Область техники

Изобретение относится к области органической и медицинской химии, молекулярной биологии и касается способа получения нового класса соединений, ингибирующих теломеразу, которые могут быть использованы для изучения теломераз и каталитических субъединиц теломераз, обратных транскриптаз, для изучения и лечения опухолевых и вирусных заболеваний.

Уровень техники

Теломераза - это фермент, необходимый для компенсации укорочения длины теломер в клетках эукариот. Теломеры состоят из характерных тандемных повторов (например TTAGGG у человека), найденных на концах большинства эукариотических хромосом (Blackburn, "Structure and Function of Telomeres, "Nature, 350:569-573, 1991). Количество повторов определяет длину теломер. Пролиферативный потенциал клетки связывают с длиной теломер, так как стабильность и целостность эукариотических хромосом зависят от динамической структурной организации теломер (Baird DM. "Mechanisms of telomeric instability", Cytogenet Genome Res. 2008; 122(3-4):308-14, 2009), при их укорочении меньше критической длины стабильность нарушается, затем клетка гибнет. Теломеры играют важную роль в контроле разделения хромосом и вовлечены в регулирование клеточного цикла. С каждым клеточным делением у соматической клетки теряются приблизительно 60-100 оснований с концов хромосом. Теломеры сокращаются, клетка, в конечном счете, достигает кризиса, и в клетке запускается апоптоз. В организме существуют клетки с неограниченным потенциалом деления. Именно в них (в половых, стволовых клетках, а так же в клетках опухоли), существует процесс компенсации укорочения теломер. За этот процесс отвечает фермент- теломераза. Теломераза активна в таких клетках и поддерживает длину теломер выше кризисного уровня. Теломераза - это специализированная обратная транскриптаза (для человека hTERT), работающая в комплексе с собственной рибонуклеиновой кислотой (РНК). Эта РНК называется теломеразной (для человека hTERC) и содержит участок для синтеза теломерных повторов ДНК (матричный участок). Другими словами, для приобретения способности к неограниченному делению клетка должна активировать механизм, поддерживающий длину теломер выше критического уровня, а именно теломеразу. Так, существенный уровень теломеразной активности был обнаружен в более чем 85% опухолей (Kim et al., "Specific Association of Human Telomerase Activity with Immortal Cells and Cancer," Science, 266:201 1-2015, 1994). Теломеразная активность также присутствует в стволовых сумках нормальных тканей, но на более низком уровне (Morin, "Is Telomerase a Universal Cancer Target?", J. Natl. Cancer Inst., 87:859-861, 1995). Таким образом, присутствие активной теломеразы в опухоли обеспечивает наличие мишени, дающей потенциально хорошую селективность к опухолевым клеткам по отношению к здоровой ткани. Ингибирование теломеразы было предложено в качестве нового подхода к терапии рака (первые работы Morin, "Is Telomerase a Universal Cancer Target?", J. Natl. Cancer Inst., 87:859-861, 1995; Parkinson, "Do Telomerase Antagonists Represent a Novel Anti-Cancer Strategy?" Brit. J. Cancer, 73: 1-4, 1996; Raymond et al., "Agents that target telomerase and telomeres," Curr Opinion Biotech.,7:583-591, 1996, более современное состояние в обзоре Shay JW, Wright WE. Telomerase therapeutics for cancer: challenges and new directions. Nat Rev Drug Discov. 5(7):577-84, 2006).

Третичная структура белка каталитической субъединицы теломеразы человека остается на настоящий момент неразрешенной, но на основе анализа первичной структуры показано, что этот белок сходен с другими обратными транскриптазами (Lingner et al., "Reverse Transcriptase Motifs in the Catalytic Subunit of Telomerase," Sci., 276:561-567, 1997), поэтому ее активность подавляется при использовании ингибиторов обратных транскриптаз, например: AZT (Strahl and Blackburn, "Effects of Reverse Transcriptase Inhibitors on Telomere Length and Telomerase Activity in Two Immortalized Human Cell Lines,"Mol. Cell. Biol.,16;53-65, 1996) и других нуклеозидов (Fletcher et al., "Human Telomerase Inhibition by 7-Deaza 2'-deoxypurine Nucleoside Triphosphates," Biochem, 35:1561 1-15617, 1996). Также была показана возможность ингибирования любой теломеразной активности при использования антисмысловой последовательности к матричному участку теломеразной РНК, например нуклеиновых кислот, слитых с пептидом (Norton et al., "Inhibition of Human Telomerase Activity by Peptide Nucleic Acids," Nature Biotechnol., 14:615-619, 1996) и фосфотиоатных олигонуклеотидов (Mata et al., "A Hexameric Phosphorothioate Oligonucleotide Telomerase Inhibitor Arrests Growth of Burkitt's Lymphoma Cells in Vitro and in Vivo, "Toxicol Appl. Pharmacol., 144: 189-197, 1997). Антисмысловый дезоксирибонуклеотид, содержащий 185 нуклеотидов hTERC, был в состоянии сократить теломеры в клетках HeLa за 23-26 клеточных делений до критического уровня и вызвал апоптоз. Другой дезоксирибонуклеотид, содержащий 2'-5'-аденилат (2-5А) с тем, чтобы не только связать, но и расщепить hTERC, вызвал апоптоз в глиоме, раке простаты, раке шейки матки, мочевого пузыря и яичников в течение 4-5 дней. Чтобы увеличить сродство к hTERC-последовательности и стабильность олигонуклеотида были использованы 2'-0- метил-РНК-олигонуклеотиды. Самым эффективным оказался олигонуклеотид GRN163 (Asai et al. A novel telomerase template antagonist (GRN163) as a potential anticancer agent. Cancer Research, 63:3931-3939, 2003). Клетки, культивируемые с этим соединением, гибли в течение 100 дней, GRN163 ингибировал теломеразную активность при очень низких, по сравнению с другими олигонуклеотидами, концентрациях, GRN163L является первым ингибитором теломеразы, который вошел в клиническую практику. Доклинические исследования показали безопасность и эффективность такого ингибирования. Безопасность и определение дозы для пациентов, невосприимчивых к другой терапии, находятся в стадии изучения. Эти исследования не закончены (США, ClinicalTrials.gov, NCT00310895), однако уже показанная эффективность. GRN163L - однозначное подтверждение того, что ингибирование теломеразы - это основа антираковой терапии.

Из WO99/01560 от 14.01.1999 (RU2000102361, дата приоритета 01.07.1998) также известны ингибиторы теломеразной активности олигонуклеотидной природы.

Известны примеры использования координационных соединений железа (III), цинка (II), никеля (II), марганца (III) и платины (И) (Monchaud et al., "A hitchhiker's guide to G-quadruplex ligands", Org. Biomol. Chem., 6, 627, 2008). Большинство координационных соединений содержит производные порфирина или конденсированные пиридиновые системы. Ингибирование теломеразы наблюдается при значениях IC ₅ o-TRAP (IC50 - концентрация ингибитора, при которой активность фермента подавляется на 50%) от 0,12 до 30 мкМ.

Наиболее близким аналогом изобретения является ингибитор теломеразы, который представляет собой координационное соединение меди (II), содержащее лиганд на основе производного порфирина [S. Е. Evans, М. A. Mendez, К. В. Turner, L. R. Keating, R. Т. Grimes, S. Melchoir and V. A. Szalai, J. Biol. Inorg. Chem., 2007, 12(8), 1235-1249]. Это соединение селективно взаимодействует с квадруплексом ДНК, значение ICso-TRAP в экспериментах по ингибированию теломеразы составляет 26 мкМ. К недостаткам этого ингибитора теломеразы следует отнести сложность синтеза органического лиганда и координационного соединения, а также низкое значение IC50.

Указанные недостатки известных ингибиторов теломеразы могут быть преодолены при использовании координационных соединений производных имидазол- 4-она, более подробно описанных далее со ссылками на прилагаемые иллюстративные материалы. Описание иллюстративных материалов

Фиг. 1. Структурные формулы заместителей А в заявленных производных имидазол-4-она.

Фиг. 2. Структурные формулы заместителей В в заявленных производных имидазол-4-она.

Фиг. 3. Структурные формулы заместителей С в заявленных производных имидазол-4-она.

Фиг. 4. Метод амплификации теломерных повторов (TRAP-анализ).

Фиг. 5. Тестирование теломеразной активности для различных концентраций комплекса (5Z, 5^)-2,2'-(этан-1,2-диилдисульфанилдии� �)бис(5-(2-пиридилметилен)-3- аллил-3,5-дигидро-4Н-имидазол-4-она) с хлоридом меди.

Раскрытие изобретения

В качестве ингибиторов теломеразы согласно изобретению могут быть использованы координационные соединения производных имидазол-4-она общей формулы

где заместитель А выбран из группы, включающей арильные заместители, конденсированные арильные заместители, циклопентил, циклогексил, алифатические заместители, алифатические заместители с двойной связью, алифатические заместители с тройной связью, метиламиновый заместитель CH ₃ NH-, карбэтокси-группу C ₂ HsO(0)C-, пятичленные гетероциклические заместители с одним атомом азота, пятичленные гетероциклические заместители с двумя атомами азота, шестичленные гетероциклические заместители, заместитель В отсутствует или является алифатическим заместителем, заместитель С представляет собой гетероарильный заместитель, присоединяемый к производному имидазол-4-она через атом углерода и выбран из группы, включающей 5-членные ненасыщенные моноциклические гетероарильные заместители с 1 , 2, 3 гетероатомами в цикле, выбранными из группы, включающей N, О и S, 6-членные ненасыщенные моноциклические гетероарильные заместители с 1, 2, 3 гетероатомами в цикле, выбранными из группы, включающей N, О и S, 8-, 9- и 10-членные ненасыщенные бициклические гетероарильные заместители с 1 , 2, 3 гетероатомами в цикле, выбранными из группы, включающей N, О и S, X представляет собой хлорид С1 или нитрат N0 ₃ .

В предпочтительном варианте выполнения изобретения заместитель А является незамещенным или монозамещенным, или дизамещенным арильным заместителем, при этом заместители R в арильной группе выбраны из группы, включающей галогены и алкильные заместители.

В предпочтительном варианте выполнения изобретения заместитель А является незамещенным или монозамещенным, или дизамещенным конденсированным арильным заместителем, при этом заместители R в конденсированной арильной группе выбраны из группы, включающей галогены и алкильные заместители.

В предпочтительном варианте выполнения заместитель А выбран из группы, включающей фенил C ₆ Hs-, З-хлор-4-фторфенил 3-Cl-4-F-C ₆ H3-, 4-карбэтоксифенил

4- С ₂ Н ₅ 0(0)СС ₆ Н4-, метил СН ₃ -, аллил СН ₂ =СНСН ₂ -, 2-антрил, пропил С ₃ Н ₇ - (фиг. 1).

В предпочтительном варианте выполнения заместитель В выбран из группы, включающей 1,2-этандиил -(СН ₂ ) ₂ -, 1,3-пропандиил -(СН ₂ ) ₃ -, 1 ,4-бутандиил -(СН ₂ )4-, 1 ,6-гександиил -(СН ₂ )б-, 1 , 10-декандиил -(СН ₂ )ю- (фиг. 2).

В предпочтительном варианте выполнения заместитель С выбран из группы, включающей 2-хинолил, 2-пиридил, 1-метил-2-имидазолил, 4-метил-5-имидазолил,

5- имидазолил, 2-имидазолил, 1,5-диметил-З-пиразолинил, 1,5-дифенил-З-пиразолинил (фиг. 3).

В способе получения координационных соединений производных имидазол-4-она согласно изобретению осуществляют следующие стадии: смешивают раствор производного имидазол-4-она в дихлорметане с метонолом, медленно приливают к смеси раствор соли меди в метаноле или ацетонитриле, реакционную смесь выдерживают до выпадения осадка координационного соединения производного имидазол-4-она.

В качестве соли меди могут быть использованы хлорид меди и нитрат меди. В качестве производных имидазол-4-она могут быть использованы соединения общей формулы

где заместитель А выбран из группы, включающей арильные заместители, конденсированные арильные заместители, циклопентил, циклогексил, алифатические заместители, алифатические заместители с двойной связью, алифатические заместители с тройной связью, метиламиновый заместитель CH ₃ NH-, карбэтокси-группу С ₂ Н ₅ 0(0)С-, пятичленные гетероциклические заместители с одним атомом азота, пятичленные гетероциклические заместители с двумя атомами азота, шестичленные гетероциклические заместители, заместитель В отсутствует или является алифатическим заместителем, заместитель С представляет собой гетероарильный заместитель, присоединяемый к производному имидазол-4-она через атом углерода и выбран из группы, включающей 5-членные ненасыщенные моноциклические гетероарильные заместители с 1 , 2, 3 гетероатомами в цикле, выбранными из группы, включающей N, О и S, 6-членные ненасыщенные моноциклические гетероарильные заместители с 1 , 2, 3 гетероатомами в цикле, выбранными из группы, включающей N, О и S, 8-, 9- и 10-членные ненасыщенные бициклические гетероарильные заместители с 1, 2, 3 гетероатомами в цикле, выбранными из группы, включающей N, О и S.

В предпочтительном варианте выполнения изобретения заместитель А является незамещенным или монозамещенным, или дизамещенным арильным заместителем, при этом заместители R в арильной группе выбраны из группы, включающей галогены и алкильные заместители.

В предпочтительном варианте выполнения изобретения заместитель А является незамещенным или монозамещенным, или дизамещенным конденсированным арильным заместителем, при этом заместители R в конденсированной арильной группе выбраны из группы, включающей галогены и алкильные заместители.

В предпочтительном варианте выполнения заместитель А выбран из группы, включающей фенил С _б Н ₅ -, З-хлор-4-фторфенил 3-С1-4-Р-С _б Н ₃ -, 4-карбэтоксифенил 4-С ₂ Н ₅ 0(0)СС ₆ Н ₄ -, метил СН ₃ -, аллил СН ₂ =СНСН ₂ -, 2-антрил, пропил С ₃ Н ₇ - (фиг. 1).

В предпочтительном варианте выполнения заместитель В выбран из группы, включающей 1,2-этандиил -(СН ₂ ) ₂ -, 1,3-пропандиил -(СН ₂ ) ₃ -, 1 ,4-бутандиил -(СН ₂ )4-, 1 ,6-гександиил -(СН ₂ ) ₆ -, 1 , 10-декандиил -(СН ₂ )ю- (фиг. 2). В предпочтительном варианте выполнения заместитель С выбран из группы, включающей 2-хинолил, 2-пиридил, 1 -метил-2-имидазолил, 4-метил-5-имидазолил, 5-имидазолил, 2-имидазолил, 1,5-диметил-З-пиразолинил, 1 ,5-дифенил-З-пиразолинил (фиг. 3).

Заявленные производные имидазол-4-она могут быть получены алкилированием замещенных в 3-положении 2-тиогидантоинов α,ω-дибромалканами. Для этого к смеси производных 2-тиогидантоинов (2 эквивалента) и сухого К ₂ С0 ₃ (3 эквивалента) в диметилформамиде при температуре 0°С при перемешивании добавляют α,ω-дибромалкан (1 эквивалент). Реакционную смесь перемешивают в течение двух часов при температуре 0°С, а затем 2 часа при комнатной температуре. После этого к смеси добавляют 50 мл воды. Образовавшийся осадок отфильтровывают и промывают водой, а затем диэтиловым эфиром.

Изобретение иллюстрируется примерами альтернативных вариантов его выполнения.

Пример 1. Синтез (5Z, 5'г)-2,2'-(этан-1,2-диилдисульфанилди� �л)бис(5-(2- пиридилметилен)-3-метил-3,5-дигидр� �-4Н-имидазол-4-она)

Из 0,5 г (0,0025 моль) 2-тиоксо-3-метил-5(( )-2-пиридилметилен)-тетрагидро- 4Н-имидазол-4-она и 0,21 г (0,0013 моль) 1,2-дибромэтана получено 0,40 г (76%) (5Z, 5^)-2,2'-(этан-1 ,2-диилдисульфанилдиил)бис(5-(2-пир идилметилен)-3-метил-3,5- дигидро-4Н-имидазол-4-она). Т _пл =215°С.

Спектр ЯМР Ή (400МГц, CDC1 ₃ , δ, м.д.): 8,82(д, 1Н, Н„-Ру, .1=7,9Гц), 8,59(д, Ш, Нр-Ру, 1=4,0Гц), 7,71(тд, 1Н, Нр-Ру, 1,=7,ЗГц, ^=2,ЗГц), 7,23(с, 1Н, СН=), 7,13(дд, 1Н, H Py, 3,08(с, ЗН, N-CH ₃ ).

ИК-спектр (см ¹ ): 1710(С=О), 1670(C=N), 1640(С=С).

Элементный анализ: C ₂ 2H ₂ oN ₆ 0 ₂ S2 вычислено С 56,88% Н 4,34% N 18,09%; найдено С 56,74% Н 4,27% N 17,82%.

Пример 2. Синтез (5Z, 5^)-2,2'-(этан-1,2-диилдисульфанилдии� �)бис(5-(2- пиридилметилен)-3-пропил-3,5-дигид� �о-4Н-имидазол-4-она)

Из 0,5 г (0,002 моль) 2-тиоксо-3-пропил-5((г)-2-пиридилмет� �лен)-тетрагидро- 4Н-имидазол-4-она и 0,19 г (0,001 моль) 1,2-дибромэтана получено 0,43 г (82%) (5Z, 5'г)-2,2'-(этан-1,2-диилдисульфанилди� �л)бис(5-(2-пиридилметилен)-3-пропил -3,5- дигидро-4Н-имидазол-4-она).

Спектр ЯМР Ή (400МГц, CDC1 ₃ , δ, м.д.): 8,69(д, J=8,0 Гц, 1Н, Н _а -Ру,), 8,65 (д, J=4,7 Гц, Ш, Нр-Ру,), 7,63 (тд, 1,=7,4Гц, т ₂ =2,0Гц, 1Н, Нр-Ру,), 7,19 (да, -Γι=7,5Γ _α , 1 ₂ =0,9Гц, 1H, H _Y -Py,), 7,12 (c, 1H, CH=), 7,12 (c, 1H, CH=), 3,93 (c, 2H, S-CH ₂ ), 3,60 (τ, J=7,5 Гц, 2H, CH ₂ N), 1,72 (м, 2H, CH ₂ ), 0,96 (т, J=7,5, 3H, CH ₃ ).

ИК-спектр (CM ^-1 ): 1705(C=O), 1675(C=N), 1640(C=C).

Элементный анализ: C ₂₆ H ₂ gN ₆ 0 ₂ S ₂ вычислено С 59,98% H 5,42% N 16,14%; найдено С 59,34% Н 5,17% N 15,88%.

Пример 3. Синтез (5Z, 5^)-2,2'-(этан-1,2-диилдисульфанилдии� �)бис(5-(2- пиридилметилен)-3-аллил-3,5-дигидр� �-4Н-имидазол-4-она)

Из 0,5 г (0,002 моль) 2-тиоксо-3-пропил-5((2)-2-пиридилмети лен)-тетрагидро- 4Н-имидазол-4-она и 0,19 г (0,001 моль) 1 ,2-дибромэтана получено 0,46 г (92%) (5Z, 5' )-2,2'-(этан-1,2-диилдисульфанилдиил) бис(5-(2-пиридилметилен)-3-аллил-3,5- дигидро-4Н-имидазол-4-она).

Спектр ЯМР Ή (400МГц, CDC1 ₃ , δ, м.д.): 8,65(м, 2Н, Н _а -Ру + Н _р -Ру,), 7,62 (т, 1=7,5Гц, 1Н, Н _р -Ру,), 7,19 (м, Ш, Н _у -Ру,), 7,14 (с, 1Н, СН=), 7,12 (с, 1Н, СН=), 5,82 (м, 1Н, СН=), 5,23 (м., 2Н, СН ₂ =), 4,23 (м, 2Н, CH ₂ N) 3,89 (с, 2Н, S-CH ₂ ).

ИК-спектр (см ¹ ): 1720(С=О), 1680(C=N), 1640(С=С).

Элементный анализ: C ₂ 6H ₂₆ N ₆ 0 ₂ S ₂ вычислено С 60,44% Н 4,68% N 16,27%; найдено С 60,14% Н 4,48% N 16,03%.

Пример 4. Синтез (5Z, 5' )-2,2'-(этан-1,2-диилдисульфанилдиил) бис(5-(2- пиридилметилен)-3-фенил-3,5-дигидр� �-4Н-имидазол-4-она)

Из 0,3 г (0,001 моль) 2-тиоксо-3-фенил-5((г)-2-пиридилмети� �ен)-тетрагидро-4Н- имидазол-4-она и 0,1 г (0,0005 моль) 1 ,2-дибромэтана получено 0,23 г (73%) (5Z, 5'Z)- 2,2'-(этан-1,2-диилдисульфанилдиил)б ис(5-(2-пиридилметилен)-3-фенил-3,5-д� �гидро- 4Н-имидазол-4-она). Тпл=259 ⁰ С.

Спектр ЯМР Ή (400МГц, CDC1 ₃ , δ, м.д.): 8,75(д, 2Н, Н _а -Ру, 1=7,9Гц), 8,66(д, 2Н, Нр-Ру, 1=4,0Гц), 7,81(тд, 2Н, Нр-Ру, 1,=7,ЗГц, 1 ₂ =2,ЗГц), 7,42(м, 6Н, H-Ph), 7,29(м, 4Н, H-Ph), 7,1 1(тд, 2Н, Н _у -Ру, 1,=7,5Гц, 1 ₂ =1,0Гц), 7,18(с, 2Н, СН=), 3,1 1(т, 4Н, S-CH ₂ -, 1=7,5Гц).

ИК-спектр (см ^"1 ): 1710(С=О), 1670(C=N), 1640(С=С).

Элементный анализ: C ₃₂ H ₂₄ N ₆ S ₂ 0 ₂ вычислено С% 65,31, Н% 4,08, N% 14,29; найдено С% 65,28, Н% 4,10, N% 14,11.

Пример 5. Синтез (5Z, 5^)-2,2'-(этан-1,2-диилдисульфанилдии� �)бис(5-(2- пиридилметилен)-3-(1-нафтил)-3,5-диг� �дро-4Н-имидазол-4-она)

Из 0,3 г (0,001 моль) 2-тиоксо-3-(1-нафтил)-5((2)-2-пиридилме тилен)- тетрагидро-4Н-имидазол-4-она и 0,1 г (0,0005 моль) 1 ,2-дибромэтана получено 0,19 г (68%) (5Z, 5^)-2,2'-(этан-1,2-диилдисульфанилдии� �)бис(5-(2-пиридилметилен)-3-(1- нафтил)-3,5-дигидро-4Н-имидазол-4-он а). Т _ПЛ ⁼ 267 ⁰ С.

Спектр ЯМР Ή (400МГц, CDC1 ₃ , δ, м.д.): 9,12 (д, J=8,8 Гц, 1Н, HetAr), 8,30 (д, J=8,7 Гц, 1Н, HetAr), 8,20 (д, J=8,3 Гц, 1Н, HetAr), 8,15 (д, J=8,3 Гц, 1Н, Аг), 7,95 (м, 1Н, Аг), 7,78 (д, J=8,l Гц, Ш, HetAr), 7,69 (т, J=7,l Гц, Ш, HetAr), 7,61 (м, 1Н, Аг), 7,53(м, 6Н, HetAr + СН= + Аг), 6,91 (с, 2Н, СН=), 3,76 (с, 4Н, CH ₂ -S).

ИК-спектр (см ¹ ): 1710(С=О), 1670(C=N), 1640(С=С).

Пример 6. Синтез (5Z, 5^)-2,2'-(этан-1,2-диилдисульфанилдии� �)бис(5-(2- пиридилметилен)-3-(2-антрил)-3,5-диг� �дро-4Н-имидазол-4-она)

Из 0,4 г (0,001 моль) 2-тиоксо-3-(2-антрил)-5((г)-2-пиридилм� �тилен)- тетрагидро-4Н-имидазол-4-она и 0,1 г (0,0005 моль) 1,2-дибромэтана получено 0,21 г (81%) (5Z, 5 'г)-2,2'-(этан- 1 ,2-диилдисульфанилдиил)бис(5-(2-пир идилметилен)-3-(2- антрил)-3,5-дигидро-4Н-имидазол-4-он а). Тпл=249°С.

Спектр ЯМР Ή (400МГц, CDC1 ₃ , δ, м.д.): 8,73 (д, J=7,9 Гц, 2Н, Аг), 8,69 (д, J=5,l Гц, Ш, Н _а -Ру), 8,45 (м, 4Н, Аг), 8,13 (д, J=8,8 Гц, 2Н, Н _р -Ру), 8,01 (м, ЗН, Аг), 7,76 (т, J=7,6 Гц, 1Н, Нр -Ру), 7,51 (м, 4Н, Аг), 7,47 (дд, Л=6,8 Гц, J2=l,4 Гц, 2Н, H _Y -Py)), 7,25 (м, 2Н, Аг), 6,94 (с, 2Н, СН=), 3,83 (с, 4Н, CH ₂ -S).

ИК-спектр (см ¹ ): 1730(С=О), 1680(C=N), 1620(С=С).

Элементный анализ: C ₄₈ H ₃₂ N ₆ 0 ₂ S ₂ вычислено С 73,08% Н 4,09% N 10,65%; найдено С 73,35% Н 4,82% N 10,13%.

Пример 7. Синтез (5Z, 5^)-2,2'-(бутан-1,4-диилдисульфанилди� �л)бис(5-(2- пиридилметилен)-3-аллил-3,5-дигидр� �-4Н-имидазол-4-она)

Из 0,5 г (0,002 моль) 2-тиоксо-3-аллил-5((г)-2-пиридилмети� �ен)-тетрагидро-4Н- имидазол-4-она и 0,22 г (0,001 моль) 1 ,4-дибромбутана получено 0,40 г (76%) (5Z, 5'Z)- 2,2'-(бутан-1 ,4-диилдисульфанилдиил)бис(5-(2-пир идилметилен)-3-аллил-3,5-дигидро- 4Н-имидазол-4-она). Т _ПЛ =198 ⁰ С.

Спектр ЯМР Ή (400МГц, CDC1 ₃ , δ, м.д.): 8,72(д, 8,1Гц, 2Н, Н _а -Ру), 8,65(д, 1=3,8Гц, 2Н, Нр-Ру), 7,63(тд, Л=8,ЗГц, 12=4,6Гц, 2Н, Н Ру), 7,05(дд, Л=4,7 Гц, J2=l,2 Гц, 2Н, Н _р -Ру,), 7,12(с, 2Н, СН=), 5,80 (м, 2Н, =СН-) 5,25 (м, 4Н, СН ₂ =), 4,22 (д, J=7,l Гц, 4Н, -CH ₂ -N), 3,45(т, J=6,7 Гц, 4Н, -CH ₂ -S), 2,07 (м, 4Н, -СН ₂ -).

ИК-спектр (см- ¹ ): 1710(С=О), 1670(C=N), 1640(С=С).

Элементный анализ: C ₂₈ H ₂₈ N ₆ 0 ₂ S ₂ вычислено С 61,74% Н 5,18% N 15,43%; найдено С 61 ,74% Н 5,18% N 15,43%. Пример 8. Синтез (5Z, 5'г)-2,2'-(бутан-1,4-диилдисульфанилд� �ил)бис(5-(2- пиридилметилен)-3-фенил-3,5-дигидр� �-4Н-имидазол-4-она

Из 0,3 г (0,001 моль) 2-тиоксо-3-фенил-5((2)-2-пиридилметил ен)-тетрагидро-4Н- имидазол-4-она и 0,12 г (0,0005 моль) 1 ,4-дибромбутана получено 0,18 г (78%) (5Z, 5'2)-2,2'-(бутан-1,4-диилдисульфанилди ил)бис(5-(2-пиридилметилен)-3-фенил- 3,5- дигидро-4Н-имидазол-4-она). Т _ПЛ =249 ⁰ С.

Спектр ЯМР Ή (400МГц, CDC1 ₃ , δ, м.д.): 8,75(д, J=7,9 Гц, 2Н, Н„-Ру), 8,66(д, J=4,0 Гц, 1Н, Нр-Ру), 7,81(тд, J,=7,3 Гц, J ₂ =2,3 Гц, 2Н, Нр-Ру), 7,42(м, 6Н, H-Ph), 7,29(м, 4Н, H-Ph), 7,1 1(тд, J,=7,5 Гц, J ₂ =1 ,0 Гц, 2Н, H _r Py), 7,18(с, 2Н, СН=), 3,1 1(т, J=7,5 Гц, 4Н, S-CH ₂ -,) 1,86(кв, 1=7,6Гц, 4Н, -СН ₂ -).

ИК-спектр (см ¹ ): 1720(С=О), 1670(C=N), 1640(С=С).

Элементный анализ: C ₃ 4H ₂₈ N ₆ 0 ₂ S ₂ вычислено С 66,21% Н 4,58% N 13,63%; найдено С 66,12% Н 4,76% N 13,20%.

Пример 9. Синтез (5Z, 5^)-2,2'-(гексан-1,6-диилдисульфанилд� �ил)бис(5-(2- пиридилметилен)-3-аллил-3,5-дигидр� �-4Н-имидазол-4-она)

Из 0,5 г (0,002 моль) 2-тиоксо-3-аллил-5((г)-2-пиридилмети� �ен)-тетрагидро-4Н- имидазол-4-она и 0,22 г (0,001 моль) 1 ,6-дибромгексана получено 0,40 г (81%) (5Z, 5^)-2,2'-(гексан-1,6-диилдисульфанилд� �ил)бис(5-(2-пиридилметилен)-3-аллил -3,5- дигидро-4Н-имидазол-4-она). Т _пл =171 °С.

Спектр ЯМР Ή (400МГц, CDC1 ₃ , 5, м.д.): 8,75 (д, 1=8,2Гц, 2Н, Н„-Ру), 8,67(д, J=4,ir , 2Н, Нр-Ру), 7,68(т, J=7,8 Гц, 21Н, Н _г Ру), 7,16(м, 2Н, Нр-Ру), 7,13(с, 2Н, СН=), 5,83(м, 2Н, -СН=), 5,25(м, 4Н, СН ₂ =), 4,15(д, J=5,9, 4Н, -CH ₂ -N), 3,38 (т, J=7,0 Гц, 4Н, CH ₂ -S), 1,91 (м, 4Н, -СН ₂ -), 1,60 (м, 4Н, -СН ₂ -).

ИК-спектр (см ¹ ): 1710(С=О), 1670(C=N), 1640(С=С).

Элементный анализ: C ₃ oH ₃₂ N ₆ 0 ₂ S2 вычислено С 62,91% Н 5,63% N 14,67%; найдено С 62,91% Н 5,63% N 14,67%.

Пример 10. Синтез (5Z, 5'г)-2,2'-(гексан-1,6-диилдисульфанил� �иил)бис(5-(2- пиридилметилен)-3-фенил-3,5-дигидр� �-4Н-имидазол-4-она)

Из 0,3 г (0,001 моль) 2-тиоксо-3-фенил-5((г)-2-пиридилмети� �ен)-тетрагидро-4Н- имидазол-4-она и 0,13 г (0,0005 моль) 1 ,6-дибромгексана получают 0,19г (64%) (5Z, 5'г)-2,2'-(гексан-1,6-диилдисульфанил� �иил)бис(5-(2-пиридилметилен)-3-фени л-3,5- дигидро-4Н-имидазол-4-она). T _M =240°C.

Спектр ЯМР Ή (400МГц, CDC1 ₃ , δ, м.д.): 8,77(д, 1=7,9Гц, 2Н, Н _а -Ру,), 8,66(д, 1=3,9Гц ,1Н, Нр-Ру), 7,75(тд, .ч=7,ЗГц, 1 ₂ =2,ЗГц, 2Н, Нр-Ру), 7,45(м, 6Н, H-Ph), 7,30(м, 4H, H-Ph), 7,17(c, 2H, CH=), 7,13(дц, 1,=7,5Гц, 1 ₂ =0,9Гц, 2H, Н _г Ру), 3,32(τ-, 7,5Гц, 4Η, S-CH ₂ ), 1,86(м, 4Н, -СН ₂ -), 1,54(м, 4Н, -СН ₂ -).

ИК-спектр (см ¹ ): 1700(С=О), 1670(C=N), 1630(С=С).

Элементный анализ: C ₃ 6H ₃₂ N ₆ S ₂ 0 ₂ вычислено С% 67,06, Н% 5,00, N% 13,03; найдено С% 66,71, Н% 5,04, N% 12,65.

Пример 11. Синтез (5Z, 5'г)-2,2'-(этан-1,2-диилдисульфанилди� �л)бис(5-(2- хинолилметилен)-3-пропил-3,5-дигид� �о-4Н-имидазол-4-она)

Из 0,5 г (0,0015 моль) 2-тиоксо-3-пропил-5(^)-2-хинолилмети� �ен)-тетрагидро- 4Н-имидазол-4-она и 0,15 г (0,0008 моль) 1 ,2-дибромэтана получено 0,75 г (81%) (5Z, 5'г)-2,2'-(этан-1,2-диилдисульфанилди� �л)бис(5-(2-хинолилметилен)-3-пропил -3,5- дигидро-4Н-имидазол-4-она). Тпл= 140°С.

Спектр ЯМР Ή (400МГц, CDC1 ₃ , δ, м.д.): 8,82 (д, J=9,l Гц, 2Н, HetAr), 8,05 (м, 4Н, HetAr), 7,72 (м, 4Н, HetAr), 7,53 (м, 2Н, HetAr), 7,29 (с, 2Н, СН=), 4,00(с, 4Н, -СН ₂ - S), 3,64(т, J=7,4 Гц, 4Н, CH ₂ -N), 1,75 (м, 4Н, СН ₂ ), 1,01 (т, J=7,3, СН ₃ -).

ИК-спектр (см ¹ ): 1715(С=0), 1670(C=N), 1640(С=С).

Элементный анализ: C ₃₈ H ₃₈ N ₂ 0 ₂ S ₂ вычислено С 73,75% Н 6,19% N 4,53%; найдено С 73,13% Н 6,53% N 4,88%.

Пример 12. Синтез (5Z, 5'г)-2,2'-(этан-1,2-диилдисульфанилди� �л)бис(5-(2- хинолилметилен)-3-аллил-3,5-дигидр� �-4Н-имидазол-4-она)

Из 0,5 г (0,0015 моль) 2-тиоксо-3-аллил-5(^)-2-хинолилметил� �н)-тетрагидро- 4Н-имидазол-4-она и 0,15 г (0,0008 моль) 1 ,2-дибромэтана получено 0,70 г (78%) (5Z, 5^)-2,2'-(этан-1,2-диилдисульфанилдии� �)бис(5-(2-хинолилметилен)-3-аллил-3,5 - дигидро-4Н-имидазол-4-она). Тпл=180°С.

Спектр ЯМР Ή (400МГц, CDC1 ₃ , δ, м.д.): 8,82 (д, J=9,0 Гц, 2Н, HetAr), 8,05 (м, 4Н, HetAr), 7,73 (м, 4Н, HetAr), 7,57 (м, 2Н, HetAr), 7,32 (с, 2Н, СН=), 5,88 (м, 2Н, СН=), 5,30 (м, 4Н, СН ₂ =), 4,30 (д, 1=5,6Гц, 4Н, -CH ₂ -N), 3,97(с, 4Н, CH ₂ -S).

ИК-спектр (см ¹ ): 1710(С=О), 1670(C=N), 1640(С=С).

Элементный анализ: C ₃₈ H ₃₄ N ₂ 0 ₂ S ₂ вычислено С 74,24% Н 5,57% N 4,56%; найдено С 74,42% Н 5,14% N 4,89%.

Пример 13. Синтез (5Z, 5'г)-2,2'-(этан-1,2-диилдисульфанилди� �л)бис(5-(2- хинолилметилен)-3-фенил-3,5-дигидр� �-4Н-имидазол-4-она)

Из 0,5 г (0,0015 моль) 2-тиоксо-3-фенил-5((г)-2-хинолилмети� �ен)-тетрагидро- 4Н-имидазол-4-она и 0,14 г (0,0007 моль) 1 ,2-дибромэтана получено 0,41 г (81%) (5Z, 5^)-2,2'-(этан-1,2-диилдисульфанилдии� �)бис(5-(2-хинолилметилен)-3-фенил-3,5 - дигидро-4Н-имидазол-4-она). Т _П л ⁼ 239 ⁰ С. Спектр ЯМР Ή (400МГц, CDC1 ₃ , 5, м.д.): 8,84 (д, J=8,6 Гц, 2Н, HetAr), 8,05 (д, J=8,8 Гц, 2Н, HetAr), 7,97 (д, J=8,3 Гц, 2Н, HetAr), 7,73 (м, 4Н, HetAr), 7,45 (м, 14Н, Аг + СН= + HetAr), 3,93 (с, 4Н, -CH ₂ -S).

И -спектр (см ¹ ): 1710(С=О), 1670(C=N), 1640(С=С).

Элементный анализ: C ₄₄ H ₃₄ N ₂ 0 ₂ S ₂ вычислено С 76,94% Н 4,99% N 4,08%; найдено С 76,67% Н 4,13% N 3,98%.

Пример 14. Получение координационных соединений производных имидазол-4-она

К раствору 0,0001 моль алкилированных производных 2-тиогидантоина (производных имидазол-4-она) в 2-3 мл хлористого метилена добавляют 2 мл метанола для достижения расслоения. Затем медленно, по каплям, в течение не менее чем 2 минут приливают раствор 0,0002 моль соли меди в 2-3 мл метанола. Реакционную смесь плотно закрывают и оставляют до выпадения осадка.

В случае получения комплекса (5Z, 5'Z)-2,2'-(3TaH-l,2- диилдисульфанилдиил)бис(5-(2-пири� �илметилен)-3-аллил-3,5-дигидро-4Н-и� �идазол-4- она) с нитратом меди в качестве растворителя соли используют ацетонитрил, при этом реакционную смесь закрывают от света и оставляют до выпадения осадка.

Получение комплекса (5Z, 5 '2)-2,2 '-(этан-1,2-диилдисульфанилдиил)би� �(5-(2- пиридилметилен)-3-метш-3,5-дигидро- 4Н-1шидазол-4-она) с СиС1г2Н ₂ 0

Из 0,05 г (5Z, 5'2)-2,2'-(этан-1,2-диилдисульфанилдии л)бис(5-(2- пиридилметилен)-3-метил-3,5-дигидр� �-4Н-имидазол-4-она) и 0,03 г СиС1 ₂ -6Н ₂ 0 получают 0,04 г (54%) комплекса коричневого цвета.

Элементный анализ: C ₂₂ H ₂₀ N ₆ O ₂ S ₂ *CuCl ₂ *CuCl С 37,86% Н 2,89% N 12,04%; найдено С 37,04% Н 2,57% N 12,22%.

Получение комплекса (5Z, 5 '2)-2,2 '-(этан-1,2-диилдисульфанилдиил)би� �(5-(2- пиридилметилен)-3-пропил-3,5-дигид� �о-4Н-имидазол-4-она) с СиС1 2Н ₂ 0

Из 0,05 г (5Z, 5'г)-2,2'-(этан-1 ,2-диилдисульфанилдиил)бис(5-(2- пиридилметилен)-3-пропил-3,5-дигид� �о-4Н-имидазол-4-она) и 0,03 г СиС1 ₂ -6Н ₂ 0 получают 0,03 г (45%) комплекса коричневого цвета.

Элементный анализ: C ₂₆ H ₂₈ N ₆ 0 ₂ S ₂ *CuCl ₂ *CuCl вычислено С 41 ,41% Н 3,74% N 1 1,14%; найдено С 41,63% Н 3,87% N 1 1,86%. Получение комплекса (5Z, 5 '2)-2,2 '-(этан-1,2-диилдисулъфанилдиил)би� �(5-(2- пиридилметилен)-3-аллил-3,5-дигидр� �-4Н-имидазол-4-она) с СиС1 2Н20

Из 0,05 г (5Z, 5'2)-2,2'-(этан-1,2-диилдисульфанилдии л)бис(5-(2- пиридилметилен)-3-аллил-3,5-дигидр� �-4Н-имидазол-4-она) и 0,03 г СиС1 ₂ -6Н ₂ 0 получают 0,03 г (40%) комплекса коричневого цвета.

Элементный анализ: C ₂₆ H ₂₄ N ₆ 0 ₂ S ₂ * CuCl ₂ *CuCl вычислено С 41 ,63% Н 3,23% N 1 1,15%; найдено С 41,36% Н 3,23% N 1 1,85%.

Получение комплекса (5Z, 5 ' )-2,2 '-(этан-1,2-диилдисульфанилдиил)би� �(5-(2- пиридилметилен)-3-фенил-3,5-дигидр� �-4Н-имидазол-4-она) с СиС1г2Н ₂ 0

Из 0,05 г (5Z, 5'г)-2,2'-(этан-1,2-диилдисульфанилди� �л)бис(5-(2- пиридилметилен)-3-фенил-3,5-дигидр� �-4Н-имидазол-4-она) и 0,03 г СиС1 ₂ -6Н ₂ 0 получают 0,03 г (55%) комплекса коричневого цвета.

Элементный анализ: C ₃₂ H ₂₄ N ₆ 0 ₂ S ₂ *CuCl ₂ *CuCl вычислено С 46,75% Н 2,94% N 10,22%; найдено С 46,67% Н 2,14% N 10,77%.

Получение комплекса (5Z, 5 ' )-2,2 '-(бутан-1,4-диилдисульфанилдиил)б� �с(5-(2- пиридилметилен)-3-аллил-3,5-дигидр� �-4Н-имидазол-4-она) с СиС1г2Н ₂ 0

Из 0,05 г (5Z, 5^)-2,2'-(бутан-1,4-диилдисульфанилди� �л)бис(5-(2- пиридилметилен)-3-аллил-3,5-дигидр� �-4Н-имидазол-4-она) и 0,03 г СиС1 ₂ 6Н ₂ 0 получают 0,04 г (59%) комплекса коричневого цвета.

Элементный анализ: C ₂₈ H ₂₈ N ₆ 0 ₂ S ₂ *CuCl ₂ *CuCl вычислено С 43,22% Н 3,63% N 10,80%; найдено С 43,45% Н 3,33% N 10,30%.

Получение комплекса (5Z, 5 ' )-2,2 '-(бутан-1,4-диилдисульфанилдиил)б� �с(5-(2- пиридилметипен)-3-фенил-3,5-дигидр� �-4Н-имидазол-4-она) с СиС1 2Н ₂ 0

Из 0,05 г (5Z, 5'г)-2,2'-(бутан-1,4-диилдисульфанилд� �ил)бис(5-(2- пиридилметилен)-3-фенил-3,5-дигидр� �-4Н-имидазол-4-она) и 0,03 г СиС1 ₂ -6Н ₂ 0 получают 0,03 г (49%) комплекса коричневого цвета.

Элементный анализ: C ₃₄ H ₂₈ N ₆ 0 ₂ S ₂ *CuCl ₂ *CuCl вычислено С 48,03% Н 3,32% N 9,88% найдено С 48,49% Н 2,60% N 9,10%.

Для тестирования ингибирования теломеразы, полученными соединениями был использован метод амплификации добавленных теломерных повторов (TRAP-анализ). TRAP-анализ является стандартным методом определения активности теломеразы, благодаря некоторым модификациям получивший возможности полуколичественного метода. Выбор метода детекции теломеразной активности определялся его широкой освещенностью в мировой литературе, практически чувствительностью, а так же доступностью оборудования и реагентов.

Протокол амплификации теломерных повторов можно подразделить на 3 основных шага: удлинение праймера, амплификация получившегося продукта (продуктов) и детекция. На шаге удлинения теломерные повторы прибавляются присутствующей в клеточном экстракте теломеразой к олигонуклеотиду, узнаваемому ею как субстрат (TS). При амплификации продуктов удлинения олигонуклеотида TS теломеразой могут появляться ложные сигналы с теломер хромосом, содержащихся в клеточном экстракте. Чтобы избежать этого, 5 '-конец олигонуклеотида TS имеет нетеломерную последовательность, мешающую ему связываться с теломерами, однако узнается теломеразой как субстрат. Поскольку человеческая теломераза добавляет серию повторов по шесть нуклеотидов, то в результате удлинения олигонуклеотида TS теломеразой получается набор фрагментов ДНК, различающихся по длине. Затем следует шаг увеличения количества продукта с помощью специфических праимеров методом ПЦР с нуклеотидами, содержащими радиоактивную или флуоресцентную метку для детекции. Далее осуществляется детекция (фиг. 4), как правило, с помощью электрофоретического разделения и последующего сканирования.

Праймеры TS и АСХ (таблица 1) были использованы в TRAP-анализе, АСХ имеет на 5'-конце нетеломерный довесок из 6 нуклеотидов, за счет этого не образует димеров с теломеразным субстратом. При использовании этих праймеров количество встроенной метки пропорционально числу добавленных теломеразой повторов.

Таблица 1. Последовательности олигонуклеотидов, используемых при измерении теломеразной активности

Количество ПЦР-продукта слабо зависит от того, сколько в реакции было исходной матрицы, поэтому нельзя оценить количество теломеразного продукта по интенсивности его сигнала на фотографии. При введении в ПЦР набора теломеразных продуктов они все амплифицируются. Поэтому мы можем использовать количество добавленных теломеразой повторов как критерий ее активности.

Первым этапом было культивирование раковых клеточных линий человека для выделения активных экстрактов, необходимых для проверки. Для этого перевиваемые клетки карциномы шейки матки человека линий SiHa, СЗЗА, CaSki и HeLa выращивали на стандартной среде DMEM, содержащей 10% эмбриональной сыворотки (FCS), 4мМ L-глутамина, 1 мМ пирувата натрия, стрептомицин/пенициллин в концентрации 100 мкг/мл и 100 ед/мл, соответственно, при температуре 37°С в атмосфере 5% С0 ₂ . Для пересева клеток клеточный монослой промывали PBS (10 мМ Na ₂ HP0 ₄ , 2 мМ КН ₂ Р0 ₄ , 137 мМ NaCl, 2 мМ КО), добавляли стандартный раствор трипсин:ЕОТА (Sigma) и помещали в С0 ₂ -инкубатор на 3-5 минут, добавляли среду с FCS и суспендировали пипетированием, клетки рассевали в необходимое количество культуральных флаконов. После образования монослоя клетки линий смывали с подложки раствором трипсина и осаждали центрифугированием (10 мин., 2000g). Дважды промывали буфером PBS. Ресуспендировали в лизирующем буфере (10 мМ Tris-HCl или 10 мМ HEPES-KOH, рН 7,5, 1 ,0 мМ MgCl ₂ , 1 мМ EGTA, 5 мМ β-меркаптоэтанола, 5% глицерина, 0,5% CHAPS, 0,1 мМ PMSF), 1 мл на 0,3-10 млн. клеток, в зависимости от необходимой концентрации. Инкубировали 30 минут во льду. Центрифугировали 10 минут при 4°С на 15000 об/мин и отбирали надосадочный раствор. Экстракт делили на аликвоты по 10 мкл и замораживали в жидком азоте. После этого проводили анализ теломеразной активности методом TRAP-теста. На первом шаге готовили смесь N1 : 49 мкл смеси TRAP, содержащей 1х TRAP-буфер (1х TRAP-буфер: 20 мМ HEPES-KOH рН 8,3, 1 ,5 мМ MgCl ₂ , 63 мМ КС1, 1мМ EGTA, 0, 1 мг/мл BSA, 0,005% v/v Tween-20), 20 мкМ dNTP, 1,6 мкМ олигонуклеотида TS, 1 мкл раствора тестируемого препарата в ДМСО и экстракт клеток клеточных линий или тканей. Реакционную смесь инкубировали 30 минут при 30°С. На втором шаге к смеси добавляли 2 ед. Taq-ДНК- полимеразы ("Хеликон"), 0, 1 мкг олигонуклеотида АСХ и проводили ПЦР по следующей схеме: 35 с 94°С, 35 с 50°С 90 с 72°С (30 циклов, амплификатор Mastercycler ("Eppendorf ', Германия)). 15 мкл раствора и 2,5 мкл буфера для нанесения 6xDNA loading dye ("Fermentas", 10 мМ Tris-HCl, рН 7,6, 0,03% бромфенолового голубого, 0,03% ксиленоцианола, 60% глицерина, 60 мМ ЭДТА) наносили на полиакриламидный 20% гель (акриламид: BIS-акриламид 1 : 19 10%, TBElx, TEMED 0, 1%, персульфат аммония 0, 1 %). В качестве электродного буфера использовали ТВЕ lx (0, 1М Tris, 0,1М Н ₃ ВОз, 2 мМ Ыа ₂ ЭДТА). Проводили электрофорез пока ксиленцианол не пройдет 10-20 см. Гель окрашивали раствором SYBR Green (ΙΟΟΟΟ ^χ концентрат в ДМСО фирмы Sigma-Aldrich, разведенный в 10000 раз 0, 1М буфером Tris-HCl с рН 8,5). Окраску детектировали с помощью сканирования флуоресценции в геле.

В качестве контроля действия препарата именно на РНК-зависимую ДНК- полимеразу (обратную транскриптазу) теломеразы, а не на ДНК-полимеразу, которая используется в данном анализе на втором шаге для амплификации сигнала 1 мкл раствора препарата приливали не к смеси для работы теломеразы, а вместе с олигонуклеотидом АСХ перед ПЦР на втором шаге. Такая контрольная реакция проводилась одновременно с тестом для каждого проверяемого соединения.

Для определения 1С ₅₀ (концентрация вещества при которой происходит ингибирование теломеразной активности на 50%) проводили реакции для различных концентраций препаратов. Значение 1С ₅₀ приведено в таблице 2.

Для более точного определения IC50 проводилось отдельное повторное измерение ингибирования веществами с использованием дополнительных разведений. Пример такого анализа для препарата с наибольшей ингибирующей активностью представлен на фиг. 5. Экспериментальное изображение анализировали с помощью программы Image Qvant, сравнивая интенсивность полос, соответствующих одинаковому удлинению теломер-подобного субстрата TS теломеразой, в дорожках Т и П для каждой концентрации препарата.

Таблица 2. Тестирование теломеразной активности методом TRAP для серии препаратов

* Для данных препаратов данное значение соответствует ингибирующему эффекту 15% для насыщенного раствора (1С ₅₀ неизмеримо в силу низкой растворимости исходных препаратов).