktion kann z. B. auf dieser Stufe durch Reaktion mit N, N'-Bis-BOC-1 H-pyrazol-1-carboxamidin in einem möglichst unpolaren und inerten Lösungsmittel (z. B. Dichlormethan) erfolgen. Nach Abspalten der Z-Schutzgruppe durch katalytische Hydrierung an einem Palladium/Aktivkohle-Katalysator, wird die freie Aminogruppe mit Hilfe von in der Peptidchemie üblichen Kupplungsreagenzien (z. B. DCC oder HBTU und HOBt) mit Z- (D)-Ser- (tBu)- OH zum entsprechenden Z- (D)-Ser (tBu)-Gly- (4-N, N'-Bis-BOC- Guandinobenzyl) amid umgesetzt. Abspaltung der Z-Schutzgruppe durch katalytische Hydrierung an einem Pd-Aktivkohlekatalysator liefert H- (D)- Ser (tBu)-Gly- (4-N, N'-Bis-BOC-Guanidinobenzyl) amid als Buildingblock (1) für die im Folgenden beschriebenen N-terminalen Derivatisierungsreaktionen.

Beispiel 6 : Synthese von N-terminalen Sulfonamidderivaten der allgemeinen Formel

(Beispiele WXC-296,298, 300,302, 316,318, 340) Zur Synthese der erfindungsgemäßen N-terminalen Sulfonamidderivate wird der Buildingblock 1 mit einem Äquivalent des gewünschten substituierten Sulfonylchlorids in Gegenwart einer tertiären organischen Base (z. B. TEA oder DIPEA) in einem inerten organischen Lösungsmittel (z. B.

Dichlormethan) umgesetzt. Anschließend werden die Schutzgruppen des dabei gebildeten vollgeschützten Produkts durch 4M HCL9 in Dioxan abgespalten, wodurch das Hydrochlorid der gewünschten Verbindungen R- S02- (D)-Ser-Gly- (4-Guanidinobenzyl) amid erhalten wird (R steht allgemein für einen organischen Rest). Alternativ können die Schutzgruppen auch durch TFA abgespalten werden. Das entstandene TFA-Salz des Produkts wird anschließend durch lonenaustausch in das korrespondierende Hydrochlorid überführt.

6.1. (-)-Camphor-10-sulfonyl- (D)-Ser-Gly- (4-Guanidinobenzyl) amid Hydrochlorid (WXC-296) Zur Synthese der erfindungsgemäßen Verbindung (-)-Camphor-1 0-sulfonyl- (D)-Ser-Gly- (4-Guanidinobenzyl) amid Hydrochloird (WXC-296) wird der Buildingblock 1 mit einem Äquivalent (-)-Camphor-10-sulfonylchlorid in Gegenwart einer tertiären organischen Base (z. B. TEA oder DIPEA) in einem inerten organischen Lösungsmittel (z. B. Dichlormethan) umgesetzt.

Anschließend werden die Schutzgruppen des dabei gebildeten vollgeschützten Produkts durch 4M HC ! g in Dioxan abgespalten, wodurch das Hydrochlorid der Zielverbindung erhalten wird. Alternativ können die Schutzgruppen auch durch TFA abgespalten werden. Das entstandene TFA-Salz des Produkts wird anschließend durch ionenaustausch in das korrespondierende Hydrochlorid überführt.

6.2. (+)-Camphor-10-sulfonyl- (D)-Ser-Gly- (4-Guanidinobenzyl) amid Hydrochlorid (WXC-298) Die Synthese von +)-Camphor-1 0-sulfonyl- (D)-Ser-Gly- (4- Guanidinobenzyl) amid Hydrochlorid (WXC-298) verläuft wie unter 6.1. beschrieben allerdings mit (+)-Camphor-10-sulfonylchlorid.

6.3. n-Butyl-sulfonyl- (D)-Ser-Gly- (4-Guanidinobenzyl) amid Hydrochlorid (WXC-300) Die Synthese von n-Butyl-sulfonyl- (D)-Ser-Gly- (4-Guanidinobenzyl) amid Hydrochlorid (WXC-300) verläuft wie unter 6.1. beschrieben allerdings mit -Butylsulfonylchlorid.

6.4. n-Octyl-sulfonyl- (D)-Ser-Gly- (4-Guanidinobenzyl) amid Hydrochlorid (WXC-302) Die Synthese von n-Octyl-sulfonyl- (D)-Ser-Gly- (4-Guanidinobenzyl) amid Hydrochlorid (WXC-302) verläuft wie unter 6.1. beschrieben allerdings mit n-Octylsulfonylchlorid.

6.5. 3-Nitrobenzyl-sulfonyl- (D)-Ser-Gly- (4-Guanidinobenzyl) amid Hydrochlorid (WXC-316) Die Synthese von 3-Nitrobenzyl-sulfonyl- (D)-Ser-Gly- (4- Guanidinobenzyl) amid Hydrochlorid (WXC-316) verläuft wie unter 6.1. beschrieben allerdings mit 3-Nitrobenzyl-sulfonylchlorid.

6.6. 3-Chlorbenzyl-sulfonyl- (D)-Ser-Gly- (4-Guanidinobenzyl) amid Hyrochlorid (WXC-318) Die Synthese von 3-Chlorbenzyl-sulfonyl- (D)-Ser-Gly- (4- Guanidinobenzyl) amid Hydrochlorid (WXC-318) verläuft wie unter 6.1 beschrieben allerdings mit 3-Chlorbenzyl-sulfonylchlorid.

6.7. 4-Chlorbenzyl-sulfonyl- (D)-Ser-Gly- (4-Guanidinobenzyl) amid Hydrochlorid (WXC-340) Die Synthese von 4-Chlorbenzyl-sulfonyl- (D)-Ser-Gly- (4- Guanidinobenzyl) amid Hydrochlorid (WXC-340) verläuft wie unter 6.1. beschrieben allerdings mit 4-Chlorbenzyl-sulfonylchlorid.

Beispiel 7 : Synthese von N-terminalen Harnstoffderivaten der allgemeinen Formel (Beispiele WXC-202, 304,306, 308,310, 312,314, 320,322, 324,326, 328,330, 332,334, 336,338, 342) Zur Synthese der erfindungsgemäßen N-terminalen Harnstoffderivate wird der Buildingblock 1 mit einem Äquivalent des gewünschten substituierten Isocyanats in einem inerten organischen Lösungsmittel (z. B. Dichlormethan) umgesetzt. Anschließend werden die Schutzgruppen des dabei gebildeten vollgeschützten Produkts durch 4M HCIg in Dioxan abgespalten, wodurch das Hydrochlorid der gewünschten Verbindungen N- [ (4-Guanidino- <BR> <BR> <BR> <BR> benzylcarbamoyl) methyl]-3-hydroxy-2- (3-R-ureido)-propionamid erhalten wird (R stellt allgemein für einen organischen Rest). Alternativ können die Schutzgruppen auch durch TFA abgespalten werden. Das entstandene

TFA-Salz des Produkts wird anschließend durch lonenaustausch in das korrespondierende Hydrochlorid überführt.

7.1. 3-Chlorphenyl-aminocarbonyl- (D)-Ser-Gly- (4-Guanidinobenzyl) amid Hydrochlorid (WXC-292) Zur Synthese der erfindungsgemäßen Verbindung 3-Chlorphenyl- aminocarbonyl- (D)-Ser-Gly- (4-Guanidinobenzyl) amid Hydrochlorid (WXC- 292) wird der Buildingblock 1 mit einem Äquivalent 3-Chlorphenylisocyanat in einem inerten organischen Lösungsmittel (z. B. Dichlormethan) umgesetzt. Anschließend werden die Schutzgruppen des dabei gebildeten vollgeschützten Produkts durch 4M HCIg in Dioxan abgespalten, wodurch das Hydrochlorid des gewünschten Produkts erhalten wird. Alternativ können die Schutzgruppen auch durch TFA abgespalten werden. Das entstandene TFA-Salz des Produkts wird anschließend durch lonenaustausch in das korrespondierende Hydrochlorid überführt.

7.2. 2-Chlorphenyl-aminocarbonyl- (D)-Ser-Gly- (4-Guanidinobenzyl) amid Hydrochlorid (WXC-304) Die Synthese von 2-Chlorphenyl-aminocarbonyl- (D)-Ser-Gly- (4- Guanidinobenzyl) amid Hydrochlorid (WXC-304) verläuft wie unter 7.1. beschrieben allerdings mit 2-Chlorphenylisocyanat.

7. 3A-Methoxyphenyl-aminocarbonyl-(D)-Ser-Gly-(4-Guanidinobenzy l) amid Hydrochlorid (WXC-306) Die Synthese von 4-Methoxyphenyl-aminocarbonyl- (D)-Ser-Gly- (4- Guanidinobenzyl) amid Hydrochlorid (WXC-306) verläuft wie unter 7.1. beschrieben allerdings mit 4-Methoxyphenylisocyanat.

7.4. 3,4, 5-Tri-Methoxyphenyl-aminocarbonyl- (D)-Ser-Gly- (4- Guanidinobenzyl) amid Hydrochlorid (WXC-308)

Die Synthese von 3,4, 5-Tri-Methoxyphenyl-aminocarbonyl- (D)-Ser-Gly- (4- Guanidinobenzyl) amid Hydrochlorid (WXC-308) verläuft wie unter 7.1. beschrieben allerdings mit 3,4, 5-Tri-Methoxyphenylisocyanat.

7. 5. 4-Phenoxyphenyl-aminocarbonyl- (D)-Ser-Gly- (4-Guanidinobenzyl) amid Hydrochlorid (WXC-310) Die Synthese von 4-Phenoxyphenyl-aminocarbonyl- (D)-Ser-Gly- (4- Guanidinobenzyl) amid Hydrochlorid (WXC-310) verläuft wie unter 7.1. beschrieben allerdings mit 4-Phenoxyphenylisocyanat.

7.6. 3-Ethoxycarbonylphenyl-aminocarbonyl- (D)-Ser-Gly- (4- Guanidinobenzyl) amid Hydrochlorid (WXC-312) Die Synthese von 3-Ethoxycarbonylphenyl-aminocarbonyl- (D)-Ser-Gly- (4- Guanidinobenzyl) amid Hydrochlorid (WXC-312) verläuft wie unter 7.1. beschrieben allerdings mit Ethyl-3-Isocyanatobenzoat.

7.7. 3-Acetylphenyl-aminocarbonyl- (D)-Ser-Gly- (4-Guanidinobenzyl) amid Hydrochlorid (WXC-314) Die Synthese von 3-Acetylphenyl-aminocarbonyl- (D)-Ser-Gly- (4- Guanidinobenzyl) amid Hydrochlorid (WXC-314) verläuft wie unter 7.1. beschrieben allerdings mit 3-Acetylphenylsiocyanat.

7.8. 1-Adamantyl-aminocarbonyl- (D)-Ser-Gly- (4-Guanidinobenzyl) amid Hydrochlorid (WXC-320) Die Synthese von 1-Adamantyl-aminocarbonyl- (D)-Ser-Gly- (4- Guanidinobenzyl) amid Hydrochlorid (WXC-320) verläuft wie unter 7.1. beschrieben allerdings mit 1-Adamantylisocyanat.

7.9. 2-Bromphenyl-aminocarbonyl- (D)-Ser-Gly- (4-Guanidinobenzyl) amid Hydrochlorid (WXC-322)

Die Synthese von 2-Bromphenyl-aminocarbonyl- (D)-Ser-Gly- (4- Guanidinobenzyl) amid Hydrochlorid (WXC-322) verläuft wie unter 7.1. beschrieben allerdings mit 2-Bromphenylisocyanat.

7.10. 3-Carboxyphenyl-aminocarbonyl- (D)-Ser-Gly- (4-Guanidinobänzyl) amid Hydrochlorid (WXC-324) Die Synthese von 3-Carboxyphenyl-aminocarbonyl- (D)-Ser-Gly- (4- Guanidinobenzyl) amid Hydrochlorid (WXC-324) verläuft wie unter 7.1. beschrieben allerdings mit tert-Butyl-3-isocyanatobenzoate. Die tert-Butyl- Schutzgruppe wird gemeinsam mit den anderen säurelabilen Schutzgruppen durch Behandlung mit 4M HOg in Dioxan abgespalten.

7. 11.2, 3-Dihydro-1, 4-benzodioxin-6-yl-aminocarbonyl- (D)-Ser-Gly- (4- Guanidinobenzyl) amid Hydrochlorid (WXC-326) <BR> <BR> <BR> <BR> DieSynthesevon2, 3-Dihydro-1, 4-benzodioxin-6-yl-aminocarbonyl-(D)-Ser- Gly- (4-Guanidinobenzyl) amid Hydrochlorid (WXC-326) verläuft wie unter 7.1. beschrieben allerdings mit 2, 3-Dihydro-1, 4-benzodioxin-6-yl-isocyanat.

7.12. 1-Naphthyl-aminocarbonyl- (D)-Ser-Gly- (4-Guanidinobenzyl) amid Hydrochlorid (WXC-328) Die Synthese von 1-Naphthyl-aminocarbonyl- (D)-Ser-Gly- (4- Guanidinobenzyl) amid Hydrochlorid (WXC-328) verläuft wie unter 7.1. beschrieben allerdings mit 1-Naphthylisocyanat.

7.13. 4-Acetylphenyl-aminocarbonyl- (D)-Ser-Gly- (4-Guanidinobenzyl) amid Hydrochlorid (WXC-330) Die Synthese von 4-Acetylphenyl-aminocarbonyl- (D)-Ser-Gly- (4- Guanidinobenzyl) amid Hydrochlorid (WXC-328) verläuft wie unter 7.1. beschrieben allerdings mit 4-Acetylphenylisocyanat.

7. 14. 3, 4-Methylendioxyphenyl-aminocarbonyl- (D)-Ser-Gly- (4- Guanidinobenzyl) amid Hydrochlorid (WXC-332) Die Synthese von 3, 4-Methylendioxyphenyl-aminocarbonyl- (D)-Ser-Gly- (4- Guanidinobenzyl) amid Hydrochlorid (WXC-332) verläuft wie unter 7.1. beschrieben allerdings mit 3, 4-methylendioxyphenylisocyanat.

7. 15. 2, 3-Dichlorphenyl-aminocarbonyl- (D)-Ser-Gly- (4- Guanidinobenzyl) amid Hydrochlorid (WXC-334) Die Synthese von 2, 3-Dichlorphenyl-aminocarbonyl- (D)-Ser-Gly- (4- Guanidinobenzyl) amid Hydrochlorid (WXC-334) verläuft wie unter 7.1. beschrieben allerdings mit 2, 3-Dichlorphenylisocyanat.

7. 16. 4-Ethyloxycarbonylphenyl-aminocarbonyl- (D)-Ser-Gly- (4- Guanidinobenzyl) amid Hydrochlorid (WXC-336) Die Synthese von 4-Ethyloxycarbonylphenyl-aminocarbonyl- (D)-Ser-Gly- (4- Guanidinobenzyl) amid Hydrochlorid (WXC-336) verläuft wie unter 7.1. beschrieben allerdings mit 4-Ethyloxycarbonylphenylisocyanat.

7. 17. 2, 4-Dibromphenyl-aminocarbonyl- (D)-Ser-Gly- (4- Guanidinobenzyl) amid Hydrochlorid (WXC-338) Die Synthese von 2, 4-Dibromphenyl-aminocarbonyl- (D)-Ser-Gly- (4- Guanidinobenzyl) amid Hydrochlorid (WXC-338) verläuft wie unter 7.1. beschrieben allerdings mit 2, 4-Dibromphenylsiocyanat.

7. 18. 4-Nitrophenyl-aminocarbonyl- (D)-Ser-Gly- (4-Guanidinobenzyl) amid Hydrochlorid (WXC-342) Die Synthese von 4-Nitrophenyl-aminocarbonyl- (D)-Ser-Gly- (4- Guanidinobenzyl) amid Hydrochlorid (WXC-342) verläuft wie unter 7.1. beschrieben allerdings mit 4-Nitrophenylisocyanat.

Beispiel 8 : Synthese von N-terminalen Amid-Derivaten der allgemeinen Formel

(Beispiel WX-571) Zur Synthese der erfindungsgemäßen N-terminalen Amidderivate wird der Buildingblock 1 mit einem Äquivalent des gewünschten substituierten Carbonsäurechlorids in Gegenwart einer tertiären organischen Base (z. B.

TEA oder DIPEA) in einem inerten organischen Lösungsmittel (z. B.

Dichlormethan) umgesetzt. Alternativ lassen sich auch Carbonsäuren mit in der Peptidchemie üblichen Kupplungsreagenzien (z. B. DCC oder HBTU oder HOBt) zum gewünschten Amid umsetzen. Andere Formen der Carbonsäureaktivierung z. B. als Pentafluorphenylester, Hydroxysuccinimidester oder als Anhydrid sind ebenso möglich.

Anschließend werden die Schutzgruppen des dabei gebildeten vollgeschützten Produkts durch 4M HCIg in Dioxan abgespalten, wodurch das Hydrochlorid der gewünschten Verbindungen N- [ (4-Guanidino- <BR> <BR> <BR> <BR> benzylcarbamoyl)-methyl]-3-hydroxy-2-R-Acylamino-propionamid erhalten wird (R steht allgemein für einen organischen Rest). Alternativ können die Schutzgruppen auch durch TFA abgespalten werden. Das entstandene TFA-Salz des Produkts wird anschließend durch lonenaustausch in das korrespondierende Hydrochlorid überführt.

8.1. 3, 4-Dihydroxyphenyl-acetyl- (D)-Ser-Gly- (4-Guanidino-benzyl) amid Hydrochlorid (WX-571) Zur Synthese der erfindungsgemäßen Verbindung 3, 4-Dihydroxyphenyl- acetyl- (D)-Ser-Gly- (4-Guanidino-benzyl) amid Hydrochlorid (WX-571) wird der Buildingblock 1 mit einem Äquivalent 3, 4-Dihydroxyphenylessigsäure und 1,1 Äquivalenten eines in der Peptidchemie üblichen Kupplungsreagenz (z. B. DCC oder HBTU und HOBt) in Gegenwart einer tertiären organischen Phsae (z. B. TEA oder DIPEA) in einem inerten organischen Lösungsmittel (z. B. Dichlormethan) umgesetzt. Anschließend werden die Schutzgruppen des dabei gebildeten vollgeschützten Produkts durch 4M HO in Dioxan abgespalten, wodurch das Hydrochlorid der gewünschten Verbindungen gebildet wird. Alternativ können die Schutzgruppen auch durch TFA abgespalten werden. Das entstandene TFA-Salz des Produkts wird anschließend durch lonenaustausch in das korrespondierende Hydrochlorid überführt.

Beispiel 9 : Synthese von BzS02- (D)-Ser-AzaGly- (4-Guanidinobenzyl) amid (WX-544) Zur Synthese der erfindungsgemäßen Verbindung BzS02- (D)-Ser-AzaGly- (4- Guanidinobenzyl) amid wird zunächst die Aminomethylgruppe von 4- Aminobenzylamin mit Z-OSu zu N-Z- (4-Aminobenzyl) amin umgesetzt. Der Aufbau der BOC-geschützten Guanidinofunktion kann z. B. auf dieser Stufe

durch Reaktion mit N, N'-Bis-BOC-1H-pyrazol-1-carboxamidin in einem möglichst unpolaren und inerten Lösungsmittel (z. B. Dichlormethan) erfolgen. Nach Abspalten der Z-Schutzgruppe durch katalytische Hydrierung an einem Palladium/Aktivkohle-Katalysator, wird die freie Aminogruppe zunächst in einem inerten Lösungsmittel (z. B. Dichlormethan) unter Einskühlung mit 1/3 Äquivalent Triphosgen und einem Äquivalent TEA, und nach erfolgter Reaktion mit Benzylcarbazat zu Z-AzaGly- (4-N, N- Bis-BOC-Guanidinobenzyl) amid umgesetzt. Nach Abspalten der Z- Schutzgruppe durch katalytische Hyrierung an einem Palladium/Aktivkohle- Katalysator, wird die freie Aminogruppe mit Hilfe von in der Peptidchemie üblichen Kupplungsreagenzien (z. B. DCC oder HBTU und HOBt) mit Z- (D)- Ser (tBu)-OH zum entsprechenden Z- (D)-Ser (tBu)-AzaGly- (4-N, N'-Bis-BOC- Guanidinobenzyl) amid umgesetzt. Nach erneuter katalytischer Abspaltung der Z-Schutzgruppe erfolgt die Umsetzung mit Phenylmethansulfonylchlorid zum vollgeschützten Produkt BzS02- (D)-Ser (tBu)-AzaGly-4 (N, N'-Bis-BOC- Guanidinobenzyl) amid. Im letzten Syntheseschritt werden die BOC- Schutzgruppen und die tert-Butylethergruppe durch 4M HCIg in Dioxan abgespalten, wodurch direkt das Hydrochlorid von BzS02- (D)-Ser-AzaGly-4- (Guanidinobenzyl) amid erhalten wird. Alternativ können die Schutzgruppen auch durch TFA abgespalten werden. Das entstandene TFA-Salz des Produkts wird anschließend durch lonenaustausch in das korrespondierende Hydrochlorid überführt.

Beispiel 10 : Synthese der erfindungsgemäßen Verbindungen des Typs BzS02- (D)-Ser- Aaa- (4-Guanidinobenzyl) amid (Aaa bedeutet allgemein eine natürliche oder nicht-natürliche a-Aminosäure in R-oder S-Konfiguration oder deren Racemat)

(Beispiel WX-550) Kommerziell erhältliches 4-Aminobenzylamin wird in einem inerten Lösungsmittel mit der gewünschten Z-geschützten Aminosäure (Z-Aaa) und in der Peptidchemie üblichen Kupplungsreagenzien (z. B. DCC oder HBTU und HOBt) zu Z-Aaa- (4-Aminobenzyl) amid umgesetzt. Evtl. vorhandene reaktive Gruppen in der Seitenkette der Aminosäure Aaa sollten dabei nach Möglichkeit mit einer säurelabilen Schutzgruppe (z. B. BOC, Trityl, tert- Butylester bzw. -ether) versehen sein. Nach Abspalten der Z-Schutzgruppe durch katalytische Hyrierung an einem Palladium/Aktivkohle-Katalysator, wird die freie Aminogruppe mit Hilfe von in der Peptidchemie üblichen Kupplungsreagenzien (z. B. DCC oder HBTU und HOBt) mit Z- (D)-Ser (tBu) - OH zum entsprechenden Z- (D)-Ser (tBu)-Aaa- (4-Aminobenzyl) amid umgesetzt. Der Aufbau der BOC-geschützten Guanidinofunktion kann z. B. auf dieser Stufe durch Reaktion mit N, N'-Bis-BOC-1 H-pyrazol-1- carboxamidin in einem möglichst unpolaren und inerten Lösungsmittel (z. B.

Dichlormethan) erfolgen. Nach erneuter katalytischer Abspaltung der Z- Schutzgruppe erfolgt die Umsetzung mit Phenylmethansulfonylchlorid zum vollgeschützten Produkt BzS02- (D)-Ser (tBu)-Gly-4- (N, N'-Bis-BOC- Guanidinobenzyl) amid. Im letzten Syntheseschritt werden die BOC- Schutzgruppen und die tert-Buthylethergruppe durch 4M HCIg in Dioxan abgespalten, wodurch direkt das Hydrochlorid von BzS02- (D)-Ser-Aaa- (4-

Guanidinobenzyl) amid erhalten wird. Alternativ können die Schutzgruppen auch durch TFA abgespalten werden. Das entstandene TFA-Salz des Produkts wird anschließend durch lonenaustausch in das korrespondierende Hydrochlorid überführt.

10. 1 Benzylsulfonyl- (D)-Ser-HomoPhe- (4-Guanidinobenzyl) amid Hydrochlorid (WX-550) Kommerziell erhältliches 4-Aminobenzylamin wird in einem inerten Lösungsmittel (z. B. Dichlormethan) mit Z-HomoPhe-OH und in der Peptidchemie üblichen Kupplungsreagenzien (z. B. DCC oder HBTU und HOBt) zu Z-HomoPhe- (4-Aminobenzyl) amid umgesetzt. Nach Abspalten der Z-Schutzgruppe durch katalytische Hydrierung an einem Palladium/Aktivkohle-Katalysator, wird die freie Aminogruppe mit Hilfe von in der Peptidchemie üblichen Kupplungsreagenzien (z. B. DCC oder HBTU und HOBt) mit Z- (D)-Ser (tBu) -OH zum entsprechenden Z- (D)-Ser (tBu)- HomoPhe- (4-Aminobenzyl) amid umgesetzt. Der Aufbau der BOC- geschützten Guanidinofunktion kann z. B. auf dieser Stufe durch Reaktion mit N, N'-Bis-BOC-1 H-pyrazol-1-carboxamidin in einem möglichst unpolaren und inerten Lösungsmittel (z. B. Dichlormethan) erfolgen. Nach erneuter katalytischer Abspaltung der Z-Schutzgruppe erfolgt die Umsetzung mit Phenylmethansulfonylchlorid zum vollgeschützten Produkt BzS02- (D)- Ser (tBu)-HomoPhe-4- (N, N'-Bis-BOC-Guanidino-benzyl) amid. Im letzten Syntheseschritt werden die BOC-Schutzgruppen und die tert-Butylether- Gruppe durch 4M HCIg in Dioxan abgespalten, wodurch direkt das Hydrochlorid von BzS02- (D)-Ser-HomoPhe- (4-Guanidinobenzyl) amid erhalten wird. Alternativ können die Schutzgruppen auch durch TFA abgespalten werden. Das entstandene TFA-Salz des Produkts wird anschließend durch lonenaustausch in das korrespondierende Hydrochlorid überführt.

10.2. Benzylsulfonyl- (D)-Ser-Ala- (4-Guanidinobenzyl) amid Hydrochlorid (WX-532) Die Synthese von Benzylsulfonyl- (D)-Ser-Ala- (4-Guanidinobenzyl) amid Hydrochlorid (WX-532) verläuft wie unter 10.1 beschrieben allerdings mit Z-Ala-OH anstelle von Z-HomoPhe-OH.

Beispiel 11 11. 1 Synthese der erfindungsgemäßen Verbindung 2- (4-Chlorophenyl- methansulfonylamino)-N- [1- (4-guanidino-benzylcarbamoyl)-ethyl]-3- hydroxy-N-methyl-propionamid bzw. 4-Chlorbenzylsulfonyl- (d)-Ser-N-Me- Ala- (4-Guaniinobenzylamid) (WX-582) Zur Synthese der erfindungsgemäßen Verbindung wird N-Z-N-Methyl-Alanin mit in der Peptidchemie üblichen Kupplungsreagenzien (z. B. DCC oder HBTU oder HOBt) mit 4-Aminobenzylamin zu N-Z-N-Methyl-Alanin- (4- aminobenzyl) amid umgesetzt. Nach Abspalten der Z-Schutzgruppe durch katalytische Hydrierung an einem Palladium/Aktivkohle-Katalysator, wird die freie Aminogruppe mit Hilfe von in der Peptidchemie üblichen Kupplungsreagenzien (z. B. DCC oder HBTU und HOBt) mit Z- (D)-Ser (tBu) - OH zum entsprechenden Z- (D)-Ser (tBu)-N-Methyl-Ala- (4-Aminobenzyl) amid umgesetzt. Der Aufbau der BOC-geschützten Guanidinofunktion kann z. B. auf dieser Stufe durch Reaktion mit N, N'-Bis-BOC-1 H-pyrazol-1- carboxamidin in einem möglichst unpolaren und inerten Lösungsmittel (z. B.

Dichlormethan) erfolgen. Nach erneuter katalytischer Abspaltung der Z- Schutzgruppe erfolgt die Umsetzung mit 4- Chlorophenylmethansulfonylchlorid zum voligeschützten Produkt 4C1- <BR> <BR> <BR> <BR> BzS02- (D)-Ser (tBu)-N-Methyl-Ala- (4-N, N'-Bis-BOC-Guanidinobenzyl)-amid.

Im letzten Syntheseschritt werden die BOC-Schutzgruppen und die tert- Butylethergruppe durch 4M HCIg in Dioxan abgespalten, wodurch direkt das Hydrochlorid von 2- (4-Chlorophenyl-methansulfonylamino)-N- [1- (4- <BR> <BR> <BR> <BR> guanidino-benzylcarbamoyl)-ethyl]-3-hydroxy-N-methyl-propion amid erhalten wird. Alternativ können die Schutzgruppen auch durch TFA abgespalten werden. Das entstandene TFA-Salz des Produkts wird anschließend durch lonenaustausch in das korrespondierende Hydrochlorid überführt.

11.2 Synthese von Benzylsulfonyl- (D)-Ser-N-Me-Gly- (4- Guanidinobenzyl) amid (WX-538) Die Synthese der erfindungsgemäßen Verbindung Benzylsulfonyl- (D)-Ser-N- Me-Gly- (4-Guanidinobenzyl) amid (WX-538) verläuft analog zu 11.1 allerdings mit N-Z-N-Me-Gly-OH anstelle von N-Z-N-Methyl-Alanin und mit Benzylsulfonylchlorid anstelle von 4-Chlorbenzylsulfonylchlorid.

Beispiel 12 : Synthese von N-[N'-Guanidino-phenyl)- <BR> <BR> <BR> <BR> hydrazinocarbonylmethyl]-3-hydroxy-2-phenyl-methansulfonylam ino- propionamid Hydrochlorid (WX-600) (vgl. Fig. 4) 4-Nitrophenylhydrazin (1) wird mit Z-Gly-OH und einem in der Peptidchemie üblichen Kupplungsreagenz (z. B. PyBOP, HBTU oder DCC und HOBt) in einem inerten organischen Lösungsmittel (z. B. Dichlormethan oder DMF) zu Verbindung 2 umgesetzt. Durch katalytische Hydrierung an einem Palladium-Aktivkohle-Katalysator lässt sich sowohl die Z-Schutzgruppe abspalten als auch die Nitrofunktion zur korrespondierenden Aminogruppe reduzieren, wodurch Aminoessigsäure-N'- (4-amino-phenyl) hydrazin (3) erhalten wird. Die aliphatische Aminofunktion lässt sich durch in der Peptidchemie übliche Kupplungsreagenzien (z. B. PyBOP, HBTU oder DCC

und HOBt) in einem inerten organischen Lösungsmittel (z. B. Dichlormethan oder DMF) mit Z- (D)-Ser- (tBu)-OH zum mid 4 umsetzen. Der Aufbau der Bis-Boc-geschützten Guanidinofunktion (5) erfolgt durch Reaktion mit N, N'- Bis (tert-butoxycarbonyl)-1 H-pyrazol-1-carboxamidin in einem inerten organischen (z. B. Dichlormethan). Durch erneute katalytische Hydrierung an einem Palladium-Aktivkohle-Katalysator wird die Z-Schutzgruppe abgespalten (6). Die anschließende Reaktion mit 1 Äquivalent Benzylsulfonylchlorid in Dichlormethan liefert das vollgeschützte Produkt 7, das durch Reaktion in 4M HCIg in Dioxan zum Hydrochlorid des gewünschten Produkts N- [N'- (4-Guanidino-phenyl)-<BR> hydrazinocarbonylmethyl]-3-hydroxy-2-phenyl-methansulfonylam ino- propionamid (8) entschützt wird.

Beispiel 13 : Synthese der Derivate mit der allgemeinen Formel 13.1. Synthese von Benzylsulfonyl- (D)-Dap (Z)-Gly- (4-Guanidino- benzyl) amid Hydrochlorid (WXM-5) Kommerziell erhältliches 4-Aminobenyzlamin wird in einem inerten Lösungsmittel mit Z-Gly-OSu zu Z-Gly- (4-Aminobenzyl) amid umgesetzt.

(Alternativ kann auch Z-Gly-OH und in der Peptidchemie übliche Kupplungsreagenzien (z. B. DCC oder HBTU und HOBt) verwendet werden.

Nach Abspalten der Z-Schutzgruppe durch katalytische Hydrierung an einem Palladium/Aktivkohle-Katalysator, wird die freie Aminogruppe mit

Hilfe von in der Peptidchemie üblichen Kupplungsreagenzien (z. B. DCC oder HBTU und HOBt) mit Fmoc- (D)-Dap (Z) -OH zum entsprechenden Fmoc- (D)- Dap (Z)-Gly- (4-Aminobenzyl) amid umgesetzt. Der Aufbau der BOC- geschützten Guanidinofunktion kann z. B. auf dieser Stufe durch Reaktion mit N, N'-Bis-BOC-1 H-pyrazol-1-carboxamidin in einem möglichst unpolaren und inerten Lösungsmittel (z. B. Dichlormethan) erfolgen. Nach Abspaltung der Fmoc-Schutzgruppe durch eine sekundäre organische Base (z. B.

Diethylamin oder Piperidin) erfolgt die Umsetzung mit Phenylmethansulfonylchlorid zum geschützten Produkt BzS02- (D)-Dap (Z) - Gly- (4-N, N'-Bis-BOC-Guanidinobenzyl) amid. Im letzten Syntheseschritt werden die BOC-Schutzgruppen durch 4M HOg in Dioxan abgespalten, wodurch direkt das Hydrochlorid von Benzylsulfonyl- (D)-Dap (Z)-Gly- (4- Guanidino-benzyl) amid Hydrochlorid (WXM-5) erhalten wird. Alternativ können die Schutzgruppen auch durch TFA abgespalten werden. Das entstandene TFA-Salz des Produkts wird anschließend durch lonenaustausch in das korrespondierende Hydrochlorid überführt.

13.2. Synthese von Benzylsulfonyl- (D)-Dap-Gly- (4-Guanidino-benzyl) amid Bis-Hydrochlorid (WXM-6) Benzylsulfonyl- (D)-Dap-Gly- (4-Guanidino-benzyl) amid Bis-Hydrochlorid (WXM-6) kann durch katalytische Hydrierung von WXM-5 (siehe 13.1) an einem Palladium-Aktivkohle-Katalysator in Methanol das 2 molare Äquivalente 1 M HCI enthält, synthetisiert werden.

Beispiel 14 : In vitro Hemmung von Urokinase und Plasmin Zur Bestimmung der Inhibitoraktivität wurden 200 pI Tris-Puffer (0,05 mol/l, den Inhibitor enthaltend, 0,154 mot/1 NaCI, pH 8,0), 25, ul Substrat (Pefachrome uPA, Pefachrome PL oder Pefabloc TH in H20 ; Pentapharm LTD, Basel, Schweiz) und 50, ul Urokinase (Calbiochem-Novabiochem GmbH, Bad Soden, Deutschland) bzw. eine entsprechende andere

Protease, z. B. Plasmin, Thrombin oder FXa, 10 Minuten bei 30 °C inkubiert. Nach ca. 30 Minuten und 30 Zyklen wird die Absorption bei 405 nm mittels eines Mikroplate Reader (Mediators PHL, Aureon Biosystems, Wien, Österreich) bestimmt. Die Kj-Werte wurden nach Dixon durch lineare Regression mittels eines Computerprogramms ermittelt. Die K,-Werte sind das Mittel aus mindestens drei Bestimmungen, die Standardabweichung lag unter 25 %. Formel Bez. Ki lpiM] Ki [MiM] Ki [ifiM] Ki [pM] Plasmin Thrombin FXa uPA H H WX->200 > 350 0, 034 N N 508 HO H=N t/NH O nu H WX-no inh. C304 *) H H / H=N'NH NU WX-no inh. NuN CI C292 * . '\ H / H=N'NH NI NH WX-C 4, 1 N N N N-a 306 lOl H 0 0 Ha H, N NH nu NU H H H wx-c > 20 N Non 308 '\ 1/ rut O H 0 H 0 Nu H H H WX-C 2, 0 ' 310 lOl H lQl hou // H2NYNH b NU NU H H H N N N "312 H Ho H2NYHNH ICI NH H H H wx-c no inh. gw XNtN m 314) H2N Ny rHSJ N NYN 314 A 2 320 11 HO H2N NH NU NH H ? H H f\) 'C 20 H H H wx-c > 20 N , N/N 320 9 HO zu H : ho HNYNH NH nu. N N N r UNX-C > 2U 322 / T NH H ß H H tf X-C 3. 1 WX-C 3, 1 n n ! t j 9 Zu H HO / HZN'NH II NH H H H N 326 lol H IQI ho / HN NH NU NH WX-C > 20 '-C. N Ny N 328 0 0 I HOU HO n han nu Nu Ö H I Ö/ HÖJ nez H ICI NU H 0 - C > 20 N N 0 332 H y 1 0 0 0 H ho H=N'NH NH H wH wx-c > 20 Cl 334 H 11 0 0 H2N NH NH I, 1 NH WX-C 13, 1 N ^N N"N I 336 Ö H Ö/ 0 H 0 / H2N NH ICI NH H H H Br WX-C > N N N N" 338 HHYH 0 0 ber H2N NH NH NH H R H H WX-C 4, 9 NIrN N N 342 N Nô t n. WX-C 05--- H2NrNH NH HNNH NH H H o WX-C 0, 45 N O O \ HA nu HiN'NH Nu NEZ N O 'C _ II H S zozo HA I H, N NH NH H ? H o WX. C 0, 5---- 4 00 C 0, 27 H R H o WX-C... _ 0, 27 N N 300 H p / H2N NH NH WX-C 302 0, 5 o. in NH) NH H R H WX-C no inh. no inh. at 32, 4 0, 09 316 at 900 100 NM Ö H J O N° IM * * HO HA T I I NH H R H WX-C no inh. no inh. at 36 0, 047 N N 318 at 100 100 PM Iol H o NM *) *) HO ho f) J HO-* HMNH NH NH H 8 H o ~ WX-C no inh. no inh. at 34 0, 01 N 340 at 100 100 pM II H o NM. N H pu H2N NH NH H H WX-14, 7 rTY-fY""'" I I \ O HO O/OH : i li NH WX-40 no inh. at 0, 016 N N oh neo HLNH 0 Nu HZN'NH ; nu NH WX-130 > 100 > 100 0, 041 N 538 ö so HOCH i H2NrNH NH NH H wx-no inh. at 0, 83 H 544 100 PM Ny N N ZON T NU WX-2, 5 > 50 > 100 0, 10 550 ZU N N HO H2N) rNH T NH Ha H, N NH H Me *°, H WX-0, 01 453 t INX o"S<>CI 582 i" 11 Nu H H 4 HS M6 H 0, o hein H2NrNH NH NH H H Ho-0, 5 N N M5 N ouzo HN NH NH NH 9 n WX->1000 >1000 2, 1 O0N t"SsC 568 568 HO NU HA r, HN'NH I I NH H2N ; ; NH. WX, 2, N 0 hfOr O HN'NHZ ici NH 1

*) no inh. = keine Inhibierung *) no inh. at = keine Inhibierung bei Beispiel 15 In vitro Hemmung von Urokinase durch WX-508 Zur Bestimmung der uPA Inhibitoraktivität wurden 200 NI Tris-Puffer (0,05 mol/l, den Inhibitor enthaltend, 0,154 mol/I NaCI, pH 8,0), 25, ul Substrat (Pefachrome uPA oder BZ-ß-Ala-Gly-Arg-pNA in H20 ; Pentapharm LTD, Basel, Schweiz) und 50, ul Urokinase (Calbiochem-Novabiochem GmbH, Bad Soden, Deutschland) bzw. eine entsprechende andere Protease bei 30 °C inkubiert. Nach ca. 30 Minuten und 30 Zyklen wird die Absorption bei 405 nm mittels eines Mikroplate Reader (Mediators PHL, Aureon Biosystems, Wien, Österreich) bestimmt. Die Kj-Werte wurden nach Dixon durch lineare Regression mittels eines Computerprogramms ermittelt. Die K,-Werte sind das Mittel aus mindestens drei Bestimmungen, die Standardabweichung lag unter 25 %.

K ; (, uM) Urokinase 0,04 Plasmin > 1000 Thrombin > 1000 Beispiel 16 : Zellkulturexperimente (Caco-Assay) Es wurde der Transport der Verbindungen WX-508, WXC-316, WXC-318, WXC-324, WXC-340, WX-532, WX-538, WX-550 und WX-582 über Caco-2-Zellmonoschichten untersucht. In diesem Versuch wurden die genannten Verbindungen hinsichtlich ihrer Bioverfügbarkeit nach oraler Applikation beurteilt.

16.1 Versuchsaufbau 16.1. 1 Zellkultur :

Caco-2-Zellen (American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA) werden in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (Life Technologies, Gibco BRL, UK) enthaltend 10 % Vol/Vol hitzedenaturiertes fötales Kälberserum (FCS), 1 % Vol/Vol nicht essenzielle Aminosäuren, 160 U/ml Benzylpenicillin und 100 U/ml Streptomycin (Sigma Chemical, St. Louis, MO, USA) kultiviert. Die Zellen werden bei 37 °C in einer Atmosphäre aus 95 % Luft und 5 % CO2 bei 90 % relativer Luftfeuchtigkeit gehalten. Die Zellen werden in 25 cm3 Kulturkolben gezüchtet, wobei das Medium jeden zweiten Tag gewechselt wird und die Zellen einmal in der Woche trypsiniert werden.

16.1. 2. Transportexperimente und transepithelialer elektrischer Widerstand (TEER) Für Transportuntersuchungen werden die Caco-2-Zellen auf porösen Polycarbonatfiltermembranen mit einer Porengröße von 0, 4 Im und einer Oberfläche von 4,7 cm2 in Clustern von 6 Vertiefungen (Costar Transwell, Badhoevedorp, Niederlande) kultiviert. Die Zellen werden mit einer anfänglichen Dichte von 104 Zellen/cm2 auf jeden Filter geimpft. Diese Zellen werden bei 37 °C in einer wie oben beschriebenen Atmosphäre gehalten. Das Medium wird jeden zweiten Tag über drei Wochen ersetzt.

Am Tag der Transportexperimente wird das Kulturmedium mit dem gleichen Volumen an Hank's ausgeglichener Salzlösung (HBSS) gepuffert mit 30 mM HEPES bei pH 7,2 (Transportmedium) ersetzt und die Zellen werden für eine Stunde äquilibrieren gelassen. Danach wird das Apicalmedium durch 1,5 mi einer die Verbindungen enthaltende Lösung in HBSS/HEPES (10 , ug/mi) ersetzt. Die Zellmonoschichten werden für vier Stunden inkubiert.

Proben von den apicalen und basolateralen Kompartementen werden am Ende der Experimente genommen und zur quantitativen Bestimmung des Transports der jeweiligen Verbindungen herangezogen.

Der transepitheliale elektrische Widerstand (TEER) wird vor und nach dem Äquilibrieren unter Verwendung eines Milicell ERS-Meters gemessen, welches mit einem Paar Elektroden verbunden war, um die Integrität der auf den Filtern gebildeten Monoschichten sicherzustellen. TEER wird auch am Ende der Experimente gemessen, um sicherzustellen, dass die Zellmonoschicht zusammenhängend bleibt.

Permeabilitätsuntersuchungen unter Verwendung von'4C-Mannitol über Caco-2-Zellmonoschichten werden durch Zugabe von 1,5 mi der radioaktiv markierten"C-Mannitollösung in HBSS-HEPES (4 mol/1 mit einer spezifischen Aktivität von 0, 2 NCi/ml) zu der apicalen Seite durchgeführt.

Proben von der apicalen und der basolateralen Seite werden entnommen und nach Zugabe eines Szintillationscocktails in einem Beta-Zähler analysiert. Alle Experimente wurden dreifach durchgeführt.

Das Flussschema des Experiments ist wie folgt : Zeit (h) 1 2 3 4 5 Äquilibrierung Inkubation mit/ohne Verbindungen 1 TEER TEER TEER Ergebnisse :

Verbindung % Menge im basolateralen Kompartement WX-508 0, 2 0, 1 0, 7 WXC-316 0, 2 0, 2 3, 6 WXC-318 0,4 1,0 4,5 WXC-324 0,1 0,1 2,0 WXC-340 2, 4 0, 2 0, 1 Wu-532000 WX-538 0, 2 0, 2 0, 1 wu-55003,) 0,6 WX-582 0, 4 3, 1 5,2 16.1. 3 Ergebnisse Caco-2-Zellmonoschichten bilden das humane intestinale absorptive Epithel nach und stellen ein wertvolles Werkzeug zur Untersuchung des transepithelialen Transports dar. Die TEER-Werte stellen eine Kontrolle für die Lebensfähigkeit und Zusammenhängigkeit der Monoschicht dar und waren zwischen 100 % und 120 %. TEER ist definiert als das Produkt von Widerstand x Oberfläche. Der Widerstand reflektiert die Resistivität über dichte Verbindungen (parazelluläre Route) und nicht über Zellmembranen (transzelluläre Route).

Die in dieser in vitro Transportuntersuchung erhaltenen Werte zeigen, dass für die untersuchten Verbindungen ein Transport von der apicalen Seite der epithelialen Zellschicht zur basolateralen Seite auftritt. Die Ergebnisse zeigen, dass die untersuchten Verbindungen eine Bioverfügbarkeit aufweisen.

Die Ergebnisse für die untersuchten Verbindungen sind nochmals in der folgenden Tabelle zusammengefasst : Tabelle: Bestimmung der Inhibitorischen Konstante, Spezifität und der oralen Bioverfügbarke Formel Bez. Ki [pM] Ki [pM] Ki [pM] Ki [pM] Ki [pM] Caco-2 assay uPA Plasmin FXa Thrombin PK % basolateral H tf H 0, 2/0, 1/0, 7 Wu'508 0, 034 >200 > 350 180. lí > HO H's H2N) (NH NU MG : 499 H R H 0, 2/0, 2/3, 4 ex-0, 09 no inh. at 32. 4 no inh. at 875 0, 1/0, 1/3, 6 a NO2 C316 100 uM 100 uM 9 HO)) HO H2N NH ICI NH MG : 544 ; Lösl. : mind. 20 mg/ml PBS 0 0, 4/1, 0/4, 5 WX-0, 047 no inh. at 36 no inh. at 176 0, 2/0, 6 l 7, 0 o c C318 100 NM 100 NM HO H2N NH NH T NH MG : 533, 5 H 0 521 ci 2, 4/0, 2/0, 1 ; s WX-0, 01 no inh. at 34 no inh. at 216 2, 3/0, 1/0, 1 N, s"Z 0 H C340 100 PM 100 PM HO HO)) H2N NH Y NH MG : 533, 5 H ) ? H 0/0/0 N N WX-532 0, 016 40 no inh. at 49 "o,, o /100 NM I ho 0 H 0 100 PM H2NNH NH NH NH MG : 513 H H 0, 2/0, 2/0, 1 N N WX-538 0, 041 130 >100 |> 100 |109 ; 0, 1/0, 1/0 nus HA T NH Ho MG : 513 0/3, 1/0, 6 WX-550 0, 10 2, 5 >100 >50 268 Homo- H ° H Phe H H hirn N HA T NH NI NH MG : 603 ; Lösl. : 5 mg/ml PBS+10% EtOH H-8 H 0/3, 1/5, 2 wax-582 0, 01 58 0, 4/2, 9/3, 0 IÖ Me OH CL T NH NH MG : 564 0 N N N, wx-0, 27 Y'-H HO S 0 HOU H2NYHNH NH MG : 465, 0 H H 0 11 WX-0, 16 1 ho Ho / H2NYHNH NH NH MG : 559, 1 0, 1/0, 1/2, 9 wax-0/0/3, 0 C324 *) no inh. = keine Inhibierung *) no inh. at = keine Inhibierung bei

Beispiel 17 : In vivo Untersuchungen Zehn erfindungsgemäße uPA Inhibitor-Kandidaten wurden in Nagern hinsichtlich oraler Bioverfügbarkeit und Plasmakinetik untersucht. Hierzu wurden Versuche an neun Wochen alten weiblichen Balb/c-Mäusen mit einem Gewicht von 17,6 bis 18,5 g durchgeführt. Die folgenden Testsubstanzen, welche Guanidinophenylalanin-Derivate mit HCI als Gegenion sind, wurden eingesetzt : MW einschl. Ki human HCI uPA [, uM] 1 WX-508 499 0, 034 2 WXC-316 544 0, 09 3 WXC-318 534 0, 047 4 WXC-340 533 0, 01 5 WX-532 513 0, 016 6 WX-538 513 0, 041 7 WX-550-603 0, 10 Homo-Phe 8 WX-582 564 0, 01 9 WXC-300 465 0, 27 10 WXC-298 559 0, 016 Die Verbindungen wurden im Bereich von 0,1 bis 1000 mg/kg, insbesondere 0,5 bis 500 mg und mehr bevorzugt 3 bis 300 mg/kg eingesetzt. Die Verabreichung erfolgte dabei über eine Magensonde. Die Probenahme erfolgte bei 20,40 und 60 Minuten.

Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengefasst.

Test-Dosis Zeitpunkt c [, ug/ml] im c [, ug/ml] substanz mg/kg der Proben-Serum im Serum nahme 1. Analyse 2. Analyse 0 41,1 55,5 10 i. v. 10 4,3 4,7 WX-508 30 0, 7 0, 2 20 0,3 0,3 30 oral 40 5,7 4,5 60 0, 08 0, 09 20 3, 5 300 oral 40 7,5 8,3 60 5, 4 5, 8 0 45,4 67,5 10 i. v. 10 12,4 14,3 30 2,7 2,6 WXC-316 20 0,5 0,6 30 oral 40 5, 9 7, 1 60 0, 4 0, 5 20 6,0 7,2 300 oral 40 21,8 32, 1 60 5, 3 5, 8 0-48, 4 10 i. v. 10 4,3 5,5 30 0,7 1, 4 20 0, 1 0, 2 30 oral 40-0, 05 60 0, 2 0, 2 20 100 82,6 300 oral 40 5,4 6,2 60 7,5 7,7

0 51,8 10 i. v. 10 5, 3 WXC-340 30 1, 7 20 0,3 0,5 30 oral 40 0, 3 0, 8 60 1,4 2,3 20 4,5 300 oral 40 4, 9 60 4, 3 0 61,7 68,8 10 i. v. 10 3,8 3,5 WX-532 3011, 411, 2 20 1,5 30 oral 40 10,9 60 0, 9 20 5,8 6,7 300 oral 40 2, 9 3, 3 60 12, 8 15, 0 0 45,8 10 i. v. 10 5, 5 30 0, 6 WX-538 20 0, 1 30 oral 40 0, 05 60 0, 2 20 2,5 300 oral 40 3,5 60 2, 3 0 7,2 2,5 i. v. 10 0, 7 30 0, 02 WX-550 20 0 7, 5 oral 40 0 60 0 20 0 75 oral 40 0, 3 60 0 0 11, 5 2,5 i. v. 10 0, 8 30 0, 1 WX-582 20 0 7, 5 oral 40 0 60 0 20 1 75 oral 40 0,7 60 0, 4 0 66, 2 10 i. v. 10 18, 3 30 2, 1 WXC-298 20 0,2 30 oral 40 0, 4 60 0, 1 20 17, 0 300 oral 40 10, 7 60 7, 0 0 94,4 10 i. v. 10 11, 0 30 1, 3 WXC-300 20 0,2 30 oral 40 0, 2 60 0, 2 20 1,5 300 oral 40 4,6 60 0, 6