DITHIO-BIS-NITROBENZENES SUBSTITUES ET LEURS APPLICATIONS La présente invention est relative à des dithio-bis-nitrobenzènes substitués (dithio-bis-nitro- benzylamines, dithio-bis-nitrobenzamides ou dithio-bis- nitrophénacyles) ainsi qu'à leurs applications comme substrats alternatifs des enzymes disulfure-réductases NAD (P) H-dépendantes, telles que la trypanothion réduc- tase, la thiorédoxine réductase ou la lipoamide déshy- drogénase et comme moyen de criblage d'inhibiteurs de ces enzymes.

La présente invention est également relative à un test enzymatique mettant en oeuvre lesdits substrats ainsi qu'au kit de dosage les contenant.

La trypanothion réductase (TR) (A. H. Fairlamb et al., Annu. Rev. Microbiol., 1992,46,695-729), qui est présente chez de nombreux parasites, plus particu- lièrement chez les trypanosomidés, catalyse la réduction <BR> <BR> <BR> du trypanothion disulfure (T (S) 2), un conjugué bis (glutathionyl) spermidine en dithiol trypanothion (T (SH) 2). Dans la mesure où les parasites ne possèdent pas de glutathion réductase, le trypanothion est la source majeure de groupements thiols pour les parasites et permet le maintien d'un milieu intracellulaire réducteur.

En conséquence, la TR est une cible potentielle pour les médicaments destinés à combattre les maladies provoquées par un trypanosome (maladie du sommeil, maladie de Chagas, par exemple).

L'Article au nom de A. H. Fairlamb et al. pré- cité décrit les caractéristiques structurales de la TR.

Il enseigne, en particulier, la présence d'une région hydrophobe et de résidus chargés négativement au niveau du site actif de 1'enzyme TR et préconise donc, comme substrats alternatifs possibles du trypanothion disul- fure, des composés peptidiques hydrophobes, possédant une

fonction amine secondaire ou tertiaire chargée positive- ment.

D'autres documents décrivent également des analogues du substrat naturel de la trypanothion réduc- tase (A. El-Waer et al., Anal. Biochem, 1991,198,212- 216 ; A. El-Waer et al., Int. J. Peptide Protein Res., 1993,41,141-146 ; R. Jaouhari et al., Amino Acids, 1995,9,327-342 ; R. Jaouhari et al., Amino Acids, 1995, 9,343-351 ; I. R. Marsh et al., Eur. J. Biochem., 1997, 243,690-694).

Les analogues décrits dans ces différents documents sont des analogues du substrat physiologique de 1'enzyme, le Nl, N8-bis (glutathionyl)-spermidine oxydé ou trypanothion disulfure. Ils possèdent tous une structure peptidique.

Ces analogues diffèrent du substrat physio- logique par le remplacement de sa partie spermidine par des groupes 3-diméthylaminopropylamine (DMAPA) (A. El- Waer et al., Anal. Biochem, 1991,198,212-216 ; A. El- Waer et al., Int. J. Peptide Protein Res., 1993,41,141- 146 ; R. Jaouhari et al., Amino Acids, 1995,9,327-342 ; R. Jaouhari et al., Amino Acids, 1995,9,343-351) ou par la modification chimique des chaînes latérales d'acide glutamique (I. R. Marsh et al., Eur. J. Biochem., 1997, 243,690-694).

Ces documents montrent que de tels analogues sont moins performants que le substrat naturel (A. El- Waer et al., Anal. Biochem, 1991,198,212-216, par exemple).

En effet, les spécificités dynamiques de ces substrats alternatifs (KCat/Km) vis-à-vis de la TR sont significativement inférieures à celles du substrat natu- rel.

La thiorédoxine réductase (TrxR) catalyse la réduction NADPH-dépendante de la thiorédoxine (Trx) ; les TrxRs humaines et murines sont des sélénoenzymes. La Trx réduite participe à la régulation rédox de nombreuses enzymes essentielles à la vie cellulaire. De plus, à l'extérieur de la cellule, la Trx réduite joue le rôle d'activateur de la croissance cellulaire (facteur auto- crine). Le rôle clef joué par la Trx réduite permet de penser que l'inhibition de 1'enzyme responsable de sa réduction, entraînera l'arrêt de la croissance cellu- laire.

Chez les humains, on a observé que l'activité de cette enzyme est significativement augmentée (au moins d'un facteur 10) dans les cellules cancéreuses : l'inhibition de la thiorédoxine réductase devrait donc permettre de traiter les maladies dans lesquelles on retrouve une multiplication cellulaire rapide (cancer, paludisme, psoriasis, maladies auto-immunes, maladies parasitaires).

Le DNTB a été proposé comme substrat de substitution, pour mesurer l'activité de la thiorédoxine réductase ; toutefois, les valeurs de Km du DNTB pour les TrxRs sont élevées, incompatibles dans le cadre d'une analyse cinétique de la TrxR.

Le Brevet US 4,975,367 décrit l'utilisation du DTNB ou de certains de ses analogues en tant qu'indicateur thiol dans un système catalytique comprenant i) une disulfure-réductase, ii) un substrat disulfure, à savoir le substrat naturel de 1'enzyme utilisée, et iii) ledit indicateur thiol, la disulfure-réductase catalysant la réaction entre du NAD (P) H, formé lors de réactions catalytiques

antérieures, et le substrat disulfure, de façon à produire un composé qui peut interagir avec l'indicateur thiol pour produire un changement de couleur. Dans ce Brevet, la disulfure-réductase réagit avec son substrat naturel, puis le DTNB ou l'un de ses analogues, dénommé « indicateur thiol », réagit avec le thiol ainsi formé, produisant un composé coloré.

Pour mettre au point des médicaments aptes à inhiber ces différentes enzymes, il est nécessaire de disposer de substrats alternatifs, d'un coût raisonnable, aussi efficaces que les substrats naturels (Km, Kcat et Kcai/Km de valeurs comparables) et induisant la formation d'une substance directement mesurable par spectrométrie ou fluorométrie au cours de la réaction enzymatique, de manière à disposer d'un outil adapté, permettant la robotisation, pour le criblage de substances inhibitrices desdites enzymes.

Or, l'ensemble des substrats actuellement disponibles ne permet pas d'avoir un outil efficace de criblage d'inhibiteurs de ces enzymes.

C'est pourquoi les Inventeurs se sont donné pour but de mettre au point de nouveaux substrats, qui répondent mieux aux besoins de la pratique que les substrats de l'art antérieur, notamment : -en ce qu'ils sont peu coûteux, -en ce qu'ils sont aptes à servir de substrats à l'ensemble des disulfure-réductases NAD (P) H- dépendantes, -en ce qu'ils libèrent un chromophore ou un fluorophore au cours de la catalyse enzymatique, qui est facilement mesurable par spectrométrie visible ou fluorométrie, et -en ce qu'ils présentent des propriétés plus proches de celles du substrat naturel que les substrats

de substitution antérieurement décrits, notamment aussi bien en ce qui concerne la trypanothion réductase que la thiorédoxine réductase.

La présente invention a pour objet des dithio- bis-nitrobenzènes substitués, dont la formule générale I est la suivante : formule I dans laquelle : Ri et R2, qui peuvent être identiques ou différents représentent : -un groupe NR3R4, dans lequel R3 et R4, qui peuvent être identiques ou différents, représentent un atome d'hydrogène ou une chaîne carbonée en C1-C20, linéaire, ramifiée ou cyclique, comportant 1,2 ou 3 atomes d'azote protonable, -un groupe OR5, dans lequel R5 représente un atome d'hydrogène ou une chaîne carbonée en C1-C20, éven- tuellement substituée, linéaire, ramifiée ou cyclique, comportant 1,2 ou 3 atomes d'azote protonable, à la condition que Ri ou R2 représente un groupe NR3R4, dans lequel R3 et R4, qui peuvent être identiques ou diffé- rents, représentent un atome d'hydrogène ou une chaîne carbonée en C1-C20, linéaire, ramifiée ou cyclique, comportant 1,2 ou 3 atomes d'azote protonable, -une chaîne carbonée en C1-C20, éventuellement substituée, linéaire, ramifiée ou cyclique, comportant 1 à 4 atomes d'azote protonable, -ou bien R1 et R2 sont reliés de manière covalente, pour former un macrocycle par formation d'une chaîne du type NH-R6-NH, dans laquelle R6 représente une

chaîne carbonée en C1-C20 comportant 1 à 4 atomes d'azote protonable, Y1 et Y2, qui peuvent être identiques ou différents, représentent un groupe CH2 ou un groupe CO, à la condition que lorsque Y1 et/ou Y2 représentent un groupe CH2, R1 et R2, qui peuvent être identiques ou différents représentent uniquement un groupe NR3R4, dans lequel R3 et R4 qui peuvent être identiques ou différents, représentent un atome d'hydrogène ou une chaîne carbonée en C1-C20, linéaire, ramifiée ou cyclique, comportant 1,2 ou 3 atomes d'azote protonable, et à la condition que, lorsque Y1 et Y2 représentent un groupe CO, R1 et R2 ne représentent simultanément ni un groupe-NH- (CH2) 3-N (CH3) 2, ni un groupe : Lesdits dithio-bis-nitrobenzènes substitués sont notamment utilisables en tant que substrats alterna- tifs des disulfure-réductases NAD (P) H-dépendantes telles que les enzymes trypanothion réductase (TR), par exemple trypanothion réductase de Trypanosomia cruzi ou de Leishmania et thioredoxine réductase (TrxR), par exemple thioredoxine réductase humaine (hTrxR) ou de Plasmodium falciparum (PfTrxR) ou lipoamide déshydrogénase.

Selon un mode de réalisation avantageux desdits dérivés, Y1 et Y2 sont identiques et représentent un groupe CO ; de tels composés représentent soit des dithio-bis-nitrobenzamides, soit des dithio-bis-nitro- phénacyles et répondent à la formule II suivante : formule II dans laquelle R1 et R2 ont la même significa- tion que ci-dessus.

Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, R1 et R2 sont identiques et représentent un groupe NR3R4, dans lequel R3 et Rd sont différents : l'un représente un atome d'hydrogène et l'autre repré- sente un groupe dans lequel les groupements Xl, X2 et X3 représentent une chaîne carbonée en C1-C2o, éventuellement substituée, linéaire, ramifiée ou cyclique, comportant 1 à 4 atomes d'azote protonable, un groupe alkylamine ou un groupe arylamine, éventuellement substitués ou ramifiés ou bien Xi et X2 forment une chaîne carbonée cyclique en C4-C8 pouvant contenir éventuellement au moins un atome d'azote et X3 représente un groupe alkyle en Cl-Ce, un groupe alkylamine ou un groupe arylamine, éventuellement substitués ou ramifiés, ledit groupe étant lié par un atome de carbone d'au moins l'un des groupements Xl, X2 ou X3 à l'atome d'azote du groupe NR3R4 ; R3 ou R4 représentent par exemple le groupe suivant : (composé 2) ; de tels composés sont des dithio- bis-nitrobenzamides.

Selon une autre disposition avantageuse de ce mode de réalisation, R1 et R2 sont différents, l'un représentant un groupe OR5 et l'autre représentant un groupe NR3R4, tels que définis ci-dessus. On obtient par exemple le composé 4 représenté ci-après.

Selon encore une autre disposition avantageuse de ce mode de réalisation, R1 et R2 forment une chaîne NH- R6-NH, dans laquelle R6 représente une chaîne carbonée en C1-C20 comportant 1 à 4 atomes d'azote protonable ; on obtient ainsi le composé 5 représenté ci-après.

Ces différents dithio-bis-nitrobenzamides pré- sentent, de préférence, les caractéristiques structurales suivantes : * deux noyaux phényles sont reliés par un pont disulfure, * les deux cycles aromatiques sont substitués par un groupe nitro en para, * au moins un des cycles aromatiques est substitué, en ortho ou en méta, par un groupement CO-R1 ou CO-R2, avec les différentes variantes suivantes : . les deux cycles aromatiques sont substitués, soit en ortho, soit en méta, par un groupement amide CO- NR3R4, tel que défini ci-dessus (composé 2), . un des cycles est substitué par un groupe- ment amide CO-NR3R4, tel que défini ci-dessus (en ortho ou en méta), l'autre cycle étant substitué par un groupement carboxylique ou ester (en ortho ou en méta) (composé 4), . les deux cycles aromatiques sont reliés par un benzamide cyclique, en ortho ou en méta (composés 5).

Les formules développées des composés 2,4 et 5 sont les suivantes : composé 2 composé 4 composé 5

Selon encore une autre disposition avantageuse de ce mode de réalisation, R1 et R2 qui peuvent être iden- tiques ou différents, représentent une chaîne carbonée en C1-C20, éventuellement substituée, linéaire, ramifiée ou cyclique, comprenant 1,2,3 ou 4 atomes d'azote proto- nable ; on obtient alors des dithio-bis-nitrophénacyles.

Selon un autre mode de réalisation avantageux desdits dérivés, Y1 et Y2 sont identiques et représentent un groupe CH2 ; de tels composés sont des dithio-bis- nitrobenzylamines et répondent à la formule III suivante : formule III, dans laquelle R1 et R2, qui peuvent être iden- tiques ou différents, représentent un groupe NR3R4, dans lequel R3 et R4, qui peuvent être identiques ou diffé-

rents, représentent un atome d'hydrogène ou une chaîne carbonée en C1-C20, éventuellement substituée, linéaire, ramifiée ou cyclique, comportant 1,2 ou 3 atomes d'azote protonable.

On entend au sens de la présente invention par chaîne carbonée éventuellement substituée, linéaire rami- fiée ou cyclique, un groupement alkyle, aryle, alcoxyle, aralkyle, cycloalkyle, alkylamine ou arylamine en C1-C2o (sans compter les éventuels substituants supplémen- taires).

De manière plus précise : -l'expression alkyle désigne des groupements alkyles en C1-C6, linéaires ou ramifiés ou éventuellement substitués, comme par exemple les groupements méthyle, éthyle, propyle, butyle, isopropyle, isobutyle, sec- butyle, tertio-butyle. Ces groupements forment avec un ou plusieurs atomes d'azote des groupement alkylamino tels que : diméthylamino, diéthylamino, butylamino, diiso- propylamino, ditertiobutylamino, méthyltertiobutylamino, propyltertiobutylamino, méthylpropylamino, méthyléthyl- amino ; -l'expression alcoxyle désigne des groupe- ments alcoxyle en C1-C6, tels que les groupements méthoxyle, éthoxyle, propoxyle, butoxyle, isopropoxyle, isobutoxyle, sec-butoxyle, tertiobutyloxyle ; -1'expression aryle désigne par exemple un radical phényle, éventuellement substitué par un ou plusieurs radicaux alkyle ou alcoxyle ou un radical aro- matique hétérocyclique à 4,5 ou 6 chaînons contenant 1 à 4 hétéroatomes d'azote ; -1'expression aralkyle désigne les groupe- ments de formule générale Ar-CH2, dans laquelle Ar repré- sente un groupement aryle ;

-1'expression cycloalkyle peut désigner par exemple un radical cyclopropyle, cyclobutyle, cyclo- pentyle, cyclohexyle ; l'expression hétérocycle azoté en C4-C8 désigne par exemple les radicaux pipéridine, pyrrolidine, pipérazine, imidazole, indoline, etc... ; -les différents substituants sont générale- ment des groupes alkyles tels que définis ci-dessus.

La présente invention a également pour objet un procédé de préparation des dithio-bis-nitro- benzamides, correspondant aux produits de formule I, dans laquelle : Y1 et Y2 sont identiques et représentent chacun un groupe CO, et R1 et R2, qui peuvent être identiques ou différents, représentent un groupe NR3R4, lequel procédé est caractérisé en ce qu'il comprend : (1) la conversion de l'acide dithio-bis-nitro- benzoïque (DTNB) (acide 5,5'-dithio-bis (2-nitrobenzoique ou son isomère l'acide 6,6'-dithio-bis (3-nitro- benzoïque)) en un dérivé acylé, en présence d'au moins un agent de couplage, (2) la formation d'un amide, à partir du produit obtenu en (1), par action d'une amine présente en excès, et, (3) la purification du produit obtenu en (2).

Conformément à l'invention, les agents de couplage sont sélectionnés parmi les agents de couplage décrits dans Methods in Enzymology, 1997,289,104-126 (F. Albericio et L. A. Carpino ; édité par Fields G. B., Academic Press), par exemple les agents de couplage HOBt ( (N-hydroxybenzotriazole) ou HBTU (2- (lH-benzotriazole-l- yl)-1,1,3,3-tétraméthyluronium).

Également conformément à l'invention, l'étape (1) est réalisée en présence d'une base.

La présente invention a également pour objet un procédé de préparation des dithio-bis-nitro-phéna- cyles, correspondant aux produits de formule I, dans laquelle : Y1 et Y2 sont identiques et représentent chacun un groupe CO, et R1 et R2, qui peuvent être identiques ou différents, représentent une chaîne carbonée en C1-C20, éventuellement substituée, linéaire, ramifiée ou cyclique, comprenant 1,2,3 ou 4 atomes d'azote proto- nable, lequel procédé est caractérisé en ce qu'il comprend : (1) la formation d'une diazocétone, à partir de l'acide 5-chloro-2-nitrobenzoique ou 2-chloro-5-nitro- benzoïque, (2) 1'hydrolyse de la diazocétone par l'acide bromhydrique, (3) la substitution de l'a-bromocétone par une amine et (4) la formation du disulfure, à partir du composé obtenu en (3), par action du Na2S, S8, en milieu alcoolique, conformément au schéma 1 ci-après : Arndt'Eister 2 2-- COOH COCI CH2N2 ou RCHN2 HBr 02N CI--- 02N CI COCHN2 COCHRBr diazocétone ouCO-CRN2 HNR3R4 02N ci COCHRN' Na2S, S8 02N S-S N02 ET COR1 COR2 Schéma1 L'étape d'Arndt-Eistert est notamment décrite dans Angew. Chem. Int., 1975,14,32-43 et l'étape de formation du disulfure est notamment décrite dans JM Domagala et al., (Biorg. Med. Chem., 1997,5,3,569- 579).

La présente invention a également pour objet un procédé de préparation des dithio-bis-nitro-benzyl- amines, correspondant aux produits de formule I, dans laquelle : Y1 et Y2 sont identiques et représentent chacun un groupe CH2, et Ri et R2, qui peuvent être identiques ou différents, représentent un groupe NR3R4, dans lequel R3 et R4, qui peuvent être identique ou différents, repré- sentent un atome d'hydrogène ou une chaîne carbonée en C1- C20, éventuellement substituée, linéaire, ramifiée ou

cyclique, comprenant 1,2 ou 3 atomes d'azote protonable, lequel procédé est caractérisé en ce qu'il comprend : (1) l'amination réductrice d'un aldéhyde 5- chloro-2-nitrobenzaldéhyde ou 2-chloro-5-nitrobenzal- déhyde ; une telle réaction est notamment décrite dans JA Sclafani et al., J. Org. Chem., 1996,61,3221-3222, et (2) la formation du disulfure, à partir du composé obtenu en (1), par action du Na2S, S8, en milieu alcoolique, dans les mêmes conditions que celles exposées ci-dessus, conformément au schéma 2 ci-après : SChéma 2 En variante, lesdits produits peuvent être préparés à partir du thiophénol suivant : 2-mercapto-5- nitro-benzaldéhyde, de formule suivante : par la même réaction d'amination réductrice que celle décrite ci-dessus, après protection du thiophénol.

La présente invention a également pour objet un procédé de préparation des dithio-bis-nitrobenzamides selon l'invention, dans lesquels R1 et R2 sont différents, l'un représentant un groupe ORs et l'autre représentant un groupe NR3R4, R3, R4 et R5 étant tels que définis

précédemment, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : (1) la conversion de l'acide 5,5'-dithiobis (2-nitrobenzoique) en un monoester, selon une réaction d'estérification auto-catalysée de Fisher, à l'aide d'un alcool de formule générale R50H, Rs étant tel que défini ci-dessus, (2) la séparation du monoester obtenu en (1) de l'acide 5,5'-dithiobis (2-nitrobenzoique) et du diester également formé en (1), par chromatographie, et (3) la formation d'un amide au niveau de la fonction monoacide du composé isolé en (2), par action d'une amine de formule générale NHR3R4 en excès, R3 et R4 étant tels que définis ci-dessus, en présence d'au moins un agent de couplage.

La réaction de Fisher est telle que décrite par Tsang et al. dans J. Am. Chem. Soc., 1994,116,3988- 4005.

Les agents de couplage sont tels que décrits précédemment, par exemple le HOBt et/ou le HBTU.

A titre d'exemple, le procédé de préparation des dithio-bis-nitrobenzamides selon l'invention, dans lesquels R1 et R2 sont différents, l'un représentant un groupe ORs et l'autre représentant un groupe NR3R4, R3, R4 et R5 étant tels que définis précédemment, comprend les étapes résumées dans le schéma 3 suivant :

schéma 3 dans lequel : étape a) : alcool R50H, reflux, 50 h, étape b) amine NHR3R4 (1, 6 éq.), diisopropyl-éthylamine (4 éq.), HOBt (1,25 éq.), HBTU (1,25 éq.) dans le dichlorométhane, à température ambiante.

La présente invention a également pour objet un procédé de mesure de l'activité des disulfure-réduc- tases NAD (P) H-dépendantes, dont le site actif comporte des amino-acides chargés négativement et des amino-acides aromatiques, susceptibles de développer des interactions avec leur substrat, soit de type ionique, soit de type cation- (test enzymatique), lequel procédé est caracté- risé en ce qu'il comprend : -la mise en contact desdites enzymes avec un substrat convenable sélectionné parmi les dithio-bis- nitrobenzènes substitués tels que définis ci-dessus et les dithio-bis-nitrobenzènes substitués de formule I telle que représentée ci-dessus, dans laquelle Y1 et Y2

représentent un groupe CO et R1 et R2 représentent simultanément un group -NH-(CH2)3-N(CH3)2 ou un groupe : -la détection directe des thiolates formés, notamment par spectrophotométrie visible.

Quand les dithio-bis-nitrobenzènes substitués sont tels que Y1 et Y2 représentent un groupe CO et R1 et R2 représentent simultanément un groupe-NH- (CH2) 3-N (CH3) 2 ou un groupe : ils correspondent aux composés 1 et 3 suivants : composé 1 composé3

Conformément à l'invention, lesdites enzymes sont notamment sélectionnées dans le groupe constitué par la trypanothion réductase, la thiorédoxine réductase et la lipoamide déshydrogénase.

Les thiolates qui sont formés sous l'action desdites réductases, à partir des substrats disulfurés selon l'invention, conformément au schéma suivant : TR ou TrxR x-s-s-x 2X (SH) disulfure thiolate, sont directement détectables par spectrophotométrie visible, car ils présentent un groupement chromophore, ce qui présente un avantage par rapport au test enzymatique décrit dans M. Aumercier et al., Anal. Biochem., 1994, 223,161-164, qui décrit un test enzymatique pour évaluer l'activité de 1'enzyme TR, dont le principe est de mesu- rer la quantité de disulfure résiduel présente dans le milieu à la fin de la réaction enzymatique. La mesure s'effectue par spectrophotométrie visible à 405 nm et nécessite de dérivatiser le disulfure avec le réactif CMTQ (sel de 4-chloro-1-méthyl-7-trifluorométhylquino- line), afin de le rendre détectable dans le visible.

Auparavant, les thiols formés au cours de la réaction enzymatique sont rendus non-réactifs vis-à-vis du CMTQ, par alkylation avec la 2-vinylpyridine.

La présente invention a également pour objet un kit ou coffret de mesure de l'activité des disulfure- réductases NAD (P) H-dépendantes, telles que définies ci- dessus, caractérisé en ce qu'il comprend en tant que substrat desdites enzymes, un dithio-bis-nitrobenzène substitué sélectionné dans le groupe constitué par les dithio-bis-nitrobenzènes substitués tels que définis ci-dessus et les dithio-bis-nitrobenzènes substitués de formule I telle que représentée ci-dessus dans laquelle Y et Y2 représentent un groupe CO et Ri et R2 représentent simultanément un groupe-NH- (CH2) 3-N (CH3) Z ou un groupe : La présente invention a également pour objet un procédé de criblage et de sélection de produits inhibiteurs d'une disulfure-réductase NAD (P) H-dépendante, caractérisé en ce qu'il comprend : -la mise en contact d'un inhibiteur potentiel, en présence d'une disulfure-réductase NAD (P) H- dépendante, avec un composé sélectionné dans le groupe constitué par les dithio-bis-nitrobenzènes substitués tels que définis ci-dessus et les dithio-bis- nitrobenzènes substitués de formule I telle que représentée ci-dessus, dans laquelle Yl et Y2 représentent un groupe CO et R1 et R2 représentent simultanément un groupe-NH- (CH2) 3-N (CH3) 2 ou un groupe : -la détection colorimétrique des thiolates éventuellement formés.

Le test enzymatique, tel que défini ci-dessus, permet de mesurer, par le biais des thiolates formés, l'activité des disulfure-réductases NAD (P) H-dépendantes telles que les enzymes TR et TrxR et donc d'apprécier la capacité de diverses molécules à inhiber ces réductases, en présence des différents dithio-bis-nitrobenzènes substitués selon l'invention comme substrats alternatifs.

En effet, les Km observés avec les dithio-bis-nitro- benzènes substitués et notamment les dithio-bis nitro-

benzamides selon l'invention sont particulièrement bien adaptés à l'analyse cinétique de la TR et de la TrxR et accroissent la sensibilité de la réaction aux inhibi- teurs.

La présente invention a également pour objet une méthode de dosage des disulfure-réductases NAD (P) H- dépendantes, dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend : -la mise en contact dudit échantillon biolo- gique, éventuellement traité, avec un substrat convenable sélectionné dans le groupe constitué par les dithio-bis- nitrobenzènes substitués tels que définis ci-dessus et les dithio-bis-nitrobenzènes substitués de formule I telle que représentée ci-desssus, dans laquelle Yl et Y2 représentent un groupe CO et R1 et R2 représentent simultanément un groupe-NH- (CH2) 3-N (CH3) 2 ou un groupe : et -la détection directe des thiolates formés, notamment par spectrophotométrie visible.

La présente invention a en outre pour objet l'utilisation du procédé de détection tel que défini ci- dessus, pour le diagnostic de pathologies où l'activité des disulfure-réductases NAD (P) H-dépendantes est signifi- cativement augmentée (pathologies dans lesquelles on rencontre une prolifération cellulaire accrue, telle que le cancer, par exemple).

Avantageusement, dans les procédés et méthodes décrits ci-dessus, lesdites disulfure-réductases NAD (P) H-dépendantes sont sélectionnées dans le groupe

constitué par la trypanothion réductase, la thiorédoxine réductase et la lipoamide déshydrogénase.

Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en oeuvre du procédé objet de la présente invention ainsi qu'aux dessins annexés, dans lesquels : -la figure 1 illustre la synthèse des compo- sés 1-3 ; -la figure 2 correspond à une courbe de Lineweaver-Burk de la réduction du composé 1 par la hTrxR ; la valeur Km est de 7 jj. M ; cette figure comporte en abscisse l'inverse des concentrations en substrat 1/ [S] en LM-1 et en ordonnée l'inverse de la vitesse 1/V en ml/U ; -la figure 3 illustre la formation de 5-thio- 2-nitrobenzamide catalysée par la TcTR et mesurée par spectrophotométrie à 416 nm, en fonction du temps, en l'absence (-) ou en présence (O) de 50 µM de clomipra- mine ; -la figure 4a correspond à une courbe de Lineweaver-Burk de la réduction du composé 1 par la TR ; cette figure comporte en abscisse l'inverse des concentrations en substrat 1/ [S] en pM~1 et en ordonnée l'inverse de la vitesse 1/V en min x (A416 nm)-1 (avec min = minutes ; A416 nm = absorbance mesurée à 416 nm).

La figure 4b illustre la courbe des Km apparents (en ordonnée, en J. M) de la TR, en fonction de la concen- tration en clomipramine (en abscisse, en pM) [I], déduite de la courbe de Lineweaver-Burk représentée sur la figure 4a, avec le composé 1 comme substrat ;

-la figure 5 illustre la formation de 5-thio- 2-nitrobenzamide catalysée par la TcTR et mesurée par l'absorbance à 405 nm en fonction des concentrations en inhibiteur en présence de composé 1 comme substrat.

Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation.

EXEMPLE 1 : Procédé de préparation des composés 1,2 et 3.

Les composés 1-3 sont préparés à partir de l'acide 5,5'-dithiobis (2-nitrobenzoique) disponible commercialement (DTNB). La méthode générale de synthèse permet la préparation de benzamides en quantités impor- tantes (à l'échelle du gramme). Dans chaque cas, l'amine est utilisée en excès (3,2 eq.) dans le solvant inerte CH2ci2 avec l'addition d'une co-base, DIEA (N, N-Diiso- propyléthylamine) et d'agents de couplage, HOBt et HBTU, pour convertir l'acide benzoïque en une espèce acylante active. Les disulfures obtenus, qui sont acylés avec une chaîne latérale de type polyamine, sont stockés sous forme de chlorhydrate (composé 1) ou oxalate (composés 2 et 3).

La procédure générale de synthèse des 5,5'- dithiobis (2-nitrobenzamides) 1-3 est plus particulière- ment illustrée ci-après par la préparation du composé 1 (voir aussi figure 1).

A une solution de 2 g (5,05 mmol) de DTNB dans 28 ml de CH2Cl2, on ajoute 1,94 g (2,5 eq.) d'HOBt, 4,78 g (2,5 eq.) de HBTU et 7,02 ml (8 eq.) de DIEA. Le mélange est agité à 4°C pendant 15 minutes.

Une amine, la N, N-diméthylpropylamine, (3,2 eq.) est ajoutée à 0°C et l'agitation du mélange est poursuivie pendant 20 minutes à 0°C. Le mélange réaction-

nel est réchauffé jusqu'à la température ambiante et maintenu à cette température pendant une heure. La solu- tion de CHC1 est éventuellement diluée avec 160 ml de lavéeavecdel'eau,séchéeavecduMgSO4etCH2Cl2,puis évaporée.

Une purification en chromatographie en couche mince (gel d'alumine ; solvant 1 : CHCl-MeOH (95-5) et solvant 2 : CHCl-MeOH (80-20)) permet d'obtenir 900 mg de 5,5'-dithiobis (2-nitrobenzamide) 1 sous la forme d'une huile de couleur jaune ; rendement 32 % ; Rf 0,42 dans CH2C12-MeOH (95-5).

Les 5,5'-dithiobis (2-nitrobenzamides) 2 et 3 sont également isolés sous la forme d'une huile de couleur jaune ; 2 : rendement 12 %, Rf dans CH2Cl2-MeOH (95-5) : 3 ; rendement 13 % ; Rf 0,6 dans CHZCl2-MeOH (82,5-5).

La forme chlorhydrate du produit 1 est obtenue par dissolution de la base dans 18 ml de MeOH, suivie de l'addition de 376 pi de Me3SiCl (2 eq.).

Le mélange réactionnel est agité à température ambiante pendant 5 minutes et l'évaporation des réactifs conduit à une poudre amorphe jaune claire : point de 113-114°Cfusion: ; 564,4: (M+)M, 282,7 ; RMN dE 1H (300 MHz) (qt,J=6,0Hz,4H,CH2-CH2-CH2),2,251,80 (s, 12 H, N (CH3)2), 2,55 (t, J = 6,0 Hz, 4H, CH 2-N- (CH 3) 2), 4H,CH2-NH),3,50(m, 7,55 (d, 2,0Hz,2H,H6)= Jortho=8,5Hz,Jmeta=2,0Hz,2H,H4),8,00(d,7,65(dd, 8,5Hz,Jortho= 2H, H3), 8,10 (bs, 2H, NHCO).

Les oxalates sont obtenus en ajoutant goutte à goutte une solution saturée d'acide oxalique dans de l'AcOEt (acétate d'éthyle) à la solution saturée des

dérivés aminés 2-3.

Le mélange est maintenu à 4°C pendant 3 heures ; les sels sont obtenus sous la forme de poudres amorphes jaunes claires après filtration et lavages successifs avec de la glace, de l'AcOEt froid et de l'éther.

2 (Oxalate) : point de fusion : 122-123°C ; + 1 TOF-PDMS = 674,9 (M), 336,6 ; RMN de H (300 MHz, CD3SO, <BR> <BR> <BR> <BR> 340°K) b 1,70 (qt, J = 7,0 Hz, 4H, CH2-CH2-CH2), 2,10 (s, 6H, NCH3), 2,6 (m, 4H, CH2-CH2-N), 3,30 (m, 4H, CH2-NHCO), 3,70(m,16H,N-CH2-CH2-N),7,75(d,Jmeta=2,0Hz,2,70- 2H, (dd,2H,Jortho=8,5Hz,Jmeta=2,0Hz,H4),7,80 8,10 (d, 8,5= Hz, 2H, H3), 8,60 (t, J =5,6 Hz 2H, NHCO).

3 (Oxalate) : point de fusion 182-183°C ; TOF- + 1 PDMS : 562,1 (M), 281,4 RMN de H (300 MHz, CD3SO, <BR> <BR> <BR> <BR> 340°K) 6 2,10 (s, 6H, N-CH3), (m, 16H, CH2-CH2- N) 7,70 (d, Jmeta= 2,0 Hz, 2H, H6), 7,8 (dd, 8,5= =2,0Hz,2H,H4),8,2(d,Jortho=8,5Hz,2H,Hz,Jmeta H3).

Tous les points de fusion ont été déterminés à l'aide d'un appareil de Bûchai et ne sont pas corrigés.

Toutes les réactions ont été analysées en chromatographie en couche mince (CMC) (CHCl-MeOH, 95-5) réalisée sur des plaques en gel d'alumine (0,2 mm) (Macherey-Nagel Polygram alox N/UV254), en utilisant la lumière UV comme agent de visualisation ou une solution de Reindel-Hoppe comme agent de développement. i Le spectre H est obtenu avec un spectromètre 300 MHz Brucker ; le spectre de masse est enregistré sur un spectromètre (PDMS) de désorption (Source :

californium).

EXEMPLE 2 : Mesure de l'activité des enzymes trypanothion réductase et thiorédoxine réductase, avec comme substrats, les composés 1,2 et 3 selon l'exemple 1.

-MATERIELS ET METHODES * Enzymes La trypanothion réductase de Trypanosoma cruzi <BR> <BR> <BR> (TcTR) est isolée à partir de la souche d'Escherichia<BR> <BR> <BR> <BR> coli SG5 portant un vecteur de surexpression de la trypa- nothion réductase (28), pIBITczTR.

La concentration en TcTR est déterminée en mesurant le nombre de sous-unités contenant du FAD à -i-i 461 nm (s = 11,3 mM x cm) ; l'activité enzymatique est testée comme précisé dans (28). Une unité de TR corres- pond à 1 umol de T (S) 2 réduit par minute à 25°C dans un tampon A (20 mM d'Hepes, pH 7,25 contenant 1 mM d'EDTA et 0,15 M de KC1).

Les solutions mères d'enzyme, utilisées pour les déterminations cinétiques sont pures (vérification en SDS-PAGE) et ont une activité spécifique de 137 U/mg dans le test de réduction du T (S) 2 réalisé en présence de 500 pM de NADPH et de 518 uM de T (S) 2 dans un tampon A.

La thiorédoxine réductase humaine (hTrxR) est purifiée à partir de placenta comme précisé dans J. E.

Oblong et al., Biochemistry, 1993,32,7271-7277.

La thiorédoxine réductase de Plasmodium falci- parum (PfTrxR) recombinante est exprimée dans la souche d'E. coli déficiente en glutathion réductase SG5 et puri- fiée selon une procédure similaire à celle utilisée pour la glutathion réductase humaine recombinante (26,30).

Les activités enzymatiques de ces enzymes sont habituellement déterminées à l'aide d'un test de réduc- tion du DTNB, comme suit :

L'enzyme est ajoutée à un mélange réactionnel comprenant 100 mM de phosphate de potassium, 2 mM d'EDTA, pH 7,4 et 3 mM de DTNB ; après l'addition de 200 uM de NADPH, l'augmentation de l'absorbance est mesurée à 412 nm et à 25°C. En utilisant le test de DTNB, une unité de TrxR est définie comme la production NADPH-dépendante de -i-i 2 µmol de 5-thio-2-nitrobenzoate =13,6nm mM# ).

Les concentrations en TrxR sont déterminées par mesure des sous-unités contenant du FAD à 450 nm (E- 1-1 11,3 mM-. cm). Les solutions mères d'enzymes, utilisées pour les déterminations cinétiques sont pures (vérification en SDS-PAGE) et ont une activité spécifique de 31 U/mg (hTrxR) et de 5,9 U/mg (PfTrxR), respective- ment dans le test au DTNB.

* Conditions des études cinétiques Avant utilisation, les substrats (composés 1, 2 et 3) sont dissous dans du DMSO ; des concentrations précises (10 mM dans la solution mère) sont soit calcu- lées spectrophotométriquement dans 20 mM d'HEPES, 1 mM d'EDTA, 150 mM de KC1, pH 7,25 (tampon A) d'après les concentrations en thiolates respectifs après réduction enzymatique, soit obtenues par mesure de l'absorbance à kmax = 327 nm, en utilisant le coefficient d'extinction -i-i nm=15.533molaire(#327 M x cm pour le composé 1, par exemple).

Toutes les études cinétiques sont réalisées dans le même tampon à 25°C, en présence de 200 uM de NADPH.

* Test colorimétrique . Mesure de l'activité de la TR On détermine la concentration initiale du composé 1 (sous sa forme disulfure), à Smax = 327 nm, en

utilisant son coefficient d'extinction molaire s = 327 nm 15.533 M-1 x cm-1.

Les mesures sont réalisées dans des plaques de microtitration. On ajoute 80 Ll d'une solution enzyma- <BR> <BR> <BR> <BR> tique contenant 28 x 10-4 U de TcTR à 10 pl d'une solution de substrat dans du tampon A contenant en outre du Me2SO comprenant 30 nmol de composé 1,2 ou 3 et 50 nmol de NADPH (concentrations finales : 300 M de composé 1,2 ou 3 et 500 pM de NADPH) ; le NADPH est utilisé en très large excès, car il s'abime en solution et la solution doit rester stable toute la journée (pour faire les tests de criblage). Ces conditions sont celles du test en microplaque en présence ou en l'absence d'inhibiteurs et sont différentes des conditions des tests spectrophotomé- triques dans lesquelles sont mesurées les valeurs de Km.

Des contrôles positifs et négatifs sont égale- ment préparés.

. Mesure de l'activité de la TrxR Elle est réalisée dans les mêmes conditions que ci-dessus ; elle comprend toutefois les modifications suivantes : -toutes les réactions en présence de TrxR sont réalisées dans le tampon C (100 mM de phosphate de sodium et 2 mM d'EDTA, pH 7).

-la concentration finale en composé 1,2 ou 3 est de 200 pm. La réaction est déclenchée par l'addition de 80 J. l d'une solution enzymatique contenant soit <BR> <BR> <BR> <BR> 8 x 10-4 U d'hTrxR native soit 32 x 10-4 U de PfTrxR recombinante.

. Expression des résultats L'activité enzymatique est appréciée par la formation des thiolates produits comme précisé ci-dessus.

La détection colorimétrique des thiolates

formés est immédiate car, le 5-thio-2-nitrobenzamide est un groupe chromophorique jaune. La présence du 5-thio-2- nitrobenzamide et la disparition du disulfure de départ dans le milieu réactionnel, après la réaction enzymatique complète, est démontrée par une analyse TOF-PDMS (Time Of Flight-Plasma Desorption Mass Spectrometry). Pour les trois composés 1-3, les spectres d'absorption des thio- lates formés ont été enregistrés par balayage de longueurs d'ondes (190-600 nm). Les valeurs de Smax ont été déterminées à 416 nm pour les trois composés, four- nissant ainsi les coefficients d'absorption molaires de 1 1 12188 (1), 10277 (2) et 10203 (3) M x cm à 416 nm, dans le tampon A. Par comparaison avec les absorbances des thiolates, les coefficients d'absorption molaires des disulfures de départ sont si bas qu'ils sont presque -i-i négligeables (< 400 M x cm à 416 nm). Comme la plupart des lecteurs de microplaques ont un filtre à 405 nm, la formation des thiolates a été mesurée à 405 nm, les coef- ficients d'absorption molaires étant très proches (différences < 6%) aux deux longueurs d'onde (416 et 405 nm). Dans le test à plaques de microtitration, un rapport maximum absorbance/absorbance du bruit de fond de 13 est observé à 405 nm.

-RESULTATS Les résultats obtenus sont résumés dans le Tableau I.

TABLEAU 1 Ce Tableau illustre les paramètres cinétiques des trois substrats précités, comparés à ceux obtenus avec les substrats physiologiques. Enzyme Molécule Km Kcat Kcat/Km Réfé- [pM] [sec-1] [M-1 x sec-1) rence TcTR recombi-TS2 45 240 5. 3 x 10 [1] nante DTNB Pas adapté en tant que [13] substrat 1 35 125 3.6 x 106 2 300* 125 4.2 x 105 3 Pas adapté en tant que substrat hTrxR native E. coli Trx 34 5.6 1.6 x 105 [22] (cellules d'adénocarci- nome de poumons) hTrxR natif E. coli Trx 20 nd nd [29] (placenta) HTrx 4,3 nd nd [29] DTNB 400 67 1.7 x 105 [38] 1 7 46 6.6 x 106 2 14 43 3.1 x 106 3 10 38 3.8 x 106 PfTrxR recom-PfTrx Sub strat phy siologique binant non encore identifié E. coli Trx 66 >5 nd [26] DTNB 1090 7 6.4 x 103 [26] 1 46 7 1,5 x 105 2 400 17 4,3 x 104 3 80* 6 7.5 x 104 Tous les tests ont été réalisés à 25°C dans 20 mM d'HEPES, 1 mM d'EDTA, 150 mM de KCl, à pH 7,25 (tampon A) et en présence de 0,2 mM de NADPH. Dans les tests marqués par *, les réactions catalysées ont été accompagnées d'effets d'inhibition ; ainsi, Km et toutes les autres valeurs déduites n'ont pu être estimées qu'à des concentrations faibles en substrat (15-200 uM).

La comparaison des paramètres obtenus lorsque l'on utilise comme substrat de la TR, le composé 1 ou le trypanothion disulfure permet d'observer des spécificités

dynamiques similaires, exprimées par le rapport KCat/Km ; elles résultent d'une valeur de Km plus faible (baisse de 30 %), compensée par un Kcat plus faible (baisse de 50 %).

En ce qui concerne hTrxR, l'amélioration la plus importante par rapport au DTNB en tant que substrat réside dans des Km nettement réduits des disulfures 1 à 3.

Par exemple, la figure 2 montre la réduction du composé 1 par 1'enzyme hTrxR : V max augmente légèrement, par contre avec 7 uM, le Km est beaucoup plus faible que celui du DTNB (environ 365 uM ; réf. 29). Le composé 2 selon la présente invention et les composés 1 et 3 présentent également des avantages en tant que substrats de la PfTrxR : le Km du DTNB (environ 1 mM ; réf. 26) est même plus élevé avec PfTrxR qu'avec hTrxR. Puisqu'il est difficile de réaliser un test avec plus de 3 mM en DTNB pour des problèmes de solubilité, les mesures d'activité spécifique de la PfTrxR avec le DTNB ne peuvent être mis en oeuvre qu'à environ 3 x Km. L'utilisation des disulfures 1 à 3, en particulier du composé 1 (Km = 46 uM, Tableau I), contribue ainsi à résoudre ce problème, de par les Km beaucoup plus faibles de ces composés.

La meilleure affinité des trois disulfures (composés 1,2 et 3) par comparaison avec le DTNB vis-à- vis des enzymes disulfure-réductases NAD (P) H dépendantes provient vraisemblablement, soit des interactions de type ionique entre les chaînes aminées latérales protonées à pH physiologique et les résidus acides des sites actifs des enzymes, soit des interactions de type cation/ entre les chaînes aminées latérales protonées et les résidus aromatiques des sites actifs des enzymes (D. A. Dougherty, Science, 1996,271,163-168 ; N. S. Scrutton et al., Biochem. J., 1996,319,1-8).

EXEMPLE 3 : : Protocole pour le criblage d'inhibiteurs sur plaques de microtitration -MATERIELS ET METHODES Toutes les réactions enzymatiques et non-enzy- matiques sont réalisées sur des plaques Nunc (96 puits à fonds plats) dans un volume total de 100 ul. Tous les milieux réactionnels sont incubés pendant 40 minutes à température ambiante (22-25°C) et terminées par l'addition de 20 ul d'acétonitrile.

Les plaques sont alors lues avec un lecteur de plaques Labsystems comprenant un filtre à 405 nm <BR> <BR> <BR> (Multiskan RC microplate reader Labsystems type 351, associé à un logiciel de lecture de plaque Delta Soft III Biometallics (PRINCETON, NJ).

Pour le test d'inhibition enzymatique à un seul point (c'est-à-dire n'utilisant qu'une seule concen- tration du composé testé), les composés suivants sont ajoutés à chaque puits : 10 ul de solution à 500 uM d'in- hibiteur dans H2O-Me2SO à 10% (concentration finale de 50 uM) et 10 ul d'une solution de substrat dans le tampon A-Me2SO à 10% contenant 30 nmol du composé 1 et 50 nmol de NADPH (concentrations finales de 300 uM pour le disul- fure 1 et de 500 uM pour le NADPH). La réaction est déclenchée par l'ajout de 80 pl d'une solution enzyma- -4 tique contenant 28 x 10 U de TcTR.

Des contrôles négatifs et positifs convenables sont préparés en double pour chaque plaque de microtitration en incubant les composés suivants pendant toute la durée du test : une solution de substrat (concentration finale de 2% de Me2SO) avec ou sans enzyme, une solution de substrat en présence d'enzyme et de l'inhibiteur de référence de la TR, la clomipramine (concentrations finales de 50 uM en inhibiteur, de 2% en Me2SO).

Ces conditions ont également été appliquées aux tests de la TrxR, avec les quelques modifications suivantes. Pour réduire la réaction inverse compétitive de l'oxydation du thiolate formé, toutes les réactions avec les TrxRs sont réalisées dans le tampon C (phosphate de sodium 100 mM, EDTA 2 mM, pH 7,0).

La concentration finale en composé 1,2 ou 3 est de 200 uM (au lieu de 300 uM dans les test TR). La réaction est déclenchée en ajoutant 80 pi d'une solution -4 enzymatique contenant soit 8 x 10 U de hTrxR native, -4 soit 32 x 10 U de PfTrxR recombinante. L'inhibiteur de référence de la TrxR utilisé dans un contrôle positif est le 2,6-dichloroindophénol (concentration finale de 25 uM dans le test hTrxR et de 50 uM dans le test PfTrxR) [31].

-RESULTATS 1) Une première étude d'inhibition a consisté à suivre la formation du 5-thio-2-nitrobenzamide libéré par la réduction du composé 1 en mesurant l'absorbance à 416 nm et en la suivant en fonction du temps, en l'absence et en présence de 50 uM de clomipramine (Figure 3).

D'autre part, l'activité de la TR en présence de clomipramine (0-40 uM) a été déterminée en utilisant soit le 5,5'-dithiobis (2-nitrobenzamide) 1 (20-200 uM), soit le T (S) 2 (trypanothion disulfure) (38), en tant que substrat. Les constantes d'inhibition de la clomipramine on été déduites des courbes de Lineweaver-Burk comportant en ordonnées les 1/V et en abscisse les 1/ [S] et des courbes correspondantes représentant le Km apparent contre [I]. En présence du composé 1 en tant que substrat alternatif, la clomipramine a fait preuve, comme prévu, d'une inhibition de type compétitif avec un Ki de 8,0 + 0,9 uM (Figure 4b). Ce résultat est cohérent avec la

valeur déterminée précédemment en présence de T (S) 2 (environ 6,53 + 0,59 uM ; [38]).

2) L'activité de la TR est ensuite mesurée en présence du composé 1 (50 uM) et de concentrations crois- santes en clomipramine (0-50 uM), en suivant le proto- cole standard des tests sur plaques de microtitration tel que décrit ci-dessus (Figure 5). Dans cette expérience également, les résultats sont cohérents avec les valeurs de IC obtenues précédemment par des méthodes spectrophotométriques (13). Ainsi, la nouvelle méthode colorimétrique selon l'invention permet d'obtenir une mesure précise de l'activité TR et de la sensibilité de l'inhibiteur. Les coûts de ce test sont très bas en <BR> <BR> <BR> comparaison avec les tests utilisant le T (S) 2 ou des ana-<BR> <BR> <BR> <BR> <BR> logues du T (S) 2 en tant que substrat (fourni par Bachem, 100 mg de T (S) 2 coûte environ 1300 dollars). En ce qui concerne les thioredoxine réductases, la supériorité du test selon la présente invention, par comparaison avec le test DTNB, provient de l'augmentation de l'affinité du substrat, qui permet de travailler à des concentrations en enzyme et en substrat faibles. Ceci permet également une solubilisation appropriée des inhibiteurs et réduit la probabilité d'interférence avec d'autres composés du test. Pour les trois enzymes, le test développé peut être exécuté sur des plaques de microtitration, peut être automatisé et est ainsi particulièrement adapté à un criblage d'inhibiteurs à haut rendement.

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Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à 1'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention.