SUBSTITUIERTE BENZO (D) ISOAXOL-3-YL-AMIN- VERBINDUNGEN ALS ANALGETIKA

Die vorliegende Erfindung betrifft substituierte Benzo[d]isoxazol-3-yl-amin- Verbindungen, Verfahren zu ihrer Herstellung, Arzneimittel enthaltend diese Verbindungen sowie die Verwendung dieser Verbindungen zur Herstellung von Arzneimitteln.

Die Behandlung von Schmerz, insbesondere von neuropathischem Schmerz, hat in der Medizin große Bedeutung. Es besteht ein weltweiter Bedarf an wirksamen Schmerztherapien. Der dringende Handlungsbedarf für eine patientengerechte und zielorientierte Behandlung chronischer und nicht chronischer Schmerzzustände, wobei hierunter die erfolgreiche und zufriedenstellende Schmerzbehandlung für den Patienten zu verstehen ist, dokumentiert sich auch in der großen Anzahl von wissenschaftlichen Arbeiten, die auf dem Gebiet der angewandten Analgetik bzw. der Grundlagenforschung zur Nociception in letzter Zeit erschienen sind.

Ein pathophysiologisches Merkmal von chronischen Schmerzen besteht in der Überregbarkeit von Neuronen. Die neuronale Erregbarkeit wird entscheidend von der Aktivität von K ⁺ Kanälen beeinflusst, da diese das Ruhemembranpotential der Zelle und somit die Erregbarkeitsschwelle maßgeblich bestimmen. Heteromere K ⁺ Kanäle vom molekularen Subtyp KCNQ2/3 (Kv7.2/7.3) sind in Neuronen verschiedener Regionen des zentralen (Hippocampus, Amygdala) und peripheren (Hinterwurzelganglien) Nervensystems exprimiert und regulieren deren Erregbarkeit. Die Aktivierung von KCNQ2/3 K ⁺ Kanälen führt zu einer Hyperpolarisation der Zellmembran und damit einhergehend zu einer Abnahme der elektrischen Erregbarkeit dieser Neurone. KCNQ2/3 exprimierende Neurone der Hinterwurzelganglien sind an der Übertragung nociceptiver Erregungen von der Peripherie ins Rückenmark beteiligt (Passmore et al., 2003). Dementsprechend konnte für den KCNQ2/3 Agonisten Retigabine eine analgetische Wirksamkeit in präklinischen Neuropathie- und Entzündungsschmerzmodellen nachgewiesen werden (Blackburn-Munro and Jensen, 2003; Passmore et al., 2003; Dost et al., 2004). Der KCNQ2/3 K ⁺ Kanal stellt somit einen geeigneten Ansatzpunkt zur Behandlung von Schmerz; insbesondere von Schmerz ausgewählt aus der Gruppe

bestehend aus chronischem Schmerz, neuropathischem Schmerz, inflammatorischem Schmerz und muskulärem Schmerz (Nielsen et al., 2004), insbesondere von neuropathischem und inflammatorischem Schmerz dar. Darüber hinaus ist der KCNQ2/3 K ⁺ Kanal ein geeignetes Target für die Therapie einer Vielzahl weiterer Erkrankungen wie beispielsweise Migräne (US2002/0128277), kognitive Erkrankungen (Gribkoff, 2003), Angstzuständen (Korsgaard et al., 2005), Epilepsie (Wickenden et al., 2004) und Haminkontinenz (Streng et al., 2004).

Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung bestand daher darin, neue Verbindungen zur Verfügung zu stellen, die sich insbesondere als pharmakologische Wirkstoffe in Arzneimitteln eignen, vorzugsweise in Arzneimitteln zur Behandlung von Störungen oder Krankheiten, die zumindest teilweise durch KCNQ2/3 K ⁺ Kanäle vermittelt werden.

Überraschenderweise wurde nun gefunden, dass substituierte Benzo[d]isoxazol-3-yl- amin-Verbindungen der nachstehend angegebenen allgemeinen Formel I sich zur Behandlung von Schmerzen eignen und auch eine ausgezeichnete Affinität zum KCNQ2/3 K ⁺ Kanal aufweisen und sich daher zur Behandlung von Störungen oder Krankheiten eignen, die zumindest teilweise durch KCNQ2/3 K ⁺ Kanäle vermittelt werden.

Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind daher substituierte Benzo[d]isoxazol-3-yl-amin-Verbindungen der allgemeinen Formel I,

worin

R ¹ , R ² , R ³ und R ⁴ , unabhängig voneinander, jeweils für

H; F, Cl, Br, I; -CN; -NO ₂ ; -SF ₅ ; -NR ⁷ R ⁸ ; -OR ⁹ ; -SR ¹⁰ ; -C(=O)OR ¹¹ ; -(C=O)NR ¹² R ¹³ ; -S(=O) ₂ R ¹⁴ ; -C(=O)R ¹⁵ ; -NR ¹⁶ -S(=O) ₂ R ¹⁷ ;

für einen linearen oder verzweigten, gesättigten oder ungesättigten, unsubstituierten oder wenigstens einfach substituierten aliphatischen Rest;

für einen gesättigten oder ungesättigten, unsubstituierten oder wenigstens einfach substituierten, ggf. wenigstens ein Heteroatom als Ringglied aufweisenden cycloaliphatischen Rest, der mit einem mono- oder polyzyklischen Ringsystem kondensiert und/oder über eine lineare oder verzweigte Alkylen-, Alkenylen- oder Alkinylen-Gruppe gebunden sein kann;

oder für einen unsubstituierten oder wenigstens einfach substituierten Aryl- oder Heteroaryl-Rest steht, der mit einem mono- oder polyzyklischen Ringsystem kondensiert und/oder über eine lineare oder verzweigte Alkylen, Alkenylen- oder Alkinylen-Gruppe gebunden sein kann,

R ⁵ für

-C(=S)NR ²¹ R ²²

oder für einen linearen oder verzweigten, gesättigten oder ungesättigten, unsubstituierten oder wenigstens einfach substituierten aliphatischen Rest;

oder für einen unsubstituierten oder wenigstens einfach substituierten Aryl- oder Heteroaryl-Rest steht, der mit einem mono- oder

polyzyklischen Ringsystem kondensiert sein kann und über eine lineare oder verzweigte Alkylen-Gruppe gebunden ist,

R ⁷ und R ⁸ , unabhängig voneinander, jeweils für

H, -C(=O)R ¹⁵ oder für einen linearen oder verzweigten, gesättigten oder ungesättigten, unsubstituierten oder wenigstens einfach substituierten aliphatischen Rest stehen, oder

R ⁷ und R ⁸ zusammen mit dem sie verbindenden Stickstoffatom als Ringglied einen gesättigten oder ungesättigten, unsubstituierten oder wenigstens einfach substituierten, ggf. wenigstens ein weiteres Heteroatom als Ringglied aufweisenden heterocycloaliphatischen Rest bilden,

R ⁹ , R ¹⁰ , R ¹¹ und R ¹⁶ unabhängig voneinander, jeweils für

H;

für einen linearen oder verzweigten, gesättigten oder ungesättigten, unsubstituierten oder wenigstens einfach substituierten aliphatischen Rest;

für einen gesättigten oder ungesättigten, unsubstituierten oder wenigstens einfach substituierten, ggf. wenigstens ein Heteroatom als Ringglied aufweisenden cycloaliphatischen Rest, der mit einem mono- oder polyzyklischen Ringsystem kondensiert und/oder über eine lineare oder verzweigte Alkylen-Gruppe gebunden sein kann;

oder für einen unsubstituierten oder wenigstens einfach substituierten Aryl- oder Heteroaryl-Rest stehen, der mit einem mono- oder polyzyklischen Ringsystem kondensiert und/oder über eine lineare oder verzweigte Alkylen-Gruppe gebunden sein kann;

R ¹² und R ¹³ , unabhängig voneinander, jeweils für

H oder für einen linearen oder verzweigten, gesättigten oder ungesättigten, unsubstituierten oder wenigstens einfach substituierten aliphatischen Rest stehen, oder

R ¹² und R ¹³ zusammen mit dem sie verbindenden Stickstoffatom als Ringglied einen gesättigten oder ungesättigten, unsubstituierten oder wenigstens einfach substituierten, ggf. wenigstens ein weiteres Heteroatom als Ringglied aufweisenden heterocycloaliphatischen Rest bilden,

R ¹⁴ für

-NR ⁷ R ⁸ ;

für einen linearen oder verzweigten, gesättigten oder ungesättigten, unsubstituierten oder wenigstens einfach substituierten aliphatischen Rest,

für einen gesättigten oder ungesättigten, unsubstituierten oder wenigstens einfach substituierten, ggf. wenigstens ein Heteroatom als Ringglied aufweisenden cycloaliphatischen Rest, der mit einem mono- oder polyzyklischen Ringsystem kondensiert und/oder über eine lineare oder verzweigte Alkylen-Gruppe gebunden sein kann,

oder für einen unsubstituierten oder wenigstens einfach substituierten Aryl- oder Heteroaryl-Rest steht, der mit einem mono- oder polyzyklischen Ringsystem kondensiert und/oder über eine lineare oder verzweigte Alkylen-Gruppe gebunden sein kann,

R ¹⁵ und R ¹⁷ , unabhängig voneinander, jeweils für

für einen linearen oder verzweigten, gesättigten oder ungesättigten, unsubstituierten oder wenigstens einfach substituierten aliphatischen Rest,

für einen gesättigten oder ungesättigten, unsubstituierten oder wenigstens einfach substituierten, ggf. wenigstens ein Heteroatom als Ringglied aufweisenden cycloaliphatischen Rest, der mit einem mono- oder polyzyklischen Ringsystem kondensiert und/oder über eine lineare oder verzweigte Alkylen-Gruppe gebunden sein kann,

oder für einen unsubstituierten oder wenigstens einfach substituierten Aryl- oder Heteroaryl-Rest steht, der mit einem mono- oder polyzyklischen Ringsystem kondensiert und/oder über eine lineare oder verzweigte Alkylen-Gruppe gebunden sein kann,

R ²¹ und R ²² , unabhängig voneinander, jeweils für H,

für einen linearen oder verzweigten, gesättigten oder ungesättigten, unsubstituierten oder wenigstens einfach substituierten aliphatischen Rest,

für einen gesättigten oder ungesättigten, unsubstituierten oder wenigstens einfach substituierten, ggf. wenigstens ein Heteroatom als Ringglied aufweisenden cycloaliphatischen Rest, der mit einem mono- oder polyzyklischen Ringsystem kondensiert und/oder über eine lineare oder verzweigte Alkylen-Gruppe gebunden sein kann,

oder für einen unsubstituierten oder wenigstens einfach substituierten Aryl- oder Heteroaryl-Rest steht, der mit einem mono- oder polyzyklischen Ringsystem kondensiert und/oder über eine lineare oder verzweigte Alkylen-Gruppe gebunden sein kann,

in Form des Razemats; der Enantiomere, Diastereomere, Mischungen der Enantiomere oder Diastereomere oder eines einzelnen Enantiomers oder Diastereomers; der Basen und/oder Salze physiologisch verträglicher Säuren.

Vorzugsweise können die vorstehend genannten (hetero)cycloaliphatischen Reste ggf. jeweils mit 1 , 2, 3, 4 oder 5 Substituenten unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Oxo (=0), Thioxo (=S), F, Cl ₁ Br, I, -CN, -CF ₃ , -SF ₅ , - OH, -0-C _1-5 -AIkVl, -NH ₂ , -NO ₂ , -0-CF ₃ , -S-CF ₃ , -SH, -S-C _1-5 -Alkyl, -C _1-5 -Alkyl, -C(=O)- OH, -C(=O)-O-C _1-5 -Alkyl, -NH-d. ₅ -Alkyl, -N(C _1-5 -Alkyl) ₂ , -O-Phenyl, -O-Benzyl, Phenyl und Benzyl substituiert sein, wobei jeweils der zyklische Teil der Reste -O- Phenyl, -O-Benzyl, Phenyl und Benzyl mit 1 , 2, 3, 4 oder 5 Substituenten unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus F, Cl, Br, -OH, -CF ₃ , -SF ₅ , - CN, -NO ₂ , -C _1-5 -Alkyl, -O-Ci _-5 -Alkyl, -0-CF ₃ , -S-CF ₃ , Phenyl und -O-Benzyl substituiert sein kann. Sofern ein cycloaliphatischer Rest eines oder mehrere, beispielsweise 1 , 2, 3, 4 oder 5 Heteroatome als Ringglieder aufweist, so können diese unabhängig voneinander bevorzugt ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus Sauerstoff, Stickstoff und Schwefel.

Als (hetero)cycloaliphatische Reste seien beispielsweise Cyclopropyl, Cyclobutyl, Cyclopentyl, Cyclohexyl, Cycloheptyl, Cyclooctyl, Cyclopentenyl, Cyclohexenyl, Cycloheptenyl, Imidazolidinyl, Tetrahydrofuranyl, Tetrahydrothiophenyl, Pyrrolidinyl, Piperidinyl, Morpholinyl, Piperazinyl, Thiomorpholinyl, Tetrahydropyranyl, Azepanyl, Diazepanyl und Dithiolanyl genannt.

Unter einem mono- oder polyzyklischen Ringsystem werden im Sinne der vorliegenden Erfindung mono- oder polyzyklische Kohlenwasserstoffreste verstanden, die gesättigt oder ungesättigt sein und ggf. 1 , 2, 3, 4 oder 5 Heteroatom(e) als Ringglied(er) aufweisen können, die unabhängig voneinander aus der Gruppe bestehend aus Sauerstoff, Stickstoff und Schwefel ausgewählt sind. Ein solches mono- bzw. polyzyklisches Ringsystem kann beispielsweise mit einem Aryl-Rest oder einem Heteroaryl-Rest kondensiert (anneliert) sein.

Sofern ein polyzyklisches Ringsystem wie beispielsweise ein bizyklisches Ringsystem vorliegt, können die verschiedenen Ringe, jeweils unabhängig voneinander, einen unterschiedlichen Sättigungsgrad aufweisen, d.h. gesättigt oder ungesättigt sein. Bevorzugt ist ein bizyklisches Ringsystem.

Beispielhaft für Aryl-Reste, die mit einem mono- bzw. polyzyklischen Ringsystem kondensiert sind, seien (1 ,3)-Benzodioxolyl und (1 ,4)-Benzodioxanyl genannt.

Vorzugsweise sind die Ringe der vorstehend genannten mono- oder polyzyklischen Ringsysteme jeweils 5-, 6- oder 7-gliedrig und können jeweils ggf. 1 , 2, 3, 4 oder 5 Heteroatom(e) als Ringglied(er) aufweisen, die unabhängig voneinander aus der Gruppe bestehend aus Sauerstoff, Stickstoff und Schwefel ausgewählt sind.

Ebenfalls bevorzugt können die Ringe der vorstehend genannten mono- oder polyzyklischen Ringsysteme ggf. jeweils mit 1 , 2, 3, 4 oder 5 Substituenten unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Oxo (=0), Thioxo (=S), F ₁ Cl, Br, I, -CN, -CF ₃ , -SF ₅ , -OH, -O(C=O)-Ci. ₅ -Alkyl, -O-C^-Alky!, - NH ₂ , -NO ₂ , -0-CF ₃ , -S-CF ₃ , -SH, -S-d.g-Alkyl, -C _1-5 -Alkyl, -C(O)-OH, -C(=O)-O-Ci _-5 - Alkyl, -NH-C _1-5 -Alkyl, -N(C _1-5 -Alkyl) ₂ , -O-Phenyl, -O-Benzyl, Phenyl und Benzyl substituiert sein, wobei jeweils der zyklische Teil der Reste -O-Phenyl, -O-Benzyl, Phenyl und Benzyl mit 1 , 2, 3, 4 oder 5 Substituenten unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus F, Cl, Br, -OH, -CF ₃ , -SF ₅ , -CN, -NO ₂ , - Ci _-5 -Alkyl, -O-Ci-s-Alkyl, -0-CF ₃ , -S-CF ₃ , Phenyl und -O-Benzyl substituiert sein kann.

Ebenfalls bevorzugt können die vorstehend genannten Aryl- oder Heteroaryl-Reste ggf. jeweils mit 1 , 2, 3, 4 oder 5 Substituenten unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus F, Cl, Br, I, -CN, -CF ₃ , -SF ₅ , -OH, -O-C _1-5 -Alkyl, -NH ₂ , -NO ₂ , -0-CF ₃ , -S-CF ₃ , -SH, -S-C _1-5 -Alkyl, -C _1-5 -Alkyl, -C(=O)-OH, -C(=O)-O-Ci _-5 -Alkyl, -NH-Ci _-5 -Alkyl, -N(C _1-5 -Alkyl) ₂ , -NH-C(=O)-O-C _1-5 -Alkyl, -C(=O)-H, -0(C=O)-C _1-5 - Alkyl, -C(=O)-C _1-5 -Alkyl, -C(=O)-NH _2> -C(=O)NH-Ci _-5 -Alkyl, -C(=O)-N(C _1-5 -Alkyl) ₂ , - S(=O) ₂ NH ₂ ; -S(=O) ₂ N(H)(C _1-5 -Alkyl); -S(=O) ₂ N(C _1-5 -Alkyl)(Ci _-5 -Alkyl); -S(=O) ₂ Phenyl; -S(=O) ₂ -C _1-5 -Alkyl; Cyclohexyl; Cyclopentyl; -O-Phenyl, -O-Benzyl, Phenyl und Benzyl substituiert sein, wobei jeweils der zyklische Teil der Reste -O-Phenyl, -O- Benzyl, Phenyl, Cyclohexyl, Cyclopentyl, -S(=O) ₂ Phenyl und Benzyl mit 1 , 2, 3, 4 oder 5 Substituenten unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus F, Cl, Br, -OH, -CF ₃ , -CN, -NO ₂ , -Ci _-5 -Alkyl, -O-C _1-5 -Alkyl, -0-CF ₃ , -S- CF ₃ , Phenyl und -O-Benzyl substituiert sein kann.

Ebenfalls bevorzugt weisen die vorstehend genannten Heteroaryl-Reste jeweils 1 , 2, 3, 4 oder 5 Heteroatom(e) unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Sauerstoff, Stickstoff und Schwefel als Ringglied(er) auf.

Als Aryl-Reste seien beispielsweise Phenyl und Naphthyl (umfassend 1-Naphthyl und 2-Naphthyl) genannt.

Als Heteroaryl-Reste seien beispielsweise Thiophenyl, Furanyl, Pyrrolyl, Pyrazolyl, Pyrazinyl, Pyranyl, Triazolyl, Pyridinyl, Imidazolyl, Indolyl, Isoindolyl, Benzo[b]furanyl, Benzo[b]thiophenyl, Thiazolyl, Oxazolyl, Isoxazolyl, Pyridazinyl, Pyrazinyl, Pyrimidinyl, Indazolyl, Chinoxalinyl, Chinolinyl und Isochinolinyl genannt.

Die vorstehend genannten aliphatischen Reste, d.h. die Alkyl-, Alkenyl- und Alkinyl- Reste, können bevorzugt 1-10 bzw. 2-10 Kohlenstoffatome im Alkylteil aufweisen und bevorzugt mit ggf. 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 oder 9 Substituenten unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus F, Cl, Br, I, -CN, -NO ₂ , -OH, -NH ₂ , -SH, -O(C _1-5 -Alkyl), -S(Ci-5-Alkyl), -NH(C _1-5 -Alkyl), -N(Ci^-Alkyl)(C^-Alkyl), - OCF ₃ , C _ß -β-Cycloalkyl und -SCF ₃ substituiert sein. Alkenyl-Reste weisen wenigstens eine, vorzugsweise 1 , 2, 3 oder 4 C-C-Doppelbindungen und Alkinyl-Reste wenigstens eine, vorzugsweise 1 , 2, 3 oder 4 C-C-Dreifachbindungen auf.

Bevorzugt sind Alkyl-Reste ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl, n-Butyl, sec-Butyl, Isobutyl, tert-Butyl, n-Pentyl, sec-Pentyl, neo- Pentyl und n-Hexyl, die ggf. mit 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 oder 9 Substituenten unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus F, Cl, Br, I, -CN, -NO ₂ , -OH, -NH ₂ , -SH, -OCH ₃ , -0-C ₂ H ₅ , -SCH ₃ , -S-C ₂ H ₅ , -OCF ₃ , -SCF ₃ , -NH-CH ₃ , -N(CHg) ₂ , - N(C ₂ H ₅ J ₂ und -N(CH ₃ )(C ₂ H ₅ ) substituiert sein können.

Bevorzugt sind ferner Alkenyl-Reste ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Vinyl, 1-Propenyl, 2-Propenyl, 1-Butenyl, 2-Butenyl, 3-Butenyl, 2-Methyl-buten-2-yl, 1-Pentenyl, 2-Pentenyl, 3-Pentenyl und 4-Pentenyl, die ggf. mit 1 , 2 oder 3 Substituenten unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus F, Cl, Br, I, -CN, -NO ₂ , -OH, -NH ₂ , -SH, -OCH ₃ , -0-C ₂ H ₅ , -SCH ₃ , -S-C ₂ H ₅ , -OCF ₃ , - SCF ₃ , -NH-CH ₃ , -N(CH ₃ ) ₂ , -N(C ₂ Hs) ₂ und -N(CH ₃ )(C ₂ H ₅ ) substituiert sein können.

Weiterhin bevorzugt sind Alkinyl-Reste ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Ethinyl, 1-Propinyl, 2-Propinyl, 1-Butinyl, 2-Butinyl und 3-Butinyl, die ggf. mit 1 , 2 oder 3 Substituenten unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus F, Cl, Br, I, -CN, -NO ₂ , -OH, -NH ₂ , -SH ₁ -OCH ₃ , -0-C ₂ H ₅ , -SCH ₃ , -S- C ₂ H ₅ , -OCF ₃ , -SCF ₃ , -NH-CH ₃ , -N(CH ₃ ) ₂₍ -N(C ₂ Hg) ₂ und -N(CH ₃ )(C ₂ H ₅ ) substituiert sein können.

Bevorzugt sind substituierte Benzo[d]isoxazol-3-yl-amin-Verbindungen der allgemeinen Formel I, worin

R ¹ , R ² , R ³ und R ⁴ , unabhängig voneinander, jeweils für

H; F; Cl; Br; I; -CN; -NO ₂ ; -SF ₅ ; -NR ⁷ R ⁸ ; -OR ⁹ ; -SR ¹⁰ ; -C(=O)OR ¹¹ ; -(C=O)NR ¹² R ¹³ ; -S(=O) ₂ R ¹⁴ ; -C(=O)R ¹⁵ ; -NR ¹⁶ -S(=O) ₂ R ¹⁷ ; C _1-10 -Alkyl, C _2- - _I o-Alkenyl, C _2-10 -Alkinyl;

R ⁵ für

-C(=S)NR ²¹ R ²² oder (CHR ⁶ ) _n -R ²⁵

mit n = 1 , 2 oder 3, wobei R ⁶ für H, C _3-8 -Cycloalkyl oder Ci _-6 -Alkyl steht und R ²⁵ Aryl oder Heteroaryl bedeutet

R ⁷ und R ⁸ , unabhängig voneinander, jeweils für

H, -C(=O)R ¹⁴ oder d.-io-Alkyl stehen, oder

R ⁷ und R ⁸ zusammen mit dem sie verbindenden Stickstoffatom als Ringglied einen Rest bilden, der ausgewählt ist aus Morpholin, Piperidin oder Pyrrolidin;

R s9 , _D R10 , _D R11 , u,n„dM D R16 ° unabhängig voneinander, jeweils für

H; d- ₁₀ -Alkyl, C _2- io-Alkeny!, C _2- io-Alkinyl; C _3-8 -Cycloalkyl; -(Ci _-5 - Alkylen)-C ₃ . ₈ -Cycloalkyl; Heterocycloalkyl; -(Ci- ₅ -Alkylen)- Heterocycloalkyl; Aryl; Heteroaryl; -(C _1-5 -Alkylen)-Aryl; -(C _1-5 -Alkylen)- Heteroaryl;

R ¹² und R ¹³ , unabhängig voneinander, jeweils für

H oder für einen d.-io-Alkyl-Rest; oder

R ¹² und R ¹³ zusammen mit dem sie verbindenden Stickstoffatom als Ringglied einen Rest bilden, der ausgewählt ist aus Morpholin, Piperidin oder Pyrrolidin;

R 1 ¹ 4 ⁴ f f.ü-..r

-NR ⁷ R ⁸ ; Ci- ₁₀ -Alkyl, C _2- io-Alkenyl, C _2- io-Alkinyl; C _3-8 -Cycloalkyl; -(C _1-5 - Alkylen)-C ₃ . ₈ -Cycloalkyl; Heterocycloalkyl; -(Ci _-5 -Alkylen)- Heterocycloalkyl; Aryl; Heteroaryl; -(Ci _-5 -Alkylen)-Aryl; -(Ci _-5 -Alkylen)- Heteroaryl;

R ¹⁵ und R ¹⁷ , unabhängig voneinander, jeweils für

C- _M o-Alkyl, C _2- io-Alkenyl, C _2- io-Alkinyl; C _3-8 -Cycloalkyl; -(Ci _-5 -Alkylen)- C _3-8 -Cycloalkyl; Heterocycloalkyl; -(Ci-s-AlkylenJ-Heterocycloalkyl; Aryl; Heteroaryl; -(Ci _-5 -Alkylen)-Aryl; -(Ci _-5 -Alkylen)-Heteroaryl;

R ²¹ und R ²² , unabhängig voneinander, jeweils für H, d.io-Alkyl, C _2- io-Alkenyl, C _2- i ₀ -Alkinyl; C _3-8 -Cycloalkyl; -(Ci- ₅ -Alkylen)-C _3-8 -

Cycloalkyl; Heterocycloalkyl; -(Ci- _δ -AlkylenJ-Heterocycloalkyl; Aryl; Heteroaryl;

-(Ci _-5 -Alkylen)-Aryl; -(C ₁ . ₅ -Alkylen)-Heteroaryl; wobei

die vorstehend genannten C-i-io-Alkyl-, C _2- i ₀ -Alkenyl- und C _2- i ₀ -Alkinyl-Reste jeweils linear oder verzweigt sind und ggf. mit 1 , 2, 3, 4 oder 5 Substituenten

unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus F; Cl; Br; COOH; COOC _1-4 -AIkVl; -CN; -OH; -SH; -O-C _1-2 -Alkyl; -S-Ci. ₂ -Alkyl und -NH ₂ substituiert sein können,

die vorstehend genannten C _3-8 -Cycloalkyl-Reste jeweils ggf. mit 1 , 2, 3, 4 oder 5 Substituenten unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus F; Cl; Br; -CN; -OH; -SH; -Ci. ₅ -Alkyl; -O-C _1-2 -Alkyl; -S-C _1-2 -Alkyl und -NH ₂ substituiert sein können,

die vorstehend genannten Heterocycloalkyl-Reste jeweils 4-, 5-, 6- oder 7- gliedrig sind, 1 oder 2 Heteroatome unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Sauerstoff, Schwefel und Stickstoff als Ringglied(er) aufweisen und ggf. mit 1 , 2, 3, 4 oder 5 Substituenten unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus F; Cl; Br; -CN; -OH; -SH; -C _1-5 -Alkyl; -O-d. ₂ -Alkyl; -S-C _1-2 -Alkyl und -NH ₂ substituiert sein können,

die vorstehend genannten Aryl-Reste jeweils für einen Phenyl-, Anthracenyl- oder Naphthyl-Rest stehen, der mit 1 , 2, 3, 4 oder 5 Substituenten unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus F; Cl; Br; I; -CF ₃ ; -

/ <

OCF ₃ ; -SCF ₃ ; C(=O)C _1-5 -Alkyl; < O— > ' , ^ °s/ 3 ; -NO ₂ ; Cyclohexyl;

-O(C=O)Ci _-2 -Alkyl;

-SF ₅ ; -CN; -OH; -SH; -C _1-5 -Alkyl; -O-d. ₅ -Alkyl; -S-C _1-5 -Alkyl; -C(=O)-OH;

-C(=O)-OC _1-5 -Alkyl; -NH ₂ ; -N(H)(C _1-5 -Alkyl); -N(Ci _-5 -Alkyl)(C _1-5 -Alkyl);

-S(=O) ₂ NH ₂ ; -S(=O) ₂ N(H)(Ci. ₅ -Alkyl); -S(=O) ₂ N(Ci _-5 -Alkyl)(C _1-5 -Alkyl);

-S(=O) ₂ -Phenyl; -S(=O) ₂ -d _-5 -Alkyl; Phenyl; Phenoxy, Benzyl; Benzyloxy;

Thiophenyl (Thienyl), Furanyl und Pyridinyl substituiert sein können,

die vorstehend genannten Heteroaryl-Reste jeweils 5- oder 6-gliedrig sind, 1 , 2 oder 3 Heteroatome unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Sauerstoff, Schwefel und Stickstoff als Ringglied(er) aufweisen

und ggf. mit 1 , 2, 3, 4 oder 5 Substituenten unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus F; Cl; Br; I; -CF ₃ ; -OCF ₃ ; -SCF ₃ ; - SF ₅ ; -CN; -OH; -SH; -Ci _-5 -Alkyl; -O-C _1-5 -Alkyl; -S-C _1-5 -Alkyl; -C(=O)-OH; - C(=O)-OC _1-5 -Alkyl; -NH ₂ ; -N(H)(C _1-5 -Alkyl); -NCd-s-AlkylXd.s-Alkyl); -C(=O)NH ₂ ; -C(=O)N(H)(Ci _-5 -Alkyl); -C(=O)N(Ci _-5 -Alkyl)(Ci _-5 -Alkyl); -S(=O) ₂ NH ₂ ; -S(=O) ₂ N(H)(C _1-5 -Alkyl); -S(=O) ₂ N(C _1-5 -Alkyl)(C _1-5 -Alkyl); -S(=O) ₂ -Phenyl; -S(=O) ₂ -Ci _-5 -Alkyl; Phenyl; Phenoxy, Benzyl; Thiophenyl (Thienyl), Furanyl und Pyridinyl substituiert sein können,

in Form des Razemats; der Enantiomere, Diastereomere, Mischungen der Enantiomere oder Diastereomere oder eines einzelnen Enantiomers oder Diastereomers; der Basen und/oder Salze physiologisch verträglicher Säuren.

Besonders bevorzugt sind erfindungsgemäße Verbindungen gemäß Formel I, R ¹ , R ² , R ³ und R ⁴ , unabhängig voneinander, jeweils für

H; F; Cl; Br; I; -CN; -NR ⁷ R ⁸ ; -OR ⁹ ; -SR ¹⁰ ; d- ₄ -Alkyl, C ₂ -4-Alkenyl oder C _2- 4-Alkinyl; R ⁵ für

-C(=S)NR ²¹ R ²² oder

-(CHR ⁶ VR ²⁵

mit n = 1 , 2 oder 3 wobei R ⁶ für H oder Ci _-6 -Alkyl steht und R ²⁵ Aryl oder Heteroaryl bedeutet

R ⁷ und R ⁸ , unabhängig voneinander, jeweils für

H, -C(=O)R ¹⁵ oder C^-Alkyl stehen, oder

R ⁷ und R ⁸ zusammen mit dem sie verbindenden Stickstoffatom als Ringglied einen Rest bilden, der ausgewählt ist aus Morpholin, Piperidin oder Pyrrolidin;

R ⁹ , R ¹⁰ unabhängig voneinander, jeweils für

H; C _1-4 -AIkVl, C _2-4 -Alkenyl, C^-Alkinyl; C _3-8 -Cycloalkyl; -(C ₁ , ₂ oder 3- Alkylen)-C _3-8 -Cycloalkyl; Heterocycloalkyl; -(C ₁ , ₂ oder 3-Alkylen)- Heterocycloalkyl; Aryl; Heteroaryl; -(C _{1r 2 θde} r ₃ -Alkylen)-Aryl; -(Ci _{i 2 ode} r3- Alkylen)-Heteroaryl;

R ²¹ und R ²² , unabhängig voneinander, jeweils für

H; C-i-io-Alkyl, C _2-10 -Alkenyl, C _2- i ₀ -Alkinyl; C ₃ . ₈ -Cycloalkyl; -(C _{1| 2 θd} er ₃ --Alkylen)- C _3-8 -Cycloalkyl; Heterocycloalkyl; -( C _{1i 2 oc} i _e r ₃ -Alkylen)-Heterocycloalkyl; Aryl; Heteroaryl; -( -( C _{1i 2 θde} r ₃ -Alkylen)-Heteroaryl;

wobei

die vorstehend genannten d.-io-Alkyl-, C _2- io-Alkenyl- und C _2-1 o-Alkinyl-Reste jeweils linear oder verzweigt sind und ggf. mit 1 , 2, 3, 4 oder 5 Substituenten unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus F; Cl; Br; -CN; COOH; COOC _1-4 -Alkyl; -OH; -SH; -O-C _1-2 -Alkyl; -S-C _1-2 -Alkyl und -NH ₂ substituiert sein können,

die vorstehend genannten Ci- ₄ -Alkyl-, C _2-4 -Alkenyl- und C _2-4 -Alkinyl-Reste jeweils linear oder verzweigt sind und ggf. mit 1 , 2, 3, 4 oder 5 Substituenten unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus F; Cl; Br; -CN; -OH; -OCH ₃ und -NH ₂ substituiert sein können,

die vorstehend genannten Cs-β-Cycloalkyl-Reste jeweils ggf. mit 1 , 2, 3, 4 oder 5 Substituenten unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus F; Cl; Br; -CN; -OH; -CH ₃ ; -C ₂ H ₅ ; -OCH ₃ ; und -NH ₂ substituiert sein können,

die vorstehend genannten Heterocycloalkyl-Reste jeweils 4-, 5-, 6- oder 7- gliedrig sind, 1 oder 2 Heteroatome unabhängig voneinander ausgewählt aus

der Gruppe bestehend aus Sauerstoff, Schwefel und Stickstoff als Ringglied(er) aufweisen und ggf. mit 1 , 2, 3, 4 oder 5 Substituenten unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus F; Cl; Br; -CN; -OH; -CH ₃ ; -C ₂ H ₅ ; -OCH ₃ ; und -NH ₂ substituiert sein können,

die vorstehend genannten Aryl-Reste jeweils für einen Phenyl-, Anthracenyl- oder Naphthyl-Rest stehen, der mit 1 , 2, 3, 4 oder 5 Substituenten unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus F; Cl; Br; -CF ₃ ; -

<

<

OCF ₃ ; -SCF ₃ ; O— ^{J ■} -NO ₂ , -C(=O)C _1-2 -Alkyl; Cyclohexyl; -0(C=O)C _1-2 -

Alkyl;

-SF ₅ ; -CN; -OH; Methyl; Ethyl; n-Propyl; iso-Propyl; n-Butyl; iso-Butyl; sec-

Butyl; tert.-Butyl; Methoxy; Ethoxy; -NH ₂ ; -N(CH ₃ ) ₂ ; -N(C ₂ Hs) ₂ ; Phenyl;

Benzyloxy; Phenoxy, Benzyl; Thiophenyl (Thienyl), Furanyl und Pyridinyl substituiert sein können;

die vorstehend genannten Heteroaryl-Reste jeweils für einen Furanyl-, Thienyl- (Thiophenyl-) oder Pyridinyl-Rest stehen und ggf. mit 1 , 2, 3, 4 oder 5 Substituenten unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe bestehend F; Cl; Br; -CF ₃ ; -OCF ₃ ; -SCF ₃ ; -SF ₅ ; -CN; -OH; Methyl; Ethyl; n- Propyl; iso-Propyl; n-Butyl; iso-Butyl; sec-Butyl; tert.-Butyl; Methoxy; Ethoxy; - NH ₂ ; -N(CH ₃ ) ₂ ; -N(C ₂ Hs) ₂ ; Phenyl; Phenoxy, Benzyl; Thiophenyl (Thienyl), Furanyl und Pyridinyl substituiert sein können,

in Form des Razemats; der Enantiomere, Diastereomere, Mischungen der Enantiomere oder Diastereomere oder eines einzelnen Enantiomers oder Diastereomers; der Basen und/oder Salze physiologisch verträglicher Säuren.

Bevorzugt sind Verbindungen, worin R ⁵ -C(=S)NR ²¹ R ²² bedeutet.

Bevorzugt sind auch Verbindungen, worin R ⁵ -(CHR ⁶ J _n -R ²⁵ bedeutet.

Weiterhin bevorzugt sind Verbindungen, bei denen n 1 bedeutet.

Besonders bevorzugt sind Verbindungen, worin R ²¹ für H und R ²² für Benzyl, Phenyl, Pyridyl, Naphthyl oder Phenethyl, unsubstituiert oder einfach oder mehrfach substituiert mit Methyl, Ethyl, Isopropyl, Cl, F, Br, NO ₂ , Acetyl, CN, COOH, COOCi _-4 -

Alkyl, Methoxy, Ethoxy, N(CHs) ₂ , N(C ₂ Hs) ₂ , ° , CF ₃₁ SCH ₃ ;

oder für Ci.io-Alkyl, verzweigt oder unverzweigt, gesättigt oder ungesättigt, unsubstituiert oder substituiert mit OCH ₃ , COOCH ₃ oder COOC ₂ H ₅ ; C ₃ - ₆ -Cycloalkyl, wobei die Cycloalkylgruppe über eine CH ₂ -Gruppe verknüpft sein kann; C _5-6 - Heterocycloalkyl wobei die Heterocycloalkylgruppe über eine CH ₂ -Gruppe verknüpft sein kann; steht.

Ganz besonders bevorzugt sind Verbindungen worin R ²¹ für H und R ²² für Benzyl, Phenyl, 2-Methylphenyl, Phenethyl, 2-lsoropylphenyl, 2-Chlorphenyl, 4-Fluorbenzyl, 1-(4-Fluorphenyl)ethyl, 4-Chlorbenzyl, 4-Chlor-phenethyl, 4-Nitrophenyl, 4-Acetyl- phenyl, 3-Carboxyphenyl, 3-Methylbenzoat, 4-Ethylbenzoat, 2,6-Diethylphenyl, 3- Chlor-4-methyl-phenyl, 2-Methoxyethyl, 3-Methoxypropyl, Cyclopentyl, Cyclohexyl, 3- Pyridyl, 4-Dimethylaminophenyl, 4-Diethylaminophenyl, CH ₂ COOCH ₃ , CH(CH ₃ )COOC ₂ H ₅ , CH(CH ₃ )CH ₂ COOC ₂ H ₅ , Cyclohexylmethyl, 4-Ethoxyphenyl, 3,4- Dimethoxyphenyl, 1 -Naphthyl, 3,4,5-Trimethoxyphenyl, 2,3,4,5,6-Pentafluorphenyl, Benzodioxol, 4-Fluorphenyl, Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, tert.-Butyl, AIIyI, 2- Methylprop-2-enyl, 2-Nitrophenyl, 3-Trifluormethylphenyl, 2-Trifluormethylphenyl, 4- Trifluormethylphenyl, Cyclopropyl, 2-Methylsulfanylphenyl, 3-Methylsulfanylphenyl, 4- Methylsulfanylphenyl, 3,5-Dimethylphenyl, Ethylmorpholin, ((4-Propyl)- cyclohexyl)phenyl, 4-Brom-2-trifluormethyl-phenyl, n-Octyl, n-Nonanyl, Tetrahydrofurylmethyl, 2-Ethylphenyl, 4-Cyanophenyl, 3-Cyanophenyl, 2,6- Diisopropylphenyl, n-Pentyl, n-Hexyl, sec-Butyl, Propylmorpholin, 5-Chlor-2- methoxyphenyl, 4-Chlor-3-trifluormethylphenyl, 3-Chlorphenyl, 1-Phenylethyl, CH(CH ₃ )COOCH ₃ , 2-Methoxyphenyl, 3-Methoxyphenyl, 4-Methoxyphenyl, CH ₂ CH ₂ COOC ₂ Hs, 2-Methylbenzoat, 4-Methylbenzoat, 2-Ethylbenzoat, 2- Fluorphenyl, 2-Methoxy-5-chlorphenyl oder 2,4-Dimethoxyphenyl steht.

Weiterhin bevorzugt sind Verbindungen, worin R ⁶ H bedeutet.

Ebenfalls bevorzugt sind Verbindungen, worin R ⁶ CH3 bedeutet.

Besonders bevorzugt sind auch Verbindungen, worin R ²⁵ Phenyl, Anthracenyl, Pyridyl, Thienyl oder Furyl bedeutet, jeweils unsubstituiert oder einfach oder mehrfach substituiert mit CF ₃ , SCF ₃ , C _1-4 -Alkyl, Cl, NO ₂ , O-Acetyl, OCH ₃ , F, O- Phenyl, OCF ₃ , Br, O-Benzyl, 0-AHyI, Phenyl, I, CN oder OH, vorzugsweise Phenyl unsubstituiert oder substituiert mit den genannten Resten.

Ganz besonders bevorzugt sind Verbindungen, worin R ²⁵ für 4-Trifluormethylphenyl, 4-SCF ₃ -Phenyl, 2-Methyl phenyl, Phenyl, Anthracenyl, 4-CI-Phenyl, 4-OCF ₃ -Phenyl, 4-n-Butylphenyl, 3(3-CF ₃ -Phenoxy)-phenyl, 4-OCHF ₂ -ρhenyl, 3,5-Dimethylphenyl, 3- Brom-4-methoxyphenyl, 4-Benzyloxy-3,5-dimethylphenyl, 3-Nitrophenyl, 3-Methoxy- 4-(acetylmethyl)-phenyl, 2,4,5-Trimethoxyphenyl, 4-Ethylphenyl, 3,4-Dichlorphenyl, 2,3,5-Trifluorphenyl, 4-Phenoxyphenyl, 3-Chlor-4-fluorphenyl, 3-Benzyloxy-phenyl, 3- Brom-4,5-dimethoxyphenyl, 3-Fluor-2-methylphenyl, 2-Chlor-3-trifluormethylphenyl, 3-Chlor-2-fluor-5-trifluormethylphenyl, 2-Fluor-4-trifluormethylphenyl, 4-(Allyloxy)- phenyl, 2-(Benzyloxy)-4,5-dimethoxyphenyl, 2-Phenyl-phenyl, 2,3,4-Trifluorphenyl, 2- Fluor-5-trifluorphenyl, 4-Methoxy-3-methylphenyl, 2-Fluor-3-chlorphenyl, 3,4- Difluorphenyl, 2,6-Dichlorphenyl, 3-lodphenyl, 3-lod-4,5-dimethoxyphenyl, 2- Cyanophenyl, 4-Hydroxyphenyl, 3,4-Dimethylphenyl oder 3-OCF ₃ -Phenyl steht.

Am meisten bevorzugt sind erfindungsgemäße Verbindungen ausgewählt aus der

Gruppe bestehend aus

Benzo[d]isoxazol-3-yl-[1-(4-trifluormethyl-phenyl)-ethyl] -amin

Benzo[d]isoxazol-3-yl-[1-(4-trifluormethylsulfanyl-phenyl )-ethyl]-amin

1-Benzo[d]isoxazol-3-yl-3-benzyl-thioharnstoff

1-Benzo[d]isoxazol-3-yl-3-phenyl-thiohamstoff

1-Benzo[d]isoxazol-3-yl-3-o-tolyl-thioharnstoff

1-Benzo[d]isoxazol-3-yl-3-phenethyl-thiohamstoff

1-Benzo[d]isoxazol-3-yl-3-(2-isopropyl-phenyl)-thiohamsto ff

1-Benzo[d]isoxazol-3-yl-3-(2-chlor-phenyl)-thiohamstoff

1-Benzo[d]isoxazol-3-yl-3-(4-fluor-benzyl)-thiohamstoff

1-Benzo[d]isoxazol-3-yl-3-[1-(4-fluor-phenyl)-ethyl]-thio harnstoff

1-Benzo[d]isoxazol-3-yl-3-(4-chlor-benzyl)-thioharnstoff

1-Benzo[d]isoxazol-3-yl-3-[2-(4-chlor-phenyl)-ethyl]-thio hamstoff

1-Benzo[d]isoxazol-3-yl-3-(4-nitro-phenyl)-thioharnstoff

1-(4-Acetyl-phenyl)-3-benzo[d]isoxazol-3-yl-thiohamstoff

3-(3-Benzo[d]isoxazol-3-yl-thioureido)-benzoesäure

3-(3-Benzo[d]isoxazol-3-yl-thioureido)-benzoesäuremethyl ester

4-(3-Benzo[d]isoxazol-3-yl-thioureido)-benzoesäureethyle ster

1-Benzo[d]isoxazol-3-yl-3-(2,6-diethyl-phenyl)-thioharnst off

1-Benzo[d]isoxazol-3-yl-3-(3-chlor-4-methyl-phenyl)-thioh amstoff

1-Benzo[d]isoxazol-3-yl-3-(2-methoxy-ethyl)-thioharnstoff

1-Benzo[d]isoxazol-3-yl-3-(3-methoxy-propyl)-thioharnstof f i-BenzotdJisoxazol-S-yl-S-cyclopentyl-thioharnstoff i-Benzotdlisoxazol-S-yl-S-cyclohexyl-thioharnstoff

1-Benzo[d]isoxazol-3-yl-3-pyridin-3-yl-thioharnstoff

1-Benzo[d]isoxazol-3-yl-3-(4-dimethylamino-phenyl)-thioha rnstoff

1-Benzo[d]isoxazol-3-yl-3-(4-diethylamino-phenyl)-thiohar nstoff

(3-Benzo[d]isoxazol-3-yl-thioureido)-essigsäuremethylest er

2-(3-Benzo[d]isoxazol-3-yl-thioureido)-propionsäureethyl ester

3-(3-Benzo[d]isoxazol-3-yl-thioureido)-buttersäureethyle ster

1-Benzo[d]isoxazol-3-yl-3-cyclohexylmethyl-thiohamstoff

1-Benzo[d]isoxazol-3-yl-3-(4-ethoxy-phenyl)-thioharnstoff

1-Benzo[d]isoxazol-3-yl-3-(3,4-dimethoxy-phenyl)-thioharn stoff

1-Benzo[d]isoxazol-3-yl-3-(3,4,5-trimethoxy-phenyl)-thioh arnstoff

1-Benzo[d]isoxazol-3-yl-3-pentafluorphenyl-thioharnstoff

1-Benzo[d]isoxazol-3-yl-3-naphthalen-1-yl-thioharnstoff

1-Benzo[1 ,3]dioxol-5-ylmethyl-3-benzo[d]isoxazol-3-yl-thioharnstoff

1-Benzo[d]isoxazol-3-yl-3-(4-fluor-phenyl)-thiohamstoff

1-Benzo[d]isoxazo!-3-yl-3-methyl-thioharnstoff

1-Benzo[d]isoxazol-3-yl-3-ethyl-thiohamstoff

1-Benzo[d]isoxazoi-3-yl-3-propyl-thioharnstoff

1-Benzo[d]isoxazol-3-yl-3-isopropyl-thioharnstoff

1-Benzo[d]isoxazol-3-yl-3-tert-butyl-thioharnstoff

1-Allyl-3-benzo[d]isoxazol-3-yl-thioharπstoff

1-Benzo[d]isoxazol-3-yl-3-(2-methyl-allyl)-thioharnstoff

1-Benzo[d]isoxazol-3-yl-3-(2-nitro-phenyl)-thiohamstoff

1-Benzo[d]isoxazol-3-yl-3-(2-trifluormethyl-phenyl)-thioh arnstoff

1-Benzo[d]isoxazol-3-yl-3-(3-trifluormethyl-phenyl)-thioh amstoff

1-Benzo[d]isoxazol-3-yl-3-(4-trifluormethyl-phenyl)-thioh arnstoff i-BenzotdJisoxazol-S-yl-S-cyclopropyl-thioharnstoff

2-[3-(4-Fluor-benzo[d]isoxazol-3-yl)-thioureido]-propionsäu remethylester

1-(4-Chlor-benzo[d]isoxazol-3-yl)-3-o-tolyl-thioharnstoff

1-Benzy!-3-(4-chlor-benzo[d]isoxazol-3-yl)-thioharnstoff

1-(4-Chlor-benzo[d]isoxazol-3-yl)-3-(1-phenyl-ethyl)-thio hamstoff

1-(4-Dimethylamino-benzo[d]isoxazol-3-yl)-3-isobutyl-thio harnstoff

1-(4-Dimethylamino-benzo[d]isoxazol-3-yl)-3-p-tolyl-thioh arnstoff

1-(3-Chlor-phenyl)-3-(4-dimethylamino-benzo[d]isoxazol-3- yl)-thioharnstoff

1-(4-Dimethylamino-benzo[d]isoxazol-3-yl)-3-(3-methoxy-ph enyl)-thioharnstoff

1-(4-Dimethylamino-benzo[d]isoxazol-3-yl)-3-(2-methylsulf anyl-phenyl)-thioharnstoff

1-(4-Dimethylamino-benzo[d]isoxazol-3-yl)-3-(3-methylsulf anyl-phenyl)-thioharnstoff

1-(4-Dimethylamino-benzo[d]isoxazol-3-yl)-3-(4-methylsulf anyl-phenyl)-thiohamstoff

1-(4-Dimethylamino-benzo[d]isoxazol-3-yl)-3-(2-methoxy-ph enyl)-thioharnstoff

1-(4-Dimethylamino-benzo[d]isoxazol-3-yl)-3-(4-methoxy-ph enyl)-thioharnstoff

1-(4-Dimethylamino-benzo[d]isoxazol-3-yl)-3-(3,5-dimethyl -phenyl)-thiohamstoff

1-Benzyl-3-(4-dimethylamino-benzo[d]isoxazol-3-yl)-thioha rnstoff

1-(4-Dimethylamino-benzo[d]isoxazol-3-yl)-3-(3-methoxy-pr opyl)-thioharnstoff

3-[3-(4-Dimethylamino-benzo[d]isoxazol-3-yl)-thioureido]- propionsäurethylester

2-[3-(4-Dimethylamino-benzo[d]isoxazol-3-yl)-thioureido]- propionsäurethylester

3-[3-(4-Dimethylamino-benzo[d]isoxazol-3-yl)-thioureido]- buttersäureethylester

3-[3-(4-Dimethylamino-benzo[d]isoxazol-3-yl)-thioureido]- benzoesäure

1-(4-Dimethylamino-benzo[d]isoxazol-3-yl)-3-(4-ethoxy-phe nyl)-thioharnstoff

2-[3-(4-Dimethylamino-benzo[d]isoxazol-3-yl)-thioureido]- benzoesäuremethylester

3-[3-(4-Dimethylamino-benzo[d]isoxazol-3-yl)-thioureido]- benzoesäuremethylester

4-[3-(4-Dimethylamino-benzo[d]isoxazol-3-yl)-thioureido]- benzoesäuremethylester

2-[3-(4-Dimethylamino-benzo[d]isoxazol-3-yl)-thioureido]- benzoesäureethylester

4-[3-(4-Dimethylamino-benzo[d]isoxazol-3-yl)-thioureido]- benzoesäureethylester

1-(4-Acetyl-phenyl)-3-(4-dimethylamino-benzo[d]isoxazol-3 -yl)-thiohamstoff

1-(2-Chlor-phenyl)-3-(4-methoxy-benzo[d]isoxazol-3-yl)-th iohamstoff

1-(4-Diethylamino-phenyl)-3-(4-methoxy-benzo[d]isoxazol-3 -yl)-thioharnstoff

1-(4-Methoxy-benzo[d]isoxazol-3-yl)-3-(2-morpholin-4-yl-e thyl)-thioharnstoff

2-{3-[4-(2,2,2-trifluor-ethoxy)-benzo[d]isoxazol-3-yl]-th ioureido}-propionsäuremethylester

1-Benzo[1,3]dioxol-5-ylmethyl-3-[4-(2,2,2-trifluor-ethoxy )-benzo[d]isoxazol-3-yl]-thioharnstoff

1-[4-(4-Propyl-cyclohexyl)-phenyl]-3-[4-(2,2,2-trifluor-e thoxy)-benzo[d]isoxazol-3-yl]- thiohamstoff

1-(4-Brom-2-trifluormethyl-phenyl)-3-[4-(2,2,2-trifluor-e thoxy)-benzo[d]isoxazol-3-yl]- thiohamstoff

1-(4-Methoxy-phenyl)-3-[4-(2,2,2-trifluor-ethoxy)-benzo[d ]isoxazol-3-yl]-thiohamstoff

3-{3-[4-(2,2,2-trifluor-ethoxy)-benzo[d]isoxazol-3-yl]-thiou reido}-propionsäureethylester

1-[4-(4-Methyl-benzyloxy)-benzo[d]isoxazol-3-yl]-3-octyl- thioharnstoff

1-[4-(4-Methyl-benzyloxy)-benzo[d]isoxazol-3-y!]-3-nonyl- thioharnstoff

1-Cyclopropyl-3-[4-(4-methyl-benzyloxy)-benzo[d]isoxazol- 3-yl]-thioharnstoff

1-Cyclopentyl-3-[4-(4-methyl-benzyloxy)-benzo[d]isoxazol- 3-yl]-thioharnstoff

1-Cyclohexyl-3-[4-(4-methyl-benzyloxy)-benzo[d]isoxazol-3 -yl]-thiohamstoff

1-Cyclohexy!methyl-3-[4-(4-methyl-benzyloxy)-benzo[d]isox azol-3-yl]-thiohamstoff

1-(4-Dimethylamino-phenyl)-3-[4-(2,2,2-trifluor-ethoxy)-b enzo[d]isoxazol-3-yl]-thioharnstoff

1-Allyl-3-(5-methyl-benzo[d]isoxazol-3-yl)-thiohamstoff

[3-(5-Methyl-benzo[d]isoxazol-3-yl)-thioureido]-essigsäu remethylester

1-(2-lsopropyl-phenyl)-3-(5-methyl-benzo[d]isoxazol-3-yl) -thioharnstoff

1-(5-Methyl-benzo[d]isoxazol-3-yl)-3-(4-trifluormethyl-ph enyl)-thioharnstoff

2-[3-(5-Fluor-benzo[d]isoxazol-3-yl)-thioureido]-propions äuremethylester

1-(5-Fluor-benzo[d]isoxazol-3-yl)-3-(tetrahydro-furan-2-y lmethyl)-thioharnstoff

1-(5-Brom-benzo[d]isoxazol-3-yl)-3-(2-Fluor-phenyl)-thioh arnstoff

1-(5-Brom-benzo[d]isoxazol-3-yl)-3-(2-ethy!-phenyl)-thioh arnstoff

1-(6-Chlor-benzo[d]isoxazol-3-yl)-3-(4-Fluor-phenyl)-thio harnstoff

1-(6-Chlor-benzo[d]isoxazol-3-yl)-3-(2-Fluor-phenyl)-thio harnstoff

1-(6-Chlor-benzo[d]isoxazol-3-yl)-3-cyclopentyl-thioharns toff

1-(6-Chlor-benzo[d]isoxazol-3-yl)-3-(4-cyano-phenyl)-thio harnstoff

3-[3-(6-Chlor-benzo[d]isoxazol-3-yl)-thioureido]-benzoes� �ure

1-(6-Chlor-benzo[d]isoxazol-3-yl)-3-(4-methoxy-phenyl)-th iohamstoff

1-(6-Chlor-benzo[d]isoxazol-3-yl)-3-(3-methoxy-phenyl)-th iohamstoff

1-(6-Brom-benzo[d]isoxazol-3-yl)-3-(3,4-dimethoxy-phenyl) -thiohamstoff

1-(6-Brom-benzo[d]isoxazol-3-yl)-3-naphthalen-1-yl-thioha rnstoff

1-Benzo[1 ,3]dioxol-5-ylmethyl-3-(6-brom-benzo[d]isoxazol-3-yl)-thioha rnstoff

1-(6-Fluor-benzo[d]isoxazol-3-yl)-3-(2-methylsulfanyl-phe nyl)-thioharnstoff i-CS-Cyano-phenyO-S-Cβ-fluor-benzoldJisoxazol-S-yO-thioharn stoff

1-(2-Chlor-6-methyl-phenyl)-3-(6-fluor-benzo[d]isoxazol-3 -yl)-thioharnstoff

1-(2,6-Diisopropyl-phenyl)-3-(6-fluor-benzo[d]isoxazol-3- yl)-thioharnstoff

1-(7-Fluor-benzo[d]isoxazol-3-yl)-3-methyl-thioharnstoff

1-Ethyl-3-(7-fluor-benzo[d]isoxazol-3-yl)-thioharnstoff

1-(7-Fluor-benzo[d]isoxazol-3-yl)-3-propyl-thioharnstoff

1-(7-Fluor-benzo[d]isoxazol-3-yl)-3-pentyl-thioharnstoff

1-(7-Fluor-benzo[d]isoxazol-3-yl)-3-hexyl-thioharnstoff

1-(7-Fluor-benzo[d]isoxazol-3-yl)-3-octyl-thioharnstoff

1-(7-Fluor-benzo[d]isoxazol-3-yl)-3-nonyl-thiohamstoff

1-(7-Fluor-benzo[d]isoxazol-3-yl)-3-isobutyl-thioharnstoff

1-Allyl-3-(7-fluor-benzo[d]isoxazol-3-yl)-thioharnstoff

1-(7-Fluor-benzo[d]isoxazol-3-yl)-3-p-tolyl-thiohamstoff

1-(5-Brom-benzo[d]isoxazol-3-yl)-3-(4-dimethylamino-pheny l)-thioharnstoff

1-(7-Fluor-benzo[d]isoxazol-3-yl)-3-(2-morpholin-4-yl-eth yl)-thioharnstoff

1-(7-Fluor-benzo[d]isoxazol-3-yl)-3-(3-morpholin-4-yl-pro pyl)-thioharnstoff

1-(4-Methoxy-benzo[d]isoxazol-3-yl)-3-(1-phenyl-ethyl)-th iohamstoff

1-(4-Chlor-benzyl)-3-(4-methoxy-benzo[d]isoxazol-3-yl)-th ioharnstoff

1-(4-Methoxy-benzo[d]isoxazol-3-yl)-3-(2-methoxy-phenyl)- thioharnstoff

1-(5-Brom-benzo[d]isoxazol-3-yl)-3-(4-dimethylamino-pheny l)-thioharnstoff

1-(5-Chlor-2-methoxy-phenyl)-3-(4-methoxy-benzo[d]isoxazo l-3-yl)-thioharnstoff

1-(4-Chlor-3-trifluormethyl-phenyl)-3-(4-methoxy-benzo[d] isoxazol-3-yl)-thioharnstoff

1-(2,4-Dimethoxy-phenyl)-3-(4-methoxy-benzo[d]isoxazol-3- yl)-thioharnstoff

1-[4-(2,2,2-Trifluor-ethoxy)-benzo[d]isoxazol-3-yl]-3-(3, 4,5-trimethoxy-phenyl)-thioharnstoff

Benzo[d]isoxazol-3-yl-(3-methyl-butyl)-amin

(5-Fluor-benzo[d]isoxazol-3-yl)-(2-methyl-benzyl)-amin

N4,N4-Dimethyl-N3-(3-phenyl-propyl)-benzo[d]isoxazol-3,4- diamin

N3-Butyl-N4,N4-dimethyl-benzo[d]isoxazol-3,4-diamin

Anthracen-9-ylmethyl-(4-methoxy-benzo[d]isoxazol-3-yl)-am in

(4-Chlor-benzyl)-(4-methoxy-benzo[d]isoxazol-3-yl)-amin

(6-Fluor-benzo[d]isoxazol-3-yl)-(3-nitro-benzyl)-amin

Essigsäure-4-[(6-chlor-benzo[d]isoxazol-3-ylamino)-methy l]-2-methoxyphenylester

Essigsäure-4-[(6-brom-benzo[d]isoxazol-3-ylamino)-methyl ]-2-methoxyphenylester

Benzo[d]isoxazol-3-yl-(3,4-dichlor-benzyl)-amin

Benzo[d]isoxazol-3-yl-(2,4,5-trimethoxy-benzyl)-amin

Benzo[d]isoxazol-3-yl-(4-ethyl-benzyl)-amin

(6-Chlor-benzo[d]isoxazol-3-yl)-(3,4-dichlor-benzyl)-amin

Benzo[d]isoxazol-3-yl-(2,3,5-trifluor-benzyl)-amin

(6-Chlor-benzo[d]isoxazol-3-yl)-(4-phenoxy-benzyl)-amin

(3-Chlor-4-Fluor-benzyl)-(7-fluor-benzo[d]isoxazol-3-yl)- amin

Benzo[d]isoxazol-3-yl-(4-trifluormethyl-benzyl)-amin

(7-Fluor-benzo[d]isoxazol-3-yl)-(2-methyl-pentyl)-amin

N4,N4-Dimethyl-N3-(2,3,4-trifluor-benzyl)-benzo[d]isoxazo l-3,4-diamin

N3-(2-Fluor-5-trifluormethyl-benzyl)-N4,N4-dimethyl-benzo [d]isoxazol-3,4-diamin

N3-(4-Methoxy-3-methyl-benzyl)-benzo[d]isoxazol-3,4-diami n

N3-(4-Methoxy-3-methyl-benzyl)-benzo[d]isoxazol-3,4-diami n

Benzo[d]isoxazol-3-yl-(4-trifluormethoxy-benzyl)-amin

(5-Fluor-benzo[d]isoxa2ol-3-yl)-(4-trifluormethoxy-benzyl)-a min

Benzo[d]isoxazol-3-yl-(4-trifluormethylsulfanyl-benzyl)-a min

(4-Butyl-benzyl)-(6-chlor-benzo[d]isoxazol-3-yl)-amin

(5-Fluor-benzo[d]isoxazol-3-yl)-(4-trifluormethylsulfanyl -benzyl)-amin

Benzo[d]isoxazol-3-yl-(2-fluor-4-trifluormethyl-benzyl)-a min

(7-Fluor-beπzo[d]isoxazol-3-yl)-(4-trifluormethoxy-benzy l)-amin

(7-Fluor-benzo[d]isoxazol-3-yl)-[3-(3-trifluormethyl-phen oxy)-benzyl]-amin

(4-Difluormethoxy-benzyl)-(4-methoxy-benzo[d]isoxazol-3-y l)-amin

(3,5-Dimethyl-benzyl)-(7-fluor-benzo[d]isoxazol-3-yl)-ami n

(3-Brom-4-methoxy-benzyl)-(6-fluor-benzo[d]isoxazol-3-yl) -amin

(3,5-Dimethyl-benzyl)-(6-fluor-benzo[d]isoxazol-3-yl)-ami n

(4-Benzyloxy-3,5-dimethyl-benzyl)-(6-fluor-benzo[d]isoxaz ol-3-yl)-amin

(4-Butyl-benzyl)-(6-fluor-benzo[d]isoxazol-3-yl)-amin

(6-Fluor-benzo[d]isoxazol-3-yl)-(4-trifluormethylsulfanyl -benzyl)-amin

(3-Benzyloxy-benzyl)-(6-fluor-benzo[d]isoxazol-3-yl)-amin

N3-(3,5-Dimethyl-benzyl)-benzo[d]isoxazol-3,4-diamin

N3-(4-Butyl-benzyl)-benzo[d]isoxazol-3,4-diamin

(5-Brom-benzo[d]isoxazol-3-yl)-(4-trifluormethylsulfanyl- benzyl)-amin

(3-Brom-4,5-dimethoxy-benzyl)-(7-fluor-benzo[d]isoxazol-3 -yl)-amin

(7-Fluor-benzo[d]isoxazol-3-yl)-(2-fluor-4-trifluormethyl -benzyl)-amin

N3-(3-Fluor-2-methyl-benzyl)-N4,N4-dimethyl-benzo[d]isoxa zol-3,4-diamin

N3-(2-Chlor-3-trifluormethyl-benzyl)-N4,N4-dimethyl-benzo [d]isoxazol-3,4-diamin

N3-(3-Chlor-2-fluor-5-trifluormethyl-benzyl)-N4,N4-dimeth yl-benzo[d]isoxazol-3,4-diamin

(6-Fluor-benzo[d]isoxazol-3-yl)-(2-fluor-4-trif!uormethyl -benzyl)-amin

(4-Allyloxy-benzyl)-(6-fluor-benzo[d]isoxazol-3-yl)-amin

Benzo[d]isoxazol-3-yl-(2-benzyloxy-4,5-dimethoxy-benzyl)- amin

(2-Benzyloxy-4,5-dimethoxy-benzyl)-(6-chlor-benzo[d]isoxa zol-3-yl)-amin

N3-(2-Benzyloxy-4,5-dimethoxy-benzyl)-N4,N4-dimethyl-benz o[d]isoxazol-3,4-diamin

N3-Biphenyl-2-ylmethyl-N4,N4-dimethyl-benzo[d]isoxazol-3, 4-diamin

(6-Fluor-benzo[d]isoxazol-3-yl)-(3-iodo-benzyl)-amin

(2-Benzyloxy-4,5-dimethoxy-benzyl)-(4-methoxy-benzo[d]iso xazol-3-yl)-amin

(4-Fluor-benzo[d]isoxazol-3-yl)-(3-iodo-4,5-dimethoxy-ben zyl)-amin

2-[(5-Methyl-benzo[d]isoxazol-3-ylamino)-methyl]-benzonit ril

Butyl-[4-(2,2,2-trifluor-ethoxy)-benzo[d]isoxazol-3-yl]-a min

(3-Brom-4,5-dimethoxy-benzyl)-(5-methyl-benzo[d]isoxazol- 3-yl)-amin

4-[(4-Chlor-benzo[d]isoxazol-3-ylamino)-methyl]-phenol

(6-Chlor-benzo[d]isoxazol-3-yl)-(3,4-dimethyl-benzyl)-ami n

(4-Chlor-benzo[d]isoxazol-3-yl)-(3-chlor-2-fluor-benzyl)-ami n (3,4-Difluor-benzyl)-(5-fluor-benzo[d]isoxazol-3-yl)-amin (6-Brom-benzo[d]isoxazol-3-yl)-(2,6-dichlor-benzyl)-amin (7-Fluor-benzo[d]isoxazol-3-yl)-(3-trifluormethoxy-benzyl)-a min

sowie jeweils deren entsprechende Salze, insbesondere deren Hydrochlorid- Additionssalze, und ggf. jeweils deren entsprechende Solvate.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen substituierten Benzo[d]isoxazol-3-yl-amin- Verbindungen, gemäß dem eine ggf. substituierte 2-Fluor-benzonitril-verbindung der allgemeinen Formel II,

worin die Reste R ¹ , R ² , R ³ und R ⁴ die vorstehend angegebene Bedeutung haben, in einem Reaktionsmedium, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Diethylether, Tetrahydrofuran, Acetonitril, Dimethylsulfoxid, Dimethylformamid und Dichlormethan, in Gegenwart einer Base, vorzugsweise in Gegenwart wenigstens eines Alkalimetallalkoholatsalzes, besonders bevorzugt in Gegenwart eines Alkalimetallalkoholatsalzes ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Kaliummethanolat, Natriummethanolat, Kalium-tert-butylat und Natrium-tert-butylat mit Acethydroxamsäure der Formel III

IM

vorzugsweise bei Temperaturen von 20 ⁰ C bis 100 ⁰ C zu einer Verbindung der allgemeinen Formel I,

I

worin die Reste R ¹ -R ⁴ die vorstehend genannte Bedeutung haben sowie der Rest R ⁵ für einen Wasserstoff-Rest steht, umgesetzt wird, diese ggf. gereinigt und/oder ggf. isoliert wird,

diese ggf. anschließend in einem Reaktionsmedium, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Acetonitril, Toluol, Dimethylformamid, Benzol, Ethanol, Methanol und entsprechenden Mischungen, mit wenigstens einem Isothiocyanat der allgemeinen Formel S=C=N-R ²² , worin R ²² die vorstehend angegebene Bedeutung hat, ggf. in Gegenwart wenigstens einer Base, bevorzugt in Gegenwart wenigstens einer Base ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Triethylamin, 4,4- Dimethylaminopyridin und Diisopropylethylamin, zu wenigstens einer Verbindung der allgemeinen Formel I umgesetzt wird, worin R ¹ , R ² , R ³ , R ⁴ die vorstehend genannte Bedeutung haben und R ⁵ für -C(=S)-NR ²¹ R ²² steht, wobei R ²² die vorstehend

genannte Bedeutung hat und R ²¹ für einen Wasserstoff-Rest steht, und diese ggf. gereinigt und/oder ggf. isoliert wird,

und ggf. wenigstens eine Verbindung der allgemeinen Formel I, worin R ¹ , R ² , R ³ , R ⁴ die vorstehend genannte Bedeutung haben, R ⁵ für für -C(=S)-NR ²¹ R ²² steht, wobei R ²² die vorstehend genannte Bedeutung hat und R ²¹ für einen Wasserstoff-Rest steht, in einem Reaktionsmedium, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Acetonitril, Toluol, Dimethylformamid, Benzol, Ethanol, Methanol und entsprechenden Mischungen, in Gegenwart wenigstens einer Base, bevorzugt in Gegenwart wenigstens eines Metallhydridsalzes oder eines Metallalkoholatsalzes, besonders bevorzugt in Gegenwart eines Metallhydridsalzes oder eines Metallalkoholatsalzes ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Natriumhydrid, Kaliumhydrid, Kalium-tert-butanolat, Natrium-tert-butanolat, Kaliummethanolat, Natriummethanolat, Natriumethanolat und Kaliumethanolat, mit wenigstens einer Verbindung der allgemeinen Formel LG-R ²¹ , worin LG für eine Abgangsgruppe, bevorzugt für ein Halogen-Atom, besonders bevorzugt für ein Chloratom steht, und R ²¹ die vorstehend genannte Bedeutung mit Ausnahme von Wasserstoff hat, zu wenigstens einer Verbindung der allgemeinen Formel I umgesetzt wird, und diese ggf. gereinigt und/oder ggf. isoliert wird,

oder

ggf. wenigstens eine Verbindung der allgemeinen Formel I, worin R ¹ , R ² , R ³ , R ⁴ die vorstehend genannte Bedeutung haben und R ⁵ für H steht, in einem Reaktionsmedium, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Acetonitril, Toluol, Dimethylformamid, Benzol, Ethanol, Methanol, DCM, Trifluoressigsäure und entsprechenden Mischungen, in Gegenwart wenigstens einer Base, bevorzugt in Gegenwart wenigstens eines Metallhydridsalzes oder eines Metallalkoholatsalzes oder Triethylsilan, besonders bevorzugt in Gegenwart des Triethylsilans, eines Metallhydridsalzes oder eines Metallalkoholatsalzes ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Natriumhydrid, Kaliumhydrid, Kalium-tert-butanolat, Natrium-tert-butanolat, Kaliummethanolat, Natriummethanolat, Natriumethanolat und Kaliumethanolat, mit wenigstens einer Verbindung der allgemeinen Formel R ³⁰ C(=O)H oder R ⁶ C(O)R ²⁵ , wobei R ⁶ und R ²⁵ die vorstehend genannte Bedeutung

haben und R ³⁰ für einen linearen oder verzweigten, gesättigten oder ungesättigten, unsubstituierten oder wenigstens einfach substituierten aliphatischen Rest; für einen unsubstituierten oder wenigstens einfach substituierten Aryl- oder Heteroaryl-Rest steht, der mit einem mono- oder polyzyklischen Ringsystem kondensiert sein kann; oder für einen unsubstituierten oder wenigstens einfach substituierten Aryl- oder Heteroaryl-Rest steht, der mit einem mono- oder polyzyklischen Ringsystem kondensiert sein kann und über eine lineare oder verzweigte Alkylen-Gruppe gebunden ist, zu wenigstens einer Verbindung der allgemeinen Formel I umgesetzt und diese ggf. gereinigt und/oder ggf. isoliert wird.

Wenn der Rest R ³⁰ in einer bestimmten Verbindung definiert ist, bedeutet dies, dass für diesen Fall in Strukturen der allgemeinen Formel I R ⁵ für CH ₂ R ³⁰ steht.

Die in den vorstehend beschriebenen Umsetzungen zum Einsatz kommenden Chemikalien und Reaktionskomponenten sind käuflich erhältlich oder können jeweils nach üblichen, dem Fachmann bekannten Methoden hergestellt werden.

Die vorstehend beschriebenen Umsetzungen können ferner jeweils unter üblichen, dem Fachmann geläufigen Bedingungen, beispielsweise in Hinblick auf Druck, Temperatur, Schutzgasatmosphäre oder Reihenfolge der Zugabe der Komponenten durchgeführt werden. Ggf. kann die unter den jeweiligen Bedingungen optimale Verfahrensführung vom Fachmann durch einfache Vorversuche ermittelt werden.

Die nach den vorstehend beschriebenen Umsetzungen erhaltenen Zwischen- und Endprodukte können jeweils, falls gewünscht und/oder erforderlich, nach üblichen, dem Fachmann bekannten Methoden gereinigt und/oder isoliert werden. Geeignete Reinigungsverfahren sind beispielsweise Extraktionsverfahren und chromatographische Verfahren wie Säulenchromatographie oder präparative Chromatographie sowie HPLC.

Sämtliche der vorstehend beschriebenen Verfahrensschritte sowie jeweils auch die Reinigung und/oder Isolierung von Zwischen- oder Endprodukten können teilweise oder vollständig unter einer Inertgasatmosphäre, vorzugsweise unter Stickstoffatmosphäre oder Argonatmosphäre, durchgeführt werden.

Die erfindungsgemäßen substituierten Benzo[d]isoxazol-3-yl-amin-Verbindungen können sowohl in Form ihrer freien Basen, ihrer freien Säuren wie auch jeweils in Form entsprechender Salze, insbesondere physiologisch verträglicher Salze, isoliert werden.

Die freien Basen der jeweiligen erfindungsgemäßen substituierten Benzo[d]isoxazol- 3-yl-amin-Verbindungen können beispielsweise durch Umsetzung mit einer anorganischen oder organischen Säure, vorzugsweise mit Salzsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Methansulfonsäure, p- Toluolsulfonsäure, Kohlensäure, Ameisensäure, Essigsäure, Oxalsäure, Maleinsäure, Äpfelsäure, Bernsteinsäure, Weinsäure, Mandelsäure, Fumarsäure, Milchsäure, Zitronensäure, Glutaminsäure oder Asparaginsäure, in die entsprechenden Salze, vorzugsweise physiologisch verträglichen Salze, überführt werden.

Die freien Basen der jeweiligen erfindungsgemäßen substituierten Benzo[d]isoxazol- 3-yl-amin-Verbindungen können ebenfalls mit der freien Säure oder einem Salz eines Zuckerersatzstoffes, wie z.B. Saccharin, Cyclamat oder Acesulfam, in die entsprechenden physiologisch verträglichen Salze überführt werden.

Entsprechend können die freien Säuren der erfindungsgemäßen substituierten Benzo[d]isoxazol-3-yl-amin-Verbindungen durch Umsetzung mit einer geeigneten Base in die entsprechenden physiologisch verträglichen Salze überführt werden. Beispielhaft seien die Alkalimetallsalze, Erdalkalimetallsalze oder Ammoniumsalze [NH _x R _4- X] ⁺ , worin x = 0, 1 , 2, 3 oder 4 ist und R für einen linearen oder verzweigten Ci- ₄ -Alkyl-Rest steht, genannt.

Die erfindungsgemäßen substituierten Benzo[d]isoxazol-3-yl-amin-Verbindungen können ggf., ebenso wie die entsprechenden Säuren, die entsprechenden Basen oder Salze dieser Verbindungen, nach üblichem, dem Fachmann bekannten Methoden auch in Form ihrer Solvate, vorzugsweise in Form ihrer Hydrate, erhalten werden.

Sofern die erfindungsgemäßen substituierten Benzo[d]isoxazol-3-yl-amin- Verbindungen nach ihrer Herstellung in Form einer Mischung ihrer Stereoisomeren, vorzugsweise in Form ihrer Racemate oder anderer Mischungen ihrer verschiedenen Enantiomeren und/oder Diastereomeren erhalten werden, können diese nach üblichen, dem Fachmann bekannten Verfahren getrennt und ggf. isoliert werden. Beispielhaft seien chromatographische Trennverfahren, insbesondere Flüssigkeitschromatographie-Verfahren unter Normaldruck oder unter erhöhtem Druck, bevorzugt MPLC- und HPLC-Verfahren, sowie Verfahren der fraktionierten Kristallisation genannt. Dabei können insbesondere einzelne Enantiomeren, z.B. mittels HPLC an chiraler stationärer Phase oder mittels Kristallisation mit chiralen Säuren, etwa (+)-Weinsäure, (-)-Weinsäure oder (+)-10-Camphersulfonsäure, gebildete diastereomere Salze voneinander getrennt werden.

Die erfindungsgemäßen substituierten Benzo[d]isoxazol-3-yl-amin-Verbindungen sowie jeweils die entsprechenden Säuren, Basen, Salze und Solvate eignen sich als pharmazeutische Wirkstoffe in Arzneimitteln.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein Arzneimittel enthaltend wenigstens eine erfindungsgemäße substituierte Benzo[d]isoxazol-3-yl- amin-Verbindung sowie ggf. einen oder mehrere pharmazeutisch verträgliche Hilfsstoffe.

Diese erfindungsgemäßen Arzneimittel eignen sich zur Beeinflussung von KCNQ2/3- Kanälen und üben insbesondere eine agonistische Wirkung aus.

Bevorzugt eignen sich die erfindungsgemäßen Arzneimittel zur Behandlung von Störungen oder Krankheiten, die zumindest teilweise durch KCNQ2/3-Kanäle vermittelt werden.

Bevorzugt eignet sich das erfindungsgemäße Arzneimittel zur Behandlung von einer oder mehreren Erkrankungen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Schmerz, vorzugsweise von Schmerz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus akutem Schmerz, chronischem Schmerz, neuropathischem Schmerz, muskulärem Schmerz und inflammatorischen Schmerz, Migräne; Epilepsie, Angstzuständen und

Harninkontinenz. Besonders bevorzugt eignen sich die erfindungsgemäßen Arzneimittel zur Behandlung von Schmerz, ganz besonders bevorzugt von chronischem Schmerz, neuropathischem Schmerz, inflammatorischem Schmerz und muskulärem Schmerz.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung wenigstens einer erfindungsgemäßen substituierten Benzo[d]isoxazol-3-yl-amin-Verbindung sowie ggf. eines oder mehrerer pharmazeutisch verträglicher Hilfsstoffe zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Störungen oder Krankheiten, die zumindest teilweise durch KCNQ2/3-Kanäle vermittelt werden.

Bevorzugt ist die Verwendung wenigstens einer erfindungsgemäßen substituierten Benzo[d]isoxazol-3-yl-amin-Verbindung sowie ggf. eines oder mehrerer pharmazeutisch verträglicher Hilfsstoffe zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Schmerz, vorzugsweise von Schmerz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus akutem Schmerz, chronischem Schmerz, neuropathischem Schmerz, muskulärem Schmerz und inflammatorischen Schmerz; Migräne; Epilepsie, Angstzuständen und Harninkontinenz.

Besonders bevorzugt ist die Verwendung wenigstens einer erfindungsgemäßen substituierten Benzo[d]isoxazol-3-yl-amin-Verbindung sowie ggf. eines oder mehrerer pharmazeutisch verträglicher Hilfsstoffe zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Schmerz, ganz besonders bevorzugt von chronischem Schmerz, neuropathischem Schmerz, inflammatorischem Schmerz und muskulärem Schmerz.

Das erfindungsgemäße Arzneimittel kann als flüssige, halbfeste oder feste Arzneiform, beispielsweise in Form von Injektionslösungen, Tropfen, Säften, Sirupen, Sprays, Suspensionen, Tabletten, Patches, Kapseln, Pflastern, Zäpfchen, Salben, Cremes, Lotionen, Gelen, Emulsionen, Aerosolen oder in multipartikulärer Form, beispielsweise in Form von Pellets oder Granulaten, ggf. zu Tabletten verpreßt, in Kapseln abgefüllt oder in einer Flüssigkeit suspendiert, vorliegen und als solche auch verabreicht werden. Neben wenigstens einer erfindungsgemäßen substituierten Benzo[d]isoxazol-3-yl-amin-Verbindung enthält das erfindungsgemäße Arzneimittel üblicherweise weitere physiologisch verträgliche pharmazeutische Hilfsstoffe, die

bevorzugt ausgewählt werden können aus der Gruppe bestehend aus Trägermaterialien, Füllstoffen, Lösungsmitteln, Verdünnungsmitteln, oberflächenaktiven Stoffen, Farbstoffen, Konservierungsstoffen, Sprengmitteln, Gleitmitteln, Schmiermitteln, Aromen und Bindemitteln.

Die Auswahl der physiologisch verträglichen Hilfsstoffe sowie die einzusetzenden Mengen derselben hängt davon ab, ob das Arzneimittel oral, subkutan, parenteral, intravenös, intraperitoneal, intradermal, intramuskulär, intranasal, buccal, rectal oder örtlich, zum Beispiel auf Infektionen an der Haut, der Schleimhäute und an den Augen, appliziert werden soll. Für die orale Applikation eignen sich bevorzugt Zubereitungen in Form von Tabletten, Dragees, Kapseln, Granulaten, Pellets, Tropfen, Säften und Sirupen, für die parenterale, topische und inhalative Applikation Lösungen, Suspensionen, leicht rekonstituierbare Trockenzubereitungen sowie Sprays.

Die in dem erfindungsgemäßen Arzneimittel zum Einsatz kommenden substituierten Benzo[d]isoxazol-3-yl-amin-Verbindungen können in einem Depot, in gelöster Form oder in einem Pflaster, gegebenenfalls unter Zusatz von die Hautpenetration fördernden Mitteln, als geeignete perkutane Applikationszubereitungen vorliegen. Oral oder perkutan anwendbare Zubereitungsformen können die jeweilige erfindungsgemäße substituierte Benzo[d]isoxazol-3-yl-amin-Verbindung auch verzögert freisetzen.

Die Herstellung der erfindungsgemäßen Arzneimittel erfolgt mit Hilfe von üblichen, aus dem Stande der Technik bekannten Mitteln, Vorrichtungen, Methoden und Verfahren, wie sie beispielsweise in „Remingtons Pharmaceutical Sciences", Herausgeber A.R. Gennaro, 17. Auflage, Mack Publishing Company, Easton, Pa, 1985, insbesondere in Teil 8, Kapitel 76 bis 93 beschrieben sind. Die entsprechende Beschreibung wird hiermit als Referenz eingeführt und gilt als Teil der Offenbarung.

Die an den Patienten zu verabreichende Menge der jeweiligen erfindungsgemäßen substituierten Benzo[d]isoxazol-3-yl-amin-Verbindung kann variieren und ist beispielsweise abhängig vom Gewicht oder Alter des Patienten sowie von der Applikationsart, der Indikation und dem Schweregrad der Erkrankung. Üblicherweise

werden 0,005 bis 100 mg/kg, vorzugsweise 0,05 bis 75 mg/kg Körpergewicht des Patienten wenigstens einer solchen erfindungsgemäßen Verbindung appliziert.

Im Folgenden wird die Erfindung mit Hilfe einiger Beispiele erläutert. Diese Erläuterungen sind lediglich beispielhaft und schränken den allgemeinen Erfindungsgedanken nicht ein.

Beispiele:

Die Ausbeuten der hergestellten Verbindungen sind nicht optimiert.

Alle Temperaturen sind unkorrigiert.

Abkürzungen

aq. wäßrig

APCI atmospheric pressure chemical ionisation

Äquiv. Stoffmengenäquivalente

DCM Dichlormethan

DMF Dimethylformamid

DMSO Dimethylsulfoxid

EtOAc Ethylacetat ges. gesättigt h Stunden min Minuten

NMR Kernresonanzspektroskopie

RT Raumtemperatur

Die eingesetzten Chemikalien und Lösungsmittel wurden kommerziell bei den herkömmlichen Anbietern (Acros, Avocado, Aldrich, Bachern, Fluka, Lancaster, Maybridge, Merck, Sigma, TCI, etc.) bezogen oder nach den für den Fachmann bekannten Methoden synthetisiert.

Als stationäre Phase für die Säulenchromathographie wurde Kieselgel 60 (0.040 - 0.063 mm) der Firma E. Merck, Darmstadt, eingesetzt.

Die dünnschicht-chromatographischen Untersuchungen wurden mit HPTLC- Fertigplatten, Kieselgel 60 F 254, der Firma E. Merck, Darmstadt, durchgeführt.

Die Mischungsverhältnisse von Lösungsmitteln, Laufmitteln oder für chromatographische Untersuchungen sind stets in Volumen/Volumen angegeben.

Die Analytik erfolgte durch HPLC-MS oder NMR. In den meisten Fällen wurde eine Reinheit von >80% erzielt.

Allgemeine Vorschrift zur Herstellung des Benzisoxazol-Grundgerüstes:

Das Grundgerüst der erfindungsgemäßen Benzisoxazole wurde analog der Vorschrift von Palermo (M. G. Palermo, Tetrahedron Lett. 1996; 37; 17; 2885-2886) hergestellt. Die entsprechende Beschreibung wird hiermit als Referenz eingeführt und gilt somit als Teil der vorliegenden Offenbarung. Abweichend von der genannten Vorschrift erfolgt die Aufreinigung der Benzisoxazol-Verbindungen zum Teil durch Fällen des entsprechenden HCI-Salzes.

Durchführung:

In einem Dreihalskolben wurde Acethydroxamsäure (1 ,1 Äquiv.) in DMF (1 ,45 ml / mmol Acethydroxamsäure) suspendiert. Unter Inertgas wurde Kalium-f-Butylat (1 ,1 Äquiv.) zugegeben. Die Mischung wurde 30 min. bei Raumtemperatur gerührt und anschließend mit dem ggf. substituierten 2-Fluor-benzonitril (1 Äquiv.) versetzt. Der Reaktionsansatz wurde auf 50 ⁰ C erwärmt und 1 h bei dieser Temperatur gerührt. Nach dem Abkühlen wurde die Reaktionsmischung auf eine Mischung (1 ,8 ml / mmol

Acethydroxamsäure) aus gleichen Volumenanteilen gesättigter NaCI-Lösung und Essigsäureethylester gegeben und 30 min gut gerührt. Die Phasen wurden getrennt und die wässrige Phase 3mal mit Essigester (je 0,8 ml/mmol Acethydroxamsäure) extrahiert. Die organischen Phasen wurden vereinigt und 3mal mit gesättigter NaCI- Lösung (je 0,8 ml / mmol Acethydroxamsäure) gewaschen und anschließend über Magnesiumsulfat getrocknet. Das Magnesiumsulfat wurde abfiltriert und das Filtrat zunächst am Rotationsverdampfer und anschließend an der ölpumpe aufkonzentriert.

Zur weiteren Aufreinigung war es in einigen Fällen vorteilhaft das erhaltene Hydrochlorid zu fällen.

Hierzu wurde der Rückstand in Methylethylketon (8,7 ml/g Rückstand) gelöst. Nach Zugabe von Wasser (0,1 ml/g Rückstand) wurde unter langsamen Rühren und Eis- Wasser- Kühlung Trimethylchlorsilan (0,7 ml/g Rückstand) zugetropft. Der Kolben wurde über Nacht in den Kühlschrank gestellt, der entstandene Niederschlag abfiltriert und im Exikkator mit Hilfe von Phosphorpentoxid als Trockenmittel getrocknet.

Nach dieser Vorschrift wurden die folgenden Zwischenprodukte hergestellt:

Allgemeine Vorschrift zur reduktiven Aminierung des Amino-substituierten Benzisoxazol-Grundgerüstes zur Darstellung von α-alkyl-substituierten Benzisoxazolaminen:

Durchführung

Das jeweilige Benzisoxazol (4,55 mmol, 1 Äquiv.) wurde in DCM (11 ml) gelöst, mit dem entsprechenden Alkylphenylketon (4,55 mmol, 1 Äquiv.) versetzt und 1 h unter Inertgas bei Raumtemperatur ge rührt. Anschließend wurden unter inerten

Bedingungen Triethylsilan (4,5 mmol, 1 Äquiv.) und Trifluoressigsäure (13,65 mmol, 3 Äquiv.) zugetropft und der Reaktionsansatz 4 - 12 h unter Rückfluss gerührt. Nach dem Abkühlen wurde der Ansatz mit ges. NaHCO ₃ -Lsg. auf pH 8 - 9 gestellt und die wässrige Phase 4mal mit DCM extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über MgSθ4 getrocknet und eingeengt. Das erhaltene Rohprodukt wurde durch Flash-Chromatographie (Diethylether/Hexan) aufgereinigt.

Nach dieser Vorschrift wurden die folgenden Alkylphenylketone umgesetzt:

Die folgenden Beispiele wurden nach der vorstehenden Vorschrift synthetisiert. Die Nummern der eingesetzten Edukte sind in der Tabelle angegeben.

Eingesetzte Edukte

Allgemeine Vorschrift zur reduktiven Aminierung des Amino-substituierten Benzisoxazol-Grundgerüstes:

wobei R ³⁰ für einen linearen oder verzweigten, gesättigten oder ungesättigten, unsubstituierten oder wenigstens einfach substituierten aliphatischen Rest;

für einen unsubstituierten oder wenigstens einfach substituierten Aryl- oder Heteroaryl-Rest steht, der mit einem mono- oder polyzyklischen Ringsystem kondensiert sein kann

oder für einen unsubstituierten oder wenigstens einfach substituierten Aryl- oder Heteroaryl-Rest steht, der mit einem mono- oder polyzyklischen Ringsystem kondensiert sein kann und über eine lineare oder verzweigte Alkylen-Gruppe gebunden ist.

Durchführung Automatisierte Synthese

In ein trockenes Gewindeglas wurde bei RT 100 μmol Benzisoxazol-Lösung (Lösung I, 0,05 M in DCM, 2 ml) vorgelegt und mit 100 μmol des entsprechenden Aldehyds (Lösung II, 0,15 M in DCM, 0,66 ml) versetzt. Zu der Reaktionslösung wurde eine Lösung des Gemisches aus 120μmol Triethylsilan und 300 μmol Trifluoressigsäure gegeben (Lösung III, 0,1 M Triethylsilan in DCM, 0,25 M Trifluoressigsäure in DCM, 1 ,2 ml) hinzupipettiert. Das Gewindeglas wurde mit einer Septumkappe verschlossen, und die Reaktionslösung 16h unter Rückfluß bei 60°C im gerührt. Anschließend wurde die Reaktionslösung auf RT gebracht und mit 1 ,5 ml 7%iger NaCO ₃ -Lösung alkalisch eingestellt und 30 min. durchmischt. Der Rührfisch wurde abfiltriert, und das Gefäß mit 1 ,5 ml DCM ausgespült.

Die organische Phase wurde abgenommen und gesammelt. Die wäßrige Phase wurde mit 2ml DCM versetzt, gevortext und 15 min. intensiv durchmischt. Nach dem Zentrifugieren wurde die organische Phasen abgetrennt und mit der ersten Fraktion

vereinigt. Die wäßrige Phase wurde analog ein zweites Mal mit DCM extrahiert. Anschließend wurden die vereinigten, organischen Phasen über eine MgSθ4- Kartusche getrocknet und in der GeneVac eingeengt. Die Aufreinigung erfolgte mittels HPLC.

Nach dieser Vorschrift wurden die folgenden Aldehyde umgesetzt

Die folgenden Beispiele wurden nach der vorstehenden Vorschrift synthetisiert. Die Nummern der eingesetzten Edukte sind in der Tabelle angegeben.

Eingesetzte Edukte

Identifiziert durch:

Beispiel Benzisoxazol Aldehyd Molmasse (Reinheit) Name

Benzo[d]isoxazol-3-yl-(3-methyl-

136 A Z3 204,272996 MS butyl)-amin

Ein esetzte Edukte

Synthese der Thiohamstoffe

Automatisierte Synthese

In ein trockenes Gewindeglas mit Septumkappe wurden bei RT 100 μmol Benzisoxazol-Derivat-Lösung (Lösung I; 0,1 M in Pyridin, 1 ml)) vorgelegt und mit 100 μmol Isothiocyanat-Derivat-Lösung (Lösung II; 0,1 M in Pyridin, 1 ml) versetzt. Die Reaktionslösung wurde 24h unter Rückfluß gerührt. Der Rührfisch wurde abfiltriert, und das Gefäß mit 2ml CH ₂ CI ₂ ausgespült.

Die Suspension wurde kurz aufgeschwänkt und direkt über einen 0,45 μm GHP Filter Funnel gegossen. Das Reagenzglas wurde mit 7,5 ml DCM ausgespült und anschließend wurde die Suspension im Filter-Funnel mit Hilfe von Druckluft abfiltriert. Die klare organische Phase wurde in der Gene-Vac eingeengt. Die Aufreinigung erfolgte durch HPLC.

Die folgenden Isothiocyanate wurden eingesetzt:

ie folgenden Beispiele wurden nach der vorstehenden Vorschrift synthetisiert.

Ein esetzte Edukte

Ein esetzte Edukte

Pharmakologische Methoden:

I. Fluoreszenzassay (FLIPR™-Instrument) zur Identifizierung von agonistisch wirkenden Substanzen am lonenkanal KCNQ2/3

Am Vortag des Versuchs erfolgt die Aussaat von KCNQ2/3-exprimierenden CHO-K1- Zellen bzw. CHO-K1 -Leerstamm-Zellen auf beschichtete Poly-D-Lysin-Platten black/clear (Firma Falcon/BD; Bestellnr.: 356640) in einer Konzentration von 20000 Zellen/1 OOμl MEM alpha, 50ml FCS, 5,5ml P/S/G Solution (100x) und anschließende Inkubation für 20 - 24 h im Brutschrank (37°C, 5% CO ₂ ).

Am Versuchstag werden zunächst die HBSS/Hepes-Arbeitslösung und das FMP/HBSS/Hepes-Gemisch (Membranpotential Assay Kit Red (FMP), BuIk Format Cat Nr. R8123) nach folgendem Schema hergestellt:

1. HBSS/Hepes:

1000 ml 1xHBSS-Puffer (Hank's Balanced Salt Solution (1X)(Gibco; Nr.14025) +10 ml HEPES (1 M Stammlösung, pH 7.4; Hepes-Na- Salt (Firma Sigma; Nr. H7006-500g; Lagerung bei 4°C im Kühlschrank)

2. 1x FMP/HBSS/Hepes-Arbeitslösung: 5 ml der bei -20 ⁰ C gelagerten FMP- Lösung (Herstellung s. unten; Auftauprozess bei Raumtemperatur) werden mit 6 ml HBSS/Hepes-Puffer versetzt.

Danach erfolgt eine Verdünnung der sich in Drugplates (Costar 96 well-Platten, Katnr. 3795) befindlichen Testsubstanzen (Stammlösung 2mM in 100% DMSO) durch Zugabe von HBSS/Hepes-Puffer auf eine Konzentration von 30 μM (3x konzentriert).

Die mit den Zellen bewachsenen Assayplatten werden einmalig mit 200 μl HBSS/Hepes gewaschen (Cellwash Washer, Firma Labsystems, Katnr. 5161550) und Restvolumina durch zweimaliges Ausklopfen der invertierten Platte entfernt. Anschließend werden die Zellplatten jeweils mit 100 μl der FMP/HBSS/Hepes Arbeitslösung versetzt und 1 h im CO ₂ -Brutschrank bei 37°C und 5% CO ₂ inkubiert.

Danach erfolgt die Vermessung am Instrument FLIPR III der Fa. Molecular Devices (96 Format; Benutzung des 540-590 nm Bandpass-Filters in der #2-Lokalisation). Im

experimentellen Setup der FLIPR-Software ist Filter #2 zu wählen. Die Zellplatten werden alternierend mit den Substanzplatten in den Inputstacker gestellt. Von den Zellplatten wird jeweils vor Substanzzugabe ein Signaltest durchgeführt. Danach erfolgt durch die Pipettiereinheit des FLIPRs die Zugabe der Testsubstanzen (Additionsvolumen 50μl, 3x konzentriert, Endkonzentration 10 μM) in die Cavitäten der Zellplatten zu einem Gesamtvolumen von 150 μl/well.

Die Eckdaten des FLIPR Programmes sind:

Pipettiervolumina: 50 μl

Pipettierhöhe: 225 μl

Pipettiergeschwindigkeit : 50 μl/sec

Kamerakonfiguration: Exposure = 0.4; Gain = 50

Die Pipettenspitzen werden nach jedem Pipettiervorgang 3x mit 1% DMSO in

Wasser gewaschen.

Die Zeiten der Messintervalle nach Zugabe der Testsubstanzen sehen folgendermaßen aus: Sequenz 1 : 60 x 1 sec Sequenz 2: 15 x 20 sec Gesamte Messzeit: 6 min/Platte

Die Auswertung erfolgt durch Differenzbildung zwischen Maximal- und Minimalwert. EC50/IC50 -Werte werden kalkuliert unter Benutzung der Graph Päd Prism-Software.

Lösungen:

Herstellung der Membranpotential - Loading-Puffers (Membranpotential Assay Kit

Red (FMP), BuIk Format Cat Nr. R8123) nach Angaben des Herstellers:

10 ml des 10x Assay-Puffers (Komponente B) werden mit 90 ml sterilem Wasser verdünnt und anschließend pH 7.4 mit 1.0N NaOH eingestellt (1x Assay-Puffer).

1 Gefäß mit der FLIPR Membranpotentialassay-Komponente A wird in 100 ml 1x

Assay-Puffer vollständig gelöst und für 10 min auf einem Magnetrührer durchmischt.

Anschließend werden 5 ml-Aliquots bei -2O ⁰ C gelagert (Haltbarkeit ca. 2 Wochen).

Ab einem Wert von -40 (und niedriger) ist eine agonistische Wirkung zu erkennen.

II. Voltage-clamp Messungen

Um eine KCNQ2/3 agonistische Wirkung der Substanzen elektrophysiologisch zu konfirmieren wurden patch-clamp Messungen (Hamill et al., 1981 ) im voltage-clamp Modus an einer stabil transfizierten hKCNQ2/3 CHO-K1 Zelllinie durchgeführt. Nach Ausbildung des Gigaseals wurden die Zellen zunächst auf ein Haltepotential von -60 mV geklemmt. Im Anschluss wurden depolarisierende Spannungssprünge bis zu einem Potential von +20 mV appliziert (Inkrement: 20 mV, Dauer: 1 Sekunde), um die funktionelle Expression von KCNQ2/3 typischen Strömen zu bestätigen. Die Substanztestung erfolgte bei einem Potential von -40 mV. An jeder Zelle wurde zunächst die durch Retigabin (10 μM) induzierte Stromzunahme bei -40 mV als Positivkontrolle registriert. Nach komplettem Auswaschen des Retigabineffektes (Dauer: 80 s) wurde die Testsubstanz (10 μM) appliziert. Die durch die Testsubstanz induzierte Stromzunahme wurde auf den Retigabineffekt normiert und als relative Efficacy angegeben (s. u.).

Hamill OP. Marty A. Neher E, Sakmann B. Sigworth FJ.: Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pfluαers Arch. 1981 Aug; 391 (2):85-100.

voltage clamp: relative efficacy

Beispiel. gegenüber Retigabin [10μM]

163 1 ,29

173 0,84

174 0,8

162 0,79

170 0,72

171 0,68